JPH06109728A - 抗インターフェロン抗体の定量法及びこれに用いる試薬 - Google Patents
抗インターフェロン抗体の定量法及びこれに用いる試薬Info
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- JPH06109728A JPH06109728A JP4261627A JP26162792A JPH06109728A JP H06109728 A JPH06109728 A JP H06109728A JP 4261627 A JP4261627 A JP 4261627A JP 26162792 A JP26162792 A JP 26162792A JP H06109728 A JPH06109728 A JP H06109728A
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 固相化抗原と被検液との免疫反応を利用する
抗インターフェロン抗体の定量法において、固相化抗原
として、固相担体に抗インターフェロン抗体、次いでイ
ンターフェロンを順次結合せしめて得られる固相化抗原
抗体複合体を用いる被検液中の抗インターフェロン抗体
及びインターフェロン−抗インターフェロン抗体複合体
の定量法。 【効果】 未精製のインターフェロンを使用しても固相
化工程で精製され、また簡便な操作で正確に血清中の抗
インターフェロン抗体及びインターフェロン−抗インタ
ーフェロン抗体複合体が定量できる。
抗インターフェロン抗体の定量法において、固相化抗原
として、固相担体に抗インターフェロン抗体、次いでイ
ンターフェロンを順次結合せしめて得られる固相化抗原
抗体複合体を用いる被検液中の抗インターフェロン抗体
及びインターフェロン−抗インターフェロン抗体複合体
の定量法。 【効果】 未精製のインターフェロンを使用しても固相
化工程で精製され、また簡便な操作で正確に血清中の抗
インターフェロン抗体及びインターフェロン−抗インタ
ーフェロン抗体複合体が定量できる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はインターフェロン治療時
の臨床効果の判定因子として有用な抗インターフェロン
抗体を免疫学的手段により簡便かつ高精度に定量する方
法に関する。
の臨床効果の判定因子として有用な抗インターフェロン
抗体を免疫学的手段により簡便かつ高精度に定量する方
法に関する。
【０００２】
【従来の技術】わが国における慢性肝炎はインターフェ
ロン等の抗ウィルス剤の出現によって、その治癒率が増
加するとともに、当該インターフェロンの摘要範囲はＢ
型よりＣ型にまで拡大され臨床評価が高まりつつある。
一方、インターフェロンの投与例としては連日又は週３
回を３〜６ケ月間等の長期投与が多く行われており、そ
の有効性は投与終了後、ＧＰＴの正常化及び正常値の持
続を指標として判断されている。しかしながら、近年前
述の長期投与にともない抗インターフェロン抗体の出現
の報告が増加しつつあり、慢性肝炎のインターフェロン
治療時における臨床効果に影響を与える因子の一つと考
えられている〔池田ら，肝臓３０巻３号（１９８９）、
西村ら，医学のあゆみ，Ｖｏｌ．１３０，Ｎｏ．４（１
９９２）、イトリら，Ｃａｎｃｅｒ，５９：６６８（１
９８７）、イングラダら，Ｌａｎｃｅｔ，１９８７，II
（１９８７）、大塚ら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ，６１
（１９８４）等〕。従って、抗インターフェロン抗体の
産生の有無及びその程度は、インターフェロン治療の有
効性、安全性を判定するうえでの重要なファクターと考
えられる。
ロン等の抗ウィルス剤の出現によって、その治癒率が増
加するとともに、当該インターフェロンの摘要範囲はＢ
型よりＣ型にまで拡大され臨床評価が高まりつつある。
一方、インターフェロンの投与例としては連日又は週３
回を３〜６ケ月間等の長期投与が多く行われており、そ
の有効性は投与終了後、ＧＰＴの正常化及び正常値の持
続を指標として判断されている。しかしながら、近年前
述の長期投与にともない抗インターフェロン抗体の出現
の報告が増加しつつあり、慢性肝炎のインターフェロン
治療時における臨床効果に影響を与える因子の一つと考
えられている〔池田ら，肝臓３０巻３号（１９８９）、
西村ら，医学のあゆみ，Ｖｏｌ．１３０，Ｎｏ．４（１
９９２）、イトリら，Ｃａｎｃｅｒ，５９：６６８（１
９８７）、イングラダら，Ｌａｎｃｅｔ，１９８７，II
（１９８７）、大塚ら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ，６１
（１９８４）等〕。従って、抗インターフェロン抗体の
産生の有無及びその程度は、インターフェロン治療の有
効性、安全性を判定するうえでの重要なファクターと考
えられる。
【０００３】この抗インターフェロン抗体の定量方法に
は、バイオアッセイによる方法〔Ｈｏ，Ｍら，Ｐｒｏ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ４５（１９５
９）〕、ウエスタンブロッティングによる方法〔戸田
ら，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，６６（１９
８３）〕及びＥＩＡによる方法〔Ｈｅｎｎｅｓら，Ｊ．
Ｂｉｏｌ．Ｓｔａｎｄ．，１５，２３１：１９８７〕な
どの報告がある。更に、ＥＬＩＳＡによる測定方法が、
池田ら〔Ｊ．Ｇａｓｔｒｉａｌ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇ
ｙ，４：４１１（１９８９）〕あるいは西村ら〔医学の
あゆみ，Ｖｏｌ．１６０，Ｎｏ．４，１９９２．１．２
５〕により試みられている。
は、バイオアッセイによる方法〔Ｈｏ，Ｍら，Ｐｒｏ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ４５（１９５
９）〕、ウエスタンブロッティングによる方法〔戸田
ら，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，６６（１９
８３）〕及びＥＩＡによる方法〔Ｈｅｎｎｅｓら，Ｊ．
Ｂｉｏｌ．Ｓｔａｎｄ．，１５，２３１：１９８７〕な
どの報告がある。更に、ＥＬＩＳＡによる測定方法が、
池田ら〔Ｊ．Ｇａｓｔｒｉａｌ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇ
ｙ，４：４１１（１９８９）〕あるいは西村ら〔医学の
あゆみ，Ｖｏｌ．１６０，Ｎｏ．４，１９９２．１．２
５〕により試みられている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】しかし、上記の方法の
うち、バイオアッセイ法は特殊な技術が必要な上、ウィ
ルスを使用するため日常の検査では利用できないことが
多く、かつ操作も複雑である。また、ウエスタンブロッ
ティング法は電気泳動を利用するため血清中のインター
フェロン抗体の定性的な確認等には重要であるが、簡便
な測定法とは言いがたい。更に、ＥＬＩＳＡによる測定
法は簡便性で優れているものの、従来のＥＬＩＳＡにお
いては固相担体に抗原であるインターフェロンを直接固
相化する方法であるため、固相化する抗原を高度に精製
する必要があり、かつ被検体中に存在する可能性のある
抗原−抗体複合体すべてを同時に測定することができる
とは言い難い。
うち、バイオアッセイ法は特殊な技術が必要な上、ウィ
ルスを使用するため日常の検査では利用できないことが
多く、かつ操作も複雑である。また、ウエスタンブロッ
ティング法は電気泳動を利用するため血清中のインター
フェロン抗体の定性的な確認等には重要であるが、簡便
な測定法とは言いがたい。更に、ＥＬＩＳＡによる測定
法は簡便性で優れているものの、従来のＥＬＩＳＡにお
いては固相担体に抗原であるインターフェロンを直接固
相化する方法であるため、固相化する抗原を高度に精製
する必要があり、かつ被検体中に存在する可能性のある
抗原−抗体複合体すべてを同時に測定することができる
とは言い難い。
【０００５】従って、本発明の目的は簡便な操作で高精
度に抗インターフェロン抗体を定量するための方法を提
供することにある。
度に抗インターフェロン抗体を定量するための方法を提
供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】そこで本発明者らは固相
化抗原を用いる免疫学的手段による抗インターフェロン
抗体の定量法について種々検討していたところ、抗イン
ターフェロン抗体を予め固相担体に結合させておき、そ
こに抗原であるインターフェロンを結合させて得られた
固相化抗原抗体複合体を固相化抗原として用いれば、固
相化する抗原の精製が必要でなく、簡便な操作で抗イン
ターフェロン抗体だけでなく、検体中に存在するインタ
ーフェロン−抗インターフェロン抗体複合体も同時に正
確に定量できることを見出し、本発明を完成するに至っ
た。
化抗原を用いる免疫学的手段による抗インターフェロン
抗体の定量法について種々検討していたところ、抗イン
ターフェロン抗体を予め固相担体に結合させておき、そ
こに抗原であるインターフェロンを結合させて得られた
固相化抗原抗体複合体を固相化抗原として用いれば、固
相化する抗原の精製が必要でなく、簡便な操作で抗イン
ターフェロン抗体だけでなく、検体中に存在するインタ
ーフェロン−抗インターフェロン抗体複合体も同時に正
確に定量できることを見出し、本発明を完成するに至っ
た。
【０００７】すなわち、固相化抗原と被検液との免疫反
応を利用する抗インターフェロン抗体の定量法におい
て、固相化抗原として、固相担体に抗インターフェロン
抗体、次いでインターフェロンを順次結合せしめて得ら
れる固相化抗原抗体複合体を用いることを特徴とする被
検液中の抗インターフェロン抗体及びインターフェロン
−抗インターフェロン抗体複合体の定量法を提供するも
のである。また、本発明は固相担体に抗インターフェロ
ン抗体、次いでインターフェロンを順次結合せしめて得
られる固相化抗原抗体複合体を含有する抗インターフェ
ロン抗体及びインターフェロン−抗インターフェロン抗
体複合体の定量用試薬を提供するものである。
応を利用する抗インターフェロン抗体の定量法におい
て、固相化抗原として、固相担体に抗インターフェロン
抗体、次いでインターフェロンを順次結合せしめて得ら
れる固相化抗原抗体複合体を用いることを特徴とする被
検液中の抗インターフェロン抗体及びインターフェロン
−抗インターフェロン抗体複合体の定量法を提供するも
のである。また、本発明は固相担体に抗インターフェロ
ン抗体、次いでインターフェロンを順次結合せしめて得
られる固相化抗原抗体複合体を含有する抗インターフェ
ロン抗体及びインターフェロン−抗インターフェロン抗
体複合体の定量用試薬を提供するものである。
【０００８】本発明に用いる固相化抗原抗体複合体は、
固相担体に抗インターフェロン抗体、次いでインターフ
ェロンを順次結合せしめることにより製造される。ここ
で固相担体としては、ポリスチレン、ポリプロピレン等
のプラスチック製の球状、棒状、プレート状等の担体が
挙げられるが、プラスチック製プレートが好ましい。
固相担体に抗インターフェロン抗体、次いでインターフ
ェロンを順次結合せしめることにより製造される。ここ
で固相担体としては、ポリスチレン、ポリプロピレン等
のプラスチック製の球状、棒状、プレート状等の担体が
挙げられるが、プラスチック製プレートが好ましい。
【０００９】本発明で用いられる抗インターフェロン抗
体としては、インターフェロンを投与して得られる動物
由来の抗血清もしくは抗体、又は抗体産生細胞によって
産生されたモノクローナル抗体でインターフェロンとの
交叉反応をするものであればいずれのものでも良く、例
えば、抗インターフェロン−αモノクローナル抗体、抗
組み換え型インターフェロン−αモノクローナル抗体、
抗インターフェロン−βモノクローナル抗体、抗インタ
ーフェロン−γモノクローナル抗体、又はウサギ、ウ
マ、ヤギもしくはヒツジ等由来のインターフェロン−
α、インターフェロン−βもしくはインターフェロン−
γのポリクローナル抗体等が挙げられる。
体としては、インターフェロンを投与して得られる動物
由来の抗血清もしくは抗体、又は抗体産生細胞によって
産生されたモノクローナル抗体でインターフェロンとの
交叉反応をするものであればいずれのものでも良く、例
えば、抗インターフェロン−αモノクローナル抗体、抗
組み換え型インターフェロン−αモノクローナル抗体、
抗インターフェロン−βモノクローナル抗体、抗インタ
ーフェロン−γモノクローナル抗体、又はウサギ、ウ
マ、ヤギもしくはヒツジ等由来のインターフェロン−
α、インターフェロン−βもしくはインターフェロン−
γのポリクローナル抗体等が挙げられる。
【００１０】本発明で用いられるインターフェロンとし
ては一般試薬として市販されているものであればいずれ
を使用しても良く、例えば、ヒトの白血球画分もしくは
株化リンパ芽球の培養遺伝子組み換えを利用した大腸菌
法もしくは動物細胞法等から得られる天然型インターフ
ェロン−α又は組み換え型インターフェロン−
α2a， 2b、線維芽細胞の培養もしくは遺伝子組み換えに
よる大腸菌法もしくは動物細胞法等から得られる天然型
インターフェロン−β、Ｔリンパ球の培養等から得られ
るインターフェロン−γが使用できる。
ては一般試薬として市販されているものであればいずれ
を使用しても良く、例えば、ヒトの白血球画分もしくは
株化リンパ芽球の培養遺伝子組み換えを利用した大腸菌
法もしくは動物細胞法等から得られる天然型インターフ
ェロン−α又は組み換え型インターフェロン−
α2a， 2b、線維芽細胞の培養もしくは遺伝子組み換えに
よる大腸菌法もしくは動物細胞法等から得られる天然型
インターフェロン−β、Ｔリンパ球の培養等から得られ
るインターフェロン−γが使用できる。
【００１１】固相担体に上記抗インターフェロン抗体及
びインターフェロンを結合させるには、常法例えば吸着
法、架橋化剤を用いる方法等が挙げられるが、簡便性か
ら吸着法を用いるのが好ましい。吸着法を実施するに
は、例えば、適当な緩衝液中の抗インターフェロン抗体
を固相担体に吸着させ固相化させたのち、抗原であるイ
ンターフェロンを同緩衝液下にて固相化された抗体に結
合させれば良い。固相化反応における抗インターフェロ
ン抗体の使用量は５〜５０００Ｕ／ml、特に２０〜３０
００Ｕ／mlが好ましく、インターフェロンの使用量は１
００〜５００００Ｕ／ml、特に５００〜２００００Ｕ／
mlが好ましい。本発明法において、緩衝液としてはpH５
〜９のリン酸緩衝液、トリス緩衝液、グッド緩衝液等通
常使用されるものであればいずれも使用可能である。ま
た、本発明で使用されるブロッキング緩衝液は上記緩衝
液に一般的に良く利用されるンゴーら（Ｅｎｚｙｍｅ−
ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，Ｐｌｅｎ
ｕｍ Ｐｒｅｓｓ，１９８５）の報告にあるようにアル
ブミン１〜３％又はゼラチン０．０５〜０．１％を含む
ものが好ましい。
びインターフェロンを結合させるには、常法例えば吸着
法、架橋化剤を用いる方法等が挙げられるが、簡便性か
ら吸着法を用いるのが好ましい。吸着法を実施するに
は、例えば、適当な緩衝液中の抗インターフェロン抗体
を固相担体に吸着させ固相化させたのち、抗原であるイ
ンターフェロンを同緩衝液下にて固相化された抗体に結
合させれば良い。固相化反応における抗インターフェロ
ン抗体の使用量は５〜５０００Ｕ／ml、特に２０〜３０
００Ｕ／mlが好ましく、インターフェロンの使用量は１
００〜５００００Ｕ／ml、特に５００〜２００００Ｕ／
mlが好ましい。本発明法において、緩衝液としてはpH５
〜９のリン酸緩衝液、トリス緩衝液、グッド緩衝液等通
常使用されるものであればいずれも使用可能である。ま
た、本発明で使用されるブロッキング緩衝液は上記緩衝
液に一般的に良く利用されるンゴーら（Ｅｎｚｙｍｅ−
ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，Ｐｌｅｎ
ｕｍ Ｐｒｅｓｓ，１９８５）の報告にあるようにアル
ブミン１〜３％又はゼラチン０．０５〜０．１％を含む
ものが好ましい。
【００１２】本発明の定量法は、固相担体として上記の
固相化抗原抗体複合体を使用する免疫学的方法であれば
競合法、サンドイッチ法のいずれでもよいが、特にＥＬ
ＩＳＡが好ましい。従って、本発明の好ましい実施態様
としては、前記固相化抗原抗体複合体に被検液を反応さ
せ、洗浄後標識２次抗体を反応させ、当該固相に結合し
た標識量を測定することにより、被検液中の抗インター
フェロン抗体及びインターフェロン−抗インターフェロ
ン抗体複合体を定量する方法が挙げられる。
固相化抗原抗体複合体を使用する免疫学的方法であれば
競合法、サンドイッチ法のいずれでもよいが、特にＥＬ
ＩＳＡが好ましい。従って、本発明の好ましい実施態様
としては、前記固相化抗原抗体複合体に被検液を反応さ
せ、洗浄後標識２次抗体を反応させ、当該固相に結合し
た標識量を測定することにより、被検液中の抗インター
フェロン抗体及びインターフェロン−抗インターフェロ
ン抗体複合体を定量する方法が挙げられる。
【００１３】本発明に用いられる被検液としては血清、
血漿等が挙げられる。
血漿等が挙げられる。
【００１４】本発明定量方法に用いられる標識２次抗体
の標識剤としては、ＲＩ、酵素のいずれも挙げられる
が、酵素が好ましい。標識に用いられる酵素としては、
パーオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、β−ガ
ラクトシダーゼ等が挙げられる。２次抗体としては、ヒ
トＩｇＧモノクローナル抗体、ヒトＩｇＧポリクローナ
ル抗体等が挙げられる。なお、標識２次抗体は市販され
ているものを用いることもできる。
の標識剤としては、ＲＩ、酵素のいずれも挙げられる
が、酵素が好ましい。標識に用いられる酵素としては、
パーオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、β−ガ
ラクトシダーゼ等が挙げられる。２次抗体としては、ヒ
トＩｇＧモノクローナル抗体、ヒトＩｇＧポリクローナ
ル抗体等が挙げられる。なお、標識２次抗体は市販され
ているものを用いることもできる。
【００１５】これらの標識酵素種に対応する発色用の反
応基質類としては、パーオキシダーゼではｏ−フェニレ
ンジアミンのほかに良く知られているものとして２，
２′−アジノ−ジ−（３−エチル−ベンツチアゾリンス
ルフォネート−６）（ＡＢＴＳ）、ｏ−トルイジン又は
３−メチル−２−ベンゾチアゾリンヒドラゾン（ＭＢＴ
Ｈ）などが利用できる。アルカリフォスファターゼでは
ｐ−ニトロフェニルフォスフェイト、５−ブロモ−４−
クロロ−３−インドイルフォスフェイト（ＢＣＩＰ）等
が利用できる。また、β−ガラクトシダーゼの場合は、
ｏ−又はｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシド
（ｏ−，ｐ−ＮＰＧ）の解裂による遊離ｏ−又はｐ−ニ
トロフェニル（ｏ−，ｐ−ＮＰ）の利用ができる。また
蛍光用の反応用基質としては、パーオキシダーゼではチ
ラミンあるいはｐ−ヒドロキシフェニル酢酸等が、β−
ガラクトシダーゼではフルオレッセン−β−Ｄ−ガラク
トシド等が利用できる。更に発光用の基質としては、ペ
ルオキシダーゼではルミノール等が利用できる。
応基質類としては、パーオキシダーゼではｏ−フェニレ
ンジアミンのほかに良く知られているものとして２，
２′−アジノ−ジ−（３−エチル−ベンツチアゾリンス
ルフォネート−６）（ＡＢＴＳ）、ｏ−トルイジン又は
３−メチル−２−ベンゾチアゾリンヒドラゾン（ＭＢＴ
Ｈ）などが利用できる。アルカリフォスファターゼでは
ｐ−ニトロフェニルフォスフェイト、５−ブロモ−４−
クロロ−３−インドイルフォスフェイト（ＢＣＩＰ）等
が利用できる。また、β−ガラクトシダーゼの場合は、
ｏ−又はｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシド
（ｏ−，ｐ−ＮＰＧ）の解裂による遊離ｏ−又はｐ−ニ
トロフェニル（ｏ−，ｐ−ＮＰ）の利用ができる。また
蛍光用の反応用基質としては、パーオキシダーゼではチ
ラミンあるいはｐ−ヒドロキシフェニル酢酸等が、β−
ガラクトシダーゼではフルオレッセン−β−Ｄ−ガラク
トシド等が利用できる。更に発光用の基質としては、ペ
ルオキシダーゼではルミノール等が利用できる。
【００１６】本発明定量方法を実施するには、例えばま
ず固相化抗原抗体複合体に被検液を加え室温〜４０℃で
１分〜２時間インキュベートする。次いで、緩衝液で固
相を洗浄した後標識２次抗体を加えて室温〜４０℃で１
分〜２時間インキュベートする。再度洗浄後基質溶液を
加えて室温〜４０℃で１分〜２時間反応させ、反応停止
剤を加えた後、生じた発色、蛍光又は発光を測定する。
また、一定時間における吸光度の変化量を測定してもよ
い。なお、発色反応の停止液としては、硫酸、リン酸等
の無機酸類もしくは水酸化ナトリウム等のアルカリ水溶
液等を使用することができる。
ず固相化抗原抗体複合体に被検液を加え室温〜４０℃で
１分〜２時間インキュベートする。次いで、緩衝液で固
相を洗浄した後標識２次抗体を加えて室温〜４０℃で１
分〜２時間インキュベートする。再度洗浄後基質溶液を
加えて室温〜４０℃で１分〜２時間反応させ、反応停止
剤を加えた後、生じた発色、蛍光又は発光を測定する。
また、一定時間における吸光度の変化量を測定してもよ
い。なお、発色反応の停止液としては、硫酸、リン酸等
の無機酸類もしくは水酸化ナトリウム等のアルカリ水溶
液等を使用することができる。
【００１７】
【作用及び発明の効果】本発明方法は、固相化抗原とし
て固相担体に抗インターフェロン抗体、次いでインター
フェロンを順次結合させたものを用いるため、精製不十
分な又は夾雑物を含有するインターフェロンを用いた場
合でも、固相系内で精製されることから正確な定量が可
能となった。また、固相に抗インターフェロン抗体及び
インターフェロンの両者が結合した担体を用いるため、
被検液中に存在する遊離の抗インターフェロン抗体だけ
でなく、インターフェロン−抗インターフェロン抗体複
合体をも反応し、抗インターフェロン抗体の正確な測定
が可能となった。
て固相担体に抗インターフェロン抗体、次いでインター
フェロンを順次結合させたものを用いるため、精製不十
分な又は夾雑物を含有するインターフェロンを用いた場
合でも、固相系内で精製されることから正確な定量が可
能となった。また、固相に抗インターフェロン抗体及び
インターフェロンの両者が結合した担体を用いるため、
被検液中に存在する遊離の抗インターフェロン抗体だけ
でなく、インターフェロン−抗インターフェロン抗体複
合体をも反応し、抗インターフェロン抗体の正確な測定
が可能となった。
【００１８】
【実施例】次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明する
が、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
が、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００１９】実施例１ ポリスチレンマイクロタイタープレートの各ウエルに１
４mMリン酸緩衝液pH７．２溶解した１０００IU／ml抗イ
ンターフェロン−α抗体溶液を１００μl づつ分注し、
４℃にて一夜放置させ、吸着させる。このプレートを同
緩衝液の３倍量にて洗浄した後１％ＢＳＡを含む同緩衝
液にてブロッキングを行った後、更に１００IU／mlイン
ターフェロン−α溶液を１００μl 加え抗インターフェ
ロン−α抗体に結合させ、洗浄後測定用感作プレートと
する。この感作プレートの各ウエルに検体１００μl を
加えて３７℃で２時間反応させる。洗浄後パーオキシダ
ーゼで標識した０．２μg ／ml抗ヒトＩｇＧモノクロー
ナル抗体１００mlを３７℃で２時間反応させ、再度洗浄
操作を行い、１１mMオルトフェニレンジアミン及び０．
０２％過酸化水素を含む７５mMリン酸−クエン酸緩衝液
pH５．０を加える。室温で１０分間反応後、停止液とし
て１Ｎ硫酸を１００μl 加え４９２nmにて吸光度を測定
する。なお、被検体はウサギ抗インターフェロン−α抗
体を健常人のプール血清にて系列希釈したものを使用し
た。この結果を表１に、また、この結果に基づいて作成
した検量線を図１に示す。
４mMリン酸緩衝液pH７．２溶解した１０００IU／ml抗イ
ンターフェロン−α抗体溶液を１００μl づつ分注し、
４℃にて一夜放置させ、吸着させる。このプレートを同
緩衝液の３倍量にて洗浄した後１％ＢＳＡを含む同緩衝
液にてブロッキングを行った後、更に１００IU／mlイン
ターフェロン−α溶液を１００μl 加え抗インターフェ
ロン−α抗体に結合させ、洗浄後測定用感作プレートと
する。この感作プレートの各ウエルに検体１００μl を
加えて３７℃で２時間反応させる。洗浄後パーオキシダ
ーゼで標識した０．２μg ／ml抗ヒトＩｇＧモノクロー
ナル抗体１００mlを３７℃で２時間反応させ、再度洗浄
操作を行い、１１mMオルトフェニレンジアミン及び０．
０２％過酸化水素を含む７５mMリン酸−クエン酸緩衝液
pH５．０を加える。室温で１０分間反応後、停止液とし
て１Ｎ硫酸を１００μl 加え４９２nmにて吸光度を測定
する。なお、被検体はウサギ抗インターフェロン−α抗
体を健常人のプール血清にて系列希釈したものを使用し
た。この結果を表１に、また、この結果に基づいて作成
した検量線を図１に示す。
【００２０】
【表１】
【００２１】実施例２ 血清１０検体を各々１００μl 使用し、実施例１と同様
に操作して各血清の吸光度を求めた。この結果を表２に
示す。比較例としてウエスタンブロッティングによる方
法を使用し、抗インターフェロン−α抗体の検出を行っ
た。すなわち、インターフェロン−αを電気泳動し、メ
ンブランフィルターにブロッティングを行ったのち、希
釈した被検血清を反応させた。洗浄後、ペルオキシダー
ゼ標識抗ヒトＩｇＧを反応させ、基質ジアミノベンチジ
ンにより発色させた。発色した被検血清を陽性検体と判
定した。判定結果は表２に上記本発明方法の結果ととも
に示す。
に操作して各血清の吸光度を求めた。この結果を表２に
示す。比較例としてウエスタンブロッティングによる方
法を使用し、抗インターフェロン−α抗体の検出を行っ
た。すなわち、インターフェロン−αを電気泳動し、メ
ンブランフィルターにブロッティングを行ったのち、希
釈した被検血清を反応させた。洗浄後、ペルオキシダー
ゼ標識抗ヒトＩｇＧを反応させ、基質ジアミノベンチジ
ンにより発色させた。発色した被検血清を陽性検体と判
定した。判定結果は表２に上記本発明方法の結果ととも
に示す。
【００２２】
【表２】
【００２３】表２より、本発明方法はウエスタンブロッ
ティング法の結果と良好な相関性を示した。
ティング法の結果と良好な相関性を示した。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１における抗インターフェロン−α抗体
濃度と吸光度の関係を示す図である。
濃度と吸光度の関係を示す図である。
Claims (3)
- 【請求項１】 固相化抗原と被検液との免疫反応を利用
する抗インターフェロン抗体の定量法において、固相化
抗原として、固相担体に抗インターフェロン抗体、次い
でインターフェロンを順次結合せしめて得られる固相化
抗原抗体複合体を用いることを特徴とする被検液中の抗
インターフェロン抗体及びインターフェロン−抗インタ
ーフェロン抗体複合体の定量法。 - 【請求項２】 固相担体に抗インターフェロン抗体、次
いでインターフェロンを順次結合せしめて得られる固相
化抗原抗体複合体に被検液を反応させ、洗浄後標識２次
抗体を反応させ、当該固相に結合した標識量を測定する
ことを特徴とする被検液中の抗インターフェロン抗体及
びインターフェロン−抗インターフェロン抗体複合体の
定量法。 - 【請求項３】 固相担体に抗インターフェロン抗体、次
いでインターフェロンを順次結合せしめて得られる固相
化抗原抗体複合体を含有する抗インターフェロン抗体及
びインターフェロン−抗インターフェロン抗体複合体の
定量用試薬。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4261627A JPH06109728A (ja) | 1992-09-30 | 1992-09-30 | 抗インターフェロン抗体の定量法及びこれに用いる試薬 |
| PCT/JP1993/001657 WO1995013539A1 (fr) | 1992-09-30 | 1993-11-12 | Methode de dosage d'anticorps anti-interferon et reactif utilise dans ce dernier |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4261627A JPH06109728A (ja) | 1992-09-30 | 1992-09-30 | 抗インターフェロン抗体の定量法及びこれに用いる試薬 |
| PCT/JP1993/001657 WO1995013539A1 (fr) | 1992-09-30 | 1993-11-12 | Methode de dosage d'anticorps anti-interferon et reactif utilise dans ce dernier |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06109728A true JPH06109728A (ja) | 1994-04-22 |
Family
ID=17364525
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4261627A Pending JPH06109728A (ja) | 1992-09-30 | 1992-09-30 | 抗インターフェロン抗体の定量法及びこれに用いる試薬 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH06109728A (ja) |
-
1992
- 1992-09-30 JP JP4261627A patent/JPH06109728A/ja active Pending
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