JPH06109726A - 全血中のソルビトールの定量法 - Google Patents
全血中のソルビトールの定量法Info
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- JPH06109726A JPH06109726A JP25965192A JP25965192A JPH06109726A JP H06109726 A JPH06109726 A JP H06109726A JP 25965192 A JP25965192 A JP 25965192A JP 25965192 A JP25965192 A JP 25965192A JP H06109726 A JPH06109726 A JP H06109726A
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 全血に水溶性亜鉛塩及びアルカリ金属水酸化
物を加えて生成した沈澱物を除去し、得られた上清にソ
ルビトール脱水素酵素、キレート剤及びニコチンアミド
アデニンジヌクレオチド又はニコチンアミドアデニンジ
ヌクレオチドホスフェートを反応させ、生成する還元型
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド又は還元型ニコ
チンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェートの量を
測定することによる全血中のソルビトールの定量法。 【効果】 糖尿病合併症の診断及びその治療・予防管理
をするうえで極めて重要な全血中のソルビトール濃度
が、簡便な操作で高精度で定量可能となった。
物を加えて生成した沈澱物を除去し、得られた上清にソ
ルビトール脱水素酵素、キレート剤及びニコチンアミド
アデニンジヌクレオチド又はニコチンアミドアデニンジ
ヌクレオチドホスフェートを反応させ、生成する還元型
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド又は還元型ニコ
チンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェートの量を
測定することによる全血中のソルビトールの定量法。 【効果】 糖尿病合併症の診断及びその治療・予防管理
をするうえで極めて重要な全血中のソルビトール濃度
が、簡便な操作で高精度で定量可能となった。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は糖尿病合併症の診断に有
用な全血中のソルビトール濃度を簡便な操作で正確に定
量する方法に関する。
用な全血中のソルビトール濃度を簡便な操作で正確に定
量する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】生活習慣の変化、食生活の西欧化、人口
の高齢化などに伴い、糖尿病患者の増加が指摘されてお
り、未治療の境界型患者も含めれば、我国における総数
は６００万人とも言われている。糖尿病の治療は、主と
してインシュリン、血糖降下剤、運動療法、食事療法な
どによる血糖コントロールであり、この様な療法により
血糖値を正常域にコントロールすれば、日常生活に大き
な支障はない。しかし、糖尿病が本当に恐ろしいのは合
併症の発症であり、３大合併症として網膜症、腎症及び
神経症が挙げられている。これらの合併症が発症する
と、患者の日常生活は破壊され、時には死に至る場合も
ある。従って糖尿病治療の真の目的は、血糖コントロー
ルと共に、合併症の発症予防が極めて重要である。
の高齢化などに伴い、糖尿病患者の増加が指摘されてお
り、未治療の境界型患者も含めれば、我国における総数
は６００万人とも言われている。糖尿病の治療は、主と
してインシュリン、血糖降下剤、運動療法、食事療法な
どによる血糖コントロールであり、この様な療法により
血糖値を正常域にコントロールすれば、日常生活に大き
な支障はない。しかし、糖尿病が本当に恐ろしいのは合
併症の発症であり、３大合併症として網膜症、腎症及び
神経症が挙げられている。これらの合併症が発症する
と、患者の日常生活は破壊され、時には死に至る場合も
ある。従って糖尿病治療の真の目的は、血糖コントロー
ルと共に、合併症の発症予防が極めて重要である。
【０００３】このような糖尿病合併症の発症には、アル
ドースリダクターゼ等を介したポリオール代謝系によっ
て産生されるソルビトール及びフルクトースの蓄積が関
与していると考えられている。アルドースリダクターゼ
は、１９６０年にＨｅｒｓにより、精子のエネルギー源
であるフルクトースの産生に関与するポリオール代謝系
の律速酵素として見出された。その後、本酵素は、水晶
体、網膜、末梢神経、腎臓、及び血管など、糖尿病合併
症が出現する種々の組織に存在し、合併症の発症に重要
な役割を演じていることが明らかになった。通常細胞内
にとりこまれたグルコースは、アルドースリダクターゼ
より親和性の強いヘキソキナーゼによって大部分が解糖
系へと代謝されるので、ポリオール代謝系を介して代謝
されるグルコースは３％に過ぎない。しかし、糖尿病の
ように高血糖状態になると、ヘキソキナーゼによる糖利
用が限界になるとともに、アルドースリダクターゼが活
性化され、ポリオール代謝系を介するグルコース利用が
正常状態の４倍にもなる。その際産生されるソルビトー
ル及びフルクトースは比較的安定で、いったん産生され
ると細胞内に蓄積し浸透圧上昇、水分貯留を招き、細胞
障害を引き起こすとされている。
ドースリダクターゼ等を介したポリオール代謝系によっ
て産生されるソルビトール及びフルクトースの蓄積が関
与していると考えられている。アルドースリダクターゼ
は、１９６０年にＨｅｒｓにより、精子のエネルギー源
であるフルクトースの産生に関与するポリオール代謝系
の律速酵素として見出された。その後、本酵素は、水晶
体、網膜、末梢神経、腎臓、及び血管など、糖尿病合併
症が出現する種々の組織に存在し、合併症の発症に重要
な役割を演じていることが明らかになった。通常細胞内
にとりこまれたグルコースは、アルドースリダクターゼ
より親和性の強いヘキソキナーゼによって大部分が解糖
系へと代謝されるので、ポリオール代謝系を介して代謝
されるグルコースは３％に過ぎない。しかし、糖尿病の
ように高血糖状態になると、ヘキソキナーゼによる糖利
用が限界になるとともに、アルドースリダクターゼが活
性化され、ポリオール代謝系を介するグルコース利用が
正常状態の４倍にもなる。その際産生されるソルビトー
ル及びフルクトースは比較的安定で、いったん産生され
ると細胞内に蓄積し浸透圧上昇、水分貯留を招き、細胞
障害を引き起こすとされている。
【０００４】従って、アルドースリダクターゼ阻害剤は
糖尿病合併症治療・予防薬として有用であり、最近上市
され注目を集めている。ところで、当該アルドースリダ
クターゼ阻害剤による治療にあたっては、上記の理由か
ら患者の血中ソルビトールを測定し、その濃度を管理す
ることが必要となる。また、糖尿病合併症の診断・管理
をするうえで血中ソルビトール濃度の把握は極めて重要
である。
糖尿病合併症治療・予防薬として有用であり、最近上市
され注目を集めている。ところで、当該アルドースリダ
クターゼ阻害剤による治療にあたっては、上記の理由か
ら患者の血中ソルビトールを測定し、その濃度を管理す
ることが必要となる。また、糖尿病合併症の診断・管理
をするうえで血中ソルビトール濃度の把握は極めて重要
である。
【０００５】かかる血中ソルビトールの測定法として
は、全血又は赤血球画分を過塩素酸で除蛋白し、その上
清を炭酸カリウムで中和後、遠心して過塩素酸をカリウ
ム塩として除去し、その上清中のソルビトールにソルビ
トール脱水素酵素及びニコチンアミドアデニンジヌクレ
オチド（以下、ＮＡＤと略す）を反応させ、生成された
還元型ＮＡＤ（以下、ＮＡＤＨと略す）の蛍光を測定す
る方法が知られている。
は、全血又は赤血球画分を過塩素酸で除蛋白し、その上
清を炭酸カリウムで中和後、遠心して過塩素酸をカリウ
ム塩として除去し、その上清中のソルビトールにソルビ
トール脱水素酵素及びニコチンアミドアデニンジヌクレ
オチド（以下、ＮＡＤと略す）を反応させ、生成された
還元型ＮＡＤ（以下、ＮＡＤＨと略す）の蛍光を測定す
る方法が知られている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、上記の
ソルビトール測定法では、除蛋白に過塩素酸を使用する
ため血中のヘモグロビンからヘムが遊離し、上清が黄黒
褐色を呈し、定量の精度が低下するという欠点があっ
た。更に、中和反応により生成した過塩素酸カリウムが
完全に除去されないため、ソルビトール脱水素酵素が失
活しやすく、酵素反応が定量的に進行しないことから、
定量の精度が低下するという問題があった。
ソルビトール測定法では、除蛋白に過塩素酸を使用する
ため血中のヘモグロビンからヘムが遊離し、上清が黄黒
褐色を呈し、定量の精度が低下するという欠点があっ
た。更に、中和反応により生成した過塩素酸カリウムが
完全に除去されないため、ソルビトール脱水素酵素が失
活しやすく、酵素反応が定量的に進行しないことから、
定量の精度が低下するという問題があった。
【０００７】従って、本発明の目的は血中ソルビトール
濃度を簡便な操作で高精度で定量する方法を提供するこ
とにある。
濃度を簡便な操作で高精度で定量する方法を提供するこ
とにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】そこで、本発明者らは全
血中のソルビトール定量法の精度を向上させるべく種々
検討した結果、除蛋白を水溶性亜鉛塩とアルカリ金属水
酸化物とを混和させた際に生成される水酸化亜鉛による
強い蛋白吸着作用を利用して行えば、除蛋白後の上清が
無色透明となり定量精度が向上することを見出した。し
かし、この上清をソルビトール脱水素酵素とＮＡＤの反
応系に供した場合、ソルビトール脱水素酵素活性が強く
阻害されるため正確な測定ができなかった。そこで更に
研究を進めたところ、この酵素反応系にキレート剤を共
存させれば、ソルビトール脱水素酵素活性の阻害が完全
に除去され、正確な定量が可能となることを見出し、本
発明を完成するに至った。
血中のソルビトール定量法の精度を向上させるべく種々
検討した結果、除蛋白を水溶性亜鉛塩とアルカリ金属水
酸化物とを混和させた際に生成される水酸化亜鉛による
強い蛋白吸着作用を利用して行えば、除蛋白後の上清が
無色透明となり定量精度が向上することを見出した。し
かし、この上清をソルビトール脱水素酵素とＮＡＤの反
応系に供した場合、ソルビトール脱水素酵素活性が強く
阻害されるため正確な測定ができなかった。そこで更に
研究を進めたところ、この酵素反応系にキレート剤を共
存させれば、ソルビトール脱水素酵素活性の阻害が完全
に除去され、正確な定量が可能となることを見出し、本
発明を完成するに至った。
【０００９】すなわち、本発明は、全血に水溶性亜鉛塩
及びアルカリ金属水酸化物を加えて生成した沈澱物を除
去し、得られた上清にソルビトール脱水素酵素、キレー
ト剤及びＮＡＤ又はニコチンアミドアデニンジヌクレオ
チドホスフェート（以下、ＮＡＤＰと略す）を反応さ
せ、生成する還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオ
チド（以下、ＮＡＤＨと略す）又は還元型ニコチンアミ
ドアデニンジヌクレオチドホスフェート（以下、ＮＡＤ
ＰＨと略す）の量を測定することを特徴とする全血中の
ソルビトールの定量法を提供するものである。
及びアルカリ金属水酸化物を加えて生成した沈澱物を除
去し、得られた上清にソルビトール脱水素酵素、キレー
ト剤及びＮＡＤ又はニコチンアミドアデニンジヌクレオ
チドホスフェート（以下、ＮＡＤＰと略す）を反応さ
せ、生成する還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオ
チド（以下、ＮＡＤＨと略す）又は還元型ニコチンアミ
ドアデニンジヌクレオチドホスフェート（以下、ＮＡＤ
ＰＨと略す）の量を測定することを特徴とする全血中の
ソルビトールの定量法を提供するものである。
【００１０】また、本発明は、水溶性亜鉛塩、アルカリ
金属水酸化物、ソルビトール脱水素酵素、キレート剤及
びＮＡＤ又はＮＡＤＰを含有することを特徴とする全血
中のソルビトール定量用試薬を提供するものである。
金属水酸化物、ソルビトール脱水素酵素、キレート剤及
びＮＡＤ又はＮＡＤＰを含有することを特徴とする全血
中のソルビトール定量用試薬を提供するものである。
【００１１】本発明の定量法に用いられる水溶性亜鉛塩
及びアルカリ金属水酸化物は、全血より除蛋白するため
に用いられる試薬であり、水溶性亜鉛塩としては硫酸亜
鉛、塩化亜鉛、硝酸亜鉛等が挙げられるが、就中硫酸亜
鉛が特に好ましい。また、アルカリ金属水酸化物として
は、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等が挙げられる
が、水酸化ナトリウムが特に好ましい。これら除蛋白試
薬濃度は、前記のように水酸化亜鉛の生成により血中の
蛋白を沈澱させ、かつ血中のソルビトールを損なわない
量であれば特に制限されないが、例えば水溶性亜鉛塩は
０．０５〜０．２ｇ／mlとなる量、アルカリ金属水酸化
物は０．１〜１Ｎとなる量が好ましい。
及びアルカリ金属水酸化物は、全血より除蛋白するため
に用いられる試薬であり、水溶性亜鉛塩としては硫酸亜
鉛、塩化亜鉛、硝酸亜鉛等が挙げられるが、就中硫酸亜
鉛が特に好ましい。また、アルカリ金属水酸化物として
は、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等が挙げられる
が、水酸化ナトリウムが特に好ましい。これら除蛋白試
薬濃度は、前記のように水酸化亜鉛の生成により血中の
蛋白を沈澱させ、かつ血中のソルビトールを損なわない
量であれば特に制限されないが、例えば水溶性亜鉛塩は
０．０５〜０．２ｇ／mlとなる量、アルカリ金属水酸化
物は０．１〜１Ｎとなる量が好ましい。
【００１２】除蛋白操作は、例えば全血に水溶性亜鉛塩
及びアルカリ金属水酸化物を加え、室温下ミキサー等を
用いてよく混和し、３０００〜５０００rpm １０分間程
度遠心分離して沈澱物を除去することにより行われる。
かくして得られる上清は、無色透明であり、かつ全血中
のソルビトールはほとんど失われることなく、当該上清
中に回収される。
及びアルカリ金属水酸化物を加え、室温下ミキサー等を
用いてよく混和し、３０００〜５０００rpm １０分間程
度遠心分離して沈澱物を除去することにより行われる。
かくして得られる上清は、無色透明であり、かつ全血中
のソルビトールはほとんど失われることなく、当該上清
中に回収される。
【００１３】得られた上清にソルビトール脱水素酵素、
キレート剤及びＮＡＤ又はＮＡＤＰを反応させ、生成す
るＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨの量を測定する反応は、次の
反応式で表わされる。
キレート剤及びＮＡＤ又はＮＡＤＰを反応させ、生成す
るＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨの量を測定する反応は、次の
反応式で表わされる。
【００１４】
【化１】
【００１５】この反応に用いられるソルビトール脱水素
酵素（ＥＣ１．１．１．１４）は、ソルビトールから水
素を除去しフルクトースを生成する酵素であれば動物由
来、微生物由来のいずれのものでもよいが、市販品とし
ては、例えば、Ｓｏｒｂｉｔｏｌ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅ
ｎａｓｅ（ベーリンガー社製）等が挙げられる。かかる
ソルビトール脱水素酵素の使用量は、試料上清中に含ま
れるソルビトールを全てフルクトースに変換し得る量で
あれば特に制限されないが、通常０．１〜１０Ｕ／mlと
なるような量が好ましい。
酵素（ＥＣ１．１．１．１４）は、ソルビトールから水
素を除去しフルクトースを生成する酵素であれば動物由
来、微生物由来のいずれのものでもよいが、市販品とし
ては、例えば、Ｓｏｒｂｉｔｏｌ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅ
ｎａｓｅ（ベーリンガー社製）等が挙げられる。かかる
ソルビトール脱水素酵素の使用量は、試料上清中に含ま
れるソルビトールを全てフルクトースに変換し得る量で
あれば特に制限されないが、通常０．１〜１０Ｕ／mlと
なるような量が好ましい。
【００１６】ＮＡＤ又はＮＡＤＰは、補酵素であり、そ
の使用量はソルビトール脱水素酵素の量に応じて決定さ
れるが、通常０．１〜１０mMとなる量が好ましい。
の使用量はソルビトール脱水素酵素の量に応じて決定さ
れるが、通常０．１〜１０mMとなる量が好ましい。
【００１７】この反応においてキレート剤は、ソルビト
ール脱水素酵素の失活防止の目的で添加されるものであ
り、例えばＥＤＴＡ等のポリアミノカルボン酸類、クエ
ン酸等のオキシカルボン酸類、縮合リン酸類等が使用し
得るが、これらのうち、ＥＤＴＡが好ましい。キレート
剤の使用量は０．１〜５０mM程度が好ましい。
ール脱水素酵素の失活防止の目的で添加されるものであ
り、例えばＥＤＴＡ等のポリアミノカルボン酸類、クエ
ン酸等のオキシカルボン酸類、縮合リン酸類等が使用し
得るが、これらのうち、ＥＤＴＡが好ましい。キレート
剤の使用量は０．１〜５０mM程度が好ましい。
【００１８】この反応は、例えば前記除蛋白上清に上記
成分を添加し、３０〜４０℃で１０分〜１時間インキュ
ベートすることにより行われる。なお、反応に際し、適
宜水、緩衝液を添加して反応液を希釈することもでき
る。
成分を添加し、３０〜４０℃で１０分〜１時間インキュ
ベートすることにより行われる。なお、反応に際し、適
宜水、緩衝液を添加して反応液を希釈することもでき
る。
【００１９】反応終了後、生成したＮＡＤＨ又はＮＡＤ
ＰＨの量を測定するには、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨの特
異吸収（３４０nm）を測定する方法、３４０〜３７０nm
の励起波長により発生する４５０〜４６０nmの蛍光を測
定する方法が挙げられるが、蛍光測定法がより好まし
い。また、生成したＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨを定量する
ための他の方法としては、フェナジンメトサルフェート
・スーパーオキサイドディスムターゼ系により過酸化水
素を生成せしめ、当該過酸化水素を、ペルオキシダーゼ
とｏ−ジアニシジン系、フェノール誘導体−４−アミノ
アンチピリン縮合系、アニリン誘導体−４−アミノアン
チピリン縮合系、アニリン誘導体−３−メチル−２−ベ
ンゾチアゾリノンヒドラゾン系等の色素との反応系に導
き、比色定量する方法；当該過酸化水素にペルオキシダ
ーゼと蛍光基質を作用させて生成する蛍光物質量を測定
する方法等を利用することもできる。
ＰＨの量を測定するには、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨの特
異吸収（３４０nm）を測定する方法、３４０〜３７０nm
の励起波長により発生する４５０〜４６０nmの蛍光を測
定する方法が挙げられるが、蛍光測定法がより好まし
い。また、生成したＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨを定量する
ための他の方法としては、フェナジンメトサルフェート
・スーパーオキサイドディスムターゼ系により過酸化水
素を生成せしめ、当該過酸化水素を、ペルオキシダーゼ
とｏ−ジアニシジン系、フェノール誘導体−４−アミノ
アンチピリン縮合系、アニリン誘導体−４−アミノアン
チピリン縮合系、アニリン誘導体−３−メチル−２−ベ
ンゾチアゾリノンヒドラゾン系等の色素との反応系に導
き、比色定量する方法；当該過酸化水素にペルオキシダ
ーゼと蛍光基質を作用させて生成する蛍光物質量を測定
する方法等を利用することもできる。
【００２０】
【発明の効果】本発明の定量法によれば糖尿病合併症の
診断及びその治療・予防管理をするうえで極めて重要な
全血中のソルビトール濃度が、簡便な操作で高精度で定
量可能となった。
診断及びその治療・予防管理をするうえで極めて重要な
全血中のソルビトール濃度が、簡便な操作で高精度で定
量可能となった。
【００２１】
【実施例】次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明する
が、本発明はこれら実施例に何ら限定されるものではな
い。
が、本発明はこれら実施例に何ら限定されるものではな
い。
【００２２】実施例１ 新鮮全血１mlに室温下で水５．０mlに加を、更に８．４
２４ｇ／dl硫酸亜鉛水溶液１ml及び０．４７５Ｎ水酸化
ナトリウム水溶液１．０mlを加え、よく混和し、４００
０rpm １０分間遠心分離した。得られた上清は無色透明
であった。当該上清２．０mlに２００μM ソルビトール
水溶液０．２ml、０．１Ｍ ＥＤＴＡ水溶液０〜０．２
ml、０．３３Ｍトリス緩衝液（pH６．２）０．５ml、２
５０mg／dl ＮＡＤ水溶液（オリエンタル酵母社製）
１．０ml、４０Ｕ／mlソルビトール脱水素酵素水溶液
（ベーリンガ社製）０．０５ml及び水（全量を４．０ml
にする量）を加え、３７℃で３０分間インキュベートし
た。反応終了後励起波長３６６nm、蛍光波長４５２nmで
蛍光を測定した。その結果、表１に示すようにＥＤＴＡ
を添加しない場合は蛍光がほとんど発生しないのに対
し、ＥＤＴＡを添加すると強い蛍光が発生し、ＥＤＴＡ
の添加により酵素反応の阻害が除去されていることがわ
かる。
２４ｇ／dl硫酸亜鉛水溶液１ml及び０．４７５Ｎ水酸化
ナトリウム水溶液１．０mlを加え、よく混和し、４００
０rpm １０分間遠心分離した。得られた上清は無色透明
であった。当該上清２．０mlに２００μM ソルビトール
水溶液０．２ml、０．１Ｍ ＥＤＴＡ水溶液０〜０．２
ml、０．３３Ｍトリス緩衝液（pH６．２）０．５ml、２
５０mg／dl ＮＡＤ水溶液（オリエンタル酵母社製）
１．０ml、４０Ｕ／mlソルビトール脱水素酵素水溶液
（ベーリンガ社製）０．０５ml及び水（全量を４．０ml
にする量）を加え、３７℃で３０分間インキュベートし
た。反応終了後励起波長３６６nm、蛍光波長４５２nmで
蛍光を測定した。その結果、表１に示すようにＥＤＴＡ
を添加しない場合は蛍光がほとんど発生しないのに対
し、ＥＤＴＡを添加すると強い蛍光が発生し、ＥＤＴＡ
の添加により酵素反応の阻害が除去されていることがわ
かる。
【００２３】
【表１】
【００２４】実施例２ 新鮮全血１．０mlに室温下、２００μM ソルビトール０
〜０．３ml、８．４２４ｇ／dl硫酸亜鉛水溶液１．０m
l、０．４７５Ｎ水酸化ナトリウム１．０ml及び水（全
量を７mlとする量）を加え、よく混和し、４０００rpm
１０分間遠心分離し、上清を分取した。得られた上清は
無色透明であった。この上清に０．３３Ｍトリス緩衝液
（pH６．２）、０．５ml、２５０mg／dl ＮＡＤ水溶液
１．０ml、０．１Ｍ ＥＤＴＡ水溶液０．１ml及び４０
Ｕ／mlソルビトール脱水素酵素水溶液０．０５mlを加
え、３７℃、３０分間インキュベートした。その後、励
起波長３６６nm、蛍光波長４５２nmの蛍光を測定した。
また、全血１．０mlの代わりに０．９％食塩水を用いる
以外は上記と同様に反応させて蛍光を測定した。これら
の結果を図１に併せて示す。図１より、本発明の定量法
によれば生理食塩水中のソルビトールを測定した場合と
ほぼ同様の検量線が得られた。このことより、本発明定
量法による除蛋白操作では、ソルビトールはほとんど消
失せず、本発明定量法の精度が極めて高いことがわか
る。
〜０．３ml、８．４２４ｇ／dl硫酸亜鉛水溶液１．０m
l、０．４７５Ｎ水酸化ナトリウム１．０ml及び水（全
量を７mlとする量）を加え、よく混和し、４０００rpm
１０分間遠心分離し、上清を分取した。得られた上清は
無色透明であった。この上清に０．３３Ｍトリス緩衝液
（pH６．２）、０．５ml、２５０mg／dl ＮＡＤ水溶液
１．０ml、０．１Ｍ ＥＤＴＡ水溶液０．１ml及び４０
Ｕ／mlソルビトール脱水素酵素水溶液０．０５mlを加
え、３７℃、３０分間インキュベートした。その後、励
起波長３６６nm、蛍光波長４５２nmの蛍光を測定した。
また、全血１．０mlの代わりに０．９％食塩水を用いる
以外は上記と同様に反応させて蛍光を測定した。これら
の結果を図１に併せて示す。図１より、本発明の定量法
によれば生理食塩水中のソルビトールを測定した場合と
ほぼ同様の検量線が得られた。このことより、本発明定
量法による除蛋白操作では、ソルビトールはほとんど消
失せず、本発明定量法の精度が極めて高いことがわか
る。
【図１】実施例２における試料中のソルビトール量と蛍
光との関係を示す図である。
光との関係を示す図である。
Claims (2)
- 【請求項１】 全血に水溶性亜鉛塩及びアルカリ金属水
酸化物を加えて生成した沈澱物を除去し、得られた上清
にソルビトール脱水素酵素、キレート剤及びニコチンア
ミドアデニンジヌクレオチド又はニコチンアミドアデニ
ンジヌクレオチドホスフェートを反応させ、生成する還
元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド又は還元型
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェートの
量を測定することを特徴とする全血中のソルビトールの
定量法。 - 【請求項２】 水溶性亜鉛塩、アルカリ金属水酸化物、
ソルビトール脱水素酵素、キレート剤及びニコチンアミ
ドジヌクレオチド又はニコチンアミドジヌクレオチドホ
スフェートを含有することを特徴とする全血中のソルビ
トール定量用試薬。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP25965192A JP2747633B2 (ja) | 1992-09-29 | 1992-09-29 | 全血中のソルビトールの定量法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP25965192A JP2747633B2 (ja) | 1992-09-29 | 1992-09-29 | 全血中のソルビトールの定量法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06109726A true JPH06109726A (ja) | 1994-04-22 |
| JP2747633B2 JP2747633B2 (ja) | 1998-05-06 |
Family
ID=17337015
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP25965192A Expired - Lifetime JP2747633B2 (ja) | 1992-09-29 | 1992-09-29 | 全血中のソルビトールの定量法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2747633B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005012557A1 (ja) * | 2003-08-04 | 2005-02-10 | Sanwa Kagaku Kenkyusho Co., Ltd. | 赤血球採取方法及びソルビトール測定方法 |
-
1992
- 1992-09-29 JP JP25965192A patent/JP2747633B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005012557A1 (ja) * | 2003-08-04 | 2005-02-10 | Sanwa Kagaku Kenkyusho Co., Ltd. | 赤血球採取方法及びソルビトール測定方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2747633B2 (ja) | 1998-05-06 |
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