JPH059126A - 過酸化脂質生成抑制剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 乳酸菌をくん液培地において培養して得られ
る乳酸菌発酵産物反応物または一般培地において培養し
て得られる乳酸菌発酵産物にくん液を加えることにより
得られる乳酸菌発酵産物反応物を有効成分とする過酸化
脂質生成抑制剤。 【効果】 本発明の過酸化脂質生成抑制剤は、経口投与
により容易に摂取可能であり、生体内の酸化防御能を補
強し、動脈硬化や大腸癌等の予防に有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、過酸化脂質生成阻害活
性を有する乳酸菌発酵産物反応物を有効成分とする過酸
化脂質生成抑制剤に関する。

【０００２】

【従来の技術】生体内の脂質はフリーラジカルにより過
酸化脂質に変化することが知られている。過酸化脂質は
種々の細胞膜を侵すことから、老化や動脈硬化等の成人
病や大腸癌等の疾病の原因の一つであると言われ、脳梗
塞や心筋梗塞の遠因とされている。血中過酸化脂質濃度
を低下させる作用をもつ物質としては、化学合成された
抗酸化剤、例えばダイラゼップハイドロクロライド(Dil
azep hydrochloride)、商品名「コメリアンコ−ワ」(興
和新薬株式会社製)やプロブコ−ル(Probucol)、商品名
「シンレスタールＳ」(第一製薬株式会社製)等が報告さ
れている。また、天然抗酸化剤としては、血中脂質低下
作用を有するビタミンＢ₂、Ｃ、Ｅ配合剤等が知られて
いる。

【０００３】しかしながら、化学合成品は安全性の面で
十分な配慮が必要である。また、ビタミン配合剤は、既
に血中にある程度の濃度を保っている物質であることか
ら、効果を期待するにはかなりの服用量が必要となる。

【０００４】一方、これまでに微生物発酵産物からの生
体内酸化防御能を強化する物質の探索が試みられてお
り、in vitroにおいては、ラット肝ミクロソームに２価
鉄イオンを作用させたＮＡＤＰＨ依存性脂質過酸化系を
用いたラクトバシルス・ブフネリ(Lactobacillus buchn
eri)の凍結乾燥菌体のメタノール抽出物の過酸化脂質抑
制効果が発表されている（１９９１年度日本畜産学会大
会、演題：畜利７３）。

【０００５】現代人は、フリーラジカルの生成を促進す
る種々の因子に囲まれて生活しており、過酸化脂質レベ
ルの抑制の必要性が高まってきている。すでに過酸化脂
質生成抑制剤としては、酢酸トコフェロール等のトコフ
ェロール類、フラボン類、タンニン類等の天然抗酸化剤
が開発されているが、食用油脂及びそれらを利用した食
品における保存期間中の自動酸化による品質劣化を防止
する目的での開発に留まっている。また、くん液の酸化
防止能については、くん煙成分中のフェノール誘導体が
抗酸化成分であるとされているが（梶本、「栄養と食
糧」、第１３巻、p.246ー249）、その知見は油脂の自動
酸化防止効果に留まっており、生体内の脂質レベル改善
を指標とした有効性には言及されていないのが実状であ
る。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、乳酸
菌発酵産物反応物を有効成分とする過酸化脂質抑制剤を
提供することにある。

【０００７】さらに本発明の別の目的は、過酸化脂質抑
制剤を経口摂取物の形態にて提供することにある。

【０００８】

【問題を解決するための手段】本発明によれば、乳酸菌
をくん液培地において培養して得られる乳酸菌発酵産物
反応物を有効成分とする過酸化脂質生成抑制剤が提供さ
れる。

【０００９】また本発明によれば、乳酸菌を一般培地に
おいて培養して得られる乳酸菌発酵産物にくん液を加え
ることにより得られる乳酸菌発酵産物反応物を有効成分
とする過酸化脂質生成抑制剤が提供される。

【００１０】以下、本発明をさらに詳細に説明する。

【００１１】本発明では、乳酸菌をくん液培地において
培養するか、あるいは乳酸菌を一般培地により培養した
後、くん液を加える。

【００１２】本発明において用いる乳酸菌としては、く
ん液培地または一般培地で増殖可能な乳酸菌が挙げら
れ、ラクトバシルス・フェルメンタム（Lactobacillus
fermentum）, ラクトバシルス・ヘルベティカス（Lacto
bacillus helveticus）、ラクトバシルス・コンフュー
サス（Lactobacillus confusus）、エンテロコッカス・
フェカリス（Enterococcus faecalis）等の乳酸菌が好
ましく、特に好ましくは、ラクトバシルス・フェルメン
タム（Lactobacillus fermentum）が挙げられる。これ
らの乳酸菌は公知であり、分譲株として容易に入手する
ことができる。

【００１３】本発明において使用するくん液培地として
は、食品添加物のくん液を１〜５％含有した乳酸菌培地
が好ましく挙げられ、特に好ましくは、くん液を２％含
有したブリッグス培地、あるいはくん液を２％含有した
スキムミルク−トリプトン培地等の乳培地が挙げられ
る。前記くん液は、植物由来のくん液が好ましく、例え
ば木酢液より固形分を除去して得られるくん液を蒸留
し、粉末担体に吸着させた粉末くん液を特に好ましく挙
げることができる（特公昭４９−８８６６号公報参
照）。前記くん液培地は、調製済みの培地にくん液を所
定濃度となるよう添加することにより調製することがで
きる。

【００１４】また本発明において使用する一般培地とし
ては、前述のブリックス培地及び乳培地が好ましく挙げ
られる。

【００１５】本発明に用いる乳酸菌は後述の実施例によ
り詳細に説明するが、前記くん液培地または前記一般培
地に乳酸菌を接種し、培養温度２５℃〜４０℃、特に好
ましくは３７℃にて、培養時間１８時間〜４８時間、特
に好ましくは３０時間にて培養することができる。な
お、一般培地を用いる場合には、望ましくは前記一般培
地にて培養した乳酸菌培養液の上清にくん液を所定濃度
となるように加えて、２５〜４０℃、好ましくは、３７
℃にて、０．２〜２時間、好ましくは０．５時間反応さ
せることができる。

【００１６】本発明の過酸化脂質生成抑制剤は、上述の
ようにして培養した乳酸菌発酵産物反応物を有効成分と
する。乳酸菌発酵産物反応物としては、前記くん液培地
乳酸菌培養液の培養上清または前記一般培地乳酸菌培養
液にくん液を加えた培養上清を用いることが好ましい。
培養上清を有機溶媒で抽出し、真空蒸留した後、水また
は緩衝液を用いて再溶解させるのが特に好ましい。かよ
うにして得られる乳酸菌発酵産物反応物は低分子量成分
からなる。前記培養上清の抽出をする際に使用する有機
溶媒としては、酢酸エチル、ジエチルエーテル、ジクロ
ロメタン等が挙げられ、特に酢酸エチルが好ましい。ま
た、再溶解させる際は水または緩衝液を用いることがで
き、緩衝液としては、０．２Ｍリン酸ナトリウム緩衝液
（ｐＨ６．８）を特に好ましく用いることができる。

【００１７】さらに得られた乳酸菌発酵産物反応物は、
以下の特性を示す。すなわち、平均分子量１、０００以
下の揮発性物質であり、好ましくは酢酸エチルより高い
沸点を有する。また、−８０℃〜９０℃の温度範囲にお
いて安定な過酸化脂質生成抑制能を示し、さらにｐＨ２
〜７の中酸性域においてｐＨ安定性を示す。

【００１８】本発明の過酸化脂質生成抑制剤は、リノー
ル酸の酸化防止能及びスーパーオキシドジスムターゼ
（ＳＯＤ）活性測定系を用いたフリーラジカル消去能に
おいて濃度依存的に優れた効果を示し、また油脂の抗酸
化剤に用いられているブチルヒドロキシアニソール（Ｂ
ＨＡ）、ブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）等の合成
品に比較して細胞毒性が低く、食品の保存中における外
因性酸化防止及び生体内で起こる内因性酸化防止に共に
有用である。

【００１９】また、高コレステロール食及び過酸化脂質
摂取ラットにおいて、本発明の過酸化脂質生成抑制剤を
混合した飼料を与えることにより、血液中の過酸化脂質
量の増加が１／３程度に低下することが明らかになっ
た。さらに、本発明の過酸化脂質生成抑制剤は低分子量
成分であることから、摂取後消化液等で分解されること
がなく、熱安定性等にも優れており、食品加工上も有用
である。

【００２０】本発明の過酸化脂質生成抑制剤の有効摂取
量は、年齢、性差、健康状態等により異なるが、成人男
子の場合、約１０ｍｇ／体重１kg／１日〜約１００ｍｇ
／体重１kg／１日の範囲が好ましい。

【００２１】本発明の過酸化脂質生成抑制剤を投与する
際、そのままで投与するか、もしくは適当な無毒性の経
口供与担体、例えばデキストリンやデンプン等と共に、
経口摂取可能な組成物形態あるいは形状にて投与するこ
とがより好ましく、具体的には、固形あるいは液状の食
品ないしは嗜好品、例えば栄養ドリンク剤やコーヒー飲
料等の食品に添加した形態が好ましい。なお、経口摂取
物の製造方法は、製剤あるいは食品製造における通常の
方法を適用することができる。

【００２２】

【発明の効果】本発明の過酸化脂質生成抑制剤は、細胞
毒性を示さず、脂質の自動酸化防止作用及びフリーラジ
カル消去能に優れており、生体内抗酸化物質の減少を阻
害することにより、過酸化脂質生成抑制剤として生体内
過酸化脂質レベルの上昇抑制に有用である。

【００２３】

【実施例】以下、本発明を実施例及び試験例に基づいて
具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるもの
ではない。

【００２４】

【実施例１】過酸化脂質生成抑制剤としての乳酸菌発酵産物反応物の
調製 （１）粉末くん液の調製 日本特許公告公報昭和４９−８８６６号に基づいて、木
材を乾留して得られる木酢液を２４時間静置することに
より、３，４−ベンズピレン等の発ガン物質を主とする
カルボニル化合物と２−メトキシ−４−メチルフェノー
ル等のフェノール類を反応させて樹脂化し、次いで生成
固形分を濾別した後、発ガン物質の融点以下の温度１０
０〜１５０℃にて蒸留した。さらに留分を静置して固形
分を除去し、くん液を採取した。該くん液を蒸留してオ
イル状とした後、デキストリンに吸着させ、吸着物を粉
末とし、粉末くん液を得た。

【００２５】（２）くん液培地の調製 下記表１に示す組成を有するブリッグス培地を調製し、
該培地に２％溶液となるように前記粉末くん液を添加し
た。次いで１Ｎ水酸化ナトリウム溶液でｐＨ６．８に調
製し、ろ過滅菌して、くん液培地を調製した。

【００２６】

【表１】

【００２７】また下記表２に示す組成を有する乳培地を
１１５℃で２０分間、加圧滅菌した後、ろ過滅菌済み１
０％粉末くん液水溶液（ｐＨ６．８）を終濃度２％にな
るように加えて、乳培地を主体としたくん液培地を調製
した。

【００２８】

【表２】

【００２９】（３）乳酸菌の培養 前記くん液培地に１％寒天を加えて、くん液寒天培地と
し、該寒天培地にラクトバシルス・フェルメンタムJCM1
173（Lactobacillusfermentum）を接種し、３７℃で４
８時間培養した。次いで寒天培地中のコロニーを試験管
中の液体くん液培地に接種し、３７℃で４８時間予備培
養した後、５００ｍｌの三角フラスコに移植し、３７℃
で３０時間本培養した。

【００３０】（４）乳酸菌発酵産物反応物の調製 前記培養により得られた乳酸菌培養液を８、０００ｒｐ
ｍ、１０分間の遠心分離により上清を回収し、６Ｎ塩酸
によりｐＨを約３．０に調製した後、等量の酢酸エチル
を加えて十分撹拌し、抽出液を得た。真空蒸留器を用い
て該抽出液から酢酸エチルを除去した後、０．２Ｍリン
酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．８）に再溶解させ、次い
で１Ｎ水酸化ナトリウム溶液でｐＨ７．０に再調製し、
乳酸菌発酵産物反応物１２．０ｍｇ／ｍｌを得た。

【００３１】図１、図２及び下記表３に得られた乳酸菌
発酵産物反応物の特性データを示す。

【００３２】

【表３】

【００３３】

【実施例２】過酸化脂質生成抑制剤としてのくん液−乳酸菌発酵産物
反応物の調製 （１）粉末くん液の調製 実施例１と同様な方法で作製した。

【００３４】（２）ブリックス培地の調製 前記表１に示す組成を有するブリックス培地を調製した
後、該培地を１Ｎ水酸化ナトリウム溶液でｐＨを６．８
に調製し、次いでろ過滅菌して乳酸菌一般培地としての
ブリックス培地を調製した。

【００３５】（３）乳酸菌の培養 前記ブリックス培地に１％寒天を加え、ブリックス寒天
培地とし、該寒天培地にラクトバシルス・フェルメンタ
ム JCM1173（Lactobacillus fermentum）を接種し、３
７℃で４８時間培養した。次いで、寒天培地中のコロニ
ーを試験管の液体ブリックス培地に接種し、３７℃で４
８時間予備培養した後、５００ｍｌの三角フラスコに移
植し、３７℃で３０時間本培養した。

【００３６】（４）くん液−乳酸菌発酵産物反応物の調
製 前記乳酸菌培養で得られた培養液から遠心分離により培
養上清を回収し、１０％粉末くん液水溶液を該培養上清
に１／５容量となるよう加え、振とうしながら３７℃で
３０分間反応させた。次いで６Ｎ塩酸によりｐＨを３．
０に調製した後、等量の酢酸エチルを加えて十分撹拌
し、抽出液を得た。真空蒸留器を用いて該抽出液から酢
酸エチルを除去した後、０．２Ｍリン酸ナトリウム緩衝
液（ｐＨ６．８）で再溶解させ、次いで１Ｎ水酸化ナト
リウム溶液でｐＨを７．０に再調製し、くん液−乳酸菌
発酵産物反応物８．０ｍｇ／ｍｌを得た。

【００３７】得られた乳酸菌発酵産物反応液は、実施例
１で得た乳酸菌発酵産物反応液と同様な特性を示した。

【００３８】

【実施例３】以下、実施例１及び実施例２で得た乳酸菌
発酵産物反応物（以下本発明発酵産物反応物１と称す）
の過酸化脂質生成抑制剤としての有用性を説明する。

【００３９】１．抗酸化力の測定（リノール酸酸化防止
能） （１）試料 ａ．対照（蒸留水） ｂ．１０ｍｇ／ｍｌ くん液培地酢酸エチル抽出物（未
発酵） ｃ．１０ｍｇ／ｍｌ 本発明発酵産物反応物１ ｄ．１０ｍＭ α−トコフェロール（シグマ化学株式会
社製試薬特級） ｅ．１００ｍＭ グルタチオン（シグマ化学株式会社製
試薬特級） （２）試験方法 Osawaらの方法（Agric. Biol. Chem., 45,735, 1981）
に準じて、チシアネート法により行った。精製リノール
酸１３μｌをエタノール１ｍｌに溶解し、０．０５Ｍリ
ン酸緩衝液（ｐＨ７．０）１ｍｌ及び蒸留水０．５ｍｌ
を加えた後、試料のエタノール溶液０．２ｍｌを添加
し、恒温槽（４０±２℃）にて暗所に静置反応させた。
生成過酸化物を３０％チオシアン酸アンモニウム溶液と
２０ｍＭＦｅＣｌ2溶液を用いて経時的に発色させ、５
００ｎｍの吸光度測定（日製産業株式会社製「モデル２
００−２０」）により定量した。

【００４０】（３）試験結果 過酸化物生成抑制能を抗酸化力とし、試験結果を図３に
示す。図３より本発明発酵産物反応物１は、１０ｍＭ
α−トコフェロールよりも強い抗酸化力を示すことがわ
かる。

【００４１】２．フリーラジカル消去能 （１）試料 ａ．対照（反応用緩衝液） ｂ．くん液培地酢酸エチル抽出物（未発酵） ｃ．本発明発酵産物反応物１ ｄ．アスコルビン酸（シグマ化学株式会社製試薬特級） ｅ．グルタチオン（シグマ化学株式会社製試薬特級） なお、各試料は、反応用緩衝液（５０ｍＭリン酸カリウ
ム緩衝液、ｐＨ７．８）で各濃度に希釈して用いた。

【００４２】（２）試験方法 フリーラジカルとしてスーパーオキシド（Ｏ²-）をター
ゲットにし、スーパーオキシドの不均化（２Ｏ²-＋２Ｈ
+→Ｈ₂Ｏ₂＋Ｏ₂）を触媒するスーパーオキシドジスムタ
ーゼ（ＳＯＤ）の活性測定法を応用し、Oberleyらが開
発したニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）法により
測定した。すなわち、下記表４に示す試薬（反応用緩衝
液にて溶解したもの）を所定量添加し、その混和液０．
８ｍｌに試料０．０４ｍｌを加え、キサンチンオキシタ
ーゼ（５６０ｎｍにおける吸光度の増加が０．０１５〜
０．０２５／分となるように調製したもの）０．１ｍｌ
を添加して反応を開始させた。反応終了後、２５℃で３
分間連続記録による５６０ｎｍの吸光度測定（日本分光
株式会社製「Ｕｂｅｓｔ−３５」）によりホルマザン生
成速度を求め、対照とのホルマザン生成速度比を比活性
とし、フリーラジカル消去能の強さとした。

【００４３】

【表４】

【００４４】（３）試験結果 試験結果を図４に示す。本発明発酵産物反応物１は、顕
著なフリーラジカル消去能を示し、その強さは１０ｍＭ
アスコルビン酸（血中濃度の約２００倍）に相当し、１
００ｍＭグルタチオン（血中濃度の約５０倍）より顕著
なものであった。

【００４５】３．細胞毒性試験 （１）試料 ａ．本発明発酵産物反応物１ ｂ．ＢＨＴ（ブチルヒドロキシトルエン）（シグマ化学
株式会社製試薬特級） ｃ．ＢＨＡ（ブチルヒドロキシアニソール）（シグマ化
学株式会社製試薬特級） （２）検体 平滑筋細胞（ＳＭＣ細胞） （３）試験方法 ２４ウエルプレートに培養した平滑筋細胞（ＳＭＣ細
胞）をハンクス液（日水製薬株式会社製）で洗浄し、該
プレートにイーグルＭＥＭ培地（日水製薬株式会社製）
で各濃度に調製した試料を１ｍｌ／ウエル加え、３７
℃、５％ＣＯ₂雰囲気にてインキュベータで２４時間培
養した。培養後、前記ハンクス液で洗浄し、０．２５％
トリプシン溶液で前記培養細胞を剥して、トリパンブル
ー色素排除能により細胞生存率を算出した。

【００４６】（４）試験結果 試験結果を図５に示す。細胞の５０％致死濃度（Ｌ
Ｄ₅₀）は、ＢＨＴが０．０４％、ＢＨＡが０．００６％
であったが、本発明発酵産物反応物１はほとんど細胞毒
性を示さなかった。

【００４７】４．連続自由摂取時の血中過酸化脂質低下
作用 （１）試料 ａ．本発明発酵産物反応物１ ｂ．β−カロチン（和光純薬株式会社製試薬特級） （２）検体 ５週齢雄ＳＤラット （３）試験方法 ５週齢雄のＳＤラット（１群６匹）を馴化飼育させた
後、水及び試料０．１％を含有させたビタミンＢ₂欠乏
（０．０３ｍｇ／１００ｇ未満）の高コレステロ−ル飼
料（コレステロ−ル１％，コ−ル酸０．５％）を自由に
５週間摂取させた。その間、２日に１回は酸化コーンオ
イルを胃ゾンデにより強制経口投与（１ｍｌ／匹）し
た。対照群には、試料を含有しないビタミンＢ₂欠乏飼
料を与え、他の条件は試験群と同様に飼育した。

【００４８】血中の過酸化脂質量は、チオバルビツール
酸（ＴＢＡ）法により求めた。生理食塩水１．０ｍｌに
被検血清を５０μｌ添加し撹拌した後、３０００ｒｐｍ
で１０分間遠心分離して、上清を得、該上清０．５ｍｌ
に０．０８Ｎ硫酸４．０ｍｌを加えて混合し、１０％リ
ンタングステン酸水溶液０．５ｍｌを加えた後、室温に
て５分間放置し、再度、遠心分離した。沈澱物に０．０
８Ｎ硫酸２．０ｍｌ、１０％リンタングステン酸水溶液
０．３ｍｌを加えて懸濁し遠心分離した。沈澱物に蒸留
水４．０ｍｌを加えて懸濁させ、ＴＢＡ試薬（３．３５
ｍｇ／ｍｌ）１．０ｍｌを加えた。沸騰湯浴中で６０分
間加熱した後、流水で冷却し、ｎ−ブタノール５．０ｍ
ｌで抽出した。３、０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離
し、上層のブタノール層を得た。該ブタノール層につい
て分光けい光光度計（日製産業株式会社製「Ｆ−１３０
０」）を用いて、けい光励起波長５１５ｎｍ、けい光波
長５５３ｎｍにてけい光測定を行い、血中過酸化脂質濃
度の定量を行った。

【００４９】（４）試験結果 試験結果を下記表５に示す。対照群に比べて有意に過酸
化脂質レベルの低下がみられた。その効果は１日必要摂
取量の約５０倍のβ−カロチン投与群と同等であった。

【００５０】

【表５】

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は実施例１及び実施例２で得られた乳酸菌
発酵産物反応物の温度安定性を示すグラフである。

【図２】図２は実施例１及び実施例２で得られた乳酸菌
発酵産物反応物のｐＨ安定性を示すグラフである。

【図３】図３は実施例３で行った本発明発酵産物反応物
１の抗酸化力測定結果を示すグラフである。

【図４】図４は実施例３で行った本発明発酵産物反応物
１のフリ−ラジカル消去能測定結果を示すグラフであ
る。

【図５】図５は実施例３で行った本発明発酵産物反応物
１の細胞毒性試験結果を示すグラフである。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:225）

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 乳酸菌をくん液培地において培養して得
   られる乳酸菌発酵産物反応物を有効成分とする過酸化脂
   質生成抑制剤。
2. 【請求項２】 乳酸菌を一般培地において培養して得ら
   れる乳酸菌発酵産物にくん液を加えることにより得られ
   る乳酸菌発酵産物反応物を有効成分とする過酸化脂質生
   成抑制剤。