JPH0584082A - 抗体遺伝子の可変部をコードするｄｎａフラグメントの単離法、キメラ抗体遺伝子の製法、キメラ抗体の取得法及び医薬の製法 - Google Patents
抗体遺伝子の可変部をコードするｄｎａフラグメントの単離法、キメラ抗体遺伝子の製法、キメラ抗体の取得法及び医薬の製法Info
- Publication number
- JPH0584082A JPH0584082A JP3270665A JP27066591A JPH0584082A JP H0584082 A JPH0584082 A JP H0584082A JP 3270665 A JP3270665 A JP 3270665A JP 27066591 A JP27066591 A JP 27066591A JP H0584082 A JPH0584082 A JP H0584082A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- region
- antibody
- gene
- primer
- chimeric antibody
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
- C07K16/461—Igs containing Ig-regions, -domains or -residues form different species
- C07K16/462—Igs containing a variable region (Fv) from one specie and a constant region (Fc) from another
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
- C07K16/2812—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against CD4
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【目的】 抗体遺伝子の可変部をコードするＤＮＡフラ
グメントの単離法、キメラ抗体遺伝子の製法、キメラ抗
体の取得法及び医薬の製法 【構成】 （ａ）ハイブリドーマ細胞系から、所望の抗
体を分泌する染色体ＤＮＡを単離し、（ｂ）この染色体
ＤＮＡを一本鎖に変換し、抗体遺伝子の鋳型鎖の５′−
非翻訳領域からのヌクレオチド少なくとも１０個の配列
に相補性である範囲を含有するプライマー（１）及び抗
体遺伝子の非鋳型鎖のＪ−領域の３′−非翻訳領域から
のヌクレオチド少なくとも１０個の配列に相補性である
範囲を含有するプライマー（２）と一緒に恒温保持し、
（ｃ）プライマーを延長させ、（ｄ）形成された二本鎖
ＤＮＡを一本鎖に変性し、この一本鎖ＤＮＡを再度プラ
イマー（１）及び（２）と一緒にし、プライマーを延長
させる。（ｅ）工程（ｄ）の方法を場合により数回繰り
返す。
グメントの単離法、キメラ抗体遺伝子の製法、キメラ抗
体の取得法及び医薬の製法 【構成】 （ａ）ハイブリドーマ細胞系から、所望の抗
体を分泌する染色体ＤＮＡを単離し、（ｂ）この染色体
ＤＮＡを一本鎖に変換し、抗体遺伝子の鋳型鎖の５′−
非翻訳領域からのヌクレオチド少なくとも１０個の配列
に相補性である範囲を含有するプライマー（１）及び抗
体遺伝子の非鋳型鎖のＪ−領域の３′−非翻訳領域から
のヌクレオチド少なくとも１０個の配列に相補性である
範囲を含有するプライマー（２）と一緒に恒温保持し、
（ｃ）プライマーを延長させ、（ｄ）形成された二本鎖
ＤＮＡを一本鎖に変性し、この一本鎖ＤＮＡを再度プラ
イマー（１）及び（２）と一緒にし、プライマーを延長
させる。（ｅ）工程（ｄ）の方法を場合により数回繰り
返す。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、抗体遺伝子の可変部を
コードするＤＮＡフラグメントの単離法、キメラ抗体遺
伝子の製法、キメラ抗体の取得法及び医薬の製法に関す
る。
コードするＤＮＡフラグメントの単離法、キメラ抗体遺
伝子の製法、キメラ抗体の取得法及び医薬の製法に関す
る。
【０００２】
【従来の技術】キメラ抗体、即ちマウス又は他の動物種
に由来する不変部がヒト不変部により代えられている抗
体はヒトの治療に使用する際に、ヒト以外の抗体よりも
著しく低い免疫原性であり、それ故治療作用において劇
的な改良を呈する［Ａ．Ｆ．Ｌｏ Ｂｕｇｌｉｏ及びそ
の他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
８６巻，４２２０〜４２２４頁（１９８９年）］。付加
的に、治療で使用可能な抗体は規定されたエフェクター
機能［例えば補体の固定、スタフィロコックス−タンパ
ク質Ａの結合、ＡＤＣＣ（抗体依存性細胞障害）及びＣ
ＤＣ（細胞依存性細胞障害）に関する受容能］を有すべ
きである。再現可能なエフェクター機能は規定された
（ヒトの）不変部の使用により得られる。
に由来する不変部がヒト不変部により代えられている抗
体はヒトの治療に使用する際に、ヒト以外の抗体よりも
著しく低い免疫原性であり、それ故治療作用において劇
的な改良を呈する［Ａ．Ｆ．Ｌｏ Ｂｕｇｌｉｏ及びそ
の他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
８６巻，４２２０〜４２２４頁（１９８９年）］。付加
的に、治療で使用可能な抗体は規定されたエフェクター
機能［例えば補体の固定、スタフィロコックス−タンパ
ク質Ａの結合、ＡＤＣＣ（抗体依存性細胞障害）及びＣ
ＤＣ（細胞依存性細胞障害）に関する受容能］を有すべ
きである。再現可能なエフェクター機能は規定された
（ヒトの）不変部の使用により得られる。
【０００３】キメラ抗体の製造は遺伝子工学的方法［例
えばＭ．Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ及びＬ．Ｒｉｅｃｈｍａｎ
ｎ，Ｂｉｏ Ｅｓｓａｙｓ，８巻，７４〜７８頁（１９
８８年）参照］により行なうことができる。一連のハプ
テンに対するキメラ抗体は［Ｎ．Ｂｏｕｌｌｉａｎｅ及
びその他，Ｎａｔｕｒｅ，３１２巻，６４３頁（１９８
４年）；Ｍ．Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ及びその他，Ｎａｔｕ
ｒｅ，３１２巻，６０４頁（１９８４年）；Ｓ．Ｌ．Ｍ
ｏｒｒｉｓｏｎ及びその他，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１巻，６８５１頁（１９８４
年）］及び腫瘍特異的抗原に対するキメラ抗体［Ａ．
Ｙ．Ｌｉｕ及びその他，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４巻，３４３９〜３４４３頁
（１９８７年）；Ｙ．ニシムラ及びその他，Ｃａｎｃｅ
ｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４７巻，９９９〜１００５頁
（１９８７年）］は記載されている。
えばＭ．Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ及びＬ．Ｒｉｅｃｈｍａｎ
ｎ，Ｂｉｏ Ｅｓｓａｙｓ，８巻，７４〜７８頁（１９
８８年）参照］により行なうことができる。一連のハプ
テンに対するキメラ抗体は［Ｎ．Ｂｏｕｌｌｉａｎｅ及
びその他，Ｎａｔｕｒｅ，３１２巻，６４３頁（１９８
４年）；Ｍ．Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ及びその他，Ｎａｔｕ
ｒｅ，３１２巻，６０４頁（１９８４年）；Ｓ．Ｌ．Ｍ
ｏｒｒｉｓｏｎ及びその他，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１巻，６８５１頁（１９８４
年）］及び腫瘍特異的抗原に対するキメラ抗体［Ａ．
Ｙ．Ｌｉｕ及びその他，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４巻，３４３９〜３４４３頁
（１９８７年）；Ｙ．ニシムラ及びその他，Ｃａｎｃｅ
ｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４７巻，９９９〜１００５頁
（１９８７年）］は記載されている。
【０００４】抗体のキメラ化に当り、初めに相応する抗
体の軽鎖及び重鎖の遺伝子を相当するハイブリドーマ系
から単離することが公知である［Ｓ．Ｌ．Ｓｈｉｎ及び
Ｓ．Ｌ．Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅ
ｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１７８巻，４５９〜４７６頁（１
９８９年）］。そのためにファージ中のゲノムライブラ
リーを使って、相応するＤＮＡフラグメントとのハイブ
リッド化により所望の遺伝子を確定する。この方法は著
しく膨大な作業である。それというのも、１個のマウス
染色体当り１個のコピー中にしか存在しない遺伝子を単
離するのに約１０6のプラークを調査しなければならな
い［Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ及
びＪ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏ
ｎｉｎｇ．Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａ
ｌ．，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ニューヨ
ーク在（１９８２年）］からである。
体の軽鎖及び重鎖の遺伝子を相当するハイブリドーマ系
から単離することが公知である［Ｓ．Ｌ．Ｓｈｉｎ及び
Ｓ．Ｌ．Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅ
ｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１７８巻，４５９〜４７６頁（１
９８９年）］。そのためにファージ中のゲノムライブラ
リーを使って、相応するＤＮＡフラグメントとのハイブ
リッド化により所望の遺伝子を確定する。この方法は著
しく膨大な作業である。それというのも、１個のマウス
染色体当り１個のコピー中にしか存在しない遺伝子を単
離するのに約１０6のプラークを調査しなければならな
い［Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ及
びＪ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏ
ｎｉｎｇ．Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａ
ｌ．，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ニューヨ
ーク在（１９８２年）］からである。
【０００５】更に、正と同定されたファージの一部にだ
け免疫グロブリン遺伝子が生産的な転位の形で存在する
ので、引続いて更に経費のかかる特性の確定を行なわな
ければならない。
け免疫グロブリン遺伝子が生産的な転位の形で存在する
ので、引続いて更に経費のかかる特性の確定を行なわな
ければならない。
【０００６】他の方法がヨーロッパ特許公開第０３７８
１７５号明細書に記載されている。それによるとそれぞ
れのハイブリドーマ系のｍＲＮＡから軽鎖及び重鎖のｃ
ＤＮＡを単離しかつコード領域を突然変異誘発後に相応
するベクター中に挿入する。この方法の欠点は、初めに
ｃＤＮＡクローンを単離しなければならないことであ
る。そのためにｃＤＮＡライブラリーを使って、これを
所望のクローンを単離するために相応するハイブリッド
化プローブで調査しなければならない。この方法は、ハ
イブリドーマ系中の軽鎖及び重鎖のメッセンジャーＲＮ
ＡがｍＲＮＡの５％までの過剰量で存在するのでゲノム
ライブラリーのスクリーニングよりも簡単であるが、相
応するクローンの単離は時間的ロスである。引続いて行
なう配列決定及びとりわけ正しい解読枠で所定の発現ベ
クター中に適合させるための単離体の突然変異も同様に
著しい作業的ロスでありかつ時間的ロスである。
１７５号明細書に記載されている。それによるとそれぞ
れのハイブリドーマ系のｍＲＮＡから軽鎖及び重鎖のｃ
ＤＮＡを単離しかつコード領域を突然変異誘発後に相応
するベクター中に挿入する。この方法の欠点は、初めに
ｃＤＮＡクローンを単離しなければならないことであ
る。そのためにｃＤＮＡライブラリーを使って、これを
所望のクローンを単離するために相応するハイブリッド
化プローブで調査しなければならない。この方法は、ハ
イブリドーマ系中の軽鎖及び重鎖のメッセンジャーＲＮ
ＡがｍＲＮＡの５％までの過剰量で存在するのでゲノム
ライブラリーのスクリーニングよりも簡単であるが、相
応するクローンの単離は時間的ロスである。引続いて行
なう配列決定及びとりわけ正しい解読枠で所定の発現ベ
クター中に適合させるための単離体の突然変異も同様に
著しい作業的ロスでありかつ時間的ロスである。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】それ故、本発明の課題
は、所望のキメラ抗体を著しく簡単に製造できるよう
に、技術水準の欠点が少なくとも一部除去されている方
法を開示することである。特に、ゲノム−又はｃＤＮＡ
ライブラリーのスクリーニングがもはや不要であるよう
にすべきである。
は、所望のキメラ抗体を著しく簡単に製造できるよう
に、技術水準の欠点が少なくとも一部除去されている方
法を開示することである。特に、ゲノム−又はｃＤＮＡ
ライブラリーのスクリーニングがもはや不要であるよう
にすべきである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】抗体をキメラ化するため
の第一工程、即ち非ヒト不変部（重鎖及び軽鎖）を他の
ヒト不変部により代える工程は、所望の可変部をコード
するＤＮＡフラグメントを単離することである。従っ
て、本発明の目的は、抗体遺伝子の可変部をコードする
ＤＮＡフラグメントを単離する方法であり、これは
（ａ）ハイブリドーマ細胞系から、所望の抗体を分泌す
る染色体ＤＮＡを単離し、（ｂ）この染色体ＤＮＡを一
本鎖に変換し、かつこの一本鎖ＤＮＡを２つのオリゴヌ
クレオチドプライマー（１）及び（２）と恒温保持し、
その際にプライマー（１）は、抗体遺伝子の鋳型鎖の
５′−非翻訳領域からのヌクレオチド少なくとも１０個
の配列に相補性である範囲を含有しかつプライマー
（２）は、抗体遺伝子の非鋳型鎖のその都度のＪ−領域
の３′−非翻訳領域からのヌクレオチド少なくとも１０
個の配列に相補性である範囲を含有し、（ｃ）ＤＮＡポ
リメラーゼ及びデオキシリボヌクレオシドトリホスフェ
ートを添加してプライマーを延長させ、その際にプライ
マーの間に存在する抗体遺伝子の部分範囲で二本鎖ＤＮ
Ａフラグメントが形成され、（ｄ）このように形成され
た二本鎖ＤＮＡを一本鎖に変性し、この一本鎖ＤＮＡを
再度２つのオリゴヌクレオチドプライマー（１）及び
（２）と一緒にし、プライマーを延長させて、二本鎖Ｄ
ＮＡを生成し、かつ（ｅ）工程（ｄ）の方法を場合によ
り数回繰り返すことを特徴とする。
の第一工程、即ち非ヒト不変部（重鎖及び軽鎖）を他の
ヒト不変部により代える工程は、所望の可変部をコード
するＤＮＡフラグメントを単離することである。従っ
て、本発明の目的は、抗体遺伝子の可変部をコードする
ＤＮＡフラグメントを単離する方法であり、これは
（ａ）ハイブリドーマ細胞系から、所望の抗体を分泌す
る染色体ＤＮＡを単離し、（ｂ）この染色体ＤＮＡを一
本鎖に変換し、かつこの一本鎖ＤＮＡを２つのオリゴヌ
クレオチドプライマー（１）及び（２）と恒温保持し、
その際にプライマー（１）は、抗体遺伝子の鋳型鎖の
５′−非翻訳領域からのヌクレオチド少なくとも１０個
の配列に相補性である範囲を含有しかつプライマー
（２）は、抗体遺伝子の非鋳型鎖のその都度のＪ−領域
の３′−非翻訳領域からのヌクレオチド少なくとも１０
個の配列に相補性である範囲を含有し、（ｃ）ＤＮＡポ
リメラーゼ及びデオキシリボヌクレオシドトリホスフェ
ートを添加してプライマーを延長させ、その際にプライ
マーの間に存在する抗体遺伝子の部分範囲で二本鎖ＤＮ
Ａフラグメントが形成され、（ｄ）このように形成され
た二本鎖ＤＮＡを一本鎖に変性し、この一本鎖ＤＮＡを
再度２つのオリゴヌクレオチドプライマー（１）及び
（２）と一緒にし、プライマーを延長させて、二本鎖Ｄ
ＮＡを生成し、かつ（ｅ）工程（ｄ）の方法を場合によ
り数回繰り返すことを特徴とする。
【０００９】抗体は少なくとも２種のポリペプチド鎖、
重い（Ｈ）鎖と軽い（Ｌ）鎖より構成されている。それ
ぞれのこれらの鎖は不変部と可変部より成り、その際に
抗体の可変部が抗体の抗原特異性を決定する。抗体のキ
メラ化とは、非ヒト不変部を他の、殊にヒト不変部によ
り代えることを表わす。本発明により、抗体の特定の鎖
の可変部をコードするＤＮＡフラグメントを簡単に単離
することができる。このＤＮＡフラグメントはキメラ抗
体のその鎖の発現に使用することができる。このため
に、Ｈ鎖並びにＬ鎖の可変部を単離する必要がある。
重い（Ｈ）鎖と軽い（Ｌ）鎖より構成されている。それ
ぞれのこれらの鎖は不変部と可変部より成り、その際に
抗体の可変部が抗体の抗原特異性を決定する。抗体のキ
メラ化とは、非ヒト不変部を他の、殊にヒト不変部によ
り代えることを表わす。本発明により、抗体の特定の鎖
の可変部をコードするＤＮＡフラグメントを簡単に単離
することができる。このＤＮＡフラグメントはキメラ抗
体のその鎖の発現に使用することができる。このため
に、Ｈ鎖並びにＬ鎖の可変部を単離する必要がある。
【００１０】Ｌ鎖の可変部をコードしかつ本発明方法に
より単離されるＤＮＡフラグメントは図１のａより明ら
かな、プライマー（１）及び（２）の間の範囲を含有す
る。このＤＮＡフラグメントは抗体遺伝子の次の範囲を
含有する：プライマー（１）に相補性である５′−非翻
訳領域の一部、イントロンにより分断されているシグナ
ル配列、可変（Ｖ）部及びその都度の遺伝子に使われる
結合（Ｊ）領域。フラグメントの３′末端にはＪ領域の
非翻訳領域がプライマー（２）に相補性の配列と接続し
ている。図１のａからは本発明方法によりプライマー
（１）及び（２）で増幅後に得られたＤＮＡフラグメン
トが明らかである。
より単離されるＤＮＡフラグメントは図１のａより明ら
かな、プライマー（１）及び（２）の間の範囲を含有す
る。このＤＮＡフラグメントは抗体遺伝子の次の範囲を
含有する：プライマー（１）に相補性である５′−非翻
訳領域の一部、イントロンにより分断されているシグナ
ル配列、可変（Ｖ）部及びその都度の遺伝子に使われる
結合（Ｊ）領域。フラグメントの３′末端にはＪ領域の
非翻訳領域がプライマー（２）に相補性の配列と接続し
ている。図１のａからは本発明方法によりプライマー
（１）及び（２）で増幅後に得られたＤＮＡフラグメン
トが明らかである。
【００１１】Ｈ鎖の可変部をコードするＤＮＡフラグメ
ントも基本的には同一の機能要素を含有するが、Ｈ鎖の
可変部はＶ領域とＪ領域との間で更に多様（Ｄ）領域
（Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ−Ｒｅｇｉｏｎ）を含有する点で
異なっている。この場合にも図１のｂから、プライマー
（１）と（２）との間に存在するＤＮＡフラグメントが
本発明方法によりプライマー（１）及び（２）で増幅後
に得られることが明らかである。
ントも基本的には同一の機能要素を含有するが、Ｈ鎖の
可変部はＶ領域とＪ領域との間で更に多様（Ｄ）領域
（Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ−Ｒｅｇｉｏｎ）を含有する点で
異なっている。この場合にも図１のｂから、プライマー
（１）と（２）との間に存在するＤＮＡフラグメントが
本発明方法によりプライマー（１）及び（２）で増幅後
に得られることが明らかである。
【００１２】本発明方法を実施するための前提は好適な
プライマー（１）及び（２）の合成である。そのため
に、キメラ化すべき抗体の軽鎖及び重鎖のＤＮＡ配列に
ついて特定の認識が必要であり、即ちプライマー（１）
及び（２）に対して相補性である配列を抗体遺伝子上で
５′−非翻訳領域もしくは使用するＪ領域の非翻訳領域
で認識しなければならない。この情報は直接的又は間接
的に抗体遺伝子のｍＲＮＡ又はｍＲＮＡから製造したｃ
ＤＮＡの配列決定により得られ、その詳細は後に記載さ
れている。
プライマー（１）及び（２）の合成である。そのため
に、キメラ化すべき抗体の軽鎖及び重鎖のＤＮＡ配列に
ついて特定の認識が必要であり、即ちプライマー（１）
及び（２）に対して相補性である配列を抗体遺伝子上で
５′−非翻訳領域もしくは使用するＪ領域の非翻訳領域
で認識しなければならない。この情報は直接的又は間接
的に抗体遺伝子のｍＲＮＡ又はｍＲＮＡから製造したｃ
ＤＮＡの配列決定により得られ、その詳細は後に記載さ
れている。
【００１３】プライマー（１）及び（２）は抗体の染色
体ＤＮＡに相補性のヌクレオチド少なくとも１０個の範
囲を含有する。この範囲が、一本鎖ＤＮＡに対する良好
なハイブリッド化を惹起するためにヌクレオチド１０〜
５０個であると有利である。プライマー（１）は抗体遺
伝子の５′非翻訳範囲からの配列を含有し、その際にこ
の範囲での正確な局在化は任意である。プライマー
（１）は、３′−方向で５′−非翻訳領域に接続してい
るシグナル配列からのヌクレオチドを一部含有していて
もよい。しかしながらプライマー（１）が抗体遺伝子の
転写開始部位の５′−側に存在しないと有利である。
体ＤＮＡに相補性のヌクレオチド少なくとも１０個の範
囲を含有する。この範囲が、一本鎖ＤＮＡに対する良好
なハイブリッド化を惹起するためにヌクレオチド１０〜
５０個であると有利である。プライマー（１）は抗体遺
伝子の５′非翻訳範囲からの配列を含有し、その際にこ
の範囲での正確な局在化は任意である。プライマー
（１）は、３′−方向で５′−非翻訳領域に接続してい
るシグナル配列からのヌクレオチドを一部含有していて
もよい。しかしながらプライマー（１）が抗体遺伝子の
転写開始部位の５′−側に存在しないと有利である。
【００１４】プライマー（２）は抗体遺伝子のＪ領域
３′−非翻訳領域からの配列、即ちその都度の抗体遺伝
子中で翻訳されたＪ領域の３′−側の配列を含有する。
例えば抗体遺伝子中でＪ2領域を使用する場合、プライ
マー（２）はＪ2，Ｊ3，Ｊ4又はＪ5の範囲からの配列を
含有していてよく、その際にこの範囲でのプライマー
（２）の正確な局在化は任意である。優れた実施形では
プライマー（２）はその都度のＪ領域のイントロンに接
続している配列の配列部分を含有する。
３′−非翻訳領域からの配列、即ちその都度の抗体遺伝
子中で翻訳されたＪ領域の３′−側の配列を含有する。
例えば抗体遺伝子中でＪ2領域を使用する場合、プライ
マー（２）はＪ2，Ｊ3，Ｊ4又はＪ5の範囲からの配列を
含有していてよく、その際にこの範囲でのプライマー
（２）の正確な局在化は任意である。優れた実施形では
プライマー（２）はその都度のＪ領域のイントロンに接
続している配列の配列部分を含有する。
【００１５】両方のプライマーの配向により、本発明方
法の工程（ｃ）でプライマーの延長が相互の方向で行な
われ、それ故２本鎖範囲が抗体遺伝子の可変部を包含す
るＤＮＡフラグメントが生成する。本発明によりこのフ
ラグメントはＰＣＲ反応により数多くのサイクルで、殊
に１０〜３０サイクルで増幅する。本発明方法の最終生
成物として、末端にプライマー（１）及び（２）が存在
するＤＮＡフラグメントが得られる。
法の工程（ｃ）でプライマーの延長が相互の方向で行な
われ、それ故２本鎖範囲が抗体遺伝子の可変部を包含す
るＤＮＡフラグメントが生成する。本発明によりこのフ
ラグメントはＰＣＲ反応により数多くのサイクルで、殊
に１０〜３０サイクルで増幅する。本発明方法の最終生
成物として、末端にプライマー（１）及び（２）が存在
するＤＮＡフラグメントが得られる。
【００１６】プライマー（１）及び（２）が抗体遺伝子
に対して相補性である範囲の５′−側に、勿論抗体遺伝
子に対して相補性であってはならない制限エンドヌクレ
アーゼ切断部位を含有すると有利である。プライマー
（１）及び（２）がヌクレオチド６〜８個の認識配列を
有する、制限エンドヌクレアーゼ用の切断部位を含有す
ると有利であり、特に認識部位がまれに真核生物ＤＮＡ
上に存在する（例えばＳａｌＩ，ＮｏｔＩ）ような酵素
が優れている。その制限エンドヌクレアーゼ切断部位が
プライマー（１）及び（２）と異なっていると特に優れ
ている。相補性配列と制限エンドヌクレアーゼの認識配
列との間でプライマーは任意の配列（ヌクレオチド１〜
３０個）を含有してよい。
に対して相補性である範囲の５′−側に、勿論抗体遺伝
子に対して相補性であってはならない制限エンドヌクレ
アーゼ切断部位を含有すると有利である。プライマー
（１）及び（２）がヌクレオチド６〜８個の認識配列を
有する、制限エンドヌクレアーゼ用の切断部位を含有す
ると有利であり、特に認識部位がまれに真核生物ＤＮＡ
上に存在する（例えばＳａｌＩ，ＮｏｔＩ）ような酵素
が優れている。その制限エンドヌクレアーゼ切断部位が
プライマー（１）及び（２）と異なっていると特に優れ
ている。相補性配列と制限エンドヌクレアーゼの認識配
列との間でプライマーは任意の配列（ヌクレオチド１〜
３０個）を含有してよい。
【００１７】更に、プライマー（１）及び（２）が制限
エンドヌクレアーゼ切断部位の５′−側で、ＤＮＡフラ
グメントの単離後にプライマー（１）及び（２）の切断
部位で制限エンドヌクレアーゼにより２つの切断ができ
るように少なくとも２個のヌクレオチドの突出部を含有
すると有利である。このようにして本発明により単離し
たＤＮＡフラグメントを簡単にベクター中にクローン化
することができる。
エンドヌクレアーゼ切断部位の５′−側で、ＤＮＡフラ
グメントの単離後にプライマー（１）及び（２）の切断
部位で制限エンドヌクレアーゼにより２つの切断ができ
るように少なくとも２個のヌクレオチドの突出部を含有
すると有利である。このようにして本発明により単離し
たＤＮＡフラグメントを簡単にベクター中にクローン化
することができる。
【００１８】本発明方法を実施する際にプライマーの延
長は当業者に公知のＰＣＲ反応（ヨーロッパ特許公開第
０２０１１８４号明細書）により行なう。その際にＤＮ
Ａポリメラーゼとして殊にＴａｑ−ポリメラーゼを使用
しかつ各サイクル後に二本鎖ＤＮＡを加熱により変性す
る。
長は当業者に公知のＰＣＲ反応（ヨーロッパ特許公開第
０２０１１８４号明細書）により行なう。その際にＤＮ
Ａポリメラーゼとして殊にＴａｑ−ポリメラーゼを使用
しかつ各サイクル後に二本鎖ＤＮＡを加熱により変性す
る。
【００１９】本発明方法の前提は始めにキメラ化すべき
抗体遺伝子の配列情報の確定である。この情報がなけれ
ばプライマー（１）及び（２）の構成は可能ではない。
抗体遺伝子の配列情報の確定である。この情報がなけれ
ばプライマー（１）及び（２）の構成は可能ではない。
【００２０】本発明方法にとってはその配列が明らかで
なければならない抗体遺伝子の部分範囲の配列決定は次
の方法により行なう：メッセンジャーＲＮＡの５′−非
翻訳配列が軽鎖及び重鎖を特定しかついずれのＪ領域が
軽鎖もしくは重鎖に使うかを確定するキメラ化すべき抗
体のハイブリドーマ細胞系からｍＲＮＡを単離しかつ不
変部の５′−末端に相補性であるプライマーを逆転写酵
素で延長する。不変部の配列は文献公知であり（下記参
照）かつそれぞれの抗体遺伝子中に存在する不変部は免
疫学的に簡単に測定することができる。
なければならない抗体遺伝子の部分範囲の配列決定は次
の方法により行なう：メッセンジャーＲＮＡの５′−非
翻訳配列が軽鎖及び重鎖を特定しかついずれのＪ領域が
軽鎖もしくは重鎖に使うかを確定するキメラ化すべき抗
体のハイブリドーマ細胞系からｍＲＮＡを単離しかつ不
変部の５′−末端に相補性であるプライマーを逆転写酵
素で延長する。不変部の配列は文献公知であり（下記参
照）かつそれぞれの抗体遺伝子中に存在する不変部は免
疫学的に簡単に測定することができる。
【００２１】生成したｃＤＮＡ一次鎖の３′−末端には
末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼにより
１０〜３０個の規定されたオリゴヌクレオチド（例えば
オリゴＧ）が重合する。２つのプライマー（３）及び
（４）［第１のプライマー（３）は殊に最初の制限エン
ドヌクレアーゼ切断部位を有するオリゴＣ；第２のプラ
イマー（４）はキメラ化すべき抗体の文献公知の不変部
の配列から、E.A. kabat、T.T.Wu、M.Reid-Miller、H.
M.Perry 及び K.S.Gr Hesman、Sequeuces of Proteins
of Immunological Interests、第４版、US Department
of Heaelth and Human Services (1987)、National Ins
titut of Health 参照］の添加により増幅反応を行な
い、増幅したｃＤＮＡをサブクローン化しかつ必要な範
囲で（５′−非翻訳領域，Ｊ領域）配列決定する。この
ようにしてプライマー（１）の配列情報が得られる。プ
ライマー（２）の配列情報は、その都度の抗体遺伝子中
の翻訳されたＪ領域を確定することにより間接的に得ら
れる。これは、関連するイントロン配列によるマウスの
軽鎖（Ｋ）のＪ領域のゲノム構成が記載されている
［Ｅ．Ｅ．Ｍａｘ及びその他，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．，２５６巻，５１１６〜５１２０頁（１９８１
年）］ので可能である。マウスの重鎖のＪ領域に関する
コード化及びイントロン配列の相当する情報は文献に記
載されている［Ｈ．サカノ及びその他，Ｎａｔｕｒｅ，
２８６巻，６７６〜６８３頁（１９８０年）］。増幅反
応の実施は文献記載のように行なう［Ｒ．Ｋ．Ｓａｉｋ
ｉ及びその他，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３０巻，１３５０頁
（１９８５年）又はヨーロッパ特許公開第０２０１１８
４号明細書参照］。 これに対する別法として、軽鎖及
び重鎖のｍＲＮＡの直接的な配列決定により配列が得ら
れる［Ｐ．Ｈ．Ｈａｍｌｙｎ．及びその他，Ｃｅｌｌ，
１５巻，１０６７〜１０７５頁（１９７８年）］。この
際にポリＡ+ＲＮＡを単離し、かつ軽鎖及び重鎖の公知
の不変部の５′−領域に対してハイブリッド化する合成
オリゴヌクレオチドを逆転写酵素で延長する。ｃＤＮＡ
の配列はサンガー及びクルソンの方法［Ｓａｎｇｅｒ及
びＣｏｕｌｓｏｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，９４巻，
４４１〜４４８頁（１９７５年）］により決定する。こ
の際に２′，３′−ジデオキシリボヌクレオチドを鎖の
切断に使用する。
末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼにより
１０〜３０個の規定されたオリゴヌクレオチド（例えば
オリゴＧ）が重合する。２つのプライマー（３）及び
（４）［第１のプライマー（３）は殊に最初の制限エン
ドヌクレアーゼ切断部位を有するオリゴＣ；第２のプラ
イマー（４）はキメラ化すべき抗体の文献公知の不変部
の配列から、E.A. kabat、T.T.Wu、M.Reid-Miller、H.
M.Perry 及び K.S.Gr Hesman、Sequeuces of Proteins
of Immunological Interests、第４版、US Department
of Heaelth and Human Services (1987)、National Ins
titut of Health 参照］の添加により増幅反応を行な
い、増幅したｃＤＮＡをサブクローン化しかつ必要な範
囲で（５′−非翻訳領域，Ｊ領域）配列決定する。この
ようにしてプライマー（１）の配列情報が得られる。プ
ライマー（２）の配列情報は、その都度の抗体遺伝子中
の翻訳されたＪ領域を確定することにより間接的に得ら
れる。これは、関連するイントロン配列によるマウスの
軽鎖（Ｋ）のＪ領域のゲノム構成が記載されている
［Ｅ．Ｅ．Ｍａｘ及びその他，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．，２５６巻，５１１６〜５１２０頁（１９８１
年）］ので可能である。マウスの重鎖のＪ領域に関する
コード化及びイントロン配列の相当する情報は文献に記
載されている［Ｈ．サカノ及びその他，Ｎａｔｕｒｅ，
２８６巻，６７６〜６８３頁（１９８０年）］。増幅反
応の実施は文献記載のように行なう［Ｒ．Ｋ．Ｓａｉｋ
ｉ及びその他，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３０巻，１３５０頁
（１９８５年）又はヨーロッパ特許公開第０２０１１８
４号明細書参照］。 これに対する別法として、軽鎖及
び重鎖のｍＲＮＡの直接的な配列決定により配列が得ら
れる［Ｐ．Ｈ．Ｈａｍｌｙｎ．及びその他，Ｃｅｌｌ，
１５巻，１０６７〜１０７５頁（１９７８年）］。この
際にポリＡ+ＲＮＡを単離し、かつ軽鎖及び重鎖の公知
の不変部の５′−領域に対してハイブリッド化する合成
オリゴヌクレオチドを逆転写酵素で延長する。ｃＤＮＡ
の配列はサンガー及びクルソンの方法［Ｓａｎｇｅｒ及
びＣｏｕｌｓｏｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，９４巻，
４４１〜４４８頁（１９７５年）］により決定する。こ
の際に２′，３′−ジデオキシリボヌクレオチドを鎖の
切断に使用する。
【００２２】本発明方法により単離した、可変性の抗体
領域の遺伝子断片は直接抗体フラグメント（Ｆａｂ，Ｆ
（ａｂ）2）の発現に使用するか又は他の遺伝子（例え
ば酵素、トキシン及び不変性の抗体領域用）に結合させ
ることができる。キメラ抗体を生成すると有利である。
ＩｇＧ１（実施例のように）以外に、その都度の不変部
の選択によりキメラ化された、アイソタイプＩｇＧ２，
ＩｇＧ３，ＩｇＧ４，ＩｇＭ，ＩｇＡ，ＩｇＤ及びＩｇ
Ｅの抗体が構成される。
領域の遺伝子断片は直接抗体フラグメント（Ｆａｂ，Ｆ
（ａｂ）2）の発現に使用するか又は他の遺伝子（例え
ば酵素、トキシン及び不変性の抗体領域用）に結合させ
ることができる。キメラ抗体を生成すると有利である。
ＩｇＧ１（実施例のように）以外に、その都度の不変部
の選択によりキメラ化された、アイソタイプＩｇＧ２，
ＩｇＧ３，ＩｇＧ４，ＩｇＭ，ＩｇＡ，ＩｇＤ及びＩｇ
Ｅの抗体が構成される。
【００２３】抗体遺伝子の可変部をコードするＤＮＡフ
ラグメントの単離が抗体のキメラ化の第一工程である。
次の工程はキメラ抗体遺伝子の製法であり、その際に本
発明方法により単離したＤＮＡフラグメントを、抗体遺
伝子の所望の不変部をコードするＤＮＡフラグメントを
含有するベクター中に導入すると、可変部と不変部とか
ら作動的結合において成るキメラ抗体遺伝子が生成す
る。その際に、ヒト不変部の遺伝子断片を含有するベク
ターを使用すると有利である。キメラ抗体のＬ鎖の遺伝
子断片を発現させようとする場合、Ｌ鎖の不変部の遺伝
子断片を含有するベクターを使用する。キメラ抗体のＨ
鎖の遺伝子断片を発現させようとする場合、Ｈ鎖の不変
部の遺伝子断片を含有するベクターを使用する。抗体遺
伝子を後で発現させるのに必要な要素、特にプロモータ
及びポリアデニル化部位を正しい局所に含有するベクタ
ーを使用すると有利である。
ラグメントの単離が抗体のキメラ化の第一工程である。
次の工程はキメラ抗体遺伝子の製法であり、その際に本
発明方法により単離したＤＮＡフラグメントを、抗体遺
伝子の所望の不変部をコードするＤＮＡフラグメントを
含有するベクター中に導入すると、可変部と不変部とか
ら作動的結合において成るキメラ抗体遺伝子が生成す
る。その際に、ヒト不変部の遺伝子断片を含有するベク
ターを使用すると有利である。キメラ抗体のＬ鎖の遺伝
子断片を発現させようとする場合、Ｌ鎖の不変部の遺伝
子断片を含有するベクターを使用する。キメラ抗体のＨ
鎖の遺伝子断片を発現させようとする場合、Ｈ鎖の不変
部の遺伝子断片を含有するベクターを使用する。抗体遺
伝子を後で発現させるのに必要な要素、特にプロモータ
及びポリアデニル化部位を正しい局所に含有するベクタ
ーを使用すると有利である。
【００２４】優れた基本ベクターはｐＳＶ２−ｎｅｏ
［Ｐ．Ｓｏｕｔｈｅｒｎ及びＰ．Ｊ．Ｂｅｒｇ，Ｍｏ
ｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．，１巻，３２７〜３４１頁
（１９８２年）］又はｐＳＶ２−Ｅｃｏ ｇｐｔ［Ｒ．
Ｃ．Ｍｕｌｌｉｇａｎ及びＰ．Ｂｅｒｇ，Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ，７８巻，２０７２
〜２０７６頁（１９８１年）］である。優れたプロモー
タは、イムノグロブリンプロモータ、シミアン・ウイル
ス（Ｓｉｍｉａｎ Ｖｉｒｕｓ）４０の初期又は後期プ
ロモータ、マウス又はヒトのサイトメガロウイルス（Ｃ
ｙｔｏ−ｍｅｇａｌｉｅ−Ｖｉｒｕｓ）プロモータもし
くはマウス又はヒトのメタロチオネイン（Ｍｅｔａｌｌ
ｏｔｈｉｏｎｅｉｎ）プロモータである。発現ベクター
が付加的にリンパ系細胞で活性であるエンハンサー、例
えばイムノグロブリン遺伝子、シミアンウイルス４０、
ポリオーマウイルス、マウス又はヒトのサイトメガロウ
イルスのそれを含有すると有利である。
［Ｐ．Ｓｏｕｔｈｅｒｎ及びＰ．Ｊ．Ｂｅｒｇ，Ｍｏ
ｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．，１巻，３２７〜３４１頁
（１９８２年）］又はｐＳＶ２−Ｅｃｏ ｇｐｔ［Ｒ．
Ｃ．Ｍｕｌｌｉｇａｎ及びＰ．Ｂｅｒｇ，Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ，７８巻，２０７２
〜２０７６頁（１９８１年）］である。優れたプロモー
タは、イムノグロブリンプロモータ、シミアン・ウイル
ス（Ｓｉｍｉａｎ Ｖｉｒｕｓ）４０の初期又は後期プ
ロモータ、マウス又はヒトのサイトメガロウイルス（Ｃ
ｙｔｏ−ｍｅｇａｌｉｅ−Ｖｉｒｕｓ）プロモータもし
くはマウス又はヒトのメタロチオネイン（Ｍｅｔａｌｌ
ｏｔｈｉｏｎｅｉｎ）プロモータである。発現ベクター
が付加的にリンパ系細胞で活性であるエンハンサー、例
えばイムノグロブリン遺伝子、シミアンウイルス４０、
ポリオーマウイルス、マウス又はヒトのサイトメガロウ
イルスのそれを含有すると有利である。
【００２５】特に優れた基本ベクターは図２及び３に示
されているベクターｐＵＨＷＫ（ヒトのＬ鎖不変Ｋ領域
を含有する）もしくはｐＵＨＷγ１（ヒト不変部を含有
する）である。
されているベクターｐＵＨＷＫ（ヒトのＬ鎖不変Ｋ領域
を含有する）もしくはｐＵＨＷγ１（ヒト不変部を含有
する）である。
【００２６】細胞系１５−１／Ｐ３／１４（ＥＣＡＣＣ
９００９０７０５）から分泌される、ＣＤ４−抗原に
対する抗体のＬ鎖の可変部をクローン化する際にベクタ
ーｐＵＨＷ−ＣＤ４Ｋ（ＤＳＭ６１５６）が得られる。
細胞系１５−１／Ｐ３／１４（ＥＣＡＣＣ ９００９０
７０５）から分泌される、ＣＤ４−抗原に対する抗体の
Ｈ鎖の可変部をクローン化する際にベクターｐＵＨＷ−
ＣＤ４γ１（ＤＳＭ６１５５）が得られる。
９００９０７０５）から分泌される、ＣＤ４−抗原に
対する抗体のＬ鎖の可変部をクローン化する際にベクタ
ーｐＵＨＷ−ＣＤ４Ｋ（ＤＳＭ６１５６）が得られる。
細胞系１５−１／Ｐ３／１４（ＥＣＡＣＣ ９００９０
７０５）から分泌される、ＣＤ４−抗原に対する抗体の
Ｈ鎖の可変部をクローン化する際にベクターｐＵＨＷ−
ＣＤ４γ１（ＤＳＭ６１５５）が得られる。
【００２７】本発明方法により抗体の可変部をコードす
るＤＮＡフラグメントを取得することのできる抗体産生
細胞系の他の例は細胞系３．１０−１／５Ｂ１０（ＥＣ
ＡＣＣ ９００９０７０２）である。この細胞系から分
泌される抗体はＣＤ４−抗原上の他の抗原決定基を認識
する。
るＤＮＡフラグメントを取得することのできる抗体産生
細胞系の他の例は細胞系３．１０−１／５Ｂ１０（ＥＣ
ＡＣＣ ９００９０７０２）である。この細胞系から分
泌される抗体はＣＤ４−抗原上の他の抗原決定基を認識
する。
【００２８】しかしながら、本発明方法により単離され
かつ任意の抗体に由来する可変部を同様にして好適な基
本ベクター中にクローン化することができる。
かつ任意の抗体に由来する可変部を同様にして好適な基
本ベクター中にクローン化することができる。
【００２９】本発明方法により、シグナル配列のイント
ロン及びＪ−配列のイントロンの部分範囲を共に含有す
る、抗体の軽鎖及び重鎖のゲノムフラグメントを簡単に
単離することができる。このゲノムフラグメントを含有
するベクターを用いると、キメラ抗体のｃＤＮＡだけが
発現に使われてもキメラ抗体の著しく高い収率が達成さ
れる。
ロン及びＪ−配列のイントロンの部分範囲を共に含有す
る、抗体の軽鎖及び重鎖のゲノムフラグメントを簡単に
単離することができる。このゲノムフラグメントを含有
するベクターを用いると、キメラ抗体のｃＤＮＡだけが
発現に使われてもキメラ抗体の著しく高い収率が達成さ
れる。
【００３０】同様に、本発明方法はヒトハイブリドーマ
細胞系でアイソタイプスウィッチングの実施に適用する
ことができる。その際にほとんどすべての生成クローン
の抗体はアイソタイプＩｇＭのものである。しかしこの
アイソタイプは決定的なエフェクター機能、例えばＡＤ
ＣＣ（抗体依存性細胞障害）を欠損しかつペンタマーの
ＩｇＭ分子は多量体化及び凝集の傾向を有するので、本
発明によるアイソタイプスウィッチ（抗体の不変鎖の一
定の変化）の実施は、それぞれのアイソタイプの結合特
性及びエフェクター機能を評価するのに有利である。細
胞生物学的方法［Ｐ．Ｒｏｔｈｍａｎ及びその他，Ｍｏ
ｌ，Ｃｅｌｌ，Ｂｉｏｌ．，１０巻，１６７２〜１６７
９頁（１９９０年）］でインタロイキン４、リポ多糖
（ＬＰＳ）又はＬＰＳとインタロイキン４との組合せに
よりアイソタイプスウィッチを実施するための公知方法
は著しく低い所望結果の繁度のためにあまり効果的では
ない。ヒトイムノグロブリン遺伝子の軽鎖及び重鎖のＪ
領域の配列は公知であるので［Ｐ．Ａ．Ｈｉｅｔｅｒ，
Ｊ．ｖ．Ｍａｉｚｅｌ Ｊｒ．，Ｐ．Ｌｅｄｅｒ，Ｊ．
Ｂｉｏｌ．Ｃｈｉｍ．，Ｖｏｌ．２５７，Ｎｏ．３，１
５１６〜１５２２頁（１９８２年）；Ｊ．Ｖ．Ｒａｖｅ
ｔｃｈ，Ｕ．Ｓｉｅｂｅｎｌｉｓｔ，Ｓ．Ｋｏｒｓｍｅ
ｙｅｒ，Ｔ．Ｗａｅｄｍａｎｎ，Ｐ．Ｌｅｄｅｒ，Ｃｅ
ｌｌ，２７巻，５８３〜５９１頁（１９８１年）］、本
発明方法にとって重要なプライマー（１）及び（２）の
構成は既に記載したように行なうことができる。
細胞系でアイソタイプスウィッチングの実施に適用する
ことができる。その際にほとんどすべての生成クローン
の抗体はアイソタイプＩｇＭのものである。しかしこの
アイソタイプは決定的なエフェクター機能、例えばＡＤ
ＣＣ（抗体依存性細胞障害）を欠損しかつペンタマーの
ＩｇＭ分子は多量体化及び凝集の傾向を有するので、本
発明によるアイソタイプスウィッチ（抗体の不変鎖の一
定の変化）の実施は、それぞれのアイソタイプの結合特
性及びエフェクター機能を評価するのに有利である。細
胞生物学的方法［Ｐ．Ｒｏｔｈｍａｎ及びその他，Ｍｏ
ｌ，Ｃｅｌｌ，Ｂｉｏｌ．，１０巻，１６７２〜１６７
９頁（１９９０年）］でインタロイキン４、リポ多糖
（ＬＰＳ）又はＬＰＳとインタロイキン４との組合せに
よりアイソタイプスウィッチを実施するための公知方法
は著しく低い所望結果の繁度のためにあまり効果的では
ない。ヒトイムノグロブリン遺伝子の軽鎖及び重鎖のＪ
領域の配列は公知であるので［Ｐ．Ａ．Ｈｉｅｔｅｒ，
Ｊ．ｖ．Ｍａｉｚｅｌ Ｊｒ．，Ｐ．Ｌｅｄｅｒ，Ｊ．
Ｂｉｏｌ．Ｃｈｉｍ．，Ｖｏｌ．２５７，Ｎｏ．３，１
５１６〜１５２２頁（１９８２年）；Ｊ．Ｖ．Ｒａｖｅ
ｔｃｈ，Ｕ．Ｓｉｅｂｅｎｌｉｓｔ，Ｓ．Ｋｏｒｓｍｅ
ｙｅｒ，Ｔ．Ｗａｅｄｍａｎｎ，Ｐ．Ｌｅｄｅｒ，Ｃｅ
ｌｌ，２７巻，５８３〜５９１頁（１９８１年）］、本
発明方法にとって重要なプライマー（１）及び（２）の
構成は既に記載したように行なうことができる。
【００３１】更に、本発明の目的はキメラ抗体の取得法
であり、その際に好適な細胞を本発明方法により製造し
た２種のベクターで形質転換し、その際にベクターの一
方はキメラ抗体のＨ鎖の遺伝子を含有しかつ他方はこの
キメラ抗体のＬ鎖の遺伝子を含有し、形質転換した細胞
を安定なトランスフェクション形成体に関して選択し、
かつ活性抗体を細胞培地から常法で取得する。
であり、その際に好適な細胞を本発明方法により製造し
た２種のベクターで形質転換し、その際にベクターの一
方はキメラ抗体のＨ鎖の遺伝子を含有しかつ他方はこの
キメラ抗体のＬ鎖の遺伝子を含有し、形質転換した細胞
を安定なトランスフェクション形成体に関して選択し、
かつ活性抗体を細胞培地から常法で取得する。
【００３２】本発明に好適な細胞が所謂非イムノグロブ
リン産生ハイブリドーマ細胞系であると有利であり、こ
れは抗体を分泌しないハイブリドーマ系である。この細
胞でのトランスフェクションは当業者に公知の方法で行
なうことができる。このようなハイブリドーマ系の例は
Ｓｐ２／Ｏ−Ａｇ１４［Ａ．Ｏｃｈｉ及びその他，Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８０巻，
６３５１〜６３５５頁（１９８３年）］又はＰ３Ｘ６３
−Ａｇ８．６５３［Ｊ．Ｆ．Ｋｅａｒｎｅｙ及びその
他，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２３巻，１５４８〜１５
５０頁（１９７９年）］である。安定なトランスフェク
ション形成体の選択は文献公知の方法により行なう
［Ｈ．Ｌｅｎｚ及びＵ．Ｈ．Ｗｅｉｄｌｅ，Ｇｅｎｅ，
８７巻，２１３〜２１８頁（１９９０年）］。
リン産生ハイブリドーマ細胞系であると有利であり、こ
れは抗体を分泌しないハイブリドーマ系である。この細
胞でのトランスフェクションは当業者に公知の方法で行
なうことができる。このようなハイブリドーマ系の例は
Ｓｐ２／Ｏ−Ａｇ１４［Ａ．Ｏｃｈｉ及びその他，Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８０巻，
６３５１〜６３５５頁（１９８３年）］又はＰ３Ｘ６３
−Ａｇ８．６５３［Ｊ．Ｆ．Ｋｅａｒｎｅｙ及びその
他，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２３巻，１５４８〜１５
５０頁（１９７９年）］である。安定なトランスフェク
ション形成体の選択は文献公知の方法により行なう
［Ｈ．Ｌｅｎｚ及びＵ．Ｈ．Ｗｅｉｄｌｅ，Ｇｅｎｅ，
８７巻，２１３〜２１８頁（１９９０年）］。
【００３３】
【実施例】次に本発明を添付図面に関連して実施例によ
り詳説する。
り詳説する。
【００３４】抗体産生細胞系１５−１／Ｐ３／１４（Ｅ
ＣＡＣＣ ９００９０７０５）及び３．１０−１／５Ｂ
１０（ＥＣＡＣＣ ９００９０７０２）はヨーロッパ動
物細胞培養保存機関（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃ
ｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕ
ｒｅｓ，英国，Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ，Ｗｉｌｔｓｈｉｒ
ｅ ＳＰ４ ＯＪＧ）に寄託されている。ベクターｐＵ
ＨＷ−ＣＤ４Ｋ（ＤＳＭ６１５６）及びｐＵＨＷ−ＣＤ
４γ１（ＤＳＭ６１５５）はドイツ微生物保存機関（Ｄ
ｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒ
ｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ，ｕｎｄ Ｚｅｌｌ Ｋｕｌｔ
ｕｒｅｎ ＧｍｂＨ，Ｍａｓｃｈｏｄｅｒ Ｗｅｇ １
ｂ Ｄ−３３ Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ）に寄託され
ている。
ＣＡＣＣ ９００９０７０５）及び３．１０−１／５Ｂ
１０（ＥＣＡＣＣ ９００９０７０２）はヨーロッパ動
物細胞培養保存機関（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃ
ｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕ
ｒｅｓ，英国，Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ，Ｗｉｌｔｓｈｉｒ
ｅ ＳＰ４ ＯＪＧ）に寄託されている。ベクターｐＵ
ＨＷ−ＣＤ４Ｋ（ＤＳＭ６１５６）及びｐＵＨＷ−ＣＤ
４γ１（ＤＳＭ６１５５）はドイツ微生物保存機関（Ｄ
ｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒ
ｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ，ｕｎｄ Ｚｅｌｌ Ｋｕｌｔ
ｕｒｅｎ ＧｍｂＨ，Ｍａｓｃｈｏｄｅｒ Ｗｅｇ １
ｂ Ｄ−３３ Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ）に寄託され
ている。
【００３５】例 １ キメラ化すべき抗体のｍＲＮＡの配列決定 注）本例では抗体（ＩｇＧ１型）を分泌するマウスのハ
イブリドーマ系を使用し、かつＴリンパ球レセプター
（ヒト）ＣＤ４の細胞外領域の抗原決定基を認識する。
軽鎖はκ（カッパ）型でありかつ重鎖はγ１型である。
このハイブリドーマ系は１５−１／Ｐ３／１４である。
この抗体は例えば慢性関節リウマチのような自己免疫疾
患を治療する際の可能性を有する。
イブリドーマ系を使用し、かつＴリンパ球レセプター
（ヒト）ＣＤ４の細胞外領域の抗原決定基を認識する。
軽鎖はκ（カッパ）型でありかつ重鎖はγ１型である。
このハイブリドーマ系は１５−１／Ｐ３／１４である。
この抗体は例えば慢性関節リウマチのような自己免疫疾
患を治療する際の可能性を有する。
【００３６】ａ）ＰＣＲのｍＲＮＡ及びプライマーの配
列決定 ハイブリドーマ系１５−１／Ｐ３／１４の細胞１０6個
からオリゴ−ｄＴ−セルロースを用いるクロマトグラフ
ィーにより全ＲＮＡからメッセンジャーＲＮＡを単離し
た［Ｍａｎｉａｔｉｓ及びその他，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎ
ｕａｌ．，２８３頁，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ
ｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ在（１９８２年）］。
列決定 ハイブリドーマ系１５−１／Ｐ３／１４の細胞１０6個
からオリゴ−ｄＴ−セルロースを用いるクロマトグラフ
ィーにより全ＲＮＡからメッセンジャーＲＮＡを単離し
た［Ｍａｎｉａｔｉｓ及びその他，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎ
ｕａｌ．，２８３頁，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ
ｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ在（１９８２年）］。
【００３７】引続いて、軽鎖及び重鎖のｍＲＮＡの配列
決定は逆転写酵素でプライマー延長により行なう［Ｆｒ
ｅｄ Ｓａｂｌｉｔｚｋｙ及びＫｌａｕｓ Ｒａｊｅｗ
ｓｋｉ，ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ，３巻，３００５〜
３０１７頁（１９８４年）及びＰ．Ｈ．Ｈａｍｌｙｎ及
びその他，Ｃｅｌｌ，１５巻，１０６７〜１０７５頁
（１９７８年）］。
決定は逆転写酵素でプライマー延長により行なう［Ｆｒ
ｅｄ Ｓａｂｌｉｔｚｋｙ及びＫｌａｕｓ Ｒａｊｅｗ
ｓｋｉ，ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ，３巻，３００５〜
３０１７頁（１９８４年）及びＰ．Ｈ．Ｈａｍｌｙｎ及
びその他，Ｃｅｌｌ，１５巻，１０６７〜１０７５頁
（１９７８年）］。
【００３８】ｃＤＮＡ合成は反応容量１０μｌで行なっ
た。
た。
【００３９】条件：ｍＲＮＡ ０．１μｇ、プライマー
０．０５μｇ、逆転写酵素（９０００Ｕ／μｌ）０．５
μｌ、デオキシヌクレオシドトリホスフェート５０μｍ
ｏｌ／ｌ、32Ｐ標識ヌクレオチドトリホスフェート４μ
ｍｏｌ／ｌ各反応バッチは付加的に他のジデオキシヌク
レオチドトリホスフェート（ｄｄＡＴＰ、ｄｄＴＴＰ、
ｄｄＧＴＰ又はｄｄＣＴＰ、濃度１０μｍｏｌ／ｌ）を
含有していた。緩衝液としては、５０ｍｍｏｌ／ｌトリ
ス−ＨＣｌ、ｐＨ８．３、６０ｍｍｏｌ／ｌ ＮａＣ
ｌ、２０ｍｍｏｌ／ｌジチオトレイトール、６ｍｍｏｌ
／ｌ ＭｇＣｌ2を使用した。反応混合物を３７℃で３
０分間恒温保持しかつ１０ｍｍｏｌ／ｌ ＥＤＴＡ中の
１０μｌホルムアミド、ブロムフェノールブルー及びキ
シレンシアノールＦＦで停止した。アリコートを配列決
定ゲル上に施しかつｃＤＮＡの配列［Ｆ．Ｓａｎｇｅ
ｒ，Ｓ．Ｎｉｃｋｌｅｎ及びＡ．Ｒ．Ｃｏｕｌｓｏｎ，
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７４
巻，５４６３〜５４６７頁（１９７７年）］をオートラ
ジオグラフィにより測定した。
０．０５μｇ、逆転写酵素（９０００Ｕ／μｌ）０．５
μｌ、デオキシヌクレオシドトリホスフェート５０μｍ
ｏｌ／ｌ、32Ｐ標識ヌクレオチドトリホスフェート４μ
ｍｏｌ／ｌ各反応バッチは付加的に他のジデオキシヌク
レオチドトリホスフェート（ｄｄＡＴＰ、ｄｄＴＴＰ、
ｄｄＧＴＰ又はｄｄＣＴＰ、濃度１０μｍｏｌ／ｌ）を
含有していた。緩衝液としては、５０ｍｍｏｌ／ｌトリ
ス−ＨＣｌ、ｐＨ８．３、６０ｍｍｏｌ／ｌ ＮａＣ
ｌ、２０ｍｍｏｌ／ｌジチオトレイトール、６ｍｍｏｌ
／ｌ ＭｇＣｌ2を使用した。反応混合物を３７℃で３
０分間恒温保持しかつ１０ｍｍｏｌ／ｌ ＥＤＴＡ中の
１０μｌホルムアミド、ブロムフェノールブルー及びキ
シレンシアノールＦＦで停止した。アリコートを配列決
定ゲル上に施しかつｃＤＮＡの配列［Ｆ．Ｓａｎｇｅ
ｒ，Ｓ．Ｎｉｃｋｌｅｎ及びＡ．Ｒ．Ｃｏｕｌｓｏｎ，
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７４
巻，５４６３〜５４６７頁（１９７７年）］をオートラ
ジオグラフィにより測定した。
【００４０】使用したプライマー：不変部の１つの範囲
に対して相補性（前記のＲａｊｅｗｓｋｉ，ＥＭＢＯ−
Ｊ．に記載されている） ａ） κ鎖：５′ＴＧＣＡＧＣＡＴＣＡＧＣＣＣ３′ ｂ）γ１鎖：５′ＧＧＣＣＡＧＴＧＧＡＴＡＧＡＣ３′ 配列は次の情報を与えた： ａ）軽鎖及び重鎖のｍＲＮＡの５′−非翻訳領域、これ
によりプライマー（１）が構成される。
に対して相補性（前記のＲａｊｅｗｓｋｉ，ＥＭＢＯ−
Ｊ．に記載されている） ａ） κ鎖：５′ＴＧＣＡＧＣＡＴＣＡＧＣＣＣ３′ ｂ）γ１鎖：５′ＧＧＣＣＡＧＴＧＧＡＴＡＧＡＣ３′ 配列は次の情報を与えた： ａ）軽鎖及び重鎖のｍＲＮＡの５′−非翻訳領域、これ
によりプライマー（１）が構成される。
【００４１】ｂ）軽鎖もしくは重鎖中でそれぞれ使われ
るＪ領域、これによりプライマー（２）を構成するため
の情報が得られる。使用した抗体に関しては軽鎖はＪ２
領域を有し、重鎖はＪ４領域を有することが明らかにな
った。
るＪ領域、これによりプライマー（２）を構成するため
の情報が得られる。使用した抗体に関しては軽鎖はＪ２
領域を有し、重鎖はＪ４領域を有することが明らかにな
った。
【００４２】次に重鎖及び軽鎖の５′−非翻訳配列を記
載する。これらの配列から好適なプライマー（１）（例
２．１ａ）及びｃ）参照）を選択することができる： ５′−非翻訳領域（軽鎖）： ５′−ＡＡＧＡＣＴＣＡＧＣＣＴＧＧＡＣＡＴＧＡＴＧ−３′ 開始コドン ５′−非翻訳領域（重鎖）： ５′−ＴＧＡＣＣＡＧＴＴＡＧＴＣＴＴＡＡＧＧＣＡＣＣＡＣＴＧＡＧＣ−３ ′ＣＣＡＡＧＴＣＴＴＡＧＡＣＡＴＣＡＴＧ 開始コドン 例 ２ キメラ化すべき抗体の軽鎖及び重鎖の可変部のゲノムＤ
ＮＡの増幅 キメラ化すべき抗体の配列に関する例１からの情報によ
り、軽鎖及び重鎖のそれぞれのＪ−領域のイントロン配
列に相補性であり、更に制限エンドヌクレアーゼの認識
部位を含有するプライマーを構成することができた。
載する。これらの配列から好適なプライマー（１）（例
２．１ａ）及びｃ）参照）を選択することができる： ５′−非翻訳領域（軽鎖）： ５′−ＡＡＧＡＣＴＣＡＧＣＣＴＧＧＡＣＡＴＧＡＴＧ−３′ 開始コドン ５′−非翻訳領域（重鎖）： ５′−ＴＧＡＣＣＡＧＴＴＡＧＴＣＴＴＡＡＧＧＣＡＣＣＡＣＴＧＡＧＣ−３ ′ＣＣＡＡＧＴＣＴＴＡＧＡＣＡＴＣＡＴＧ 開始コドン 例 ２ キメラ化すべき抗体の軽鎖及び重鎖の可変部のゲノムＤ
ＮＡの増幅 キメラ化すべき抗体の配列に関する例１からの情報によ
り、軽鎖及び重鎖のそれぞれのＪ−領域のイントロン配
列に相補性であり、更に制限エンドヌクレアーゼの認識
部位を含有するプライマーを構成することができた。
【００４３】２．１ 使用するプライマー： ａ）軽鎖５′プライマー（プライマー１）：非翻訳領域
＋ＳａｌＩ部位＝３５マー
＋ＳａｌＩ部位＝３５マー
【００４４】
【化１】
【００４５】ｂ）軽鎖３′プライマー（プライマー
２）：Ｊ2イントロン＋ＮｏｔＩ部位＝３５マー
２）：Ｊ2イントロン＋ＮｏｔＩ部位＝３５マー
【００４６】
【化２】
【００４７】ｃ）重鎖５′プライマー（プライマー
１）：非翻訳領域＋ＳａｌＩ部位＝３５マー
１）：非翻訳領域＋ＳａｌＩ部位＝３５マー
【００４８】
【化３】
【００４９】ｄ）重鎖３′プライマー（プライマー
２）：イントロンＪ4＋ＮｏｔＩ部位＝３８マー
２）：イントロンＪ4＋ＮｏｔＩ部位＝３８マー
【００５０】
【化４】
【００５１】２．２ 重要なＶＪ（軽鎖）領域及びＶＤ
Ｊ（重鎖）領域をＰＣＲにより増幅軽鎖及び重鎖の増幅
すべき範囲は図１に記載されている。Ｌ鎖の増幅にはプ
ライマーａ及びｂを使い、Ｈ鎖の増幅にはプライマーｃ
及びｄを使用した。
Ｊ（重鎖）領域をＰＣＲにより増幅軽鎖及び重鎖の増幅
すべき範囲は図１に記載されている。Ｌ鎖の増幅にはプ
ライマーａ及びｂを使い、Ｈ鎖の増幅にはプライマーｃ
及びｄを使用した。
【００５２】染色体ＤＮＡはハイブリドーマ系１５−１
／Ｐ３／１４から標準法により単離した［Ｔ．Ｍａｎｉ
ａｔｉｓ及びその他，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉ
ｎｇ．Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏ
ｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，
２８３頁（１９８２年）］。ＰＣＲ反応はパーキン・エ
ルマー・セツス・テルモ−サイクラー（Ｐｅｒｋｉｎ
Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ Ｔｈｅｒｍｏ−Ｃｙｃｌｅ
ｒ）で実施した（サイクル数：２６） 反応条件：１０ｍｍｏｌ／ｌトリス・ＨＣｌ、ｐＨ８．
３、５０ｍｍｏｌ／ｌ ＫＣｌ、１．５ｍｍｏｌ／ｌ
ＭｇＣｌ2、０．１％（ｗ／ｖ）ゼラチン、１μｇ染色
体ＤＮＡ、５′及び３′プライマー各１μｍｏｌ／ｌ、
ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰそれぞれ２０
０μｍｏｌ／ｌ、Ｔａｑポリメラーゼ（パーキンエルマ
ー社）２．５単位。
／Ｐ３／１４から標準法により単離した［Ｔ．Ｍａｎｉ
ａｔｉｓ及びその他，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉ
ｎｇ．Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏ
ｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，
２８３頁（１９８２年）］。ＰＣＲ反応はパーキン・エ
ルマー・セツス・テルモ−サイクラー（Ｐｅｒｋｉｎ
Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ Ｔｈｅｒｍｏ−Ｃｙｃｌｅ
ｒ）で実施した（サイクル数：２６） 反応条件：１０ｍｍｏｌ／ｌトリス・ＨＣｌ、ｐＨ８．
３、５０ｍｍｏｌ／ｌ ＫＣｌ、１．５ｍｍｏｌ／ｌ
ＭｇＣｌ2、０．１％（ｗ／ｖ）ゼラチン、１μｇ染色
体ＤＮＡ、５′及び３′プライマー各１μｍｏｌ／ｌ、
ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰそれぞれ２０
０μｍｏｌ／ｌ、Ｔａｑポリメラーゼ（パーキンエルマ
ー社）２．５単位。
【００５３】反応容量：１００μｌ、これに“鉱油ライ
ト（Ｍｉｎｅｒａｌ ｏｉｌ ｌｉｇｈｔ）”（Ｓｉｇ
ｍａ社）を装入した。
ト（Ｍｉｎｅｒａｌ ｏｉｌ ｌｉｇｈｔ）”（Ｓｉｇ
ｍａ社）を装入した。
【００５４】反応時間／サイクル：２分間 反応温度／サイクル：７２℃ 第１サイクルの前に反応混合物を９２℃で５分間、引続
いて５５℃で２分間、次に７２℃で２分間保持した。そ
の後のそれぞれのサイクルの前に反応混合物を前記の温
度でその都度２分間保持した。対照として、他のバッチ
中でマウス・ウロキナーゼ遺伝子からの２．５ｋｂのフ
ラグメントを増幅させた。反応後にアリコート（反応バ
ッチの１０％）を採取しかつ１％アガロースゲル（０．
５μｇ／ｍｌエチジウムブロミド含有）上で試験した。
いて５５℃で２分間、次に７２℃で２分間保持した。そ
の後のそれぞれのサイクルの前に反応混合物を前記の温
度でその都度２分間保持した。対照として、他のバッチ
中でマウス・ウロキナーゼ遺伝子からの２．５ｋｂのフ
ラグメントを増幅させた。反応後にアリコート（反応バ
ッチの１０％）を採取しかつ１％アガロースゲル（０．
５μｇ／ｍｌエチジウムブロミド含有）上で試験した。
【００５５】軽鎖では５６０ｂｐのフラグメントの増幅
及び重鎖では６５０ｂｐのフラグメントの増幅が認めら
れた。
及び重鎖では６５０ｂｐのフラグメントの増幅が認めら
れた。
【００５６】増幅したフラグメントを単離するに当り、
残りの反応混合物をフェノール化し、水相をエタノール
で沈殿させ、ＤＮＡを相応する緩衝液中に溶かし、引続
いて制限エンドヌクレアーゼでＳａｌＩ及びＮｏｔＩを
後切断した。増幅したフラグメントを０．８％の低温溶
融アガロースゲル上で精製しかつ収率を測定した。
残りの反応混合物をフェノール化し、水相をエタノール
で沈殿させ、ＤＮＡを相応する緩衝液中に溶かし、引続
いて制限エンドヌクレアーゼでＳａｌＩ及びＮｏｔＩを
後切断した。増幅したフラグメントを０．８％の低温溶
融アガロースゲル上で精製しかつ収率を測定した。
【００５７】配列決定するためにアリコートを、唯一の
ＨｉｎｄＩＩＩ部位がポリリンカー中でＮｏｔＩ部位に
転移されている（ＨｉｎｄＩＩＩ切断部位をヌクレアー
ゼＳ１でブラント化し、引続いてＮｏｔＩリンカーを連
結させた後）市販のベクターｐＵＣ１９［Ｙａｎｉｓｃ
ｈ−Ｐｅｒｒｏｎ及びその他，Ｇｅｎｅ，３３巻，１０
３〜１０９頁（１９８５年）］中に挿入連結した。増幅
したＳａｌＩ−ＮｏｔＩフラグメントを、ＳａｌＩ及び
ＮｏｔＩで切断された修飾ｐＵＣベクター中に連結した
後で、アンピシリン耐性コロニー（５０μｇ／ｍｌ）を
単離しかつ組換えプラスミドを制限分析によりその特性
を明らかにした。
ＨｉｎｄＩＩＩ部位がポリリンカー中でＮｏｔＩ部位に
転移されている（ＨｉｎｄＩＩＩ切断部位をヌクレアー
ゼＳ１でブラント化し、引続いてＮｏｔＩリンカーを連
結させた後）市販のベクターｐＵＣ１９［Ｙａｎｉｓｃ
ｈ−Ｐｅｒｒｏｎ及びその他，Ｇｅｎｅ，３３巻，１０
３〜１０９頁（１９８５年）］中に挿入連結した。増幅
したＳａｌＩ−ＮｏｔＩフラグメントを、ＳａｌＩ及び
ＮｏｔＩで切断された修飾ｐＵＣベクター中に連結した
後で、アンピシリン耐性コロニー（５０μｇ／ｍｌ）を
単離しかつ組換えプラスミドを制限分析によりその特性
を明らかにした。
【００５８】軽鎖及び重鎖の増幅ＳａｌＩ−ＮｏｔＩフ
ラグメントを含有するそれぞれ５個のプラスミド（それ
ぞれ制限酵素分析で同一のバンドパターンを示した）を
Ｆ．サンガー及びその他（前記文献参照）により配列決
定した。軽鎖及び重鎖でシグナル配列中に生じるイント
ロンを除いて、前以って確定したｃＤＮＡ配列との一致
が認められた。
ラグメントを含有するそれぞれ５個のプラスミド（それ
ぞれ制限酵素分析で同一のバンドパターンを示した）を
Ｆ．サンガー及びその他（前記文献参照）により配列決
定した。軽鎖及び重鎖でシグナル配列中に生じるイント
ロンを除いて、前以って確定したｃＤＮＡ配列との一致
が認められた。
【００５９】例 ３ キメラ抗体の軽鎖及び重鎖を発現させるための発現ベク
ターの製造 例２により製造しかつ増幅した抗体１５−１／Ｐ３／１
４のＶＪ−もしくはＶＤＪ領域をＳａｌＩ−ＮｏｔＩフ
ラグメントとして、ＳａｌＩ及びＮｏｔＩで切断したキ
メラ抗体用のカセット発現ベクター中に挿入連絡した。
ターの製造 例２により製造しかつ増幅した抗体１５−１／Ｐ３／１
４のＶＪ−もしくはＶＤＪ領域をＳａｌＩ−ＮｏｔＩフ
ラグメントとして、ＳａｌＩ及びＮｏｔＩで切断したキ
メラ抗体用のカセット発現ベクター中に挿入連絡した。
【００６０】３．１ カセットベクターｐＵＨＷＫの構
成 予備構成においてプラスミドｐＵＣ１８［Ｙａｎｉｓｃ
ｈ−Ｐｅｒｒｏｎ及びその他，Ｇｅｎｅ，３３巻，１０
３〜１０９頁（１９８５年）］中の唯一のＨｉｎｄＩＩ
Ｉ部位がＮｏｔＩ部位に転移した。このためにｐＵＣ１
８をＨｉｎｄＩＩＩで直線化し、突出末端をヌクレアー
ゼＳ１でブラント化し、ＮｏｔＩリンカーを連結し、Ｎ
ｏｔＩを後切断し、直線状プラスミドを低温溶融アガロ
ースゲル上で精製し、再結合させかつＥ．コリＨＢ１０
１中のトランスフェクション後に寒天平板上でアンピシ
リン耐性コロニーを選択した。所望の組換え体の特性を
制限エンドヌクレアーゼで分析することにより明らかに
した。相応するプラスミドをｐＵＣ１８（ＮｏｔＩ）と
表わす。ｐＥＰμの構成のためにｐＵＣ１８（Ｎｏｔ
Ｉ）を多数のクローン化部位で酵素ＥｃｏＲＩ及びＫｐ
ｎＩで切断しかつプラスミドｐＩｇγＥｃｏｇｐｔ［Ｗ
ｅｉｄｌｅ及びその他，Ｇｅｎｅ，６０巻，２０５〜２
１６頁（１９８７年）］記載のフラグメントはμ遺伝子
のエンハンサーを０．６ｋｂフラグメントとして［Ｂａ
ｎｅｒｊｉ及びその他，Ｃｅｌｌ，３３巻，７２９〜７
４０頁（１９８３年）］及びマウスμ遺伝子の１．４ｋ
ｂプロモータフラグメント［Ｍ．Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，
ＥＭＢＯ Ｊ．，２巻，１３７３〜１３７８頁（１９８
３年）］を前後に配列含有する。
成 予備構成においてプラスミドｐＵＣ１８［Ｙａｎｉｓｃ
ｈ−Ｐｅｒｒｏｎ及びその他，Ｇｅｎｅ，３３巻，１０
３〜１０９頁（１９８５年）］中の唯一のＨｉｎｄＩＩ
Ｉ部位がＮｏｔＩ部位に転移した。このためにｐＵＣ１
８をＨｉｎｄＩＩＩで直線化し、突出末端をヌクレアー
ゼＳ１でブラント化し、ＮｏｔＩリンカーを連結し、Ｎ
ｏｔＩを後切断し、直線状プラスミドを低温溶融アガロ
ースゲル上で精製し、再結合させかつＥ．コリＨＢ１０
１中のトランスフェクション後に寒天平板上でアンピシ
リン耐性コロニーを選択した。所望の組換え体の特性を
制限エンドヌクレアーゼで分析することにより明らかに
した。相応するプラスミドをｐＵＣ１８（ＮｏｔＩ）と
表わす。ｐＥＰμの構成のためにｐＵＣ１８（Ｎｏｔ
Ｉ）を多数のクローン化部位で酵素ＥｃｏＲＩ及びＫｐ
ｎＩで切断しかつプラスミドｐＩｇγＥｃｏｇｐｔ［Ｗ
ｅｉｄｌｅ及びその他，Ｇｅｎｅ，６０巻，２０５〜２
１６頁（１９８７年）］記載のフラグメントはμ遺伝子
のエンハンサーを０．６ｋｂフラグメントとして［Ｂａ
ｎｅｒｊｉ及びその他，Ｃｅｌｌ，３３巻，７２９〜７
４０頁（１９８３年）］及びマウスμ遺伝子の１．４ｋ
ｂプロモータフラグメント［Ｍ．Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，
ＥＭＢＯ Ｊ．，２巻，１３７３〜１３７８頁（１９８
３年）］を前後に配列含有する。
【００６１】更に構成するためにプラスミドｐ１０１９
５（ヨーロッパ特許公開第０３７８１７５号明細書によ
り製造）が必要である。このプラスミドはマウス及びヒ
トの軽鎖のイントロン配列からのキメライントロン、ヒ
トのκ鎖の不変部並びにホスホトランスフェラーゼｎｅ
ｏの発現カセットを含有する。ｐＥＰμからの２ｋｂの
ＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩフラグメント（重鎖エンハンサー
プロモータ組合せ体を含有）をＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩ
で開いたプラスミドｐ１０１９５中に挿入連結した後で
ｐＵＨＷＫが得られた（図２）。
５（ヨーロッパ特許公開第０３７８１７５号明細書によ
り製造）が必要である。このプラスミドはマウス及びヒ
トの軽鎖のイントロン配列からのキメライントロン、ヒ
トのκ鎖の不変部並びにホスホトランスフェラーゼｎｅ
ｏの発現カセットを含有する。ｐＥＰμからの２ｋｂの
ＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩフラグメント（重鎖エンハンサー
プロモータ組合せ体を含有）をＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩ
で開いたプラスミドｐ１０１９５中に挿入連結した後で
ｐＵＨＷＫが得られた（図２）。
【００６２】例２に記載の単離した、突出しているＳａ
ｌＩ及びＮｏｔＩの切断部位を有する増幅ゲノムＶＪフ
ラグメントをＳａｌＩ及びＮｏｔＩで開いたプラスミド
ｐＵＨＷＫ中に挿入連結して、その都度の抗体のキメラ
化された軽鎖の発現ベクターを確定する。
ｌＩ及びＮｏｔＩの切断部位を有する増幅ゲノムＶＪフ
ラグメントをＳａｌＩ及びＮｏｔＩで開いたプラスミド
ｐＵＨＷＫ中に挿入連結して、その都度の抗体のキメラ
化された軽鎖の発現ベクターを確定する。
【００６３】本例で得られた、抗体１５−１／Ｐ３／１
４のキメラ化軽鎖用の発現プラスミドをｐＵＨＷ−ＣＤ
４Ｋと表わす。
４のキメラ化軽鎖用の発現プラスミドをｐＵＨＷ−ＣＤ
４Ｋと表わす。
【００６４】３．２ カセットベクターｐＵＨＷγ１の
構成 使用するプラスミドｐ１１２０１はヨーロッパ特許公開
第０３７８１７５号明細書に記載されている。このプラ
スミドはマウス及びヒトのイムノグロブリン重鎖のイン
トロン配列からのキメライントロン並びにヒトγ１遺伝
子の不変部のゲノム構造を含有する。ｐ１１２０１をＮ
ｏｔＩ及びＢａｍＨＩで切断し、末端をヌクレアーゼＳ
１でブラント化した。引続いて、ＮｏｔＩリンカー（Ｇ
ＣＧＧＣＣＧＣ）を連結し（Ｔ４リガーゼ）図示されて
いるフラグメントを低温溶融アガロースゲル上で単離し
た。前記のプラスミドをプラスミドｐＥＰμの唯一のＮ
ｏｔＩ部位中に挿入連結し、Ｅ．コリＨＢ１０１中にト
ランスフェクションしかつアンピシリン耐性（５０μｇ
／ｍｌ）コロニーを寒天平板上で単離した。初めにプラ
スミドｐＵＨＷ*γ１が得られた。このプラスミドはゲ
ノムヒトγ１不変部をイムノグロブリン−プロモータ−
エンハンサー組合せに対して所望の方向で含有するが、
２つのＮｏｔＩ部位を有し、これはＰＣＲにより得られ
たＶＤＪ ＳａｌＩ−ＮｏｔＩフラグメントの目的のク
ローン化を困難にする（図３）。
構成 使用するプラスミドｐ１１２０１はヨーロッパ特許公開
第０３７８１７５号明細書に記載されている。このプラ
スミドはマウス及びヒトのイムノグロブリン重鎖のイン
トロン配列からのキメライントロン並びにヒトγ１遺伝
子の不変部のゲノム構造を含有する。ｐ１１２０１をＮ
ｏｔＩ及びＢａｍＨＩで切断し、末端をヌクレアーゼＳ
１でブラント化した。引続いて、ＮｏｔＩリンカー（Ｇ
ＣＧＧＣＣＧＣ）を連結し（Ｔ４リガーゼ）図示されて
いるフラグメントを低温溶融アガロースゲル上で単離し
た。前記のプラスミドをプラスミドｐＥＰμの唯一のＮ
ｏｔＩ部位中に挿入連結し、Ｅ．コリＨＢ１０１中にト
ランスフェクションしかつアンピシリン耐性（５０μｇ
／ｍｌ）コロニーを寒天平板上で単離した。初めにプラ
スミドｐＵＨＷ*γ１が得られた。このプラスミドはゲ
ノムヒトγ１不変部をイムノグロブリン−プロモータ−
エンハンサー組合せに対して所望の方向で含有するが、
２つのＮｏｔＩ部位を有し、これはＰＣＲにより得られ
たＶＤＪ ＳａｌＩ−ＮｏｔＩフラグメントの目的のク
ローン化を困難にする（図３）。
【００６５】不所望なＮｏｔＩ部位を除去するためにｐ
ＵＨＷ*γ１をＮｏｔＩで部分切断し、突出している末
端をヌクレアーゼＳ１でブラント化し、フラグメントを
低温溶融アガロースゲル上で精製し、再連結し、Ｅ．コ
リＨＢ１０１中にトランスフェクションし、かつアンピ
シリン耐性コロニー（５０μｇ／ｍｌ）を寒天板上で選
択した。制限エンドヌクレアーゼで分析することによ
り、不変部の３′−非翻訳領域の後の不所望なＮｏｔＩ
部位が欠失していることが確認された。生成したプラス
ミドをｐＵＨＷγ１と表わす（図３）。
ＵＨＷ*γ１をＮｏｔＩで部分切断し、突出している末
端をヌクレアーゼＳ１でブラント化し、フラグメントを
低温溶融アガロースゲル上で精製し、再連結し、Ｅ．コ
リＨＢ１０１中にトランスフェクションし、かつアンピ
シリン耐性コロニー（５０μｇ／ｍｌ）を寒天板上で選
択した。制限エンドヌクレアーゼで分析することによ
り、不変部の３′−非翻訳領域の後の不所望なＮｏｔＩ
部位が欠失していることが確認された。生成したプラス
ミドをｐＵＨＷγ１と表わす（図３）。
【００６６】ＰＣＲで増幅したＶＤＪ領域を含有する、
イムノグロブリン遺伝子の重鎖のＳａｌＩ−ＮｏｔＩフ
ラグメントをＳａｌＩ及びＮｏｔＩで切断したプラスミ
ドｐＵＨＷγ１中にクローン化して、抗体のキメラ重鎖
用の発現ベクターを確認する。抗体１５−１／Ｐ３／１
４の場合に得られる、キメラ重鎖の発現ベクターはｐＵ
ＨＷ−ＣＤγ１と表わす。
イムノグロブリン遺伝子の重鎖のＳａｌＩ−ＮｏｔＩフ
ラグメントをＳａｌＩ及びＮｏｔＩで切断したプラスミ
ドｐＵＨＷγ１中にクローン化して、抗体のキメラ重鎖
用の発現ベクターを確認する。抗体１５−１／Ｐ３／１
４の場合に得られる、キメラ重鎖の発現ベクターはｐＵ
ＨＷ−ＣＤγ１と表わす。
【００６７】例 ４ 構成性キメラＣＤ４抗体を分泌する永久細胞系の製造 プラスミドｐＵＨＷ−ＣＤ４Ｋ及びｐＵＨＷ−ＣＤ４γ
１をエレクトロポレーション（Ｅｌｅｋｔｒｏｐｏｒａ
ｔｉｏｎ：ＢｉｏｒａｄのＧｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ）に
よりイムノグロブリン非生産（Ｎｏｎ−Ｐｒｏｄｕｃｅ
ｒ）ハイブリドーマ細胞系Ｓｐ２／Ｏ−Ａｇ１４（ＡＴ
ＣＣ ＣＲＬ１５８１）［Ａ．Ｏｃｈｉ及びその他，Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８０
巻，６３５１〜６３５５頁（１９８３年）］中にトラン
スフェクションした［ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓ．，１５巻，１３１１〜１３２６頁（１９８７年）及
びＢｉｏ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，６巻，７４２〜７５
１頁（１９８８年）］。１パルス当りプラスミド１０μ
ｇ及び細胞１０6個を使用した。
１をエレクトロポレーション（Ｅｌｅｋｔｒｏｐｏｒａ
ｔｉｏｎ：ＢｉｏｒａｄのＧｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ）に
よりイムノグロブリン非生産（Ｎｏｎ−Ｐｒｏｄｕｃｅ
ｒ）ハイブリドーマ細胞系Ｓｐ２／Ｏ−Ａｇ１４（ＡＴ
ＣＣ ＣＲＬ１５８１）［Ａ．Ｏｃｈｉ及びその他，Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８０
巻，６３５１〜６３５５頁（１９８３年）］中にトラン
スフェクションした［ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓ．，１５巻，１３１１〜１３２６頁（１９８７年）及
びＢｉｏ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，６巻，７４２〜７５
１頁（１９８８年）］。１パルス当りプラスミド１０μ
ｇ及び細胞１０6個を使用した。
【００６８】遠心分離後、細胞を冷いＨｅＢｓ緩衝液
（２０ｍｍｏｌ／ｌ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０５、１３
７ｍｍｏｌ／ｌ ＮａＣｌ、５ｍｍｏｌ／ｌ ＫＣｌ、
０．７ｍｍｏｌ／ｌ Ｎａ2ＨＰＯ4、６ｍｍｏｌ／ｌデ
キストロース）で洗い、ＨｅＢｓ緩衝液で再懸濁し、濃
度を細胞１０6個／ｍｌに調節しかつ氷上に置く。プラ
スミドの添加後パルス処理した(条件:１６０μＦ及び２
００〜２６０Ｖ）。細胞を約１０分間後に氷上に置き、
引続いて培地（ＲＰＭＩ１６４０、１０％ウシ胎児血
清、２ｍｍｏｌ／ｌグルタミン、１ｍｍｏｌ／ｌピルビ
ン酸ナトリウム、０．１ｍｏｌ／ｌ非必須アミノ酸）中
３７℃で恒温保持する。安定なトランスフェクション形
成体の選択は培地１ｍｌ当りＧ４１８ ８００μｇの濃
度のＧ４１８含有培地上で成長させることにより行なっ
た。
（２０ｍｍｏｌ／ｌ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０５、１３
７ｍｍｏｌ／ｌ ＮａＣｌ、５ｍｍｏｌ／ｌ ＫＣｌ、
０．７ｍｍｏｌ／ｌ Ｎａ2ＨＰＯ4、６ｍｍｏｌ／ｌデ
キストロース）で洗い、ＨｅＢｓ緩衝液で再懸濁し、濃
度を細胞１０6個／ｍｌに調節しかつ氷上に置く。プラ
スミドの添加後パルス処理した(条件:１６０μＦ及び２
００〜２６０Ｖ）。細胞を約１０分間後に氷上に置き、
引続いて培地（ＲＰＭＩ１６４０、１０％ウシ胎児血
清、２ｍｍｏｌ／ｌグルタミン、１ｍｍｏｌ／ｌピルビ
ン酸ナトリウム、０．１ｍｏｌ／ｌ非必須アミノ酸）中
３７℃で恒温保持する。安定なトランスフェクション形
成体の選択は培地１ｍｌ当りＧ４１８ ８００μｇの濃
度のＧ４１８含有培地上で成長させることにより行なっ
た。
【００６９】安定なトランスフェクション形成体は“制
限稀釈（ｌｉｍｉｔｅｄｄｉｌｕｔｉｏｎ）”により単
離しかつ約１４日後に同定することができた。これはキ
メラＣＤ４抗体（ＩｇＧ１）を高収率で分泌した。
限稀釈（ｌｉｍｉｔｅｄｄｉｌｕｔｉｏｎ）”により単
離しかつ約１４日後に同定することができた。これはキ
メラＣＤ４抗体（ＩｇＧ１）を高収率で分泌した。
【００７０】例 ５ トランスフェクトーマ系の上澄み中の再構成性抗ＣＤ４
の検出 すべての作業工程は室温で実施した。
の検出 すべての作業工程は室温で実施した。
【００７１】微量滴定板の凹部に０．２ｍｏｌ／ｌ重炭
酸塩／炭酸塩緩衝液、ｐＨ９．５中の２．５μｇ／ｍｌ
羊−抗−ヒト−Ｆｃγ−ＩｇＧの溶液各０．２ｍｌを供
給しかつ１時間恒温保持する。
酸塩／炭酸塩緩衝液、ｐＨ９．５中の２．５μｇ／ｍｌ
羊−抗−ヒト−Ｆｃγ−ＩｇＧの溶液各０．２ｍｌを供
給しかつ１時間恒温保持する。
【００７２】吸引濾過後、５０ｍｍｏｌ／ｌ ＨＥＰＥ
Ｓ緩衝液、０．１ｍｏｌ／ｌ ＮａＣｌ、ｐＨ７．０
（恒温保持緩衝液）中の１％ゼラチン水解物の溶液各
０．３ｍｌを凹部中に装入して残りのタンパク質結合部
位を飽和しかつ３０分間恒温保持する。
Ｓ緩衝液、０．１ｍｏｌ／ｌ ＮａＣｌ、ｐＨ７．０
（恒温保持緩衝液）中の１％ゼラチン水解物の溶液各
０．３ｍｌを凹部中に装入して残りのタンパク質結合部
位を飽和しかつ３０分間恒温保持する。
【００７３】吸引濾過後、培養上澄みの検量試料もしく
は稀釈液（恒温保持緩衝液中）各０．２ｍｌを凹部中に
ピペット滴加しかつ１時間恒温保持する。
は稀釈液（恒温保持緩衝液中）各０．２ｍｌを凹部中に
ピペット滴加しかつ１時間恒温保持する。
【００７４】吸引濾過後、モノクロナール抗体（ＭＡ
Ｋ）とペルオキシダーゼ（米国特許第４６５７８５３号
明細書、例３により製造）と２５ｍｇ／ｍｌ組換えＣＤ
４抗原（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｉｏ−Ｔｅｃｈｎｏｌｏ
ｇｉｅｓ Ｉｎｃ．社）とからの複合体の溶液（恒温保
持緩衝液中）各０．２ｍｌを凹部中に装入し、再度１時
間恒温保持する。
Ｋ）とペルオキシダーゼ（米国特許第４６５７８５３号
明細書、例３により製造）と２５ｍｇ／ｍｌ組換えＣＤ
４抗原（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｉｏ−Ｔｅｃｈｎｏｌｏ
ｇｉｅｓ Ｉｎｃ．社）とからの複合体の溶液（恒温保
持緩衝液中）各０．２ｍｌを凹部中に装入し、再度１時
間恒温保持する。
【００７５】各０．３ｍｌの５０ｍｍｏｌ／ｌ ＨＥＰ
ＥＳ緩衝液、０．１５ｍｏｌ／ｌＮａＣｌ、０．１％シ
ンペロニック（Ｓｙｎｐｅｒｏｎｉｃ：登録商標）Ｆ６
８で３回洗浄後、ＡＢＴＳ−基質−溶液［９，１ｍｍｏ
ｌ／ｌ ＡＢＴＳ（登録商標：２，２′−アジノ−ジ−
［３−エチル−ベンゾチアゾリン−スルホン酸（６）］
−ジアンモニウム塩）、１００ｍｍｏｌ／ｌリン酸塩／
クエン酸塩−緩衝液、ｐＨ５．０、１．４７ｍｍｏｌ／
ｌ過硼素酸ナトリウム］各０．２ｍｌをピペット装入し
かつ３０〜４５分間の恒温保持後、明光度を４０５ｎｍ
でＥＬＩＳＡリーダーで測定する。
ＥＳ緩衝液、０．１５ｍｏｌ／ｌＮａＣｌ、０．１％シ
ンペロニック（Ｓｙｎｐｅｒｏｎｉｃ：登録商標）Ｆ６
８で３回洗浄後、ＡＢＴＳ−基質−溶液［９，１ｍｍｏ
ｌ／ｌ ＡＢＴＳ（登録商標：２，２′−アジノ−ジ−
［３−エチル−ベンゾチアゾリン−スルホン酸（６）］
−ジアンモニウム塩）、１００ｍｍｏｌ／ｌリン酸塩／
クエン酸塩−緩衝液、ｐＨ５．０、１．４７ｍｍｏｌ／
ｌ過硼素酸ナトリウム］各０．２ｍｌをピペット装入し
かつ３０〜４５分間の恒温保持後、明光度を４０５ｎｍ
でＥＬＩＳＡリーダーで測定する。
【００７６】例 ６ 例１〜３に記載した方法を、細胞系３．１０−１／５Ｂ
１０（ＥＣＡＣＣ ９００９０７０２）から分泌される
ＣＤ４抗原に対する第２の抗体のキメラ化に同じように
適用した。この抗体はヒトＣＤ４の細胞外部分上で抗体
１５−１／Ｐ３／１４とは異なる抗原決定基を認識す
る。
１０（ＥＣＡＣＣ ９００９０７０２）から分泌される
ＣＤ４抗原に対する第２の抗体のキメラ化に同じように
適用した。この抗体はヒトＣＤ４の細胞外部分上で抗体
１５−１／Ｐ３／１４とは異なる抗原決定基を認識す
る。
【００７７】軽鎖（κ）のＶＪ領域を単離するのに使用
するプライマーは次の配列を有していた： ａ）軽鎖５′プライマー（プライマー１）：非翻訳領域
＋ＳａｌＩ部位＝３４マー
するプライマーは次の配列を有していた： ａ）軽鎖５′プライマー（プライマー１）：非翻訳領域
＋ＳａｌＩ部位＝３４マー
【００７８】
【化５】
【００７９】ｂ）軽鎖３′プライマー（プライマー
２）：Ｊ1−イントロン＋ＮｏｔＩ部位＝３５マー
２）：Ｊ1−イントロン＋ＮｏｔＩ部位＝３５マー
【００８０】
【化６】
【００８１】ｃ）重鎖５′プライマー（プライマー
１）：非翻訳領域＋ＳａｌＩ部位＝３８マー
１）：非翻訳領域＋ＳａｌＩ部位＝３８マー
【００８２】
【化７】
【００８３】ｄ）重鎖３′プライマー（プライマー
２）：Ｊ3イントロン＋ＮｏｔＩ部位＝３５マー
２）：Ｊ3イントロン＋ＮｏｔＩ部位＝３５マー
【００８４】
【化８】
【００８５】前記のプライマーを用いて重要な可変部
（軽鎖ではＶＤ領域もしくは重鎖ではＶＤＪ領域）を例
２によりＰＣＲで増幅させかつ例３に記載したように相
応する発現基本ベクターｐＵＨＷＫもしくはｐＵＨＷγ
１中にクローン化した。
（軽鎖ではＶＤ領域もしくは重鎖ではＶＤＪ領域）を例
２によりＰＣＲで増幅させかつ例３に記載したように相
応する発現基本ベクターｐＵＨＷＫもしくはｐＵＨＷγ
１中にクローン化した。
【００８６】次に、抗体３．１０−１／５Ｂ１０をコー
ドする遺伝子の軽鎖及び重鎖の非翻訳領域の部分範囲を
記載する。これらの配列から好適な５′プライマー（プ
ライマー１）を選択することができる（例えば前記の
ａ）及びｃ）参照）。
ドする遺伝子の軽鎖及び重鎖の非翻訳領域の部分範囲を
記載する。これらの配列から好適な５′プライマー（プ
ライマー１）を選択することができる（例えば前記の
ａ）及びｃ）参照）。
【００８７】 軽鎖（カッパ鎖）の非翻訳領域： ５′−ＧＣＡＧＣＴＧＣＣＡＧＧＡＧＣＣＴＡＧＡＡＧＣＡＴＣＣ ＴＣＴＣＡＴＣＴＡＴＴＣＴＣＡＧＡＧＡＴＧ−３′ 開始コドン 重鎖（γ１鎖）の非翻訳領域： ５′−ＡＣＡＧＴＣＣＣＴＧＡＡＣＡＣＡＣＴＧＡＣＴＣＴＡＡＣＣＡＴＧ− ３′ 開始コドン
【図１】ａ）はＬ鎖の可変部をコードするＤＮＡフラグ
メントの構成を示す図であり、 ｂ）はＨ鎖の可変部をコードするＤＮＡフラグメントの
構成を示す図である。
メントの構成を示す図であり、 ｂ）はＨ鎖の可変部をコードするＤＮＡフラグメントの
構成を示す図である。
【図２】Ｌ鎖のキメラ抗体遺伝子用の発現基本ベクター
の構成を示す図である。
の構成を示す図である。
【図３】Ｈ鎖のキメラ抗体遺伝子用の発現基本ベクター
の構成を示す図である。
の構成を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ブリギツテ カルーツア ドイツ連邦共和国 バート ハイルブルン ホツホフエルトアンガー ３
Claims (8)
- 【請求項１】 （ａ）ハイブリドーマ細胞系から、所望
の抗体を分泌する染色体ＤＮＡを単離し、 （ｂ）この染色体ＤＮＡを一本鎖に変換し、かつこの一
本鎖ＤＮＡを、抗体遺伝子の鋳型鎖の５′−非翻訳領域
からのヌクレオチド少なくとも１０個の配列に相補性で
ある範囲を含有するプライマー（１）及び抗体遺伝子の
非鋳型鎖のその都度のＪ−領域の３′−非翻訳領域から
のヌクレオチド少なくとも１０個の配列に相補性である
範囲を含有するプライマー（２）の２つのオリゴヌクレ
オチドプライマーと一緒に恒温保持し、 （ｃ）ＤＮＡポリメラーゼ及びデオキシリボヌクレオシ
ドトリホスフェートを添加してプライマーを延長させ、
その際にプライマーの間に存在する抗体遺伝子の部分範
囲で二本鎖ＤＮＡフラグメントが形成され、 （ｄ）このように形成された二本鎖ＤＮＡを一本鎖に変
性し、この一本鎖ＤＮＡを再度２つのオリゴヌクレオチ
ドプライマー（１）及び（２）と一緒にし、プライマー
を延長させて、二本鎖ＤＮＡを生成し、かつ （ｅ）工程（ｄ）の方法を場合により数回繰り返すこと
を特徴とする、抗体遺伝子の可変部をコードするＤＮＡ
フラグメントの単離法。 - 【請求項２】 相補性範囲の５′側に更に制限エンドヌ
クレアーゼ切断部位を含有するプライマー（１）及び
（２）を使用する請求項１記載の方法。 - 【請求項３】 請求項１又は２の方法により単離したＤ
ＮＡフラグメントを、抗体遺伝子の軽鎖又は重鎖の不変
部をコードするＤＮＡフラグメントを含有する基本ベク
ター中に導入し、その際に作動結合した可変部及び不変
部より成るキメラ抗体遺伝子が生成することを特徴とす
るキメラ抗体遺伝子の製法。 - 【請求項４】 好適な細胞を請求項３により製造した２
つのベクターで形質転換し、その際に一方のベクターは
キメラ抗体の重鎖の遺伝子を含有しかつ他方はこのキメ
ラ抗体の軽鎖の遺伝子を含有しており、安定なトランス
フェクション形成体を選択し、かつ活性抗体を常法で取
得することを特徴とする、キメラ抗体の取得法。 - 【請求項５】 ハイブリドーマ系１５−１／Ｐ３／１４
（ＥＣＡＣＣ ９００９０７０５）により分泌されるキ
メラ抗体を取得することを特徴とする請求項４記載の方
法。 - 【請求項６】 キメラ抗体の重鎖のベクターとしてｐＵ
ＨＷ ＣＤ４−γ１（ＤＳＭ６１５５）及びキメラ抗体
の軽鎖のベクターとしてｐＵＨＷ ＣＤ４−ｋ（ＤＳＭ
６１５６）を使用することを特徴とする請求項５記載の
方法。 - 【請求項７】 ハイブリドーマ系３．１０−１／５Ｂ１
０（ＥＣＡＣＣ ９００９０７０２）により分泌される
キメラ抗体を取得することを特徴とする請求項４記載の
方法。 - 【請求項８】 請求項４から７までのいずれか１項によ
り得られたキメラ抗体並びに場合により公知の助剤、添
加剤、担持物質及び填料を調製することを特徴とする医
薬の製法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE4033120A DE4033120A1 (de) | 1990-10-18 | 1990-10-18 | Verfahren zur herstellung von chimaeren antikoerpern |
| DE4033120.2 | 1990-10-18 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0584082A true JPH0584082A (ja) | 1993-04-06 |
Family
ID=6416577
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3270665A Pending JPH0584082A (ja) | 1990-10-18 | 1991-10-18 | 抗体遺伝子の可変部をコードするｄｎａフラグメントの単離法、キメラ抗体遺伝子の製法、キメラ抗体の取得法及び医薬の製法 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0481502B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0584082A (ja) |
| AT (1) | ATE122095T1 (ja) |
| DE (2) | DE4033120A1 (ja) |
| DK (1) | DK0481502T3 (ja) |
| ES (1) | ES2073089T3 (ja) |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6147500A (ja) * | 1984-08-15 | 1986-03-07 | Res Dev Corp Of Japan | キメラモノクロ−ナル抗体及びその製造法 |
| JPS632934A (ja) * | 1986-04-02 | 1988-01-07 | ザ ウエルカム フアウンデ−シヨン リミテツド | モノクロナ−ル抗体 |
| JPH02231567A (ja) * | 1989-01-10 | 1990-09-13 | Boehringer Mannheim Gmbh | 血清又は血液中の物質を診断検出する方法 |
| EP0388914A1 (de) * | 1989-03-24 | 1990-09-26 | BEHRINGWERKE Aktiengesellschaft | Monoklonale Antikörper (MAK) gegen tumorassoziierte Antigene, ihre Herstellung und Verwendung |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2919890B2 (ja) * | 1988-11-11 | 1999-07-19 | メディカル リサーチ カウンスル | 単一ドメインリガンド、そのリガンドからなる受容体、その製造方法、ならびにそのリガンドおよび受容体の使用 |
-
1990
- 1990-10-18 DE DE4033120A patent/DE4033120A1/de not_active Withdrawn
-
1991
- 1991-10-17 EP EP91117772A patent/EP0481502B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1991-10-17 AT AT91117772T patent/ATE122095T1/de not_active IP Right Cessation
- 1991-10-17 DK DK91117772.3T patent/DK0481502T3/da active
- 1991-10-17 ES ES91117772T patent/ES2073089T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1991-10-17 DE DE59105378T patent/DE59105378D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1991-10-18 JP JP3270665A patent/JPH0584082A/ja active Pending
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6147500A (ja) * | 1984-08-15 | 1986-03-07 | Res Dev Corp Of Japan | キメラモノクロ−ナル抗体及びその製造法 |
| JPS632934A (ja) * | 1986-04-02 | 1988-01-07 | ザ ウエルカム フアウンデ−シヨン リミテツド | モノクロナ−ル抗体 |
| JPH02231567A (ja) * | 1989-01-10 | 1990-09-13 | Boehringer Mannheim Gmbh | 血清又は血液中の物質を診断検出する方法 |
| EP0388914A1 (de) * | 1989-03-24 | 1990-09-26 | BEHRINGWERKE Aktiengesellschaft | Monoklonale Antikörper (MAK) gegen tumorassoziierte Antigene, ihre Herstellung und Verwendung |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE59105378D1 (de) | 1995-06-08 |
| EP0481502B1 (de) | 1995-05-03 |
| DE4033120A1 (de) | 1992-04-23 |
| EP0481502A3 (en) | 1992-11-19 |
| ES2073089T3 (es) | 1995-08-01 |
| EP0481502A2 (de) | 1992-04-22 |
| ATE122095T1 (de) | 1995-05-15 |
| DK0481502T3 (da) | 1995-10-02 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP2624314B2 (ja) | 相同組換えによるキメラ抗体の製造 | |
| Gillies et al. | High-level expression of chimeric antibodies using adapted cDNA variable region cassettes | |
| US5202238A (en) | Production of chimeric antibodies by homologous recombination | |
| JP2919890B2 (ja) | 単一ドメインリガンド、そのリガンドからなる受容体、その製造方法、ならびにそのリガンドおよび受容体の使用 | |
| US7098006B1 (en) | Chimeric antibody, pharmaceutical composition and process of its production | |
| TWI827531B (zh) | 基於使用增強表現基因座之製備抗體的組成物及方法 | |
| Martin et al. | Initiation and processing of two kappa immunoglobulin germ line transcripts in mouse B cells | |
| KR20100065332A (ko) | 제조 방법 | |
| JPH0687899A (ja) | 人工抗体 | |
| KR20220025839A (ko) | 유전자이식 포유동물 및 이의 사용 방법 | |
| EP0678523B1 (en) | Recombinant anti-hiv antibody and preparation thereof | |
| KR20200085781A (ko) | 선택된 항체를 발현하도록 유전자 변형된 b 세포를 생산하기 위한 시스템 및 방법 | |
| JPH04141095A (ja) | 組換え抗ｈｉｖ改変抗体および改変抗体の調製方法 | |
| US20220154207A1 (en) | Mammalian cell lines with gene knockout | |
| JP2023529846A (ja) | 共通軽鎖免疫グロブリン遺伝子座を有する遺伝子改変非ヒト動物 | |
| JP2000508881A (ja) | 免疫グロブリン遺伝子の再編成されたゲノム可変領域のｐｃｒ増幅 | |
| KÜTEMEIER et al. | Rapid isolation of immunoglobulin variable genes from cell lysates of rat hybridomas by polymerase chain reaction | |
| US20220364125A1 (en) | Genome engineering the human immunoglobulin locus to express recombinant binding domain molecules | |
| Wood et al. | An internal ribosome binding site can be used to select for homologous recombinants at an immunoglobulin heavy-chain locus. | |
| JPH0584082A (ja) | 抗体遺伝子の可変部をコードするｄｎａフラグメントの単離法、キメラ抗体遺伝子の製法、キメラ抗体の取得法及び医薬の製法 | |
| Gaff et al. | RNA splicing generates alternate forms of germline immunoglobulin α heavy chain transcripts | |
| JP4304274B2 (ja) | ニワトリ−ヒトキメラ抗体発現用ベクターおよびこれを用いたニワトリ−ヒトキメラ抗体生産方法、並びにその利用 | |
| Walls et al. | Vectors for the expression of PCR-amplified immunoglobulin variable domains with human constant regions | |
| Lenz et al. | Expression of heterobispecific antibodies by genes transfected into producer hybridoma cells | |
| Khamlichi et al. | The effect of intron sequences on expression levels of Ig cDNAs |