JPH0576349A - 制限欠失突然変異体 - Google Patents
制限欠失突然変異体Info
- Publication number
- JPH0576349A JPH0576349A JP3229653A JP22965391A JPH0576349A JP H0576349 A JPH0576349 A JP H0576349A JP 3229653 A JP3229653 A JP 3229653A JP 22965391 A JP22965391 A JP 22965391A JP H0576349 A JPH0576349 A JP H0576349A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- restriction
- bacillus thuringiensis
- bacillus
- dna
- vector
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
- C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/75—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Bacillus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/07—Bacillus
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Virology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【目的】バチラス・スリンギエンシス（Ｂｔ）またはバ
チラス・セレウス（Ｂｃ）の部分的欠失突然変異体およ
びその製法、該変異体を用いるＢｔまたはＢｃの制限障
壁を克服する方法の提供。 【構成】突然変異していない出発菌株に固有の制限障壁
内に部分的欠失を有し、そしてそれ故に、ＢｔまたはＢ
ｃにおいて制限に自然にさらされている異種仲介宿主か
らのベクターＤＮＡが使用されるとき、上記の突然変異
していない出発菌株に比べ著しく良好に形質転換され得
るＢｔまたはＢｃの突然変異体（特にＢｔクルスタキＨ
Ｄ１ｃｒｙＢ Ｒｅｓ９）、自然突然変異体の特定の増
菌に基づく上記制限欠失突然変異体の製法、上記制限欠
失突然変異体を用いてＢｔまたはＢｃにおいて遺伝子を
クローニングする方法。
チラス・セレウス（Ｂｃ）の部分的欠失突然変異体およ
びその製法、該変異体を用いるＢｔまたはＢｃの制限障
壁を克服する方法の提供。 【構成】突然変異していない出発菌株に固有の制限障壁
内に部分的欠失を有し、そしてそれ故に、ＢｔまたはＢ
ｃにおいて制限に自然にさらされている異種仲介宿主か
らのベクターＤＮＡが使用されるとき、上記の突然変異
していない出発菌株に比べ著しく良好に形質転換され得
るＢｔまたはＢｃの突然変異体（特にＢｔクルスタキＨ
Ｄ１ｃｒｙＢ Ｒｅｓ９）、自然突然変異体の特定の増
菌に基づく上記制限欠失突然変異体の製法、上記制限欠
失突然変異体を用いてＢｔまたはＢｃにおいて遺伝子を
クローニングする方法。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はバチラス・スリンギエン
シス（Bacillus thuringiensis）およびバチラス・セレ
ウス(Bacillus cereus) の部分的制限欠失突然変異体な
らびに該突然変異体の製造方法に関する。本発明はま
た、上記制限欠失突然変異体を用いるバチラス・スリン
ギエンシスおよび／またはバチラス・セレウスにおける
制限障壁を克服する方法に関する。
シス（Bacillus thuringiensis）およびバチラス・セレ
ウス(Bacillus cereus) の部分的制限欠失突然変異体な
らびに該突然変異体の製造方法に関する。本発明はま
た、上記制限欠失突然変異体を用いるバチラス・スリン
ギエンシスおよび／またはバチラス・セレウスにおける
制限障壁を克服する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】制限／修飾系は微生物において非常に共
通しており、そして相当前から知られていた。６００種
以上の制限酵素および約１００種の関連メチラーゼが今
まで科学的文献に記載されてきた〔１１〕（〔 〕内の
数字は下に示す参考文献一覧の数字と一致する）。
通しており、そして相当前から知られていた。６００種
以上の制限酵素および約１００種の関連メチラーゼが今
まで科学的文献に記載されてきた〔１１〕（〔 〕内の
数字は下に示す参考文献一覧の数字と一致する）。
【０００３】これまで記載された制限／修飾系のうちい
わゆるクラスＩＩ系に属するものがはるかに多い。これ
らのクラスＩＩ系は低い程度の複雑さにより特徴づけら
れ、従って比較的単純なタンパク質を使用する。クラス
ＩＩ制限酵素は、例えば特定のＤＮＡ配列が関連のメチ
ラーゼによりまだ特異的にメチル化されていないという
条件で、該ＤＮＡ配列を認識し、そして切断することが
できる。いずれの酵素もＡＴＰを必要としない。これら
の酵素〔メチラーゼ〕をコードする遺伝子はバクテリア
のゲノム上で互いに近接してしばしば存在する。
わゆるクラスＩＩ系に属するものがはるかに多い。これ
らのクラスＩＩ系は低い程度の複雑さにより特徴づけら
れ、従って比較的単純なタンパク質を使用する。クラス
ＩＩ制限酵素は、例えば特定のＤＮＡ配列が関連のメチ
ラーゼによりまだ特異的にメチル化されていないという
条件で、該ＤＮＡ配列を認識し、そして切断することが
できる。いずれの酵素もＡＴＰを必要としない。これら
の酵素〔メチラーゼ〕をコードする遺伝子はバクテリア
のゲノム上で互いに近接してしばしば存在する。
【０００４】より複雑なクラスＩおよびＩＩＩのほとん
ど知られていない制限／修飾系は大腸菌、サルモネラ菌
および好血液性細菌に由来する〔１１〕。
ど知られていない制限／修飾系は大腸菌、サルモネラ菌
および好血液性細菌に由来する〔１１〕。
【０００５】これらの「古典的」系に他に、最初に大腸
菌において、そして次にその他の種において、クラスＩ
Ｉ系の場合とは逆に、系が特異的にメチル化されている
ときだけＤＮＡ配列を認識し、そして切断する制限酵素
が近年見出された〔２１，２４，１５〕。
菌において、そして次にその他の種において、クラスＩ
Ｉ系の場合とは逆に、系が特異的にメチル化されている
ときだけＤＮＡ配列を認識し、そして切断する制限酵素
が近年見出された〔２１，２４，１５〕。
【０００６】クラスＩＩの古典的制限酵素はｒＤＮＡ技
術において最も重要な道具の一つであり、それ故に現代
の分子遺伝学の基礎的要素の一つを構成する。それらの
主要な応用は組換えＤＮＡ分子の構築においてである。
術において最も重要な道具の一つであり、それ故に現代
の分子遺伝学の基礎的要素の一つを構成する。それらの
主要な応用は組換えＤＮＡ分子の構築においてである。
【０００７】しかしながら、細胞におけるそれらの天然
の作用は望ましくない外来ＤＮＡ、例えばウイルスまた
はバクテリアＤＮＡから防御することである。細胞内に
侵入した外来ＤＮＡの分解に基づいたこの天然の作用の
ために、相当激しく低下した形質転換頻度を組換えＤＮ
Ａでの操作の場合に予想しなければならない。これはい
わゆる制限障壁の存在ということばで呼ばれている〔１
７，１８，McDonald &Burke (1984) 〕。制限作用は組
換えプラスミドの大きさが増すにつれて高まるので、わ
ずかな制限障壁でさえも代表的な遺伝子バンクの構築を
妨げるには実質的に十分であり得る。それ故に、制限が
存在する場合、十分に完全な遺伝子は大きな困難さを伴
ってのみ単離され得る。バチラス・サブチリス（Bacill
us subtilis ）の場合、例えば、その菌株に生じる制限
酵素ＢｓｕＭ〔２７，１０，６〕がその生物中の組換え
プラスミドの構造的不安定性の主な原因の一つである
〔８〕ことが示されている。
の作用は望ましくない外来ＤＮＡ、例えばウイルスまた
はバクテリアＤＮＡから防御することである。細胞内に
侵入した外来ＤＮＡの分解に基づいたこの天然の作用の
ために、相当激しく低下した形質転換頻度を組換えＤＮ
Ａでの操作の場合に予想しなければならない。これはい
わゆる制限障壁の存在ということばで呼ばれている〔１
７，１８，McDonald &Burke (1984) 〕。制限作用は組
換えプラスミドの大きさが増すにつれて高まるので、わ
ずかな制限障壁でさえも代表的な遺伝子バンクの構築を
妨げるには実質的に十分であり得る。それ故に、制限が
存在する場合、十分に完全な遺伝子は大きな困難さを伴
ってのみ単離され得る。バチラス・サブチリス（Bacill
us subtilis ）の場合、例えば、その菌株に生じる制限
酵素ＢｓｕＭ〔２７，１０，６〕がその生物中の組換え
プラスミドの構造的不安定性の主な原因の一つである
〔８〕ことが示されている。
【０００８】それ故に、クラスＩＩの制限酵素により引
き起こされる制限障壁を克服することは、分子遺伝子学
において解決されるべき主要な問題の一つであったし、
そしてあり続ける。これは種々の方法で今日達成される
ことができる。
き起こされる制限障壁を克服することは、分子遺伝子学
において解決されるべき主要な問題の一つであったし、
そしてあり続ける。これは種々の方法で今日達成される
ことができる。
【０００９】一つの可能なアプローチは、その宿主のＤ
ＮＡが制限なしに実際の宿主に移入され得る非制限性仲
介宿主を使用することである。このアプローチは、例え
ばメチル化特異的制限系に適当である。仲介宿主とし
て、例えば大腸菌の非メチル化突然変異体または天然の
メチル化欠失株〔１５，欧州特許第０３４１７７６Ａ２
号〕が使用されてもよい。しかしながら、このアプロー
チはかなり複雑であり、そしてこれらのメチル化欠失大
腸菌株は形質転換が一般に困難で、理想的な宿主株では
全然ないという付加的な欠点を有する。
ＮＡが制限なしに実際の宿主に移入され得る非制限性仲
介宿主を使用することである。このアプローチは、例え
ばメチル化特異的制限系に適当である。仲介宿主とし
て、例えば大腸菌の非メチル化突然変異体または天然の
メチル化欠失株〔１５，欧州特許第０３４１７７６Ａ２
号〕が使用されてもよい。しかしながら、このアプロー
チはかなり複雑であり、そしてこれらのメチル化欠失大
腸菌株は形質転換が一般に困難で、理想的な宿主株では
全然ないという付加的な欠点を有する。
【００１０】別のアプローチにおいて、熱に不安定な制
限酵素を生体内で一時的に不活性化させる〔２，７〕。
このアプローチは宿主および制限酵素の相対的な熱感受
性により制限される。
限酵素を生体内で一時的に不活性化させる〔２，７〕。
このアプローチは宿主および制限酵素の相対的な熱感受
性により制限される。
【００１１】存在する制限障壁を克服する他の可能な手
段は使用されるＤＮＡの特異的メチル化である。ある種
の制限系に対する特異的メチラーゼが公知であって、精
製されているならば、ＤＮＡは形質転換前に試験管内で
特異的にメチル化され、そのようにして制限から保護さ
れ得る〔２８〕。相当するメチラーゼ遺伝子がクローン
化されている場合には、ＤＮＡが形質転換され適当な宿
主において生体内で直接メチル化されることは原理的に
は可能である。
段は使用されるＤＮＡの特異的メチル化である。ある種
の制限系に対する特異的メチラーゼが公知であって、精
製されているならば、ＤＮＡは形質転換前に試験管内で
特異的にメチル化され、そのようにして制限から保護さ
れ得る〔２８〕。相当するメチラーゼ遺伝子がクローン
化されている場合には、ＤＮＡが形質転換され適当な宿
主において生体内で直接メチル化されることは原理的に
は可能である。
【００１２】しかしながら、遺伝子工学に対しておそら
く最も満足できる解決、そしてそれ故に好ましい解決
は、制限障壁に関連する制限酵素を合成しない突然変異
体の単離である。宿主菌株として使用されるほとんどの
大腸菌Ｋ株は、例えばクラスＩの酵素であるＥｃｏＫに
対する遺伝子に突然変異を有する。より高度な真核細胞
のＤＮＡは一般に強くメチル化されるから、最近、メチ
ル化特異的制限系ｍｃｒＡ、ｍｃｒＢおよびｍｒｒのた
めの突然変異をさらに有する大腸菌株が構築された〔１
２〕。このアプローチは比較的多くの制限系を有する菌
株、例えばストレプトマイセス・フラジアエ（Streptom
yces fradiae）において困難である〔１７〕。
く最も満足できる解決、そしてそれ故に好ましい解決
は、制限障壁に関連する制限酵素を合成しない突然変異
体の単離である。宿主菌株として使用されるほとんどの
大腸菌Ｋ株は、例えばクラスＩの酵素であるＥｃｏＫに
対する遺伝子に突然変異を有する。より高度な真核細胞
のＤＮＡは一般に強くメチル化されるから、最近、メチ
ル化特異的制限系ｍｃｒＡ、ｍｃｒＢおよびｍｒｒのた
めの突然変異をさらに有する大腸菌株が構築された〔１
２〕。このアプローチは比較的多くの制限系を有する菌
株、例えばストレプトマイセス・フラジアエ（Streptom
yces fradiae）において困難である〔１７〕。
【００１３】しかしながら、制限障壁は大腸菌に限定さ
れておらず、クローニング実験に使用されるその他の非
常に多くの微生物においても見出される。
れておらず、クローニング実験に使用されるその他の非
常に多くの微生物においても見出される。
【００１４】バチラス・スリンギエンシスおよびバチラ
ス・セレウスにおいて、これらのバチラス種を効率的に
形質転換することができるようになったのはごく最近で
あり〔２３〕、そしてそれ故にこれらの生物における制
限／修飾系の研究にごく限定された興味しかなかったか
ら、制限／修飾系はこれまでほとんど知られていなかっ
た。従って、制限障壁はこれまでバチラス・スリンギエ
ンシスおよびバチラス・セレウスと関連して補足的にの
み記載されていた。文献〔１〕には例えばバチラス・ス
リンギエンシス イスラエンシス変種のＡｖａＩＩアイ
ソシゾマーが記載されている。
ス・セレウスにおいて、これらのバチラス種を効率的に
形質転換することができるようになったのはごく最近で
あり〔２３〕、そしてそれ故にこれらの生物における制
限／修飾系の研究にごく限定された興味しかなかったか
ら、制限／修飾系はこれまでほとんど知られていなかっ
た。従って、制限障壁はこれまでバチラス・スリンギエ
ンシスおよびバチラス・セレウスと関連して補足的にの
み記載されていた。文献〔１〕には例えばバチラス・ス
リンギエンシス イスラエンシス変種のＡｖａＩＩアイ
ソシゾマーが記載されている。
【００１５】しかしながら、バチラス・スリンギエンシ
スおよび／またはバチラス・セレウスの効率的な形質転
換のために、そしてそれ故にクローニングビヒクルとし
てこれらの生物の使用のために新規に創成された手段と
関連して、これらの制限障壁はバチラス・スリンギエン
シスおよびバチラス・セレウスの場合もまた問題となっ
ている。
スおよび／またはバチラス・セレウスの効率的な形質転
換のために、そしてそれ故にクローニングビヒクルとし
てこれらの生物の使用のために新規に創成された手段と
関連して、これらの制限障壁はバチラス・スリンギエン
シスおよびバチラス・セレウスの場合もまた問題となっ
ている。
【００１６】例えばバチラス・スリンギエンシスやバチ
ラス・サブチリスおよび大腸菌の両方において複製し得
るシャトルベクターがバチラス・スリンギエンシス ク
ルスタキ(kurstaki)ＨＤ１変種の結晶体を含まない誘導
体であるバチラス・スリンギエンシスＨＤ１ｃｒｙＢ株
のエレクトロポレーションのために使用されるならば
〔２５〕、達成される形質転換頻度は、プラスミドＤＮ
Ａが単離される菌株に主として依存する。各々の場合に
おいて得られた絶対的値は変化し得るが、しかし相対的
な頻度は実質的に一定である。
ラス・サブチリスおよび大腸菌の両方において複製し得
るシャトルベクターがバチラス・スリンギエンシス ク
ルスタキ(kurstaki)ＨＤ１変種の結晶体を含まない誘導
体であるバチラス・スリンギエンシスＨＤ１ｃｒｙＢ株
のエレクトロポレーションのために使用されるならば
〔２５〕、達成される形質転換頻度は、プラスミドＤＮ
Ａが単離される菌株に主として依存する。各々の場合に
おいて得られた絶対的値は変化し得るが、しかし相対的
な頻度は実質的に一定である。
【００１７】形質転換頻度におけるこれらの相違の代表
例は表１に示されている。結果は、例えば「シャトル」
ベクターｐＨＹ３００ＰＬＫの形質転換は、該プラスミ
ドがバチラス・スリンギエンシス宿主よりむしろ大腸菌
宿主から単離されるとき、少なくとも１０3 倍低いこと
を示す。由来菌株がバチラス・サブチリスであれば、形
質転換頻度は約１０倍低下されている。一方、プラスミ
ドＤＮＡがバチラス・スリンギエンシスＨＤ１ｃｒｙＢ
株から再単離されるならば、高頻度でＨＤ１ｃｒｙＢ内
に逆に形質転換され得る。
例は表１に示されている。結果は、例えば「シャトル」
ベクターｐＨＹ３００ＰＬＫの形質転換は、該プラスミ
ドがバチラス・スリンギエンシス宿主よりむしろ大腸菌
宿主から単離されるとき、少なくとも１０3 倍低いこと
を示す。由来菌株がバチラス・サブチリスであれば、形
質転換頻度は約１０倍低下されている。一方、プラスミ
ドＤＮＡがバチラス・スリンギエンシスＨＤ１ｃｒｙＢ
株から再単離されるならば、高頻度でＨＤ１ｃｒｙＢ内
に逆に形質転換され得る。
【００１８】この制限作用は、追加のＤＮＡがシャトル
ベクター中に、例えばプロトキシン遺伝子の形態でクロ
ーン化されているならば、さらに高まる。この場合、制
限障壁はバチラス・スリンギエンシス宿主内への形質転
換の場合に再び著しく高まったことがわかる〔表４，ｐ
ＸＩ２０４，ｐＸＩ９３参照〕。これに対する理由はお
そらく、ベクター中に付加的に組み込まれたＤＮＡが、
仮定された宿主特異的〔ＨＤ１ｃｒｙＢ〕酵素に対する
攻撃の付加的部位を表すその他の制限切断部位を有する
ということである。これらの制限障壁は約１０4 −１０
5 倍の値に達し得、これはこれらのシャトルベクターを
用いるＨＤ１ｃｒｙＢの成功裏の形質転換の可能性を非
常に低くする。
ベクター中に、例えばプロトキシン遺伝子の形態でクロ
ーン化されているならば、さらに高まる。この場合、制
限障壁はバチラス・スリンギエンシス宿主内への形質転
換の場合に再び著しく高まったことがわかる〔表４，ｐ
ＸＩ２０４，ｐＸＩ９３参照〕。これに対する理由はお
そらく、ベクター中に付加的に組み込まれたＤＮＡが、
仮定された宿主特異的〔ＨＤ１ｃｒｙＢ〕酵素に対する
攻撃の付加的部位を表すその他の制限切断部位を有する
ということである。これらの制限障壁は約１０4 −１０
5 倍の値に達し得、これはこれらのシャトルベクターを
用いるＨＤ１ｃｒｙＢの成功裏の形質転換の可能性を非
常に低くする。
【００１９】この場合において、上記プラスミドは、そ
れらがＨＤ１ｃｒｙＢから予め単離されたときだけ、
「正常に」ＨＤ１ｃｒｙＢ内に形質転換され得る。しか
しながら、非常に頻繁に異種仲介宿主においてＤＮＡを
クローン化することは望ましく、多くの場合、その宿主
はバチラス・スリンギエンシスおよび／またはバチラス
・セレウス中に存在する制限系に非適合性であるか、ま
たはわずかに適合性であるにすぎない。異種の非適合性
仲介宿主から予め単離されたベクターＤＮＡでのバチラ
ス・スリンギエンシスおよび／またはバチラス・セレウ
スの形質転換は全く満足できない結果をしばしば導く。
れらがＨＤ１ｃｒｙＢから予め単離されたときだけ、
「正常に」ＨＤ１ｃｒｙＢ内に形質転換され得る。しか
しながら、非常に頻繁に異種仲介宿主においてＤＮＡを
クローン化することは望ましく、多くの場合、その宿主
はバチラス・スリンギエンシスおよび／またはバチラス
・セレウス中に存在する制限系に非適合性であるか、ま
たはわずかに適合性であるにすぎない。異種の非適合性
仲介宿主から予め単離されたベクターＤＮＡでのバチラ
ス・スリンギエンシスおよび／またはバチラス・セレウ
スの形質転換は全く満足できない結果をしばしば導く。
【００２０】
【発明が解決しようとする課題】それ故に、本発明の範
囲内で解決すべき課題は主として、バチラス・スリンギ
エンシスおよび／またはバチラス・セレウスにおける制
限障壁を同定および特徴づけること、そしてこれらの障
壁を克服する方法を開発することだった。この課題は、
驚くべきことに、以下の詳細な記載から詳しく理解され
得るように、バチラス・スリンギエンシスの部分的制限
欠失突然変異体を利用可能にすることにより、今では本
発明の範囲内で解決されている。
囲内で解決すべき課題は主として、バチラス・スリンギ
エンシスおよび／またはバチラス・セレウスにおける制
限障壁を同定および特徴づけること、そしてこれらの障
壁を克服する方法を開発することだった。この課題は、
驚くべきことに、以下の詳細な記載から詳しく理解され
得るように、バチラス・スリンギエンシスの部分的制限
欠失突然変異体を利用可能にすることにより、今では本
発明の範囲内で解決されている。
【００２１】
【課題を解決するための手段】それ故に、本発明は特
に、突然変異していない出発菌株に固有の制限障壁内に
部分的欠失を有し、そしてそれ故に、バチラス・スリン
ギエンシスおよび／またはバチラス・セレウスにおいて
制限に自然にさらされている異種仲介宿主からのベクタ
ーＤＮＡが使用されるとき、上記の突然変異していない
出発菌株に比べ著しく良好に形質転換され得るバチラス
・スリンギエンシスおよび／またはバチラス・セレウス
の突然変異体に関する。
に、突然変異していない出発菌株に固有の制限障壁内に
部分的欠失を有し、そしてそれ故に、バチラス・スリン
ギエンシスおよび／またはバチラス・セレウスにおいて
制限に自然にさらされている異種仲介宿主からのベクタ
ーＤＮＡが使用されるとき、上記の突然変異していない
出発菌株に比べ著しく良好に形質転換され得るバチラス
・スリンギエンシスおよび／またはバチラス・セレウス
の突然変異体に関する。
【００２２】本発明の範囲内で、異種仲介宿主は、ベク
ターＤＮＡのクローニングに適当であり、そしてクロー
ニングされるべきＤＮＡが最初に単離されたバチラス・
スリンギエンシスおよび／またはバチラス・セレウスと
少なくとも同一でない宿主有機体であると理解されるべ
きである。
ターＤＮＡのクローニングに適当であり、そしてクロー
ニングされるべきＤＮＡが最初に単離されたバチラス・
スリンギエンシスおよび／またはバチラス・セレウスと
少なくとも同一でない宿主有機体であると理解されるべ
きである。
【００２３】本発明は特に、非適合性仲介宿主、例えば
大腸菌および／またはバチラス・サブチリスからのシャ
トルベクターが使用されるとき、突然変異していない出
発菌株に比べ著しく良好に、好ましくは１０2 倍以上、
とりわけ１０2 −１０4 倍形質転換され得るバチラス・
スリンギエンシスおよび／またはバチラス・セレウスの
部分的制限欠失突然変異体に関する。
大腸菌および／またはバチラス・サブチリスからのシャ
トルベクターが使用されるとき、突然変異していない出
発菌株に比べ著しく良好に、好ましくは１０2 倍以上、
とりわけ１０2 −１０4 倍形質転換され得るバチラス・
スリンギエンシスおよび／またはバチラス・セレウスの
部分的制限欠失突然変異体に関する。
【００２４】本発明の範囲内で非適合性仲介宿主は、本
発明の範囲内に開示された制限系を有するバチラス・ス
リンギエンシスまたはバチラス・セレウス株内に形質転
換した後にＤＮＡを制限から有効に保護するための機構
がなんら発見されていなかった宿主有機体であると理解
されるべきである。
発明の範囲内に開示された制限系を有するバチラス・ス
リンギエンシスまたはバチラス・セレウス株内に形質転
換した後にＤＮＡを制限から有効に保護するための機構
がなんら発見されていなかった宿主有機体であると理解
されるべきである。
【００２５】本発明の特に好ましい実施態様は、大腸菌
および／またはバチラス・サブチリスからのシャトルベ
クターが使用されるとき、突然変異していない出発菌株
のものに比べ、使用される特定の形質転換ベクターに応
じて、１０2 倍以上、とりわけ１０2 −１０4 倍良好で
ある形質転換性を示すバチラス・スリンギエンシスＨＤ
１ｃｒｙＢ株の部分的制限欠失突然変異体である。
および／またはバチラス・サブチリスからのシャトルベ
クターが使用されるとき、突然変異していない出発菌株
のものに比べ、使用される特定の形質転換ベクターに応
じて、１０2 倍以上、とりわけ１０2 −１０4 倍良好で
ある形質転換性を示すバチラス・スリンギエンシスＨＤ
１ｃｒｙＢ株の部分的制限欠失突然変異体である。
【００２６】バチラス・スリンギエンシスＨＤ１ｃｒｙ
Ｂ株からの自然突然変異により得られ、そしてそれ自体
公知の増菌方法により入手され得る部分的制限欠失突然
変異体バチラス・スリンギエンシス クルスタキＨＤ１
ｃｒｙＢ Ｒｅｓ９変種、およびその菌株から直接もし
くは間接的に誘導され、そして出発菌株の制限低下特徴
を依然として有するその突然変異体もしくは変種が本発
明の範囲内で特に好ましい。
Ｂ株からの自然突然変異により得られ、そしてそれ自体
公知の増菌方法により入手され得る部分的制限欠失突然
変異体バチラス・スリンギエンシス クルスタキＨＤ１
ｃｒｙＢ Ｒｅｓ９変種、およびその菌株から直接もし
くは間接的に誘導され、そして出発菌株の制限低下特徴
を依然として有するその突然変異体もしくは変種が本発
明の範囲内で特に好ましい。
【００２７】本発明はまた、上記制限欠失突然変異体の
製造方法に関する。
製造方法に関する。
【００２８】減じられた制限障壁を有する自然突然変異
体が連続した数回の形質転換および選択サイクルにより
増菌され、異なる選択マーカーをコードしそして十分に
高い率の形質転換、好ましくは１０6 ないし１０8 個の
形質転換体の形質転換率を保証する形質転換シャトルベ
クターが好ましくは使用され、そして減じられた制限障
壁を有する他に、高度の形質転換効率を依然として示す
突然変異体が選択される、方法が特に好ましい。
体が連続した数回の形質転換および選択サイクルにより
増菌され、異なる選択マーカーをコードしそして十分に
高い率の形質転換、好ましくは１０6 ないし１０8 個の
形質転換体の形質転換率を保証する形質転換シャトルベ
クターが好ましくは使用され、そして減じられた制限障
壁を有する他に、高度の形質転換効率を依然として示す
突然変異体が選択される、方法が特に好ましい。
【００２９】本発明はさらに、制限陰性突然変異体、特
に制限陰性突然変異体バチラス・スリンギエンシスＨＤ
１ｃｒｙＢ Ｒｅｓ９を使用してバチラス・スリンギエ
ンシスおよび／またはバチラス・セレウスにおける制限
障壁を低下させる方法に関する。
に制限陰性突然変異体バチラス・スリンギエンシスＨＤ
１ｃｒｙＢ Ｒｅｓ９を使用してバチラス・スリンギエ
ンシスおよび／またはバチラス・セレウスにおける制限
障壁を低下させる方法に関する。
【００３０】本発明はまた、制限陰性突然変異体、特に
制限陰性突然変異体バチラス・スリンギエンシスＨＤ１
ｃｒｙＢ Ｒｅｓ９が、挿入されたＤＮＡをメチル化す
ることにより、バチラス・スリンギエンシスおよび／ま
たはバチラス・セレウスに固有の制限酵素による消化か
ら挿入されたＤＮＡを保護し、そのようにしてこの方法
の効率をさらに高める特異的メチラーゼと組み合わせて
使用されるバチラス・スリンギエンシスおよび／または
バチラス・セレウスにおける制限障壁を低下させる方法
に関する。
制限陰性突然変異体バチラス・スリンギエンシスＨＤ１
ｃｒｙＢ Ｒｅｓ９が、挿入されたＤＮＡをメチル化す
ることにより、バチラス・スリンギエンシスおよび／ま
たはバチラス・セレウスに固有の制限酵素による消化か
ら挿入されたＤＮＡを保護し、そのようにしてこの方法
の効率をさらに高める特異的メチラーゼと組み合わせて
使用されるバチラス・スリンギエンシスおよび／または
バチラス・セレウスにおける制限障壁を低下させる方法
に関する。
【００３１】本発明の範囲内で規定されるように、制限
陰性または制限欠失突然変異体は、大腸菌から単離され
たシャトルベクターにより、突然変異していない出発菌
株のものに比べ１０2 倍以上良好に形質転換され得るも
のである。しかしながら、自然突然変異はバチラス・ス
リンギエンシスおよびバチラス・セレウスの場合ごくま
れにしか（１０-6−１０-8）通常起こらない。そこでこ
れらのごく少数の突然変異体は最初に公知の増菌方法の
一つにより増菌されなければならない。これは、好まし
くは、最も期待できる形質転換体を各サイクルの終わり
に選択し、そして次の形質転換／選択サイクルに再び使
用する形質転換と選択とからなるサイクルを数回、好ま
しくは１ないし８回行うことにより達成され得る。これ
らのごく少数の突然変異体の一つが一旦形質転換された
ら、１０2 −１０3 倍の増菌が形質転換／選択からなる
各々の新しいサイクルにおいて期待され得る。すなわ
ち、ほんの数回のサイクルの後に、細胞集団は大多数の
突然変異細胞からなるであろう。
陰性または制限欠失突然変異体は、大腸菌から単離され
たシャトルベクターにより、突然変異していない出発菌
株のものに比べ１０2 倍以上良好に形質転換され得るも
のである。しかしながら、自然突然変異はバチラス・ス
リンギエンシスおよびバチラス・セレウスの場合ごくま
れにしか（１０-6−１０-8）通常起こらない。そこでこ
れらのごく少数の突然変異体は最初に公知の増菌方法の
一つにより増菌されなければならない。これは、好まし
くは、最も期待できる形質転換体を各サイクルの終わり
に選択し、そして次の形質転換／選択サイクルに再び使
用する形質転換と選択とからなるサイクルを数回、好ま
しくは１ないし８回行うことにより達成され得る。これ
らのごく少数の突然変異体の一つが一旦形質転換された
ら、１０2 −１０3 倍の増菌が形質転換／選択からなる
各々の新しいサイクルにおいて期待され得る。すなわ
ち、ほんの数回のサイクルの後に、細胞集団は大多数の
突然変異細胞からなるであろう。
【００３２】自然突然変異はまれであり（１０-6−１０
-8）、そのためにこれらの突然変異体の一つが形質転換
されるであろう可能性は相当に低いから、高率の形質転
換、好ましくは少なくとも１０6 ないし１０8 の形質転
換率が達成される形質転換条件が選択されなければなら
ない。これは特に最初の２回の形質転換サイクルに当て
はまる。これらの陽性形質転換体は次に増菌され、同定
され、そして最後に形質転換／選択サイクルでさらに単
離され得る。
-8）、そのためにこれらの突然変異体の一つが形質転換
されるであろう可能性は相当に低いから、高率の形質転
換、好ましくは少なくとも１０6 ないし１０8 の形質転
換率が達成される形質転換条件が選択されなければなら
ない。これは特に最初の２回の形質転換サイクルに当て
はまる。これらの陽性形質転換体は次に増菌され、同定
され、そして最後に形質転換／選択サイクルでさらに単
離され得る。
【００３３】制限欠失突然変異体の単離に伴う特別な困
難は不所望の突然変異体の出現を避けることである。
難は不所望の突然変異体の出現を避けることである。
【００３４】従って、例えば、自然の、一般に染色体に
コードされている耐性突然変異体の増菌は、各々の新し
い形質転換／選択サイクルにおいて、好ましくは異なる
選択マーカーを有するプラスミドを用いることにより、
避けるか、または少なくともできるだけ低く保持され得
る。
コードされている耐性突然変異体の増菌は、各々の新し
い形質転換／選択サイクルにおいて、好ましくは異なる
選択マーカーを有するプラスミドを用いることにより、
避けるか、または少なくともできるだけ低く保持され得
る。
【００３５】それ故に、制限欠失突然変異体を増菌する
ために、陽性形質転換体の特異的および選択的選出を可
能にする効率的に形質転換し得るベクターを使用するこ
とは好ましい。適当なベクターが、該ベクターで形質転
換された細胞が容易に認識され、そして引続き選択され
ることを可能にする特徴を宿主細胞に付与する１種また
はそれ以上のマーカー遺伝子を含むことが好ましい。抗
生物質耐性をコードするマーカー遺伝子が好ましい。適
当な耐性遺伝子のいくつかの例は、特に、抗生物質アン
ピシリン、クロラムフェニコール、エリスロマイシン、
テトラサイクリン、ヒグロマイシン、Ｇ４１８、カナマ
イシン、ブレオマイシン、ネオマイシンまたはチオスト
レプトンをコードするものである。
ために、陽性形質転換体の特異的および選択的選出を可
能にする効率的に形質転換し得るベクターを使用するこ
とは好ましい。適当なベクターが、該ベクターで形質転
換された細胞が容易に認識され、そして引続き選択され
ることを可能にする特徴を宿主細胞に付与する１種また
はそれ以上のマーカー遺伝子を含むことが好ましい。抗
生物質耐性をコードするマーカー遺伝子が好ましい。適
当な耐性遺伝子のいくつかの例は、特に、抗生物質アン
ピシリン、クロラムフェニコール、エリスロマイシン、
テトラサイクリン、ヒグロマイシン、Ｇ４１８、カナマ
イシン、ブレオマイシン、ネオマイシンまたはチオスト
レプトンをコードするものである。
【００３６】色素原基質が利用可能である酵素をコード
するマーカー遺伝子もまた好ましい。そのようなマーカ
ー遺伝子の例はｌａｃＺ遺伝子〔色素原基質：Ｘ−ｇａ
ｌ→５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ
−ガラクトシド〕；ｘｙｌＥ遺伝子〔色素原基質：カテ
コール〕；または基質として長鎖アルデヒド〔例えばｎ
−デカナール〕とで発光するｌｕｘＡｌｕｘＢオペロン
である。形質転換されたコロニーは次に特定の呈色反応
により容易に検出され得る。
するマーカー遺伝子もまた好ましい。そのようなマーカ
ー遺伝子の例はｌａｃＺ遺伝子〔色素原基質：Ｘ−ｇａ
ｌ→５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ
−ガラクトシド〕；ｘｙｌＥ遺伝子〔色素原基質：カテ
コール〕；または基質として長鎖アルデヒド〔例えばｎ
−デカナール〕とで発光するｌｕｘＡｌｕｘＢオペロン
である。形質転換されたコロニーは次に特定の呈色反応
により容易に検出され得る。
【００３７】重金属、例えば水銀に対する耐性を付与す
る遺伝子もまた本発明に係る方法に使用するのに適当で
ある。
る遺伝子もまた本発明に係る方法に使用するのに適当で
ある。
【００３８】異なるマーカーをコードし、そして好まし
くはバチラス・スリンギエンシスおよび／またはバチラ
ス・セレウスにおいてある種の不安定性を有する一連の
互いに適合性のシャトルベクターが本発明の範囲内で特
に好ましい。この不安定性のために、可能性のある制限
陰性突然変異体からプラスミドを含まない誘導体を製造
することが後に比較的容易である。
くはバチラス・スリンギエンシスおよび／またはバチラ
ス・セレウスにおいてある種の不安定性を有する一連の
互いに適合性のシャトルベクターが本発明の範囲内で特
に好ましい。この不安定性のために、可能性のある制限
陰性突然変異体からプラスミドを含まない誘導体を製造
することが後に比較的容易である。
【００３９】それらの特徴的な特性のために、これらの
ベクターはまた、突然変異体増菌の範囲内での形質転換
のために１回以上使用され得る。
ベクターはまた、突然変異体増菌の範囲内での形質転換
のために１回以上使用され得る。
【００４０】適当な突然変異体を見つけだすためのその
他の必須条件は、それらのまれに生じる突然変異体の一
つが同時に形質転換されるであろう高度の可能性を確実
にするための最初の高い形質転換率である。少なくとも
１０6 −１０8 またはそれ以上の形質転換体の最初の形
質転換率が特に好ましい。
他の必須条件は、それらのまれに生じる突然変異体の一
つが同時に形質転換されるであろう高度の可能性を確実
にするための最初の高い形質転換率である。少なくとも
１０6 −１０8 またはそれ以上の形質転換体の最初の形
質転換率が特に好ましい。
【００４１】形質転換体の選択に適当なシャトルベクタ
ーを用いるバチラス・スリンギエンシスおよび／または
バチラス・セレウスの形質転換は好ましくはエレクトロ
ポレーションにより、例えば文献〔２３〕またはＥＰ−
Ａ３４２６３３に記載されたように行われる。
ーを用いるバチラス・スリンギエンシスおよび／または
バチラス・セレウスの形質転換は好ましくはエレクトロ
ポレーションにより、例えば文献〔２３〕またはＥＰ−
Ａ３４２６３３に記載されたように行われる。
【００４２】本発明の範囲内で好ましい特定の実施態様
において、最初にバチラス・スリンギエンシスおよび／
またはバチラス・セレウス細胞を適当な栄養培地中十分
に空気を送り適当な温度、好ましくは２０℃ないし３５
℃で、光学濃度（ＯＤ550 ）が０．１ないし１．０に達
するまで培養する。エレクトロポレーションに供給され
たバチラス培養液のエイジは形質転換頻度に明確な影響
を及ぼす。従って、０．１ないし０．３、特に０．２の
バチラス培養液の光学濃度が特に好ましい。しかしなが
ら、良好な形質転換頻度はまた、その他の成長段階にあ
るバチラス培養液、特に一晩培養液で得ることができる
ことは指摘されるべきである。
において、最初にバチラス・スリンギエンシスおよび／
またはバチラス・セレウス細胞を適当な栄養培地中十分
に空気を送り適当な温度、好ましくは２０℃ないし３５
℃で、光学濃度（ＯＤ550 ）が０．１ないし１．０に達
するまで培養する。エレクトロポレーションに供給され
たバチラス培養液のエイジは形質転換頻度に明確な影響
を及ぼす。従って、０．１ないし０．３、特に０．２の
バチラス培養液の光学濃度が特に好ましい。しかしなが
ら、良好な形質転換頻度はまた、その他の成長段階にあ
るバチラス培養液、特に一晩培養液で得ることができる
ことは指摘されるべきである。
【００４３】新鮮細胞または胞子が一般に出発材料とし
て使用されるが、しかし急速冷凍した細胞材料も全く同
様に使用される。使用される急速冷凍細胞材料は特定量
の冷凍防止剤が添加されることが有利である適当な液体
培地中のバチラス・スリンギエンシスおよび／またはバ
チラス・セレウス細胞の懸濁液の形態であることが好ま
しい。適当な冷凍防止剤は浸透圧活性成分およびＤＭＳ
Ｏの水中または適当な緩衝液中の混合物である。冷凍防
止剤溶液中への使用のためのその他の適当な成分は糖、
多価アルコール、例えばグリセロール、糖アルコール、
アミノ酸およびポリマー、例えばポリエチレングリコー
ルを包含する。
て使用されるが、しかし急速冷凍した細胞材料も全く同
様に使用される。使用される急速冷凍細胞材料は特定量
の冷凍防止剤が添加されることが有利である適当な液体
培地中のバチラス・スリンギエンシスおよび／またはバ
チラス・セレウス細胞の懸濁液の形態であることが好ま
しい。適当な冷凍防止剤は浸透圧活性成分およびＤＭＳ
Ｏの水中または適当な緩衝液中の混合物である。冷凍防
止剤溶液中への使用のためのその他の適当な成分は糖、
多価アルコール、例えばグリセロール、糖アルコール、
アミノ酸およびポリマー、例えばポリエチレングリコー
ルを包含する。
【００４４】バチラス・スリンギエンシスの胞子が出発
材料として使用されるならば、それらはまず、適当な培
地中に接種され、そして適当な温度、好ましくは２５℃
ないし２８℃で十分に空気を送って培養される。このバ
ッチは次いで希釈され、そして上記のようにさらに処理
される。
材料として使用されるならば、それらはまず、適当な培
地中に接種され、そして適当な温度、好ましくは２５℃
ないし２８℃で十分に空気を送って培養される。このバ
ッチは次いで希釈され、そして上記のようにさらに処理
される。
【００４５】バチラス・スリンギエンシスにおける胞子
形成の誘導のために、そのような胞子形成を引起すあら
ゆる培地が使用され得る。Yousten AAおよびRogoff MH
(1969)によるＧＹＳ培地が本発明の範囲内で好ましい。
形成の誘導のために、そのような胞子形成を引起すあら
ゆる培地が使用され得る。Yousten AAおよびRogoff MH
(1969)によるＧＹＳ培地が本発明の範囲内で好ましい。
【００４６】培養培地への酸素の導入は通常、例えば攪
拌機で培養液を攪拌することにより行われ、５０ｒｐｍ
ないし３００ｒｐｍの回転速度が好ましい。
拌機で培養液を攪拌することにより行われ、５０ｒｐｍ
ないし３００ｒｐｍの回転速度が好ましい。
【００４７】本発明の範囲内のバチラス・スリンギエン
シス胞子および増殖微生物細胞の培養は公知である慣用
方法に従って行われ、液体栄養培地が実際的な理由で好
ましく使用される。
シス胞子および増殖微生物細胞の培養は公知である慣用
方法に従って行われ、液体栄養培地が実際的な理由で好
ましく使用される。
【００４８】栄養培地の組成は使用されるバチラス・ス
リンギエンシスまたはバチラス・セレウスの菌株によっ
てわずかに変化し得る。バチラスの好気的種の培養に通
常使用されるような、大まかに規定され、容易に同化可
能な炭素（Ｃ）および窒素（Ｎ）源を有する複合培地が
一般に好ましい。
リンギエンシスまたはバチラス・セレウスの菌株によっ
てわずかに変化し得る。バチラスの好気的種の培養に通
常使用されるような、大まかに規定され、容易に同化可
能な炭素（Ｃ）および窒素（Ｎ）源を有する複合培地が
一般に好ましい。
【００４９】本発明の範囲内で使用されることが好まし
いＬＢ培地とは別に、バチラス・スリンギエンシスおよ
び／またはバチラス・セレウスの培養に対して適当なあ
らゆるその他の培養培地、例えば抗生物質培地３、ＳＣ
ＧＹ培地その他を使用できる。胞子形成したバチラス・
スリンギエンシス培養液が４℃の温度でＧＹＳ培地（ス
ラントアガー）上に貯蔵されるのが好ましい〔上記培地
の正確な組成は「培地および緩衝液」の項に記載してあ
る〕。
いＬＢ培地とは別に、バチラス・スリンギエンシスおよ
び／またはバチラス・セレウスの培養に対して適当なあ
らゆるその他の培養培地、例えば抗生物質培地３、ＳＣ
ＧＹ培地その他を使用できる。胞子形成したバチラス・
スリンギエンシス培養液が４℃の温度でＧＹＳ培地（ス
ラントアガー）上に貯蔵されるのが好ましい〔上記培地
の正確な組成は「培地および緩衝液」の項に記載してあ
る〕。
【００５０】細胞培養液が所望の細胞濃度に達したら、
細胞を遠心分離により集め、そして予め氷で冷却するこ
とが好ましい適当な緩衝液中に懸濁させる。本発明の範
囲内で特に適当な緩衝液は、糖例えばグルコースもしく
はサッカロース、または糖アルコール例えばマンニトー
ルを安定化剤として含有し、そして５．０ないし８．０
のｐＨ値に調整された浸透圧的に安定化されたリン酸緩
衝液である。５．０ないし８．０、好ましくは５．５な
いし６．５のｐＨ値を有し、そして安定化剤としてサッ
カロースを０．１Ｍないし１．０Ｍ、好ましくは０．３
Ｍないし０．５Ｍの濃度で含有するＰＢＳタイプのリン
酸緩衝液が特に好ましい。
細胞を遠心分離により集め、そして予め氷で冷却するこ
とが好ましい適当な緩衝液中に懸濁させる。本発明の範
囲内で特に適当な緩衝液は、糖例えばグルコースもしく
はサッカロース、または糖アルコール例えばマンニトー
ルを安定化剤として含有し、そして５．０ないし８．０
のｐＨ値に調整された浸透圧的に安定化されたリン酸緩
衝液である。５．０ないし８．０、好ましくは５．５な
いし６．５のｐＨ値を有し、そして安定化剤としてサッ
カロースを０．１Ｍないし１．０Ｍ、好ましくは０．３
Ｍないし０．５Ｍの濃度で含有するＰＢＳタイプのリン
酸緩衝液が特に好ましい。
【００５１】エレクトロポレーションの前および後のバ
チラス細胞の培養期間は０．１ないし３０分が好ましい
が、しかし特に１０分である。温度は広範囲から自由に
選択され得る。好ましい温度範囲は０℃ないし３５℃、
好ましくは２℃ないし１５℃であり、４℃が特に好まし
い。
チラス細胞の培養期間は０．１ないし３０分が好ましい
が、しかし特に１０分である。温度は広範囲から自由に
選択され得る。好ましい温度範囲は０℃ないし３５℃、
好ましくは２℃ないし１５℃であり、４℃が特に好まし
い。
【００５２】懸濁したバチラス細胞の一部を次にキュベ
ットまたはあらゆるその他の適当な容器に移し、そして
形質転換されるべきＤＮＡと共に、適当な期間、好まし
くは０．１ないし３０分、特に５ないし１５分、適当な
温度、好ましくは０℃ないし３５℃、特に２℃ないし１
５℃、とりわけ４℃の温度で培養するのが特に好まし
い。
ットまたはあらゆるその他の適当な容器に移し、そして
形質転換されるべきＤＮＡと共に、適当な期間、好まし
くは０．１ないし３０分、特に５ないし１５分、適当な
温度、好ましくは０℃ないし３５℃、特に２℃ないし１
５℃、とりわけ４℃の温度で培養するのが特に好まし
い。
【００５３】低温で操作する場合、予備冷却キュベット
またはあらゆるその他の適当な予備冷却容器を使用する
ことが有利である。
またはあらゆるその他の適当な予備冷却容器を使用する
ことが有利である。
【００５４】バチラス・スリンギエンシスまたはバチラ
ス・セレウス形質転換に対して好ましいＤＮＡ濃度は１
ｎｇないし２０μｇの範囲である。１０ｎｇないし２μ
ｇのＤＮＡ濃度が特に好ましい。
ス・セレウス形質転換に対して好ましいＤＮＡ濃度は１
ｎｇないし２０μｇの範囲である。１０ｎｇないし２μ
ｇのＤＮＡ濃度が特に好ましい。
【００５５】バチラス・スリンギエンシスおよび／また
はバチラス・セレウス細胞ならびに形質転換されるべき
プラスミドＤＮＡを含む全体のバッチは次にエレクトロ
ポレーション装置内に導入され、そしてエレクトロポレ
ーション、すなわち電気パルスに短時間晒される。
はバチラス・セレウス細胞ならびに形質転換されるべき
プラスミドＤＮＡを含む全体のバッチは次にエレクトロ
ポレーション装置内に導入され、そしてエレクトロポレ
ーション、すなわち電気パルスに短時間晒される。
【００５６】本発明に係る方法における使用に適当なエ
レクトロポレーション装置はすでに多くの会社、例えば
バイオラド〔米国カリフォルニア州リッチモンド；ジー
ン・パルサー・アパレイタス(Gene Pulser Aparatu
s)〕、バイオテクノロジーズ・アンド・エクスペリメン
タル・リサーチ社〔米国カリフォルニア州サンジエゴ；
ＢＴＸトランスフェクター１００(BTX Transfecter 10
0) 〕、プロメガ〔米国ウイスコンシン州マジソン；Ｘ
−セル２０００エレクトロポレーション・システム(X-C
ell 2000 Electroporation System)〕その他により販売
されている。もちろんその他の適当な装置もまた本発明
に係る方法に使用され得る。
レクトロポレーション装置はすでに多くの会社、例えば
バイオラド〔米国カリフォルニア州リッチモンド；ジー
ン・パルサー・アパレイタス(Gene Pulser Aparatu
s)〕、バイオテクノロジーズ・アンド・エクスペリメン
タル・リサーチ社〔米国カリフォルニア州サンジエゴ；
ＢＴＸトランスフェクター１００(BTX Transfecter 10
0) 〕、プロメガ〔米国ウイスコンシン州マジソン；Ｘ
−セル２０００エレクトロポレーション・システム(X-C
ell 2000 Electroporation System)〕その他により販売
されている。もちろんその他の適当な装置もまた本発明
に係る方法に使用され得る。
【００５７】コンデンサーで設定される静電容量は１μ
Ｆないし２５０μＦ、特に１μＦないし５０μＦであ
り、とりわけ２５μＦが好ましい。初期電圧は広範囲か
ら自由に選択され得る。０．２ｋＶないし５０ｋＶの初
期電圧Ｖ0 が好ましく、０．２ｋＶないし２．５ｋＶが
特に好ましく、なかでも１．２ｋＶないし１．８ｋＶが
好ましい。電極板間の距離はとりわけエレクトロポレー
ション装置の大きさに依存している。０．１ｃｍないし
１．０ｃｍ、好ましくは０．２ｃｍないし１．０ｃｍが
有利である。０．４ｃｍの板間距離が特に好ましい。電
極板間の距離およびコンデンサーで設定された初期電圧
は細胞懸濁液に作用する電界強さを決定する。それらの
値は１００Ｖ／ｃｍないし５００００Ｖ／ｃｍの範囲が
有利である。１００Ｖ／ｃｍないし１００００Ｖ／ｃ
ｍ、特に３０００Ｖ／ｃｍないし４５００Ｖ／ｃｍの電
界強さがとりわけ好ましい。
Ｆないし２５０μＦ、特に１μＦないし５０μＦであ
り、とりわけ２５μＦが好ましい。初期電圧は広範囲か
ら自由に選択され得る。０．２ｋＶないし５０ｋＶの初
期電圧Ｖ0 が好ましく、０．２ｋＶないし２．５ｋＶが
特に好ましく、なかでも１．２ｋＶないし１．８ｋＶが
好ましい。電極板間の距離はとりわけエレクトロポレー
ション装置の大きさに依存している。０．１ｃｍないし
１．０ｃｍ、好ましくは０．２ｃｍないし１．０ｃｍが
有利である。０．４ｃｍの板間距離が特に好ましい。電
極板間の距離およびコンデンサーで設定された初期電圧
は細胞懸濁液に作用する電界強さを決定する。それらの
値は１００Ｖ／ｃｍないし５００００Ｖ／ｃｍの範囲が
有利である。１００Ｖ／ｃｍないし１００００Ｖ／ｃ
ｍ、特に３０００Ｖ／ｃｍないし４５００Ｖ／ｃｍの電
界強さがとりわけ好ましい。
【００５８】本発明に係る方法の範囲内で好ましい指数
的破壊時間は約２ｍｓないし約５０ｍｓであり、特に約
８ｍｓないし約３０ｍｓである。約１４ｍｓないし約２
０ｍｓの指数的破壊時間が非常に好ましい。
的破壊時間は約２ｍｓないし約５０ｍｓであり、特に約
８ｍｓないし約３０ｍｓである。約１４ｍｓないし約２
０ｍｓの指数的破壊時間が非常に好ましい。
【００５９】自由に選択可能なパラメータ、例えば静電
容量、初期電圧、板間距離等の微調整は使用される装置
の構造にある程度依存し、そして事例毎にある範囲内を
変化し得る。それ故に、最適な電界強さを得るために必
要であるという限りにおいて、ある場合には与えられた
限定範囲を越えるか、または下回ることも可能である。
容量、初期電圧、板間距離等の微調整は使用される装置
の構造にある程度依存し、そして事例毎にある範囲内を
変化し得る。それ故に、最適な電界強さを得るために必
要であるという限りにおいて、ある場合には与えられた
限定範囲を越えるか、または下回ることも可能である。
【００６０】実際のエレクトロポレーション操作は、当
該の特定の系に対する最適形質転換頻度が達成されるま
で、１回または数回繰り返され得る。
該の特定の系に対する最適形質転換頻度が達成されるま
で、１回または数回繰り返され得る。
【００６１】エレクトロポレーションの後、処理された
バチラス細胞は、好ましくは０．１ないし３０分間、０
℃ないし３５℃、好ましくは２℃ないし１５℃の温度で
さらに培養されるのが有利である。エレクトロポレーシ
ョン後の細胞を次に適当な培地で希釈し、そして適当な
期間、好ましくは２ないし３時間、十分に空気を通し
て、そして適当な温度、好ましくは２０℃ないし３５℃
で再び培養する。
バチラス細胞は、好ましくは０．１ないし３０分間、０
℃ないし３５℃、好ましくは２℃ないし１５℃の温度で
さらに培養されるのが有利である。エレクトロポレーシ
ョン後の細胞を次に適当な培地で希釈し、そして適当な
期間、好ましくは２ないし３時間、十分に空気を通し
て、そして適当な温度、好ましくは２０℃ないし３５℃
で再び培養する。
【００６２】上に詳細に記載したベクターの一つとの各
々の新しいエレクトロポレーションサイクルの最後に、
処理されたバチラス・スリンギエンシスおよび／または
バチラス・セレウス細胞は選択培地上移され、そしてそ
の場所で１０℃ないし４０℃の温度で、好ましくは２０
℃ないし３５℃、特に３０℃ないし３３℃の温度で培養
される。選択培地は、選択物質として好ましくは使用さ
れるベクターに応じて上記抗生物質の１種を含有し、そ
して場合によって、適当な固化剤、例えばアガー、アガ
ロース、ゼラチン等を含有する。
々の新しいエレクトロポレーションサイクルの最後に、
処理されたバチラス・スリンギエンシスおよび／または
バチラス・セレウス細胞は選択培地上移され、そしてそ
の場所で１０℃ないし４０℃の温度で、好ましくは２０
℃ないし３５℃、特に３０℃ないし３３℃の温度で培養
される。選択培地は、選択物質として好ましくは使用さ
れるベクターに応じて上記抗生物質の１種を含有し、そ
して場合によって、適当な固化剤、例えばアガー、アガ
ロース、ゼラチン等を含有する。
【００６３】可能性のある制限陰性突然変異体の別の評
価のために、まず最初に増菌された突然変異体のプラス
ミドを含まない誘導体が製造される。その目的のため
に、各々の場合に最も新しい形質転換／選択サイクルか
ら得られる増菌培養液の個々のコロニーが選択され、そ
して選択のない適当な培地上で培養される。
価のために、まず最初に増菌された突然変異体のプラス
ミドを含まない誘導体が製造される。その目的のため
に、各々の場合に最も新しい形質転換／選択サイクルか
ら得られる増菌培養液の個々のコロニーが選択され、そ
して選択のない適当な培地上で培養される。
【００６４】このようにして得られる培養液を次に希釈
し、そして適当な固体培地、好ましくは選択マーカーな
しのＬアガー上で平板培養する。適当な希釈物は次いで
適当な選択培地、好ましくは異なる選択マーカーを異な
る濃度で含有するＬ培地上で繰り返される。感受性細胞
の生育を阻害するが、相当する耐性プラスミドを有する
細胞の生育を依然として許容する濃度のテトラサイクリ
ン、クロラムフェニコールおよびエリスロマイシンが本
発明の範囲内で特に好ましい。このようにして、特異的
に使用される選択マーカーの存在下でさらに生育しない
誘導体を見つけることが比較的容易である。
し、そして適当な固体培地、好ましくは選択マーカーな
しのＬアガー上で平板培養する。適当な希釈物は次いで
適当な選択培地、好ましくは異なる選択マーカーを異な
る濃度で含有するＬ培地上で繰り返される。感受性細胞
の生育を阻害するが、相当する耐性プラスミドを有する
細胞の生育を依然として許容する濃度のテトラサイクリ
ン、クロラムフェニコールおよびエリスロマイシンが本
発明の範囲内で特に好ましい。このようにして、特異的
に使用される選択マーカーの存在下でさらに生育しない
誘導体を見つけることが比較的容易である。
【００６５】制限障壁を分析するために、残っている単
離体が次に一方で大腸菌から、他方でバチラス・スリン
ギエンシスおよび／またはバチラス・セレウスの非突然
変異出発株から生じ得る適当なベクターを用いて形質転
換される。この場合もまた、形質転換は上記のようにエ
レクトロポレーションにより行われるのが好ましい。
離体が次に一方で大腸菌から、他方でバチラス・スリン
ギエンシスおよび／またはバチラス・セレウスの非突然
変異出発株から生じ得る適当なベクターを用いて形質転
換される。この場合もまた、形質転換は上記のようにエ
レクトロポレーションにより行われるのが好ましい。
【００６６】それ故に、これまで記載したように、バチ
ラス・スリンギエンシスおよび／またはバチラス・セレ
ウスにおいて制限に自然にさらされている異種仲介宿主
からのベクターＤＮＡが使用されるとき、突然変異して
いない出発菌株に比べ著しく良好に、好ましくは１０2
倍以上良好に形質転換され得るバチラス・スリンギエン
シスおよび／またはバチラス・セレウスの制限欠失突然
変異体を選択することが可能である。
ラス・スリンギエンシスおよび／またはバチラス・セレ
ウスにおいて制限に自然にさらされている異種仲介宿主
からのベクターＤＮＡが使用されるとき、突然変異して
いない出発菌株に比べ著しく良好に、好ましくは１０2
倍以上良好に形質転換され得るバチラス・スリンギエン
シスおよび／またはバチラス・セレウスの制限欠失突然
変異体を選択することが可能である。
【００６７】非適合性仲介宿主、例えば大腸菌および／
またはバチラス・サブチリスからのシャトルベクターが
使用されるとき、突然変異していない出発菌株に比べ１
０2 倍以上良好である形質転換性を有するバチラス・ス
リンギエンシスＨＤ１ｃｒｙＢ株の部分的制限欠失突然
変異体が特に好ましい。
またはバチラス・サブチリスからのシャトルベクターが
使用されるとき、突然変異していない出発菌株に比べ１
０2 倍以上良好である形質転換性を有するバチラス・ス
リンギエンシスＨＤ１ｃｒｙＢ株の部分的制限欠失突然
変異体が特に好ましい。
【００６８】バチラス・スリンギエンシスＨＤ１ｃｒｙ
Ｂ株からの自然突然変異により得られ、そしてそれ自体
公知の増菌方法により入手され得る部分的制限欠失突然
変異体バチラス・スリンギエンシス クルスタキＨＤ１
ｃｒｙＢ Ｒｅｓ９変種、およびその菌株から直接もし
くは間接的に誘導され、そして出発菌株の制限低下特徴
を依然として有するその突然変異体もしくは変種が本発
明の範囲内で特に好ましい。
Ｂ株からの自然突然変異により得られ、そしてそれ自体
公知の増菌方法により入手され得る部分的制限欠失突然
変異体バチラス・スリンギエンシス クルスタキＨＤ１
ｃｒｙＢ Ｒｅｓ９変種、およびその菌株から直接もし
くは間接的に誘導され、そして出発菌株の制限低下特徴
を依然として有するその突然変異体もしくは変種が本発
明の範囲内で特に好ましい。
【００６９】これまで記載された制限欠失突然変異体
は、それらの改良された形質転換性のために、遺伝子ま
たはその他の有用なＤＮＡ配列、特にプロトキシン遺伝
子のクローニングおよび所望により発現のための宿主菌
株としての使用に極めて適している。
は、それらの改良された形質転換性のために、遺伝子ま
たはその他の有用なＤＮＡ配列、特にプロトキシン遺伝
子のクローニングおよび所望により発現のための宿主菌
株としての使用に極めて適している。
【００７０】詳しくは、操作は以下のように行われるの
が好ましい：最初に（ａ）該遺伝子またはＤＮＡ配列を
適当な供給源から単離するか、または合成し、（ｂ）単
離または合成された遺伝子またはＤＮＡ配列を、バチラ
ス・スリンギエンシスおよび／またはバチラス・セレウ
スにおいて機能し得、そして使用された上記遺伝子また
はＤＮＡ配列に関して同種または異種の起源であってよ
い発現シグナルに操作可能に連結し、（ｃ）項（ｂ）の
キメラ遺伝子構築物を、適当なベクターを用いて請求項
１ないし６のいずれか１項に記載のバチラス・スリンギ
エンシスおよび／またはバチラス・セレウスの制限欠失
突然変異体内に形質転換し、そして（ｄ）相当する遺伝
子産物を場合により発現させ、そして所望するならば単
離する。
が好ましい：最初に（ａ）該遺伝子またはＤＮＡ配列を
適当な供給源から単離するか、または合成し、（ｂ）単
離または合成された遺伝子またはＤＮＡ配列を、バチラ
ス・スリンギエンシスおよび／またはバチラス・セレウ
スにおいて機能し得、そして使用された上記遺伝子また
はＤＮＡ配列に関して同種または異種の起源であってよ
い発現シグナルに操作可能に連結し、（ｃ）項（ｂ）の
キメラ遺伝子構築物を、適当なベクターを用いて請求項
１ないし６のいずれか１項に記載のバチラス・スリンギ
エンシスおよび／またはバチラス・セレウスの制限欠失
突然変異体内に形質転換し、そして（ｄ）相当する遺伝
子産物を場合により発現させ、そして所望するならば単
離する。
【００７１】本発明に係る方法の効率を高めるために、
ベクターＤＮＡを適当な反応混合物中試験管内で、宿主
特異的制限エンドヌクレアーゼの認識配列内の塩基の１
個またはそれ以上をメチル化し得る特異的メチラーゼと
共に保温し、そしてメチル化されたベクターＤＮＡを次
にバチラス・スリンギエンシスおよび／またはバチラス
・セレウスの制限欠失突然変異体内に形質転換する追加
段階を上記方法に含めることが可能である。
ベクターＤＮＡを適当な反応混合物中試験管内で、宿主
特異的制限エンドヌクレアーゼの認識配列内の塩基の１
個またはそれ以上をメチル化し得る特異的メチラーゼと
共に保温し、そしてメチル化されたベクターＤＮＡを次
にバチラス・スリンギエンシスおよび／またはバチラス
・セレウスの制限欠失突然変異体内に形質転換する追加
段階を上記方法に含めることが可能である。
【００７２】大腸菌またはバチラス・サブチリスから生
じるベクターが使用される、遺伝子またはその他の有用
なＤＮＡ配列のクローニングおよび所望による発現のた
めの方法が本発明の範囲内で特に好ましい。
じるベクターが使用される、遺伝子またはその他の有用
なＤＮＡ配列のクローニングおよび所望による発現のた
めの方法が本発明の範囲内で特に好ましい。
【００７３】構造遺伝子の他に、あらゆるその他の有用
なＤＮＡ配列、例えば制御作用を有する非コード性ＤＮ
Ａ配列を使用することももちろん可能である。ＲＮＡに
転写されるが、タンパク質に翻訳されない「アンチセン
ス」ＤＮＡがここで例として記載され得る。
なＤＮＡ配列、例えば制御作用を有する非コード性ＤＮ
Ａ配列を使用することももちろん可能である。ＲＮＡに
転写されるが、タンパク質に翻訳されない「アンチセン
ス」ＤＮＡがここで例として記載され得る。
【００７４】さらに、制限欠失突然変異体を用いて、バ
チラス・スリンギエンシスおよび／またはバチラス・セ
レウス中に代表的な遺伝子バンクを通常の方法で確立す
ることが初めて可能となった。操作は好ましくは以下の
とおりである：最初に（ａ）バチラス・スリンギエンシ
スの全ＤＮＡを機械的にまたは好ましくは適当な制限酵
素を用いて断片に分解し、（ｂ）適当な大きさの断片を
単離し、（ｃ）前記断片を適当なベクター、例えばバチ
ラス・スリンギエンシスおよびバチラス・セレウスにお
いて制限に自然にさらされているベクター内に挿入し、
（ｄ）制限欠失バチラス・スリンギエンシスおよび／ま
たはバチラス・セレウス細胞を適当なベクターで形質転
換し、そして（ｅ）形質転換体から、適当なスクリーニ
ング方法を用いて、新規で所望のＤＮＡ配列を含む形質
転換体を選択する。
チラス・スリンギエンシスおよび／またはバチラス・セ
レウス中に代表的な遺伝子バンクを通常の方法で確立す
ることが初めて可能となった。操作は好ましくは以下の
とおりである：最初に（ａ）バチラス・スリンギエンシ
スの全ＤＮＡを機械的にまたは好ましくは適当な制限酵
素を用いて断片に分解し、（ｂ）適当な大きさの断片を
単離し、（ｃ）前記断片を適当なベクター、例えばバチ
ラス・スリンギエンシスおよびバチラス・セレウスにお
いて制限に自然にさらされているベクター内に挿入し、
（ｄ）制限欠失バチラス・スリンギエンシスおよび／ま
たはバチラス・セレウス細胞を適当なベクターで形質転
換し、そして（ｅ）形質転換体から、適当なスクリーニ
ング方法を用いて、新規で所望のＤＮＡ配列を含む形質
転換体を選択する。
【００７５】この場合においてまた、形質転換の効率
は、挿入されるべきＤＮＡの付加的なメチル化によりさ
らに高められ得る。
は、挿入されるべきＤＮＡの付加的なメチル化によりさ
らに高められ得る。
【００７６】前記バチラス・スリンギエンシスが、バチ
ラス・スリンギエンシスＨＤ１ｃｒｙＢ株に匹敵する制
限／修飾系を有する菌株である方法が本発明の範囲内で
特に好ましい。
ラス・スリンギエンシスＨＤ１ｃｒｙＢ株に匹敵する制
限／修飾系を有する菌株である方法が本発明の範囲内で
特に好ましい。
【００７７】本発明はさらに、制限陰性突然変異体、特
に制限陰性突然変異体バチラス・スリンギエンシスＨＤ
１ｃｒｙＢ Ｒｅｓ９を使用するバチラス・スリンギエ
ンシスおよび／またはバチラス・セレウスにおける制限
障壁を低下させる方法に関する。
に制限陰性突然変異体バチラス・スリンギエンシスＨＤ
１ｃｒｙＢ Ｒｅｓ９を使用するバチラス・スリンギエ
ンシスおよび／またはバチラス・セレウスにおける制限
障壁を低下させる方法に関する。
【００７８】制限障壁の低下を反復することによる本方
法の効率におけるその他の増加は、制限陰性突然変異
体、特に制限陰性突然変異体バチラス・スリンギエンシ
スＨＤ１ｃｒｙＢ Ｒｅｓ９が、挿入されたベクターＤ
ＮＡをメチル化することにより、バチラス・スリンギエ
ンシスおよび／またはバチラス・セレウスに固有の制限
酵素による消化から挿入された該ＤＮＡを保護し、その
ようにしてこの方法の効率をさらに高める特異的メチラ
ーゼと組み合わせて使用されることにより達成され得
る。
法の効率におけるその他の増加は、制限陰性突然変異
体、特に制限陰性突然変異体バチラス・スリンギエンシ
スＨＤ１ｃｒｙＢ Ｒｅｓ９が、挿入されたベクターＤ
ＮＡをメチル化することにより、バチラス・スリンギエ
ンシスおよび／またはバチラス・セレウスに固有の制限
酵素による消化から挿入された該ＤＮＡを保護し、その
ようにしてこの方法の効率をさらに高める特異的メチラ
ーゼと組み合わせて使用されることにより達成され得
る。
【００７９】詳しくは、以下のように操作することも可
能である：ベクターＤＮＡを宿主特異的制限エンドヌク
レアーゼの認識配列内の塩基の１個またはそれ以上をメ
チル化し得る特異的メチラーゼと共に適当な反応混合物
中試験管内で保温し、そしてメチル化されたベクターＤ
ＮＡを次にバチラス・スリンギエンシスおよび／または
バチラス・セレウスの制限欠失突然変異体内、特に制限
欠失突然変異体バチラス・スリンギエンシスＨＤ１ｃｒ
ｙＢ Ｒｅｓ９に形質転換する。
能である：ベクターＤＮＡを宿主特異的制限エンドヌク
レアーゼの認識配列内の塩基の１個またはそれ以上をメ
チル化し得る特異的メチラーゼと共に適当な反応混合物
中試験管内で保温し、そしてメチル化されたベクターＤ
ＮＡを次にバチラス・スリンギエンシスおよび／または
バチラス・セレウスの制限欠失突然変異体内、特に制限
欠失突然変異体バチラス・スリンギエンシスＨＤ１ｃｒ
ｙＢ Ｒｅｓ９に形質転換する。
【００８０】限定すると見なされるためのものではない
メチラーゼのような例は、制限酵素ＦｎｕＤＩＩ、また
はそのアイソシゾマー例えばＢｔｈＫＩ〔*ＣＧＣＧ〕
の認識配列内の最初のシトシンを特異的にメチル化する
酵素Ｍ−ＦｎｕＤＩＩであり、それ故に、このメチラー
ゼで処理されたベクターＤＮＡをその酵素による消化か
ら保護する。この方法において、Ｄａｍ−特異的制限の
排除後に残存する残留活性を低下させるか、または完全
に除去することが可能である。それにもかかわらず、そ
の残留活性は非変性ＤＮＡの形質転換頻度を１０ないし
５０倍低下させるのに依然として関連する。
メチラーゼのような例は、制限酵素ＦｎｕＤＩＩ、また
はそのアイソシゾマー例えばＢｔｈＫＩ〔*ＣＧＣＧ〕
の認識配列内の最初のシトシンを特異的にメチル化する
酵素Ｍ−ＦｎｕＤＩＩであり、それ故に、このメチラー
ゼで処理されたベクターＤＮＡをその酵素による消化か
ら保護する。この方法において、Ｄａｍ−特異的制限の
排除後に残存する残留活性を低下させるか、または完全
に除去することが可能である。それにもかかわらず、そ
の残留活性は非変性ＤＮＡの形質転換頻度を１０ないし
５０倍低下させるのに依然として関連する。
【００８１】
【実施例】本発明のかなり一般的な記載を説明し、そし
てよりよい理解を与えるのために、特定の実施例を下に
示すが、これは本発明を限定するものでない。これまで
例として記載した全ての列挙にも同様のことが当てはま
る。
てよりよい理解を与えるのために、特定の実施例を下に
示すが、これは本発明を限定するものでない。これまで
例として記載した全ての列挙にも同様のことが当てはま
る。
【００８２】実施例１：ＨＤ１ｃｒｙＢ株の制限陰性突
然変異体の単離 １．１ 突然変異体の選択に使用されるシャトルベクタ
ー バチラス・スリンギエンシスＨＤ１ｃｒｙＢ株〔２５〕
の制限欠失突然変異体の単離のために、以下の全て大腸
菌から単離された大腸菌／バチラス・スリンギエンシス
シャトルベクターが以下の順序で使用される： ベクター 選択 起源／参考文献 （バチラス・スリ 〔２９〕 ンギエンシス中） ──────────────────────────────────── １．ｐＡＭ４０１ Ｃｍ 〔２９〕 ２．ｐＨＹ３００ＰＬＫ Ｔｃ 東洋紡株式会社 （注文番号ＰＨＹ−００１） ３．ｐＡＭ４０１ Ｃｍ 〔２９〕 ４．ｐＨＰ１３ Ｅｍ，Ｃｍ バチラス・ジェネティック・スト ック・センター（米国オハイオ州 コロンブス，オハイオ州立大学， 株番号１Ｐ５０）
然変異体の単離 １．１ 突然変異体の選択に使用されるシャトルベクタ
ー バチラス・スリンギエンシスＨＤ１ｃｒｙＢ株〔２５〕
の制限欠失突然変異体の単離のために、以下の全て大腸
菌から単離された大腸菌／バチラス・スリンギエンシス
シャトルベクターが以下の順序で使用される： ベクター 選択 起源／参考文献 （バチラス・スリ 〔２９〕 ンギエンシス中） ──────────────────────────────────── １．ｐＡＭ４０１ Ｃｍ 〔２９〕 ２．ｐＨＹ３００ＰＬＫ Ｔｃ 東洋紡株式会社 （注文番号ＰＨＹ−００１） ３．ｐＡＭ４０１ Ｃｍ 〔２９〕 ４．ｐＨＰ１３ Ｅｍ，Ｃｍ バチラス・ジェネティック・スト ック・センター（米国オハイオ州 コロンブス，オハイオ州立大学， 株番号１Ｐ５０）
【００８３】プラスミドｐＡＭ４０１は極端に不安定で
あり、そして選択がない場合急速に再び失われるから、
１回以上形質転換のために使用され得る。そのほかのシ
ャトルベクターはバチラス・スリンギエンシスにおいて
ある種の不安定さを示すから、プラスミドを含まない誘
導体は可能性のある制限陰性突然変異体から比較的容易
に後に得られる。
あり、そして選択がない場合急速に再び失われるから、
１回以上形質転換のために使用され得る。そのほかのシ
ャトルベクターはバチラス・スリンギエンシスにおいて
ある種の不安定さを示すから、プラスミドを含まない誘
導体は可能性のある制限陰性突然変異体から比較的容易
に後に得られる。
【００８４】１．２ バチラス・スリンギエンシスＨＤ
１ｃｒｙＢの形質転換 １．１に挙げたシャトルベクターを用いるバチラス・ス
リンギエンシスの形質転換がエレクトロポレーションに
より行われる。
１ｃｒｙＢの形質転換 １．１に挙げたシャトルベクターを用いるバチラス・ス
リンギエンシスの形質転換がエレクトロポレーションに
より行われる。
【００８５】１．２．１ エレクトロポレーションによ
るバチラス・スリンギエンシスＨＤ１ｃｒｙＢの形質転
換のための標準的プロトコル ＬＢ培地（トリプトン１０ｇ／ｌ、酵母抽出物５ｇ／
ｌ、ＮａＣｌ５ｇ／ｌ）１０ｍｌにバチラス・スリンギ
エンシス クルスタキＨＤ１変種の無プラスミド変種で
あるバチラス・スリンギエンシス クルスタキＨＤ１ｃ
ｒｙＢ〔２５〕の胞子を接種する。
るバチラス・スリンギエンシスＨＤ１ｃｒｙＢの形質転
換のための標準的プロトコル ＬＢ培地（トリプトン１０ｇ／ｌ、酵母抽出物５ｇ／
ｌ、ＮａＣｌ５ｇ／ｌ）１０ｍｌにバチラス・スリンギ
エンシス クルスタキＨＤ１変種の無プラスミド変種で
あるバチラス・スリンギエンシス クルスタキＨＤ１ｃ
ｒｙＢ〔２５〕の胞子を接種する。
【００８６】バッチを２７℃の温度にて回転シェーカー
上５０ｒｐｍで回転させ一晩培養する。バチラス・スリ
ンギエンシス培養液を次にＬＢ培地１００ないし４００
ｍｌで１００倍に希釈し、そして０．２の最適濃度（Ｏ
Ｄ550 ）に到達するまで３０℃の温度にて回転シェーカ
ー上２５０ｒｐｍで回転させさらに培養する。
上５０ｒｐｍで回転させ一晩培養する。バチラス・スリ
ンギエンシス培養液を次にＬＢ培地１００ないし４００
ｍｌで１００倍に希釈し、そして０．２の最適濃度（Ｏ
Ｄ550 ）に到達するまで３０℃の温度にて回転シェーカ
ー上２５０ｒｐｍで回転させさらに培養する。
【００８７】細胞を遠心分離により集め、氷冷ＰＢＳ緩
衝液（４００ｍＭサッカロース、１ｍＭ ＭｇＣｌ2 、
７ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ６．０）１／４０容量中に懸濁
する。遠心分離および集められたバチラス・スリンギエ
ンシスのＰＢＳ緩衝液中への引き続く懸濁を１回繰り返
す。
衝液（４００ｍＭサッカロース、１ｍＭ ＭｇＣｌ2 、
７ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ６．０）１／４０容量中に懸濁
する。遠心分離および集められたバチラス・スリンギエ
ンシスのＰＢＳ緩衝液中への引き続く懸濁を１回繰り返
す。
【００８８】そのように前処理した細胞を次に直接エレ
クトロポレーションするか、または緩衝液にグリセロー
ル添加後〔２０％（ｗ／ｖ）〕、−２０℃ないし−７０
℃で貯蔵し、そして後に使用する。
クトロポレーションするか、または緩衝液にグリセロー
ル添加後〔２０％（ｗ／ｖ）〕、−２０℃ないし−７０
℃で貯蔵し、そして後に使用する。
【００８９】氷冷細胞の一部４００μｌを次に予め冷却
したキュベットに移し、プラスミドＤＮＡを次に適当な
濃度で添加し、そして全バッチを４℃で０．１ないし１
０分間培養する。
したキュベットに移し、プラスミドＤＮＡを次に適当な
濃度で添加し、そして全バッチを４℃で０．１ないし１
０分間培養する。
【００９０】急速冷凍細胞材料が使用されるとき、冷凍
細胞の適当量をまず氷中および室温で解凍する。次の処
理は新鮮細胞材料が使用されるとき適用される操作と同
様に行われる。
細胞の適当量をまず氷中および室温で解凍する。次の処
理は新鮮細胞材料が使用されるとき適用される操作と同
様に行われる。
【００９１】キュベットを次にエレクトロポレーション
装置内に導き、そして懸濁液中に存在するバチラス・ス
リンギエンシス細胞を、コンデンサーを１回放電するこ
とにより０．１ｋＶないし２．５ｋＶの電圧を適用して
エレクトロポレーションに供する。１．３ｋＶの電圧が
好ましい。
装置内に導き、そして懸濁液中に存在するバチラス・ス
リンギエンシス細胞を、コンデンサーを１回放電するこ
とにより０．１ｋＶないし２．５ｋＶの電圧を適用して
エレクトロポレーションに供する。１．３ｋＶの電圧が
好ましい。
【００９２】この場合に使用されるコンデンサーは２５
μＦの静電容量を有し、キュベットの電極間距離は０．
４ｃｍであり、その中で放電が起こり、そして設定に応
じて、０．２５ｋＶ／ｃｍないし６．２５ｋＶ／ｃｍ、
とりわけ３．２５ｋＶ／ｃｍの初期ピーク電圧で指数的
破壊性電界強さを示す。指数的破壊時間は１０ｍｓない
し１２ｍｓである。
μＦの静電容量を有し、キュベットの電極間距離は０．
４ｃｍであり、その中で放電が起こり、そして設定に応
じて、０．２５ｋＶ／ｃｍないし６．２５ｋＶ／ｃｍ、
とりわけ３．２５ｋＶ／ｃｍの初期ピーク電圧で指数的
破壊性電界強さを示す。指数的破壊時間は１０ｍｓない
し１２ｍｓである。
【００９３】記載されたエレクトロポレーション実験の
ために、例えばエレクトロポレーション装置はバイオラ
ド（「ジーン・パルサー・アパレイタス」，カタログ番
号１６５−２０７５，バイオラド，米国９４８０４カリ
フォルニア州リッチモンド，ハーバー・ウェイ・サウス
１４１４）により供給された。もちろんその他のあらゆ
る適当な装置が上記エレクトロポレーションにおいて使
用され得る。
ために、例えばエレクトロポレーション装置はバイオラ
ド（「ジーン・パルサー・アパレイタス」，カタログ番
号１６５−２０７５，バイオラド，米国９４８０４カリ
フォルニア州リッチモンド，ハーバー・ウェイ・サウス
１４１４）により供給された。もちろんその他のあらゆ
る適当な装置が上記エレクトロポレーションにおいて使
用され得る。
【００９４】４℃でさらに０．１ないし１０分間培養し
た後、細胞懸濁液をＬＢ培地１．６ｍｌで希釈し、そし
て３０℃の温度にて回転シェーカー上２５０ｒｐｍで回
転させ２時間培養する。
た後、細胞懸濁液をＬＢ培地１．６ｍｌで希釈し、そし
て３０℃の温度にて回転シェーカー上２５０ｒｐｍで回
転させ２時間培養する。
【００９５】適当な希釈物を次に、新たに得られたプラ
スミドの選択のために適当な抗生物質を添加物として含
有するＬアガー（１５ｇ／ｌアガーで固化させたＬＢ培
地）上で平板培養する。ｐＨＹ３００ＰＬＫの場合、抗
生物質は２０ｍｇ／ｌの濃度で培地に添加されるテトラ
サイクリンである。
スミドの選択のために適当な抗生物質を添加物として含
有するＬアガー（１５ｇ／ｌアガーで固化させたＬＢ培
地）上で平板培養する。ｐＨＹ３００ＰＬＫの場合、抗
生物質は２０ｍｇ／ｌの濃度で培地に添加されるテトラ
サイクリンである。
【００９６】バチラス・セレウス細胞はバチラス・スリ
ンギエンシス細胞と同様の上記プロトコルに従って形質
転換され得る。
ンギエンシス細胞と同様の上記プロトコルに従って形質
転換され得る。
【００９７】１．２．２ 個々の形質転換／選択サイク
ルでの特異的修飾 １回目のエレクトロポレーション：バチラス・スリンギ
エンシスＨＤ１ｃｒｙＢ株を標準プロトコル〔項１．
２．１参照〕に従って培養し、高い形質転換頻度を達成
するために５００倍濃縮する。〔バチラス・スリンギエ
ンシス細胞のエレクトロポレーションに関する詳細な情
報は欧州特許出願ＥＰ−Ａ０３４２６３３に見出すこと
ができる〕。
ルでの特異的修飾 １回目のエレクトロポレーション：バチラス・スリンギ
エンシスＨＤ１ｃｒｙＢ株を標準プロトコル〔項１．
２．１参照〕に従って培養し、高い形質転換頻度を達成
するために５００倍濃縮する。〔バチラス・スリンギエ
ンシス細胞のエレクトロポレーションに関する詳細な情
報は欧州特許出願ＥＰ−Ａ０３４２６３３に見出すこと
ができる〕。
【００９８】バチラス・スリンギエンシスＨＤ１ｃｒｙ
Ｂ細胞をｐＡＭ４０１プラスミドＤＮＡ５μｇとエレク
トロポレーションした後、細胞をＬＢ培地に５倍に希釈
し、そして２５０ｒｐｍおよび３０℃で２時間保温す
る。次に、クロラムフェニコール２０μｇ／ｍｌを用い
て２５０ｒｐｍおよび３０℃で４時間形質転換体を選択
し、そして次のエレクトロポレーションのためにＬＢ培
地中に２００倍に希釈する。
Ｂ細胞をｐＡＭ４０１プラスミドＤＮＡ５μｇとエレク
トロポレーションした後、細胞をＬＢ培地に５倍に希釈
し、そして２５０ｒｐｍおよび３０℃で２時間保温す
る。次に、クロラムフェニコール２０μｇ／ｍｌを用い
て２５０ｒｐｍおよび３０℃で４時間形質転換体を選択
し、そして次のエレクトロポレーションのためにＬＢ培
地中に２００倍に希釈する。
【００９９】２回目のエレクトロポレーション：標準プ
ロトコル〔項１．２．１参照〕に従って１５０ｒｐｍお
よび３０℃で２時間の保温の後、細胞を洗浄し、４００
倍に濃縮する。ｐＨＹ３００ＰＬＫプラスミドＤＮＡ１
２μｇとエレクトロポレーションした後、細胞をＬＢ培
地に５倍に希釈し、そして２５０ｒｐｍおよび３０℃で
１．５時間保温する。さらに５倍希釈した後、テトラサ
イクリン２０μｇ／ｍｌを用いて１５０ｒｐｍおよび３
０℃で一晩形質転換体を選択し、そして次のエレクトロ
ポレーションのためにＬＢ培地中に２００倍に希釈す
る。
ロトコル〔項１．２．１参照〕に従って１５０ｒｐｍお
よび３０℃で２時間の保温の後、細胞を洗浄し、４００
倍に濃縮する。ｐＨＹ３００ＰＬＫプラスミドＤＮＡ１
２μｇとエレクトロポレーションした後、細胞をＬＢ培
地に５倍に希釈し、そして２５０ｒｐｍおよび３０℃で
１．５時間保温する。さらに５倍希釈した後、テトラサ
イクリン２０μｇ／ｍｌを用いて１５０ｒｐｍおよび３
０℃で一晩形質転換体を選択し、そして次のエレクトロ
ポレーションのためにＬＢ培地中に２００倍に希釈す
る。
【０１００】３回目のエレクトロポレーション：標準プ
ロトコルに従って２５０ｒｐｍおよび３０℃で１．５時
間の保温の後、細胞を洗浄し、１００倍に濃縮する。ｐ
ＡＭ４０１プラスミドＤＮＡ５μｇとエレクトロポレー
ションした後、２回目のエレクトロポレーションに記載
したように、細胞をＬＢ培地中に希釈し、保温し、そし
てＬＢ培地で再び希釈し、そしてクロラムフェニコール
１０μｇ／ｍｌを用いて２５０ｒｐｍおよび３０℃で
２．５時間形質転換体を選択する。このように選択され
た培養物を次に室温で貯蔵する。
ロトコルに従って２５０ｒｐｍおよび３０℃で１．５時
間の保温の後、細胞を洗浄し、１００倍に濃縮する。ｐ
ＡＭ４０１プラスミドＤＮＡ５μｇとエレクトロポレー
ションした後、２回目のエレクトロポレーションに記載
したように、細胞をＬＢ培地中に希釈し、保温し、そし
てＬＢ培地で再び希釈し、そしてクロラムフェニコール
１０μｇ／ｍｌを用いて２５０ｒｐｍおよび３０℃で
２．５時間形質転換体を選択する。このように選択され
た培養物を次に室温で貯蔵する。
【０１０１】４回目のエレクトロポレーション：上記の
培養物を５０倍に希釈し、そして標準プロトコルに従っ
て一晩培養し、次に継代培養としてさらに培養し、洗浄
し、そして濃縮する。ｐＨＰ１３ ５μｇでのエレクト
ロポレーションの後、細胞を５倍に希釈し、そして２５
０ｒｐｍおよび３０℃で３．５時間保温する。細胞を次
に再び希釈し、そしてエリスロマイシン２００μｇ／ｍ
ｌを含むＬアガー上で平板培養する。
培養物を５０倍に希釈し、そして標準プロトコルに従っ
て一晩培養し、次に継代培養としてさらに培養し、洗浄
し、そして濃縮する。ｐＨＰ１３ ５μｇでのエレクト
ロポレーションの後、細胞を５倍に希釈し、そして２５
０ｒｐｍおよび３０℃で３．５時間保温する。細胞を次
に再び希釈し、そしてエリスロマイシン２００μｇ／ｍ
ｌを含むＬアガー上で平板培養する。
【０１０２】３回目および４回目のエレクトロポレーシ
ョンは既に著しく高められた形質転換頻度を示してお
り、これは制限欠失突然変異体の増菌の最初の明示であ
る。
ョンは既に著しく高められた形質転換頻度を示してお
り、これは制限欠失突然変異体の増菌の最初の明示であ
る。
【０１０３】１．３ 無プラスミド誘導体の製造 可能性のある制限欠失突然変異体の別の評価のために、
まず最初にプラスミドを含まない（無プラスミド）誘導
体が製造される。その目的のために、１０個のコロニー
が上記選択プレート〔４回目のエレクトロポレーション
後，項１．２．２参照〕から採取され、そして５０ｒｐ
ｍおよび２７℃、選択なしで一晩、ＬＢ培地１０ｍｌ中
で培養される。
まず最初にプラスミドを含まない（無プラスミド）誘導
体が製造される。その目的のために、１０個のコロニー
が上記選択プレート〔４回目のエレクトロポレーション
後，項１．２．２参照〕から採取され、そして５０ｒｐ
ｍおよび２７℃、選択なしで一晩、ＬＢ培地１０ｍｌ中
で培養される。
【０１０４】培養液を次に希釈し、そして選択マーカー
を含まないＬアガー上で平板培養する。これらの培養液
の適当な希釈物は次いで各々以下の選択マーカー：テト
ラサイクリン〔２０μｇ／ｍｌ〕，クロラムフェニコー
ル〔１０μｇ／ｍｌ〕またはエリスロマイシン〔２０μ
ｇ／ｍｌ〕の一つを含むＬアガープレート上で繰り返さ
れる。
を含まないＬアガー上で平板培養する。これらの培養液
の適当な希釈物は次いで各々以下の選択マーカー：テト
ラサイクリン〔２０μｇ／ｍｌ〕，クロラムフェニコー
ル〔１０μｇ／ｍｌ〕またはエリスロマイシン〔２０μ
ｇ／ｍｌ〕の一つを含むＬアガープレート上で繰り返さ
れる。
【０１０５】このようにして、最初の１０個のコロニー
から、３種の全部の選択マーカーの存在下でさらに生育
しない６個の誘導体を見つけだすことは比較的容易であ
る。これらの誘導体のいずれにも、以前挿入されたプラ
スミドが検出されなかった。
から、３種の全部の選択マーカーの存在下でさらに生育
しない６個の誘導体を見つけだすことは比較的容易であ
る。これらの誘導体のいずれにも、以前挿入されたプラ
スミドが検出されなかった。
【０１０６】１．４ シャトルベクターｐＨＹ３００Ｐ
ＬＫでの形質転換 制限障壁を分析するために、残っている６個の単離体が
次に一方で大腸菌から、他方でバチラス・スリンギエン
シスＨＤ１ｃｒｙＢに由来するｐＨＹ３００ＰＬＫを用
いて形質転換される。形質転換はエレクトロポレーショ
ンにより行われる〔実施例１．２．１参照〕。
ＬＫでの形質転換 制限障壁を分析するために、残っている６個の単離体が
次に一方で大腸菌から、他方でバチラス・スリンギエン
シスＨＤ１ｃｒｙＢに由来するｐＨＹ３００ＰＬＫを用
いて形質転換される。形質転換はエレクトロポレーショ
ンにより行われる〔実施例１．２．１参照〕。
【０１０７】表３の結果は、試験された６個の単離体の
うち４個が親のＨＤ１ｃｒｙＢ株に比べ著しく減じられ
た制限障壁を示す。Ｒｅｓ５、７、８および９と表され
るそれらの突然変異体の中でＲｅｓ５、７および９は、
ＨＤ１ｃｒｙＢのものに比べ約５０−１００倍低い制限
障壁を有する。しかしながら、Ｒｅｓ５および７は絶対
的な関係でみれば、ＨＤ１ｃｒｙＢより１０倍形質転換
しにくい。Ｒｅｓ８は絶対的な関係でみてＨＤ１ｃｒｙ
Ｂの約５００倍低い形質転換性であり、極端に低い制限
障壁を示すけれども、これは減じられた制限障壁の利点
を相殺している。
うち４個が親のＨＤ１ｃｒｙＢ株に比べ著しく減じられ
た制限障壁を示す。Ｒｅｓ５、７、８および９と表され
るそれらの突然変異体の中でＲｅｓ５、７および９は、
ＨＤ１ｃｒｙＢのものに比べ約５０−１００倍低い制限
障壁を有する。しかしながら、Ｒｅｓ５および７は絶対
的な関係でみれば、ＨＤ１ｃｒｙＢより１０倍形質転換
しにくい。Ｒｅｓ８は絶対的な関係でみてＨＤ１ｃｒｙ
Ｂの約５００倍低い形質転換性であり、極端に低い制限
障壁を示すけれども、これは減じられた制限障壁の利点
を相殺している。
【０１０８】制限陰性突然変異体Ｒｅｓ９だけが高度の
形質転換頻度と減じられた制限障壁の利点を併せもつ。
形質転換頻度と減じられた制限障壁の利点を併せもつ。
【０１０９】突然変異体Ｒｅｓ９の利点は組換えプラス
ミドでの形質転換の場合に、より明確になる。表４か
ら、プロトキシン遺伝子〔ｐＸＩ２０４，ｐＸＩ９３〕
を含む大腸菌から単離されたシャトルベクターがバチラ
ス・スリンギエンシスＨＤ１ｃｒｙＢ内に非常に低い頻
度で形質転換されえるが、突然変異体Ｒｅｓ９は同じプ
ラスミドを用いて効率的な形質転換を可能にすることが
明らかである。
ミドでの形質転換の場合に、より明確になる。表４か
ら、プロトキシン遺伝子〔ｐＸＩ２０４，ｐＸＩ９３〕
を含む大腸菌から単離されたシャトルベクターがバチラ
ス・スリンギエンシスＨＤ１ｃｒｙＢ内に非常に低い頻
度で形質転換されえるが、突然変異体Ｒｅｓ９は同じプ
ラスミドを用いて効率的な形質転換を可能にすることが
明らかである。
【０１１０】１．５ 使用されたバチラス・スリンギエ
ンシス株の分類学的特徴 １．５．１ ＨＤ１ｃｒｙＢ株 ＤＳＭ４５７４株の同定 該菌株の特徴 棹菌 幅 １．０−１．２μｍ 長さ ３．０−５．０μｍ 運動性 ＋ 胞子 ＋ 楕円形 ＋ 円形 − 膨張した胞子嚢 − グラム反応 ＋ カタラーゼ ＋ 嫌気的生育 ＋ ＶＰ反応 ＋ ＶＰ培地中のｐＨ ４．９ 最高温度 生育 ４５℃ 非生育 ５０℃ 以下の条件での生育 培地ｐＨ５．７ ＋ ＮａＣｌ ５％ ＋ ７％ − １０％ − 以下の物質からの酸生成 グルコース ＋ Ｌ−アラビノース − キシロース − マンニトール − グルコースからのガス生成 − レシチナーゼ − 以下の物質の加水分解 デンプン ＋ ゼラチン ＋ カゼイン ＋ 以下の物質の利用性 シトレート ＋ プロピオネート − チロシンの分解 − ＮＯ3 からＮＯ2 ＋ インドール − フェニルアラニンデサミナーゼ − アルギニンジヒドロラーゼ ＋ 独特の特徴：レシチナーゼ活性なし
ンシス株の分類学的特徴 １．５．１ ＨＤ１ｃｒｙＢ株 ＤＳＭ４５７４株の同定 該菌株の特徴 棹菌 幅 １．０−１．２μｍ 長さ ３．０−５．０μｍ 運動性 ＋ 胞子 ＋ 楕円形 ＋ 円形 − 膨張した胞子嚢 − グラム反応 ＋ カタラーゼ ＋ 嫌気的生育 ＋ ＶＰ反応 ＋ ＶＰ培地中のｐＨ ４．９ 最高温度 生育 ４５℃ 非生育 ５０℃ 以下の条件での生育 培地ｐＨ５．７ ＋ ＮａＣｌ ５％ ＋ ７％ − １０％ − 以下の物質からの酸生成 グルコース ＋ Ｌ−アラビノース − キシロース − マンニトール − グルコースからのガス生成 − レシチナーゼ − 以下の物質の加水分解 デンプン ＋ ゼラチン ＋ カゼイン ＋ 以下の物質の利用性 シトレート ＋ プロピオネート − チロシンの分解 − ＮＯ3 からＮＯ2 ＋ インドール − フェニルアラニンデサミナーゼ − アルギニンジヒドロラーゼ ＋ 独特の特徴：レシチナーゼ活性なし
【０１１１】１．５．２ ＨＤ１ｃｒｙＢ Ｒｅｓ９株 ＤＳＭ５８５４の同定 該菌株の特徴 棹菌 幅 １．０−１．２μｍ 長さ ３．０−５．０μｍ 運動性 ＋ 胞子 ＋ 楕円形 ＋ 円形 − 膨張した胞子嚢 − グラム反応 ＋ カタラーゼ ＋ 嫌気的生育 ＋ ＶＰ反応 ＋ ＶＰ培地中のｐＨ ４．７ 最高温度 生育 ４５℃ 非生育 ５０℃ 以下の条件での生育 培地ｐＨ５．７ ＋ ＮａＣｌ ５％ ＋ ７％ − １０％ − 以下の物質からの酸生成 グルコース ＋ Ｌ−アラビノース − キシロース − マンニトール − グルコースからのガス生成 − レシチナーゼ − 以下の物質の加水分解 デンプン ＋ ゼラチン ＋ カゼイン ＋ 以下の物質の利用性 シトレート ＋ プロピオネート − チロシンの分解 − ＮＯ3 からＮＯ2 ＋ インドール − フェニルアラニンデサミナーゼ − アルギニンジヒドロラーゼ ＋ 独特の特徴：レシチナーゼ活性なし
【０１１２】実施例２：ＨＤ１ｃｒｙＢ株およびＲｅｓ
９株の制限障壁の特徴づけ ２．１ 制限酵素ＢｔｈＫ１ 試験ＤＮＡは非特異的ヌクレアーゼにより全体的に消化
されるから、ＨＤ１ｃｒｙＢ株の粗抽出物中に配列特異
的制限酵素を検出することは不可能である。これらの妨
害性ヌクレアーゼは、かなりの程度まで、デキストラン
／ポリエチレングリコール相分配〔２２〕により簡単な
方法で分離され得る。存在するヌクレアーゼおよび制限
エンドヌクレアーゼの特徴に応じて、異なる酵素が異な
る相を選択するイオン強度が見出され得る。ＨＤ１ｃｒ
ｙＢの場合、非特異的ヌクレアーゼは全てのイオン強度
で除去され得る。１０ｍＭより低いか、または２５０ｍ
Ｍより高いＮａＣｌ濃度で配列特異的ヌクレアーゼは水
相に検出され得る。
９株の制限障壁の特徴づけ ２．１ 制限酵素ＢｔｈＫ１ 試験ＤＮＡは非特異的ヌクレアーゼにより全体的に消化
されるから、ＨＤ１ｃｒｙＢ株の粗抽出物中に配列特異
的制限酵素を検出することは不可能である。これらの妨
害性ヌクレアーゼは、かなりの程度まで、デキストラン
／ポリエチレングリコール相分配〔２２〕により簡単な
方法で分離され得る。存在するヌクレアーゼおよび制限
エンドヌクレアーゼの特徴に応じて、異なる酵素が異な
る相を選択するイオン強度が見出され得る。ＨＤ１ｃｒ
ｙＢの場合、非特異的ヌクレアーゼは全てのイオン強度
で除去され得る。１０ｍＭより低いか、または２５０ｍ
Ｍより高いＮａＣｌ濃度で配列特異的ヌクレアーゼは水
相に検出され得る。
【０１１３】ＨＤ１ｃｒｙＢ株に存在する制限酵素のさ
らなる精製および分離はヘパリンカラム上でのアフィニ
ティークロマトグラフィー〔４〕により以下のとおりに
行われた。細胞を培養液５リットルから遠心分離により
集め、そして細胞分解装置〔例えばフレンチ・プレッシ
ャー・セル〕中で分解し、そして細胞破片を遠心分離に
より分離除去する。核酸をポリエチレンイミンでの沈殿
により分離除去し〔２０〕、そしてタンパク質を７０％
飽和の（ＮＨ4 ）2ＳＯ4 で沈殿させ、そして少量の緩
衝液中に採取する。次にタンパク質をヘパリンカラムに
注入し、そしてＮａＣｌグラジエント〔０Ｍ−１Ｍ〕で
溶出する。溶離画分の一部を制限酵素の存在に対して試
験する〔４〕。使用された基質はｐＨＹ３００ＰＬＫで
あり、これは制限にさらされることが知られており、そ
して大腸菌から単離されているプラスミドである。非特
異的ヌクレアーゼの不完全な分離にもかかわらず、ＤＮ
Ａ断片の明瞭なパターンを生じる配列特異的制限活性が
示された。制限活性はおよそ０．６Ｍ−０．８Ｍで溶離
する。
らなる精製および分離はヘパリンカラム上でのアフィニ
ティークロマトグラフィー〔４〕により以下のとおりに
行われた。細胞を培養液５リットルから遠心分離により
集め、そして細胞分解装置〔例えばフレンチ・プレッシ
ャー・セル〕中で分解し、そして細胞破片を遠心分離に
より分離除去する。核酸をポリエチレンイミンでの沈殿
により分離除去し〔２０〕、そしてタンパク質を７０％
飽和の（ＮＨ4 ）2ＳＯ4 で沈殿させ、そして少量の緩
衝液中に採取する。次にタンパク質をヘパリンカラムに
注入し、そしてＮａＣｌグラジエント〔０Ｍ−１Ｍ〕で
溶出する。溶離画分の一部を制限酵素の存在に対して試
験する〔４〕。使用された基質はｐＨＹ３００ＰＬＫで
あり、これは制限にさらされることが知られており、そ
して大腸菌から単離されているプラスミドである。非特
異的ヌクレアーゼの不完全な分離にもかかわらず、ＤＮ
Ａ断片の明瞭なパターンを生じる配列特異的制限活性が
示された。制限活性はおよそ０．６Ｍ−０．８Ｍで溶離
する。
【０１１４】集積された酵素は、それが大腸菌またはバ
チラス・サブチリスから予め単離されたものであればプ
ラスミドｐＨＹ３００ＰＬＫを切断し、ＨＤ１ｃｒｙＢ
株から単離されたものであれば切断しない。それ故に、
特徴的なことに、この場合においてもまた、制限酵素の
製造主は、おそらく配列特異的メチル化の結果として、
それ自身のＤＮＡの消化から保護されている。
チラス・サブチリスから予め単離されたものであればプ
ラスミドｐＨＹ３００ＰＬＫを切断し、ＨＤ１ｃｒｙＢ
株から単離されたものであれば切断しない。それ故に、
特徴的なことに、この場合においてもまた、制限酵素の
製造主は、おそらく配列特異的メチル化の結果として、
それ自身のＤＮＡの消化から保護されている。
【０１１５】上記の全ての特徴はクラスＩＩの制限酵素
を示す。採用された命名法〔２６〕に従って、バチラス
・スリンギエンシスＨＤ１ｃｒｙＢから単離された酵素
はＢｔｈＫ１と命名される。
を示す。採用された命名法〔２６〕に従って、バチラス
・スリンギエンシスＨＤ１ｃｒｙＢから単離された酵素
はＢｔｈＫ１と命名される。
【０１１６】本発明はまた、この制限酵素ＢｔｈＫ１に
関する。
関する。
【０１１７】２．１．１ ＢｔｈＫ１の特異的認識配列 ＨＤ１ｃｒｙＢから単離された制限酵素の特異的な認識
配列および切断配列は以下のように決定され得る。
配列および切断配列は以下のように決定され得る。
【０１１８】基質として使用されるＤＮＡは一般に多く
の小さい断片に切断されるが、このことは、その認識配
列が４個のヌクレオチドだけからなる酵素であるという
仮定を導く。さらに、平均して高いＧＣ含量を有するＤ
ＮＡが頻繁に切断され、低い高いＧＣ含量を有するＤＮ
Ａが頻繁には切断されない場合、認識配列がＧＣに富む
という結論を導く。４つの配列を認識する酵素におい
て、配列が排他的にＧＣからなることを示す。バチラス
・サブチリスから単離されたプラスミドｐＣ１９４
の小さい断片に切断されるが、このことは、その認識配
列が４個のヌクレオチドだけからなる酵素であるという
仮定を導く。さらに、平均して高いＧＣ含量を有するＤ
ＮＡが頻繁に切断され、低い高いＧＣ含量を有するＤＮ
Ａが頻繁には切断されない場合、認識配列がＧＣに富む
という結論を導く。４つの配列を認識する酵素におい
て、配列が排他的にＧＣからなることを示す。バチラス
・サブチリスから単離されたプラスミドｐＣ１９４
〔９〕およびｐＢＣ１６〔３〕の基質ＤＮＡを用い、市
販の制限酵素との比較により、制限酵素ＢｔｈＫ１が市
販の酵素Ｔｈａ１〔米国メリーランド州ガイザースバー
グ，ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ〕、Ａｃｃ２〔米国カリフォル
ニア州ラ・ヨラ，ストラタジーン〕、ＢｓｔＵ１〔米国
マリーランド州ビバリー，ニュー・イングランド・バイ
オラブス〕およびＭｖｎ１〔ドイツ国マンハイム，ベー
リンガー・マンハイム〕のアイソシゾマーであることが
はっきりと示された。すなわち、ＢｔｈＫ１は配列ＣＧ
ＣＧが特異的にメチル化されていないならば、該配列を
認識し、そして切断する。制限酵素ＢｔｈＫ１に仮定さ
れた特異的メチラーゼＭ．ＢｔｈＫ１は、ＢｔｈＫ１に
よる消化だけでなくＴｈａ１またはＡｃｃ２による消化
からの保護を与える。これらの２つの酵素のメチル化は
公知であるから、Ｍ．ＢｔｈＫ１が配列ＣＧＣＧ中の少
なくとも最初のＣ、そして可能ならば両方のＣをメチル
化すると結論され得る。
販の制限酵素との比較により、制限酵素ＢｔｈＫ１が市
販の酵素Ｔｈａ１〔米国メリーランド州ガイザースバー
グ，ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ〕、Ａｃｃ２〔米国カリフォル
ニア州ラ・ヨラ，ストラタジーン〕、ＢｓｔＵ１〔米国
マリーランド州ビバリー，ニュー・イングランド・バイ
オラブス〕およびＭｖｎ１〔ドイツ国マンハイム，ベー
リンガー・マンハイム〕のアイソシゾマーであることが
はっきりと示された。すなわち、ＢｔｈＫ１は配列ＣＧ
ＣＧが特異的にメチル化されていないならば、該配列を
認識し、そして切断する。制限酵素ＢｔｈＫ１に仮定さ
れた特異的メチラーゼＭ．ＢｔｈＫ１は、ＢｔｈＫ１に
よる消化だけでなくＴｈａ１またはＡｃｃ２による消化
からの保護を与える。これらの２つの酵素のメチル化は
公知であるから、Ｍ．ＢｔｈＫ１が配列ＣＧＣＧ中の少
なくとも最初のＣ、そして可能ならば両方のＣをメチル
化すると結論され得る。
【０１１９】Ｒｅｓ９株中の制限酵素がＨＤ１ｃｒｙＢ
に対して上記したのと同様に分析される。Ｒｅｓ９の場
合のヘパリン／セファロースアフィニティーカラムの溶
離プロフィールはＨＤ１ｃｒｙＢのものと同様である。
すなわちＢｔｈＫ１は依然として製造され、そしてそれ
故に、Ｒｅｓ９の場合における減じられた制限障壁の原
因ではない。従ってそれに関連する突然変異は依然とし
て説明されないままである。
に対して上記したのと同様に分析される。Ｒｅｓ９の場
合のヘパリン／セファロースアフィニティーカラムの溶
離プロフィールはＨＤ１ｃｒｙＢのものと同様である。
すなわちＢｔｈＫ１は依然として製造され、そしてそれ
故に、Ｒｅｓ９の場合における減じられた制限障壁の原
因ではない。従ってそれに関連する突然変異は依然とし
て説明されないままである。
【０１２０】２．２ メチル化特異的制限 アデニンまたはシトシンの特異的メチル化はＤａｍまた
はＤｃｍメチラーゼにより大腸菌Ｋ中で行われる。大腸
菌Ｂ株は天然ではｄｃｍ- である。ＤａｍまたはＤｃｍ
メチラーゼと同じ配列を認識する制限酵素はそれらのタ
イプに従ってこのメチル化により阻害され得る。これら
の制限酵素はそれ故に特定のＤＮＡのメチル化の状態を
明らかにするために診断に使用され得る。この方法を用
いて、バチラス・サブチリスおよびバチラス・スリンギ
エンシスの両方がＤａｍまたはＤｃｍメチル化のいずれ
も示さないことを明らかにすることが可能である。
はＤｃｍメチラーゼにより大腸菌Ｋ中で行われる。大腸
菌Ｂ株は天然ではｄｃｍ- である。ＤａｍまたはＤｃｍ
メチラーゼと同じ配列を認識する制限酵素はそれらのタ
イプに従ってこのメチル化により阻害され得る。これら
の制限酵素はそれ故に特定のＤＮＡのメチル化の状態を
明らかにするために診断に使用され得る。この方法を用
いて、バチラス・サブチリスおよびバチラス・スリンギ
エンシスの両方がＤａｍまたはＤｃｍメチル化のいずれ
も示さないことを明らかにすることが可能である。
【０１２１】Ｒｅｓ９株における突然変異の性質の表示
は、異なるＤａｍ／Ｄｃｍ表現型を有する菌株から単離
されたシャトルベクターｐＨＹ３００ＰＬＫのＤＮＡを
用いて得ることができる。表５はそのＤＮＡのＨＤ１ｃ
ｒｙＢ株およびＲｅｓ９株への形質転換頻度を示す。Ｄ
ＮＡのＤａｍ／Ｄｃｍ表現型は相当するメチル化感受性
制限酵素での消化により各々の場合において注意深く確
認された。
は、異なるＤａｍ／Ｄｃｍ表現型を有する菌株から単離
されたシャトルベクターｐＨＹ３００ＰＬＫのＤＮＡを
用いて得ることができる。表５はそのＤＮＡのＨＤ１ｃ
ｒｙＢ株およびＲｅｓ９株への形質転換頻度を示す。Ｄ
ＮＡのＤａｍ／Ｄｃｍ表現型は相当するメチル化感受性
制限酵素での消化により各々の場合において注意深く確
認された。
【０１２２】表５からの結果は以下のようにまとめら
れ、そして説明される。
れ、そして説明される。
【０１２３】ＤＮＡのＤａｍメチル化はＨＤ１ｃｒｙＢ
に観察される大部分の制限障壁に関連する。他方、Ｒｅ
ｓ９はＤａｍ表現型により影響されず、そしてＤａｍメ
チル化ＤＮＡおよび非メチル化ＤＮＡを全く均等に受容
する。
に観察される大部分の制限障壁に関連する。他方、Ｒｅ
ｓ９はＤａｍ表現型により影響されず、そしてＤａｍメ
チル化ＤＮＡおよび非メチル化ＤＮＡを全く均等に受容
する。
【０１２４】従って、Ｄｃｍメチル化はバチラス・スリ
ンギエンシスＨＤ１ｃｒｙＢの形質転換性に事実上なん
ら影響を及ぼさない。同質遺伝子の菌株が利用できなか
ったから、個々の宿主間の比較的小さいが再生可能な相
違を単一の表現型で説明することはできない。しかしな
がら、異なる宿主菌株からのＤＮＡが異なる形質転換性
を有するという興味深い観察が残っている。
ンギエンシスＨＤ１ｃｒｙＢの形質転換性に事実上なん
ら影響を及ぼさない。同質遺伝子の菌株が利用できなか
ったから、個々の宿主間の比較的小さいが再生可能な相
違を単一の表現型で説明することはできない。しかしな
がら、異なる宿主菌株からのＤＮＡが異なる形質転換性
を有するという興味深い観察が残っている。
【０１２５】市販のＤａｍメチラーゼでの試験管内メチ
ル化により、Ｄａｍメチル化が実際にＨＤ１ｃｒｙＢに
おける制限障壁のいくつかの原因であることを確認する
ことが可能である（表６）。３種のその他のメチラーゼ
での試験管内メチル化はまた、それが一般的なメチル化
ではなく、制限障壁を引き起こす特異的なＤａｍメチル
化であることも示す。
ル化により、Ｄａｍメチル化が実際にＨＤ１ｃｒｙＢに
おける制限障壁のいくつかの原因であることを確認する
ことが可能である（表６）。３種のその他のメチラーゼ
での試験管内メチル化はまた、それが一般的なメチル化
ではなく、制限障壁を引き起こす特異的なＤａｍメチル
化であることも示す。
【０１２６】実施例３：特異的メチル化による制限障壁
の一層の低下 バチラス・スリンギエンシスＨＤ１ｃｒｙＢ株に存在す
る２つの制限系のうち、Ｄａｍ特異的制限に基づいてい
る主な活性は、誘導体Ｒｅｓ９における突然変異により
不活性化され得る。非修飾ＤＮＡの形質転換頻度の低下
を１０−５０倍にするのに依然として関連し、そして制
限酵素ＢｔｈＫ１に基づいている残りの残留活性はメチ
ラーゼＭ−ＦｎｕＤＩＩでの特異的メチル化により著し
く低下され得る。
の一層の低下 バチラス・スリンギエンシスＨＤ１ｃｒｙＢ株に存在す
る２つの制限系のうち、Ｄａｍ特異的制限に基づいてい
る主な活性は、誘導体Ｒｅｓ９における突然変異により
不活性化され得る。非修飾ＤＮＡの形質転換頻度の低下
を１０−５０倍にするのに依然として関連し、そして制
限酵素ＢｔｈＫ１に基づいている残りの残留活性はメチ
ラーゼＭ−ＦｎｕＤＩＩでの特異的メチル化により著し
く低下され得る。
【０１２７】３．１ シャトルベクターｐＨＹ３００Ｐ
ＬＫのＭ−ＦｎｕＤＩＩメチラーゼでの特異的メチル化 ニュー・イングランド・バイオラブス〔カタログ番号２
２４Ｓ，米国マサチューセッツ州ビバリー，ドザー・ロ
ード３２，ニュー・イングランド・バイオラブス〕によ
り供給されたメチラーゼＭ−ＦｎｕＤＩＩは配列 *ＣＧ
ＣＧを特異的にメチル化し、それにより該配列をＦｎｕ
ＤＩＩおよびそのアイソシゾマー、例えばＢｔｈＫ１で
の消化から保護する。
ＬＫのＭ−ＦｎｕＤＩＩメチラーゼでの特異的メチル化 ニュー・イングランド・バイオラブス〔カタログ番号２
２４Ｓ，米国マサチューセッツ州ビバリー，ドザー・ロ
ード３２，ニュー・イングランド・バイオラブス〕によ
り供給されたメチラーゼＭ−ＦｎｕＤＩＩは配列 *ＣＧ
ＣＧを特異的にメチル化し、それにより該配列をＦｎｕ
ＤＩＩおよびそのアイソシゾマー、例えばＢｔｈＫ１で
の消化から保護する。
【０１２８】シャトルベクターｐＨＹ３００ＰＬＫのＤ
ＮＡはバチラス・サブチリスまたは大腸菌から単離さ
れ、そして以下の混合物中でメチル化される： ＤＮＡ ｐＨＹ３００ＰＬＫ ０．３μｇ トリス−ＨＣｌ〔ｐＨ７．５〕 ５０ｍＭ ＥＤＴＡ １０ｍＭ β−メルカプトエタノール ５ｍＭ Ｓ−アデノシンメチオニン ０．０８ｍＭ Ｍ−ＦｎｕＤＩＩ ２ＵＮ* ─────────────────────────
────────── ＊ＵＮ＝メチル化単位。１単位はＦｎｕＤＩＩによる消
化からラムダＤＮＡ１μｇ〔１時間／３７℃で，反応容
量１０μｌ中〕を十分に保護するのに要求される酵素の
量に相当する。
ＮＡはバチラス・サブチリスまたは大腸菌から単離さ
れ、そして以下の混合物中でメチル化される： ＤＮＡ ｐＨＹ３００ＰＬＫ ０．３μｇ トリス−ＨＣｌ〔ｐＨ７．５〕 ５０ｍＭ ＥＤＴＡ １０ｍＭ β−メルカプトエタノール ５ｍＭ Ｓ−アデノシンメチオニン ０．０８ｍＭ Ｍ−ＦｎｕＤＩＩ ２ＵＮ* ─────────────────────────
────────── ＊ＵＮ＝メチル化単位。１単位はＦｎｕＤＩＩによる消
化からラムダＤＮＡ１μｇ〔１時間／３７℃で，反応容
量１０μｌ中〕を十分に保護するのに要求される酵素の
量に相当する。
【０１２９】メチル化は３７℃の温度で１時間行われ
る。メチル化反応はメチラーゼを不活性化することによ
り停止される。その目的のために全体の混合物は６５℃
の温度で２０分間もう１回保温される。次いでＤＮＡを
エタノールの添加により沈殿させ、そしてＴＥ緩衝液１
０μｌ中に再懸濁させる。各混合物を３重に反応させ
る。各々の場合の一部は引き続く形質転換のために使用
され、別の一部は損傷の不在のためにプラスミドＤＮＡ
を試験するために使用される。この後者の試験はアガロ
ースゲル電気泳動により行われる。
る。メチル化反応はメチラーゼを不活性化することによ
り停止される。その目的のために全体の混合物は６５℃
の温度で２０分間もう１回保温される。次いでＤＮＡを
エタノールの添加により沈殿させ、そしてＴＥ緩衝液１
０μｌ中に再懸濁させる。各混合物を３重に反応させ
る。各々の場合の一部は引き続く形質転換のために使用
され、別の一部は損傷の不在のためにプラスミドＤＮＡ
を試験するために使用される。この後者の試験はアガロ
ースゲル電気泳動により行われる。
【０１３０】メチル化の影響はＦｎｕＤＩＩアイソシゾ
マーＴｈａＩでのプラスミドＤＮＡの消化により試験さ
れる。結果は、ＤＮＡがＴｈａＩによる消化から保護さ
れていることを示す。すなわち、それが十分にメチル化
され、一方非メチル化対照は酵素により消化されてい
る。
マーＴｈａＩでのプラスミドＤＮＡの消化により試験さ
れる。結果は、ＤＮＡがＴｈａＩによる消化から保護さ
れていることを示す。すなわち、それが十分にメチル化
され、一方非メチル化対照は酵素により消化されてい
る。
【０１３１】３．２ 突然変異およびメチル化の組合せ 項３．１に記載したメチル化されたｐＨＹ３００ＰＬＫ
プラスミドＤＮＡを実施例１．２．１に記載したプロト
コルに従って制限欠失バチラス・スリンギエンシス突然
変異体Ｒｅｓ９内に形質転換させる。結果を表７に示し
ている。この結果は、Ｍ−ＦｎｕＤＩＩによるプラスミ
ドＤＮＡのメチル化と宿主菌株としてＲｅｓ９の使用の
組合せは、バチラス・スリンギエンシスＨＤ１ｃｒｙＢ
株に見られる制限障壁が完全に克服されることを可能に
することを示す。
プラスミドＤＮＡを実施例１．２．１に記載したプロト
コルに従って制限欠失バチラス・スリンギエンシス突然
変異体Ｒｅｓ９内に形質転換させる。結果を表７に示し
ている。この結果は、Ｍ−ＦｎｕＤＩＩによるプラスミ
ドＤＮＡのメチル化と宿主菌株としてＲｅｓ９の使用の
組合せは、バチラス・スリンギエンシスＨＤ１ｃｒｙＢ
株に見られる制限障壁が完全に克服されることを可能に
することを示す。
【０１３２】 培地および緩衝液 ＬＢ培地 〔ｇ／ｌ〕 トリプトン １０ 酵母抽出物 ５ ＮａＣｌ ５ Ｌアガー アガー１５ｇ／ｌで固化させたＬＢ培地 抗生物質培地Ｎｏ．３（ディフコ・ラボラトリーズ）〔ｇ／ｌ〕 牛肉抽出物 １．５ 酵母抽出物 １．５ ペプトン ５ グルコース １ ＮａＣｌ ３．５ Ｋ2 ＨＰＯ4 ３．６８ ＫＨ2 ＰＯ4 １．３２ ＳＣＧＹ培地 〔ｇ／ｌ〕 カサミノ酸 １ 酵母抽出物 ０．１ グルコース ５ Ｋ2 ＨＰＯ4 １４ ＫＨ2 ＰＯ4 ６ Ｎａ3 シトレート １ （ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 ２ ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ０．２ ＧＹＳ培地(Yousten & Rogoff, 1969)〔ｇ／ｌ〕 グルコース １ 酵母抽出物 ２ （ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 ２ Ｋ2 ＨＰＯ4 ０．５ ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ０．２ ＣａＣｌ2 ・２Ｈ2 Ｏ ０．０８ ＭｎＳＯ4 ・Ｈ2 Ｏ ０．０５ オートレーブ前にｐＨを７．３に調整 ＰＢＳ緩衝液 〔ｍＭ〕 サッカロース ４００ ＭｇＣｌ2 １ リン酸緩衝液，ｐＨ６．０ ７ ＴＢＳＴ緩衝液 〔ｍＭ〕 ツイーン２０* ０．０５％（ｗ／ｖ） トリスＨＣｌ* （ｐＨ８．０） １０ ＮａＣｌ １５０ 緩衝液ハイ〔Maniatis等(1982)， 104頁〕 〔ｍＭ〕 ＮａＣｌ １００ トリスＨＣｌ* （ｐＨ７．５） ５０ ＭｇＣｌ2 １０ ジチオトレイトール １ ニックトランスレーション緩衝液（１０倍） 〔ｍＭ〕 トリスＨＣｌ* （ｐＨ７．２） ５００ ＭｇＳＯ4 １００ ジチオトレイトール １ ウシ血清アルブミン（ＢＳＡペンタックス・フラクションＶ）５００μｇ／ｍ ｌ ＴＥ緩衝液 〔ｍＭ〕 トリス／ＨＣｌ（ｐＨ８．０） １０ ＥＤＴＡ １ ──────────────────────────────────── ＊ツイーン２０ ポリエトキシソルビタンラウレート ＊トリスＨＣｌ α，α，α−トリス（ヒドロキシメチ
ル）メチルアミノヒドロクロリド
ル）メチルアミノヒドロクロリド
【０１３３】寄託 本発明の範囲内で使用される以下に列挙した微生物は、
特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペ
スト条約の要求に従って、国際寄託当局として認められ
ているドイツ連邦共和国ブルンスヴィックにある「ドイ
チェ・ザンムルンク・フォン・ミクロオルガニスメン」
に寄託された。なお、微生物名の次のカッコ内にはＡと
して寄託日、Ｂとして寄託番号、そしてＣとして生存証
明日を記載する。 １．バチラス・スリンギエンシス クルスタキＨＤ１変
種（Ａ＝１９８６年３月４日，Ｂ＝ＤＳＭ３６６７，Ｃ
＝１９８６年３月４日） ２．バチラス・スリンギエンシス クルスタキＨＤ１ｃ
ｒｙＢ変種（Ａ＝１９８８年５月４日，Ｂ＝ＤＳＭ４５
７４，Ｃ＝１９８８年５月４日） ３．バチラス・スリンギエンシス クルスタキＨＤ１ｃ
ｒｙＢ Ｒｅｓ９変種（Ａ＝１９９０年３月21日，Ｂ＝
ＤＳＭ５８５４，Ｃ＝１９９０年３月21日） ４．ｐＫ６１で形質転換されたバチラス・スリンギエン
シス クルスタキＨＤ１ｃｒｙＢ変種（Ａ＝１９８８年
５月４日，Ｂ＝ＤＳＭ４５７２，Ｃ＝１９８８年５月４
日） ５．ｐＫ９３で形質転換されたバチラス・スリンギエン
シス クルスタキＨＤ１ｃｒｙＢ変種（Ａ＝１９８８年
５月４日，Ｂ＝ＤＳＭ４５７１，Ｃ＝１９８８年５月４
日）
特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペ
スト条約の要求に従って、国際寄託当局として認められ
ているドイツ連邦共和国ブルンスヴィックにある「ドイ
チェ・ザンムルンク・フォン・ミクロオルガニスメン」
に寄託された。なお、微生物名の次のカッコ内にはＡと
して寄託日、Ｂとして寄託番号、そしてＣとして生存証
明日を記載する。 １．バチラス・スリンギエンシス クルスタキＨＤ１変
種（Ａ＝１９８６年３月４日，Ｂ＝ＤＳＭ３６６７，Ｃ
＝１９８６年３月４日） ２．バチラス・スリンギエンシス クルスタキＨＤ１ｃ
ｒｙＢ変種（Ａ＝１９８８年５月４日，Ｂ＝ＤＳＭ４５
７４，Ｃ＝１９８８年５月４日） ３．バチラス・スリンギエンシス クルスタキＨＤ１ｃ
ｒｙＢ Ｒｅｓ９変種（Ａ＝１９９０年３月21日，Ｂ＝
ＤＳＭ５８５４，Ｃ＝１９９０年３月21日） ４．ｐＫ６１で形質転換されたバチラス・スリンギエン
シス クルスタキＨＤ１ｃｒｙＢ変種（Ａ＝１９８８年
５月４日，Ｂ＝ＤＳＭ４５７２，Ｃ＝１９８８年５月４
日） ５．ｐＫ９３で形質転換されたバチラス・スリンギエン
シス クルスタキＨＤ１ｃｒｙＢ変種（Ａ＝１９８８年
５月４日，Ｂ＝ＤＳＭ４５７１，Ｃ＝１９８８年５月４
日）
【０１３４】バチラス・スリンギエンシスは採択された
基準を用いて、そのパラ胞子結晶によってのみバチラス
・セレウスと区別され得るから、ＨＤ１ｃｒｙＢ株（Ｄ
ＳＭ番号４５７４）および制限欠失株Ｒｅｓ９（ＤＳＭ
番号５８５４）はバチラス・セレウスと分類され得る。
基準を用いて、そのパラ胞子結晶によってのみバチラス
・セレウスと区別され得るから、ＨＤ１ｃｒｙＢ株（Ｄ
ＳＭ番号４５７４）および制限欠失株Ｒｅｓ９（ＤＳＭ
番号５８５４）はバチラス・セレウスと分類され得る。
【０１３５】ＨＤ１ｃｒｙＢ株はプラスミドを含まない
からこの分類は可能であり、それ故に無結晶のＨＤ１の
誘導体〔２５〕は自動的にバチラス・セレウスと分類さ
れる。特徴づけられた３種の菌株の間の公知の相違で
は、分類学的同定は期待できない。しかしながら、項
１．５に示されている３種の菌株の特徴は示された関連
起源と矛盾しないから、ＨＤ１ｃｒｙＢ株およびＲｅｓ
９株は本発明の範囲内でバチラス・スリンギエンシスと
して記載を続ける。
からこの分類は可能であり、それ故に無結晶のＨＤ１の
誘導体〔２５〕は自動的にバチラス・セレウスと分類さ
れる。特徴づけられた３種の菌株の間の公知の相違で
は、分類学的同定は期待できない。しかしながら、項
１．５に示されている３種の菌株の特徴は示された関連
起源と矛盾しないから、ＨＤ１ｃｒｙＢ株およびＲｅｓ
９株は本発明の範囲内でバチラス・スリンギエンシスと
して記載を続ける。
【０１３６】参考文献一覧
【０１３７】 ＊＝相対値の計算のためにＨＤ１ｃｒｙＢ株から単離さ
れたプラスミドの頻度を１と設定した ＊＊＝〔アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクショ
ン（ＡＴＣＣ），米国メリーランド州ロックヴィレ，寄
託番号３３６９４〕 ＊＊＊＝〔東洋紡株式会社，注文番号ＰＨＹ−００１〕
れたプラスミドの頻度を１と設定した ＊＊＝〔アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクショ
ン（ＡＴＣＣ），米国メリーランド州ロックヴィレ，寄
託番号３３６９４〕 ＊＊＊＝〔東洋紡株式会社，注文番号ＰＨＹ−００１〕
【０１３８】
【０１３９】 ＊＝相対値の計算のためにＨＤ１ｃｒｙＢ株から単離さ
れたプラスミドの頻度を１と設定した
れたプラスミドの頻度を１と設定した
【０１４０】 ＊＝ＥＰ−Ａ０３４２６３３に記載 ＊＊＝文献〔２３〕およびＥＰ−Ａ０３４２６３３に記
載；ＤＳＭにより発行された寄託証明書中に記載された
内部表示ｐＫは現在の国際分類に従ってｐＸＩに現在補
正されている 表中、Ｂｔはバチラス・スリンギエンシスを表す
載；ＤＳＭにより発行された寄託証明書中に記載された
内部表示ｐＫは現在の国際分類に従ってｐＸＩに現在補
正されている 表中、Ｂｔはバチラス・スリンギエンシスを表す
【０１４１】 ＊＝ＨＤ１ｃｒｙＢまたはＲｅｓ９から単離されたｐＨ
Ｙ３００ＰＬＫをＨＤ１ｃｒｙＢ株内に同様の頻度で形
質転換し、そして１と設定する。その他の単離体の形質
転換頻度はその値に対して示される。同様のことがＲｅ
ｓ９株内への形質転換にも当てはまる。 表中、Ｂｔはバチラス・スリンギエンシスを表し、Ｂｓ
はバチラス・サブチリスを表す
Ｙ３００ＰＬＫをＨＤ１ｃｒｙＢ株内に同様の頻度で形
質転換し、そして１と設定する。その他の単離体の形質
転換頻度はその値に対して示される。同様のことがＲｅ
ｓ９株内への形質転換にも当てはまる。 表中、Ｂｔはバチラス・スリンギエンシスを表し、Ｂｓ
はバチラス・サブチリスを表す
【０１４２】 ＋＝ＨＤ１ｃｒｙＢ株およびＲｅｓ９株への形質転換頻
度は１と設定された ＊＝５−メチルシトシン ＄＝Ｎ6 −メチルアデニン
度は１と設定された ＊＝５−メチルシトシン ＄＝Ｎ6 −メチルアデニン
【０１４３】 ＊＝アマルシャム（英国バッキンガムシャイヤー）によ
り製造される試験管内突然変異誘発キット（カタログ番
号ＲＰＮ１５２３）の成分
り製造される試験管内突然変異誘発キット（カタログ番
号ＲＰＮ１５２３）の成分
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/87 (Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:085） (Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:07） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:085） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:07） (72)発明者 クリスチーナ ラインハルト ドイツ連邦共和国 7815 キルヒツアルテ ン ブルツクミユレンヴエーク 10 (72)発明者 ダニエル マテ フランス国 68870 バルテナイ ラ シ ヨゼ リユ デユスタエン 39
Claims (23)
- 【請求項１】 突然変異していない出発菌株に固有の制
限障壁内に部分的欠失を有し、そしてそれ故に、バチラ
ス・スリンギエンシスおよび／またはバチラス・セレウ
スにおいて制限に自然にさらされている異種仲介宿主か
らのベクターＤＮＡが使用されるとき、上記の突然変異
していない出発菌株に比べ著しく良好に形質転換され得
るバチラス・スリンギエンシスおよび／またはバチラス
・セレウスの突然変異体。 - 【請求項２】 前記異種仲介宿主が非適合性仲介宿主で
ある請求項１記載の部分的制限欠失突然変異体。 - 【請求項３】 前記非適合性仲介宿主が大腸菌またはバ
チラス・サブチリスである請求項２記載の部分的制限欠
失突然変異体。 - 【請求項４】 前記の突然変異していない出発菌株がバ
チラス・スリンギエンシスＨＤ１ｃｒｙＢ株である請求
項１記載の部分的制限欠失突然変異体。 - 【請求項５】 前記突然変異体が突然変異していない出
発菌株のものに比べ１０2 倍以上良好な形質転換性を有
する請求項１記載の部分的制限欠失突然変異体。 - 【請求項６】 以下の分類学的特徴： 棹菌 幅 １．０−１．２μｍ 長さ ３．０−５．０μｍ 運動性 ＋ 胞子 ＋ 楕円形 ＋ 円形 − 膨張した胞子嚢 − グラム反応 ＋ カタラーゼ ＋ 嫌気的生育 ＋ ＶＰ反応 ＋ ＶＰ培地中のｐＨ ４．７ 最高温度 生育 ４５℃ 非生育 ５０℃ 以下の条件での生育 培地ｐＨ５．７ ＋ ＮａＣｌ ５％ ＋ ７％ − １０％ − 以下の物質からの酸生成 グルコース ＋ Ｌ−アラビノース − キシロース − マンニトール − グルコースからのガス生成 − レシチナーゼ − 以下の物質の加水分解 デンプン ＋ ゼラチン ＋ カゼイン ＋ 以下の物質の利用性 シトレート ＋ プロピオネート − チロシンの分解 − ＮＯ3 からＮＯ2 ＋ インドール − フェニルアラニンデサミナーゼ − アルギニンジヒドロラーゼ ＋ 独特の特徴：レシチナーゼ活性なし を有する請求項１記載の部分的制限欠失突然変異体、ま
たはその菌株から直接もしくは間接的に生じ、そして出
発菌株の制限低下特徴を依然として有するその突然変異
体もしくは変種。 - 【請求項７】 ＤＳＭ５８５４の特徴を有する制限欠失
突然変異体バチラス・スリンギエンシス クルスタキＨ
Ｄ１ｃｒｙＢ Ｒｅｓ９変種、またはその菌株から直接
もしくは間接的に生じ、そして出発菌株の制限低下特徴
を依然として有するその突然変異体もしくは変種。 - 【請求項８】 減じられた制限障壁を有する自然突然変
異体が連続した数回の形質転換および選択サイクルによ
り増菌され、異なる選択マーカーをコードしそして十分
に高い率の形質転換を保証する形質転換シャトルベクタ
ーが好ましくは使用され、そして減じられた制限障壁を
有する他に、高度の形質転換効率を依然として示す突然
変異体が選択される、バチラス・スリンギエンシスおよ
び／またはバチラス・セレウスの制限欠失突然変異体の
製造方法。 - 【請求項９】 増菌の開始時の形質転換が少なくとも１
０6 ないし１０8 個の形質転換体を生じる請求項８記載
の方法。 - 【請求項１０】 形質転換がエレクトロポレーションに
より行われる請求項８記載の方法。 - 【請求項１１】 陽性形質転換体の特異的および選択的
選出を可能にする効率的に形質転換し得るベクターが異
なる形質転換／選択サイクルにおいて使用される請求項
８記載の方法。 - 【請求項１２】 前記ベクターで形質転換された細胞が
認識され、そして引続き選択されることを可能にする特
徴を宿主細胞に付与する１種またはそれ以上のマーカー
遺伝子を前記ベクターが含む請求項８記載の方法。 - 【請求項１３】 前記マーカー遺伝子が（ａ）抗生物質
耐性をコードするか、（ｂ）色素原基質が利用可能であ
る酵素をコードするか、または（ｃ）重金属に対する耐
性を付与する請求項１２記載の方法。 - 【請求項１４】 適当な突然変異体の選択の間に、最初
にプラスミドを含まない子孫が製造され、これらが次に
制限を受けることが知られているシャトルベクターで形
質転換される請求項８記載の方法。 - 【請求項１５】 請求項１ないし７のいずれか１項に記
載の制限欠失突然変異体を用いてバチラス・スリンギエ
ンシスおよび／またはバチラス・セレウスにおいて遺伝
子または別のＤＮＡ配列をクローニングする方法であっ
て、（ａ）該遺伝子またはＤＮＡ配列を適当な供給源か
ら単離するか、または合成し、（ｂ）単離または合成さ
れた遺伝子またはＤＮＡ配列を、バチラス・スリンギエ
ンシスおよび／またはバチラス・セレウスにおいて機能
し得、そして使用された上記遺伝子またはＤＮＡ配列に
関して同種または異種の起源であってよい発現シグナル
に操作可能に連結し、（ｃ）項（ｂ）のキメラ遺伝子構
築物を、適当なベクターを用いて請求項１ないし７のい
ずれか１項に記載のバチラス・スリンギエンシスおよび
／またはバチラス・セレウスの制限欠失突然変異体内に
形質転換し、そして（ｄ）相当する遺伝子産物を場合に
より発現させ、そして所望するならば単離する、上記方
法。 - 【請求項１６】 ベクターＤＮＡを適当な反応混合物中
試験管内で、宿主特異的制限エンドヌクレアーゼの認識
配列内の塩基の１個またはそれ以上をメチル化し得る特
異的メチラーゼと共に保温し、そしてメチル化されたベ
クターＤＮＡを次にバチラス・スリンギエンシスおよび
／またはバチラス・セレウスの制限欠失突然変異体内に
形質転換する追加段階を包含する請求項１５記載の方
法。 - 【請求項１７】 前記ベクターＤＮＡがバチラス・スリ
ンギエンシスおよび／またはバチラス・セレウスの制限
に自然にさらされている請求項１５または１６のいずれ
かに記載の方法。 - 【請求項１８】 前記ベクターが大腸菌またはバチラス
・サブチリスに由来するか、または少なくともそれから
単離された請求項１５または１６のいずれかに記載の方
法。 - 【請求項１９】（ａ）バチラス・スリンギエンシスの全
ＤＮＡを機械的にまたは適当な制限酵素を用いて断片に
分解し、（ｂ）適当な大きさの断片を単離し、（ｃ）前
記断片を適当なベクター内に挿入し、（ｄ）制限欠失バ
チラス・スリンギエンシスおよび／またはバチラス・セ
レウス細胞を適当なベクターで形質転換し、そして
（ｅ）形質転換体から、適当なスクリーニング方法を用
いて、新規で所望のＤＮＡ配列を含む形質転換体を選択
するバチラス・スリンギエンシスおよび／またはバチラ
ス・セレウス中に遺伝子バンクを確立する方法。 - 【請求項２０】 ベクターＤＮＡを適当な反応混合物中
試験管内で、宿主特異的制限エンドヌクレアーゼの認識
配列内の塩基の１個またはそれ以上をメチル化し得る特
異的メチラーゼと共に保温し、そしてメチル化されたベ
クターＤＮＡを次にバチラス・スリンギエンシスおよび
／またはバチラス・セレウスの制限欠失突然変異体内に
形質転換する追加段階を包含する請求項１９記載の方
法。 - 【請求項２１】 前記バチラス・スリンギエンシスが、
バチラス・スリンギエンシスＨＤ１ｃｒｙＢ株に匹敵す
る制限−修飾系を有する菌株である請求項１９または２
０のいずれかに記載の方法。 - 【請求項２２】 バチラス・スリンギエンシスおよび／
またはバチラス・セレウスの制限欠失突然変異体、特に
制限陰性突然変異体バチラス・スリンギエンシスＨＤ１
ｃｒｙＢ Ｒｅｓ９が使用されるバチラス・スリンギエ
ンシスおよび／またはバチラス・セレウスにおける制限
障壁を低下させる方法。 - 【請求項２３】 バチラス・スリンギエンシスおよび／
またはバチラス・セレウスの制限欠失突然変異体、特に
制限陰性突然変異体バチラス・スリンギエンシスＨＤ１
ｃｒｙＢ Ｒｅｓ９が、挿入されたＤＮＡをメチル化す
ることにより、バチラス・スリンギエンシスおよび／ま
たはバチラス・セレウスに固有の制限酵素による消化か
ら挿入されたＤＮＡを保護し、そのようにしてこの方法
の効率をさらに高める特異的メチラーゼと組み合わせて
使用される請求項２２記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CH2660/90-4 | 1990-08-16 | ||
| CH266090 | 1990-08-16 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0576349A true JPH0576349A (ja) | 1993-03-30 |
Family
ID=4238725
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3229653A Pending JPH0576349A (ja) | 1990-08-16 | 1991-08-16 | 制限欠失突然変異体 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0471647A3 (ja) |
| JP (1) | JPH0576349A (ja) |
| AU (1) | AU8250691A (ja) |
| CA (1) | CA2049188A1 (ja) |
| IE (1) | IE912898A1 (ja) |
| IL (1) | IL99179A0 (ja) |
| PT (1) | PT98676A (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113458852A (zh) * | 2021-06-09 | 2021-10-01 | 华大君 | 一种智能型机械加工用加工设备 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4595660A (en) * | 1983-03-02 | 1986-06-17 | University Of Delaware | Molecular cloning with bifunctional plasmid vectors in Bacillus subtilis, mutants and substantially stably transformed mutants of Bacillus subtilis, and methods for utilizing the transformed mutants |
| DE58909762D1 (de) * | 1988-05-20 | 1997-02-20 | Ciba Geigy Ag | Bacillus thuringiensis Transformation |
-
1991
- 1991-08-07 EP EP19910810617 patent/EP0471647A3/de not_active Withdrawn
- 1991-08-14 PT PT98676A patent/PT98676A/pt not_active Application Discontinuation
- 1991-08-14 CA CA002049188A patent/CA2049188A1/en not_active Abandoned
- 1991-08-14 IL IL99179A patent/IL99179A0/xx unknown
- 1991-08-15 AU AU82506/91A patent/AU8250691A/en not_active Abandoned
- 1991-08-15 IE IE289891A patent/IE912898A1/en unknown
- 1991-08-16 JP JP3229653A patent/JPH0576349A/ja active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| IL99179A0 (en) | 1992-07-15 |
| CA2049188A1 (en) | 1992-02-17 |
| IE912898A1 (en) | 1992-02-26 |
| EP0471647A3 (en) | 1993-02-24 |
| PT98676A (pt) | 1992-07-31 |
| EP0471647A2 (de) | 1992-02-19 |
| AU8250691A (en) | 1992-02-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US4828994A (en) | Bacillus strains with reduced extracellular protease levels | |
| Kudo et al. | DNA sequences required for the alkalophily of Bacillus sp. strain C-125 are located close together on its chromosomal DNA | |
| JPH028714B2 (ja) | ||
| WO1996029418A1 (en) | Introduction of dna into bacillus strains by conjugation | |
| EP0060663A2 (en) | A process for transforming certain microorganisms, vectors and their production, and a process for producing certain substances using said vectors | |
| EP0064680B1 (en) | Novel lysozyme-sensitive microorganism | |
| EP0032238A2 (en) | Recombinant bacteriophage for heterologous cloning of bacillus microorganisms and method for its production | |
| CA2083407C (en) | Microorganisms for the stabilization of plasmids | |
| EP0213898B1 (en) | A host-vector system | |
| US5766940A (en) | Plasmid and plasmid vector | |
| JPH0576349A (ja) | 制限欠失突然変異体 | |
| EP0135045A2 (en) | A novel plasmid and methods for its use | |
| AKAGAWA et al. | Plasmids of Streptomyces kasugaensis MB273: their pock formation, their dispensable endonuclease cleavage sites for pock formation, and transformation of S. kasugaensis MB273 by them | |
| EP0165002B1 (en) | Recombinant dna, microorganisms containing same and their use in the production of amylases | |
| EP1303626B1 (en) | Recombinant plasmid psp1, microorganisms transformed therewith, and method for producing an alkaline protease vapk | |
| US6858408B2 (en) | Recombinant plasmid pDSBCm, microorganisms transformed therewith, and method for producing an alkaline protease VapK | |
| Wong et al. | Recombination-induced variants of Clostridium acetobutylicum ATCC 824 with increased solvent production | |
| SU1532585A1 (ru) | Рекомбинантна плазмидна ДНК @ 33, кодирующа метилазу S @ 11, и штамм бактерий ЕSснеRIснIа coLI - продуцент метилазы S @ 11 | |
| JP3240052B2 (ja) | アントラサイクリン抗生物質に対して耐性の遺伝子の単離及び特徴付け | |
| Taylor et al. | Gene cloning in the actinomycetes | |
| JPH0113358B2 (ja) | ||
| JPS6221514B2 (ja) | ||
| JPS60186277A (ja) | 新規なプラスミドを保有する新規な微生物 |