PT98676A - Mutantes de b. thuringiensis e/ou b. cereus deficientes na restricao e metodos para a sua preparacao - Google Patents

Description

0 presente Bac 111 us thu.rinoiensi na restrição e com mutantes. 0 invento ultrapassar as barrei e/ou Bac i11us cersus invento está relacionada com mutantes de _s e Baci 11 us cereus parcialmente deficientes métodos para a preparação dos referidos está também relacionado com métodos para ras de restrição em Baci1lus thurinaiensis usando os referidos mutantes deficientes na restrição.

Os sistemas de restrição/modificação são muito comuns nos microorganismos e são conhecidos desde há muito» Foram até agora descritas na literatura científica mais de 6-όΦ enzimas de restrição e aproximadamente 10Φ das meti1ases associadas CKessler Holtke (1986)3.

De longe o maior número de sistemas de restrição/modi— ficação até agora descritos pertencem aos chamdos sistemas da classe II. Estes sistemas da. classe II são caracterizados pelo seu baixo grau de complexidade e portanto usam proteínas relativamente simples. Uma enzima de restrição da classe II, por exempla, ê capaz de reconhecer e de clivar uma sequência de DNA específica, desde que esta última não tenha sido já especifica-menta metilada pala meti 1ase associada. Nenhuma das enzimas requere ATP. Os genes codificadores destas enzimas C me tilases 2 frequentemente estão adjacentes uns aos outras em estreita proximidade no genoma bacteriano.

Os poucos sistemas de restriçlo/modificação conhecidos das classes mais complexas I e III derivam de Esenerichia coli. Saltnonella a Haemoahilus CKessler & Holtke (1986)1.

Para além destes sistemas “clássicos” encontrou-se nos últimos anos, primeira em E.___coli, e depois noutras espécies, enzimas de restrição que, ao contrário da situação com os 4

reconhecem e cortam uma sequência de DNA sistema foi especifica,mente meti lado 6)j Sladek et ai» í Í986) e MacNeil (1988)3,

As enzimas de restrição clássicas da classe II são um dos instrumentos mais importantes na tecnologia de rDNft e portanto constituem um dos essenciais básicos da genética molecular moderna. A sua principal aplicação é na construção de moléculas da DMA recombinante.

sistemas da classe II, apenas quando aquela CRaleigh & Wilson < 198* A su.a função natural na célula é, no entanto, defender contra DMA estranho indesejável, por exempla DNA virai ou bacte-riano. Devido a esta função natural, que se baseia na degradação de DMA estranho que tenha penetrado na célula, é de esperar frequências de transformação altamente reduzidas quando se trabalha com DNA recomtainante. Isto é referido em termos da presença das chamadas barreiras de restrição EMatsushima et al, (1987)? Miller et a1» (1988) a McDonald & Burke, (1984)3. Mesmo barreiras de restrição ligeiras podem ser suficientes para. evitar a construção da um banco de genes representativo, uma vez que o efeito de restrição aumentei à medida que aumenta o tamanho do plasmideo rscombinante. Quando existe restrição apenas com grande dificuldade se consegue isolar genes totalmente intactos. No caso de B. subtil is. por exemplo, mostrau-se que a enzima de restrição jBsuM que ocorre naquela estirpe EUozumi et al. (1977)? Hoshino et ãJL·. í 198©5 e Bron et al« (1988)3 é uma das principais causas da instabilidade estrutural dos plasmídeos recombinantes naquele organismo CHaina et al, (1987)3. A ultrapassagem das barreiras de restrição impostas pelas enzimas de restrição da classe II foi e continua a ser um dos principais problemas a serem resolvidos em genética molecular. Isto pode ser conseguido actua1mente de várias maneiras.

Uma abordagem possível é usar hospedeiros intermediários não restringentes, cujo DMA pode ser transferido para o hospedeiro pretendido sem restrição» Esta abordagem é adequada, por exemplo, para sistemas de restrição espcíficos de metilação» Pode ser usado como hospedeiro intermediário por exemplo um mutante não meti lente de E« cot j ou uma estirpe naturalmente deficiente em metilação CMacNeil <1988)? Patente Europeia NQ & 341 7/6 A23« Esta abordagem é, no entanto bastante complicada e tem a desvantagem adicional de estas estirpes de E. coli deficientes em metilação são geralmente díficeis de transformar e não são de algum modo estirpes hospedeiras ideais,

Numa outra abordagem, enzimas de restrição sensíveis ao calor são temporalmente inactivadas in vivo tBailey & Winstanley <1986)? Engel <1987)3 hsta abordagem está limitada pelas sensibilidades relativas ao calor do hospedeiro e das enzimas de restrição»

Um outro meio possível para ultrapassar as barreiras de restrição existentes é a metilação específica do DMA usado. Se a metilase especifica para um certo sistema de restrição fôr conhecida e tiver sido purificada, o DNA pode ser especificsmente metilado in vitro antes da transformação e portanto sar assim protegido contra restrição CVehmaanpera, 1988). Numa situação em que o gene da metilase resistente tenha sido clonado é possível em princípio para o DNA a ser transformado ser metilado directa-mente in vivo num hospedeiro adequado. A solução que é provavelmente a mais satisfatória e portanto a solução preferida, para a engenharia genética é no entanto o isolamento de mutantes que não sintetizam as enzimas de restrição responsáveis pelas barreiras de restrição» A maior parte das estirpes K de E. coli usadas como células hospedeiras uma são portadoras por exemplo de uma mutação no gerte de EcoK, enzima da ciasse I. Uma vez o DNA dos eucariotas superiores é geralmente fortemente metilado, recentemente foram construídas estirpes de E. coli que possuem mutações adicionais para os sistemas de restrição específicos de meti 1 ação mcrft. rncrB e mrr CKretz et al. (1989)3. Esta abordagem ê difícil em estirpes que possuem u.m número relativamente grande de sistemas de restrição, por exemplo Streptomvces f radiae ESlatsushima et al. (1987)3.

No entanto as barreiras de restrição não estão restringidas a E. coli sendo encontradas noutros microorganismos que são usados em experiências de clonagem.

Os sistemas de restrição/modificação de B. thuringiensis e de B. cersus são ainda muito pouco conhecidos pois só relativamente há pouco tempo foi possível transformar estas espécies de Bacillus eficazmente (Schurter et al. 19SÔ) e tem existido assim um interesse limitado no estudo dos sistemas de restrição/modificação naqueles organismos. Assim, as barreiras de restrição foram até aqui mencionadas apenas de passagem em relação a B. thuringiensis e B. cereus. Azizbekjan et al. (1983), por exemplo, descreve um isosquizómero Aval de B» thuringiensis var. israelensis.

Com os meios recentemente criados para a transformação eficiente de B. thuringiensis e/ou B. cereus e portanto para a utilização daqueles organismos como veículos de clonagem, no entanto estas barreiras de restrição tornaram-se um problema também no caso de Bthurinqiensis e de B. cereus. estirpe

Se, por exemplo, um vector vai-vem que é capaz de se replicar tanto em B. thuringiensis como em B- ... subtil is e em E« coli f8r usado para a electroporação de B thuringiensis V 7

HDlcryB tStahly et ai« <1978)3, um derivado de B thurinaiensis var. kurstaki HD1 sem corpos cristalinos, a frequência de transformação conseguida depende principalmente da. estirpe de onde deriva o DNA de plasmídeo» Os valores absolutos obtidos em cada caso podem variar mas as frequências relativas permanecem substancial mente constantes»

Um exemplo representativo destas diferenças nas frequências de transformação está apresentado na Tabela 1. Os resultados apresentados mostram que por eKemplo, a transformação do vectar vai-vem pHY3€*0PLK é sais baixa par um factor de pelo menos 1Θ"' quando o plasmídeo é isolado de um hospedeiro E. coli em vez de um hospedeiro B._thur 1 ηuiensis Se a estirpe original é reduzida por um lado, o DNA de f-Sr B » subtil is» a frequência de transformação factor de aproximadamenie 10, Se, por outro partir de B» thurinaiensis plasmídeo fSr novamante isolado a estirpe HDlcryB, ele pode ser transformado ele pode transformar HDlcryB com uma frequência elevada.

Este efeito de restrição sofre um outro aumento se o DMA estiver clonado num vector vai-vem, por exemplo na forma de um gene de protoxina. Neste caso a barreira de restrição aumenta marcadamente de novo no caso da transformação num hospedeiro B, thurinaiensis Cver Tsb» 4, ρΧIΞΘ4, pXI933. 0 motivo disto é presumivelmente o DNA adicionalmente integrado no vector ter outros sítios de restrição, os quais representam um sítio adicional de ataque para as enzimas postuladas como específicas do hospedeiro tHDlcryB3„ Estas barreiras de restrição podem atingir um valor de aproximadamente 1€? - 10 x o que torna muito baixa a probabilidade de uma transformação com êxito de HDlcryB usando estes vectores vai-vem. 8

Ssjgjste caso também os referidos plasmídeos podem ser transformados "riormalmente” em HDicryB apenas se tiverem sido previamente isolados a partir de HDicryB, Muitas vezes, no entanto, é desejável clonar DNA num hospedeiro intermediário heterólogo, o qual, no entanto, em muitos casos é incompatível ou apenas ligeiramente compatível com o sistema de restrição presente em B. thurinaiensis e/ou B»___cereus, A transformação de B. thurinaiensis e/ou B. cereus com o DNA vector que foi previamente isolado a partir de tal hospedeiro intermediário heterólogo não compatível conduz então muitas vezes a resultados nlo muito sa t i s fa tó r i os. 0 problema a resolver dentro do contexto do presente invento foi portanto essencialmente identificar e caracterizar barreiras de restrição em B, thurinaiensis e/ou B>_cereus e desenvolver métodos para ultrapassar aquelas barreiras. Este problema foi agora resolvido dentro do contexto deste invento, surpreendentemente, tornando disponível um mutante pareilamente deficiente em restrição de B. thurinaiensis como se pode ver a partir da descrição detalhada que se segue. 0 presente invento está pois relacionado especialmente com um mutante de B. thurinoiensis e/ou de B. cereus que tem uma deficiência parcial das barreiras de restrição inerente na estirpe inerente à estirpe de partida não mutagenizada e que pode ser portanto transformado significativamente melhor do que a referida estirpe de partida não mutagenizada quando é usado DNA vector de um hospedeiro intermediário heterólogo que está naturalmente sujeito a restrição em B. thurinaiensis e/ou B_»__cereus.

Dentro do contexto deste invento, um hospedeiro intermediário heterólogo deve ser entendido como sendo um organismo hospedeiro que é adequado para a clonagem ds DNA vector e que não é idêntica pelo senos à estirpe de B. thurinaiensis e/ou B.. cereus a partir da qual foi originalmente isolado o DMA a ser clonada. 0 invento está especialmente relacionado com um mutante parcialmente deficiente em restrição de B. thurinqiensis e/ou B. cereus que, quando são usados vectores vai-vem de um hospedeiro intermediário não compatível, como seja E» coli e/ou B. subtilis- pode ser transformado significativamente melhor do que a estirpe de partida não mutagenizada, de preferência por um factor de >1Θ^ 2 4 e de preferência especialmente por um factor de 10 -10 «

Dentro do contexto do presente invento deve ser entendido como hospedeiro intermediário não compatível um organismo hospedeiro que não desenvolveu quaisquer mecanismos para proteger eficazmente o seu DMA contra restrição após transformação de uma estirpe de B» thurinaiensis ou 5, cereus tendo um sistema de restrição divulgado dentro do contexto do presente invento.

Uma realização especialmente preferida do presente invento é um mutante parcialmente deficiente em restrição da estirpe HDicryB de 6. thurinaiensis. a qual quando da utilização de vectores vai-vem de E» coli e/ou. B. subtil is, apresenta uma capacidade de transformação que é melhor do que a da estirpe não -*? £i mutagenizada por um factor de 1 Φ“'~~ 1 © r5 dependendo do vector de transformação particular usado. e é dada especial preferência dentro do contexto do presente inventa ao mutante parcialmente deficiente em restrição B„ thurinaiensis ver, Kurstki HDicryB Res9, que é obtido por meio de mutação espontânea de B. t. estirpe HDicryB e pode ser obtido por meio de meios de enriquecimento conhecidos per se e a seus mutantes e variantes que derivem directamente daquela estirpe que ainda t'§'m as características redutoras da restrição caracte™ rísticas da estirpe de partida» O presente invento está também relacionado com métodos de preparação dos referidos mutantes deficientes em restrição» é dada prefer'incia a tun método em que essencialmente mutantes espontâneos tendo uma barreira de restrição reduzida são enriquecidos por meio de uma série de vários ciclos de transfor— mação e selecção, sendo de preferência usados na transformação vectores vai-vem que codificam diferentes marcas de selecção e que garantem uma taxa elevada de transfarmação, de preferência uma taxa de transformação de ίθ'- a 1Θ~ transformantes e seleccío-nados os mutantes que, para além de terem uma barreira de restrição reduzida, ainda apresentam um elevado grau de eficiência de transformação. 0 invento está relacionado ainda com métodos de redução de barreiras de restrição em B» thurinaiensis e/ou B»_cersus usando mutantes negativos em restrição, especialmente usando o mutante B. thurinaiensis HDlcryB Res9 negativo para restrição. 0 invento está também relacionado com um método de redução de barreiras de restrição em §_»_thuriηαiens:i.s e/ou B. coreus. em que um mutante negativo na restrição, SíSpSi- ia1mente o mutante B_._thurinaiensis HDlcryB Res9, é usado em combinação com uma metilase específica que por metilação do DMA inserido protege este último de ser digerido por enzimas de restrição inerentes a B. thurinoiensis e/ou B» cereus e assim aumenta mais a eficiência do método.

Conforme definido dentro do contexto do presente invento, um mutante negativo para restrição ou deficiente em restrição é uni que possa ser melhor transformado, por um fsetor de £10·“, por um vector vai-vem que tenha sido isolado a partir de E» coli do que uma estirpe de partida não mutagenizada» No entanto as mutações espontâneas ocorrem geralmente com uma __ p frequência muito baixa (10 -1Θ ~'> no caso de B. thurinoiensis e de B. cereus. de forma que estes raros mutantes primeiro têm de ser enriquecidos por um dos meiso de enriquecimento conhecidos. Isto pode ser conseguido, de preferência, por passagem através de vários, de preferência X a 8 ciclos consistindo em transformação e selecção, sendo seleccionados os transformantes mais promissores no final de cada ciclo e usados novamente no ciclo de trans- formação/selecção seguinte. Uma vez transformado um destes raros 2 Γ·ί mutantes, pode-se esperar enriquecimento por um factar de Ιό^-ΐβ" em cada novo ciclo consistindo em transformação selecção, ou seja após apenas alguns ciclos a população celular compreenda uma maioria de células mutageniçadas»

Uma vez que os mutantes espontâneos são raros _ ~.jtj ,_g (10 -10 > ε portanto a probabilidade de que um desses mutantes seja transformado será pois baixa, as condições de transformação devem ser ssleccionadas de forma que sejam conseguidas taxas elevadas de transformação, de preferência taxas de transformação B 8 de pelo menos 10 -1Θ , Isto aplica-se ©specialmente aos dois primeiros ciclos de transformação» estes transformantes positivos podem ser então enriquecidos, identificados e finalmente isolados noutros ciclos de transformação/selscção. A dificuldade particular que o isolamento de mutantes de restrição apresenta ê evitar que a ocorrência de mutantes indesejáveis.

Assim, por exemplo, o enriquecimento em mutantes de resistências geraimente codificados pelo cromossoma podem ser evitados ou pelo menos mantido tão baixo quanto passível usando em cada ciclo de transformação/sslscção preferencialmente pias-mídeos tendo diferentes marcas de selecção»

Para enriquecimento em mutantes deficientes na restrição, é pois preferível usar vectores que podem ser transformados eficazmente.que permitam uma escolha específica e selectiva dos transformantes positivos. Vectores adequados contêm de preferência uma ou mais marcas de genes que conferem á célula hospedeira uma característica pela qual as células transformadas com o vsctor podem ser facilmente identificadas e subsequentemente seleccionadas. έ dada preferência a genes de marcas que codifiquem resistência a antibióticos. Alguns exemplos de genes de resistência adequados são especialmente os que codificam os antibióticos ampicilina, cloranfenicol, eritromicina, tetraci-clina, higromicina, S418, canamicina, bleomicina, neoreicina ou tiostreptona. É dada preferência também a genes de marcas que codificam enzimas para as quais exista um substrato cromogénico. Exemplos de tais genes de marcas são o gene lacZ Esubstrato cromogénico! X~gal -> 5-bromo-4-cloro-3-indolil-í5-D-galactosido3% o gene xylE Esubstrato cromogénico: cetecol3 5 ou o oper3o luxAluxB que, com aldeídos de cadeia longa como substrato Cpor exemplo n-decanal3, dão origem à emissão de luz.

As colónias transformadas podem ser então detectadas muito facilmente por meio de uma reacçlo corada específica.

Também adequado para usar no método de acordo com o invento são genes que conferem uma resistência a metais pesados, como seja o mercúrio. É dada preferência especial dentro do contexto deste invento a uma série de vectores vai-vem compatíveis que codifica.m diferentes marcas e preferencialmente tendo uma certa instabilidade em B» thurinoiensis e/ou B cereus. Devido à sua instabilidade, é relativamente simples preparar roais tarde derivados sem plasmídeo a partir de mu t antes potencial mente negativos para. a restrição.

Devido à sua caracteristica específica, estes vectores podem também ser usados roais de uma vez para transformação dentro do contexto do enriquecimento ©m mutantes.

Uma outra condição para encontrar mutant.es adequados é taxas de transformação inicialmente elevadas para assegurar um elevada grau de probabilidade de que um das mutantes que raramente ocorrem seja transformaado ao mesmo tempo é dada especial preferência a taxas de transformação iniciais de pelo menos

A R 10 -10 ou roais transformantes. A transformação de B ·, thurinoiensís e/ou B. cereus usando vectores vai-vem adequados para a selecção de transforman-tes é preferencialmente realizada por meio de electroporação, como descrito por exemplo em Schurter at a 1 «1989 ou em EP-A 342 Q-JO «

Numa realização especifica preferida dentro do contexto deste invento, as células de B. thuringiensis e/ou. B. cereus são em primeiro lugar incubadas num meio nutritivo adequado com ventilação adequada e a uma temperatura adequada, de preferência entre 20 °C e 3S°C, até ser atingida uma densidade óptica ϋϋν en tre 0,1 e 1,0. 14 A idade das culturas de Bacillus usadas na electropora™ çâo tem muita importância na. frequência de transformação, é pois dada especial preferência a uma densidadiB óptica de culturas de Saci 11 lis entre Φ,Ι e Θ, 3, especialmente θ,2« Deve—se notar no entanto que ê passível conseguir boas frequências de transformação também com culturas de Baci 11 us de outras fases de crescimento, especialmente com culturas crescidas durante a noite.

Beralmente, usa-se como material de partida células frescas ou congeladas. O material celular congelado está de preferência na forma de suspensões de células de B. thurinqiensis e/ou B. cersus em meio líquido adequado, ao qual com vantagem se adiciona uma certa quantidade de agente anti—congelação. São agentes anti-congelação adequados especialmente misturas de componentes osmoticamente activos e DMSO em água ou uma solução tampão adequada. Outros componentes adequados que podem ser considerados para usar em soluções de agentes anti-congelação incluem açúcares, alcoóis poli-hídricos, como seja glicerol, alcoóis de açúcares, aminoácidos e polímeros, como seja polieti-lenoglicol.

Se se usar esporos de B, thurinqiensis como material de partida eles são primeira inoculados num meio adequado e incubados durante a noite a uma temperatura adequada, de preferência entre 25°Ce 28°C e com ventilação adequada. Este lote é então diluido e tratado ainda como descrito atrás.

Para induzir esporulação em B. thurinqiensis pode ser usadoo qualquer meio que induza tal esporulação. Dentro do contexto do presente inventa é dada preferência a um meio SYS de acordo com Yousten Aft e Rogoff MH (1969). A introdução de oxigénio no meio de cultura é geral mente efectuada através de agitação das culturas, por exemplo usando um dispositivo de agitação, sendo preferidas velocidades entre 50 rpm e 30© rpm» A cultura de esporos de B» thurinoiensis e de células ds um organismo vegetativo dentro do contento do presente invento ê efectuada segundo métodos convencionais bem conhecidos, por razões práticas sendo preferidos meios nutritivos líquidos. A composição do meio nutritivo pode variar ligeiramente de acorda com a estirpe de B. thurinqiensis ou B» cereus usada» Em geral, são preferidos meios complexos tendo fontes mal definidas mas facilmente assimiláveis de carbono <C) e azoto iM), como seja os normalmente usados para a cultura de espécies aeróbias de Bacilius»

Para além do meio LB preferencialmente usado dentro do contexto do presente invento,é possível usar qualquer outro meio de cultura para a cultura de B. thurinqiensis e/ou B. cereus» por exemplo meio antibiótico 3, SCGY, etc» As culturas esporuladas de B. thurinoiensis são preferencialmente guardadas em meios GYS (rampas de agar) a uma temperatura de 4°C« CA composição precisa dos meios referidos é dada na secção "Meios e soluções tampão".3

Uma vez a cultura ter atingido a densidade celular pretendida, as células são colhidas por meio de centrifugação e ressuspensas numa solução tampão adequada que foi preferencialmente arrefecida antes com gelo. Dentro do contexto deste invento são soluções tampão especialmente adequadas os tampões de fosfa-tos osmoticamente estabilizados que compreendem como agente estabilizador açúcares, tais como glucose ou sucrose, ou alcoóis de açúcares, por exemplo manitol e que foram ajustados a valores

de pH entre 5,Φ e 8,©» é dada especial preferência a tampões d© fosfatas do tipo PBS tendo um valor de pH entre 5,0 e 8,0, de preferência entre 5,5 e 6,5, que contêm sucrose como agente estabilizador numa concentração entre 0,114 e Ι,ΘΜ, de preferência entre 0,3M e &,5M

0 período de incubação para células de Bacilius antes e após electroporação é de preferência entre ô,1 e 30 minutos, especialmente 1@ minutos.. A temperatura pode ser livremente seleccionada dentro de uma larga gama. é preferida unja gama entre 0°C e 35*C, de preferência entre 2°C e 15°C e mais preferencial-mente uma temperatura de 4°C.

Amostras de células de bacilos ressuspensas são então transferidas para cuvetes ou quaisquer outros recipientes adequados e incubadas juntamente com o DNA a ser transformado, durante um período adequado, de preferência durante um período entre cerca de 0,1 e 30 minutos, especialmente entre 5 e 15 minutos, s 3. uma temperatura adequada, de preferência a uma temperatura de 0*C a 35*C, especialmente a uma temperatura entre 2°C e 15CC e fnais preferencialmente a uma temperatura de 4°C.

Quando se trabalha a bai;<as temperaturas, é vantajoso usar cuvetes previamente arrefecidas ou quaisquer outros vasos adequados previamente arrefecidos» A concentração de DNA preferida para B. thurinqiensis au B« cereus está na gama de 1 ng a 20 pg» ú especialmente preferida uma concentração de DNA entre 1Θ ng e 2 pg„

Todo o lote, compreendendo células de B» thurinaiensis e/ou B, cereus e o DNA de plasmídeo a ser transformado, é então introduzido num sistema de electroporação e sujeito a electropo™ ração, ou seja, exposto rapidamente a um pulso eléctrico.

Os aparelhos de electroporação que slo adequados pa.ra usar no método de acordo com o invento podem agora ser adquiridos de vários fabricantes, co/no seja Bio Rad (Richmond, CA, USA? "Bens Pulser Apparatus”), Biotechnologies and Experimental Research, Inc. (San Diego, CA, USA; "BTX Transfector 108"), Promega (Madison, WI, USA? "X-Cell 200© Electroporation System"), etc. É certamente possível usar qualquer outro sistema adequado no método da acordo com o invento. A capacitãncia estabelecida no capacitador é vantajosamente entre 1 pF e 25© pF, espec ia 1 mente entre ipF e 50 p.F e ma is preferido 25 μΡ« A escolha da voltagem de partida pode ser feita livremente dentro de uma larga gama. é dada preferência a uma voltagem de partida V entre 0,2 kV e 50 KV, especialmente entre 0,2 KV e 2,-5 KV e mais preferencialmente entre 1,2 KV e 1,8 KV. 0 espaço que separa as placas do eléctrado depende inter alia das dimensões do aparelho de electroporação. é vantajoso entre 0,1 cm e 1,0 cm, de preferência entre ©,2 cm e 1,0 cm. é especialmente preferida um espaço entre placas de ©,4 cm. 0 espaço entre as placas do eléctrodo de 0,4 cm. 0 espaço entre as placas do eléctrodo e a voltagem de partida marcada no capacitador produz os valores de força de campo que actuam na suspensão celular. Estes valores situam-se vantajosamente numa gama entre 10Θ V/cm e 50 000 V/cm. SSo especialmente preferidas forças de campo entra 10© V/cm e 1Θ0Θ0 V/cm, especialmente entre 3ΘΘΘΘ V/cm ε 45Θ© V/cm. • 0 tempo de decaimento exponencial preferido dentro do contexto do método de acordo com o invento á entre aproximadamen-te 2 ms e aprox imadamente 5Θ ms, especialmente entre aproximada-mente 8 ms e aproximadamente 3Θ ms» έ dada especial preferência a um tempo de decaimento exponencial entre aproximadamente 14 ms e aproximadamente 2® ms» 0 ajustamento dos parâmetros seleccionáveis, como seja capacitãncia, voltagem inicial, espaça entre as placas, etc» depende até certo ponto da arquitectura do aparelho usado e pode portanto variar de caso para caso dentro de certos limites, έ pois possível também em certos casos exceder ou ir abaixo dos valores limites dados, desde que isso seja necessário para se conseguir valores óptimos da força do campo» A operação de electroporação pode ser repetida um ou mais veses até ser atingida uma frequência de transfarmação óptima para o sistema particular» A electroporação pode com vantagem ser seguida d® outra incubação das células de Baci. 11 us» de preferência durante um período entre ©,1 e 3® minutos, a uma temperatura entre o°C e 35 °C, de preferência entre 2°C e 15°C» As células electroporadas foram então diluídas com um meio adequado e incubadas novamente durante um período de tempo adequado, de preferência entre 2 e 3 horas, com ventilação adequada e uma temperatura adequada, de preferência entre 2©°C e 35°C.

No final de cada novo ciclo de electropo-ração com um dos vectores descrito detalhadamente atrás, as células tratadas de Baci11us thurinoiensis e/ou B» cersus foram então transferidas para um meio selectivo e incubadas a uma temperatura entre 10°C e 40°C, de preferência a uma temperatura entre cerca de 2©*C e 35*C e mais preferencialmente a uma temperatura entre 30°C e 33':'C, 0 meio selectivo contem como substância selectiva de preferência um dos antibióticos atrás referidos, dependendo do vector usado e facultativamente um agente solidificante adequado, como seja aqar, agarose, gelatina, etc.

Para melhor avaliar os mutantes potencialmente negativos para a restrição, em primeiro lugar são preparados derivados de mutantes enriquecidos sem plasmídeo. Para esta finalidade, colónias individuais de culturas enriquecidas obtidas a partir do ciclo mais recente de transformação/selecção são seleccionadas em cada um dos casos e incubadas num meio adequado sem selecção.

As culturas obtidas desta forma são então diluídas e semeadas em meio sólido adequado, de preferência em agar L, sem marcas selectivas. Diluições adequadas são então replicadas num meio selectivo adequado, de preferência num meio L, que contem diferentes marcas selectívas em diferentes concentrações, é dada especial preferência dentro do contexto deste inventa a tetraci-clina, cloranfenicol e eritromicina numa concentração que inibe o crescimento de células sensíveis mas que ainda permite o crescimento das células tendo os correspondentes plasmídeos de resistência. Deste modo, é relativamente simples encontrar derivados que não apresentem crescimento na presença das marcas seletivas especificamente usadas.

Para analisar as barreiras de restrição, os restantes isolados são então usados para transformar um vector adequado que pode derivar de E. coli por um lado e da estirpe de partida não mutagenisada por outro lado, B. thurinqiensis e/ou. B„__csreus.

Neste caso também a transformação é preferencialmente realizada como descrito atrás, via electroporação.

Conformei descrito anteriormente ê pois passível selec-cionar mutantes deficientes em restrição de B« thurinaiensis e/ου. B. cereus qu.e quando se usa o DMA vector de um hospedeiro intermediário heterólogo que está naturaimente sujeito a restrição em B. thurinaiensis e/ou B. cereus, pode ser transformado significa-tivamente melhor, de preferência por um factor de >1Θ"~ relativa-mente à estirpe não mutagenizada. é dada preferência especial a um mutante parcialmente deficiente em restrição de B. thurinqiensis estirpe HDlcryB que, quando se usa um vector vai-vem de um hospedeiro intermediário não compatível, como seja E. coli e/ou B« subtil is tem uma capacidade de transformação que é superior por um factor de à da estirpe não mutagenizada de partida. é dada especial preferência dentro do contexto do presente invento ao mutante parcialmente deficiente em restrição de B. thurinqiensis var. Kurstaki HDlcryB Res9, o qual foi obtido por meio de mutação espontânea de B. t. estirpe HDlcryB e pode ser obtido por meio de métodos de enriquecimento que são conhecidos per se e a mutantes e variantes seus que derivem directamente daquela estirpe e que ainda possuam as características de redução da restrição que caracterizam a estirpe de partida.

Qs mutantes deficientes em restrição aqui jâ descritos-são muito adequados provavelmente devido à sua maior capacidade de transformação, para usar como estirpes hospedeiras para a clonagem e facultativamente expressão de genes ou. de outras sequências de DNA úteis, especialmente genes de protoxina.

Detalhadamente o processo é de preferência como se segue primeiros <a> os referidas genes ou. sequências de l*NA são isolados· a partir de uma fonte adequada ou são sintetizados5 <b> os genes isolados ou sintetizados ou sequências de DMA são operacionalmente ligados aos sinais de eKpressão que são capazes de funcionar ©m Baci1lus thurinaiensis e/ou B„ csrsus e que podem ser homólogos ou heterólogos relativamente aos genes ou sequin— ciss ds DNrt <c) a construção de ^enss c^uxrnèri.ca de acordo cocn a so*.„çdo Cd/ foi usada em transformação usando vectores adequados, incluindo os que estão naturalmente sujeitos a restrição em B. tb.y£ÍnflÍÊQJ.Í'ã e/ou B. cereus, num mutante deficiente em restrição de Baci1lus thurinqiensis e/ou B» cereus; e íd) um produto correspondente do gene é facultativamente expresso e, caso se pretenda, isolado.

Para aumentar a eficiência do método de acordo com o invento, é possível incluir no método um passo adicional em que o DMA vector é incubado in vit.ro numa mistura de reacção adequada, juntamente com uma metila.se específica que é capaz de metilar uma ou mais bases dentro da sequência de reconhecimento de uma endonucleasa de met.i.lado é então restrição de B, restrição específica do hospedeiro e o DMA vector usado para transformar um mutante deficiente em thuringiensis e/ou B. cereus. - é dada preferência especial dentro do contexto deste invento a um método para a clonagem e facultativamente expressão de geens ou outras sequências de DMA úteis, método esse em que são usados vectores que derivam de E. coii ou de B. suotilis.

Para além de genes estruturais- é certamente possível usar quaisquer outras sequências ds DNA úteis, tais cqí?íq sequências de DNA de DNA não codificadoras que têm uma função reguladora» Nesta altura pode ser referido como exemplo que um DNA "anti-codão" que é transcrito em RNA mas não é traduzido em proteína.

Usando o mutante deficiente em restrição é pois possível pela primeira vez como rotina estabelecer bancos de genes representativos em B. thurinoiensis e/ou Bacilus cereus, o processo preferencialmente sendo como se segue primeiro. (a) o DNA total de Bacillus__thurinqiensis é desintegrado em fragmentos mecanicamente ou de preferincia usando enzimas de restrição adequadasρ (b) fragmentos de tamanho adequado são isolados? (C > os referidos fragmentos são inseridos num vector adequado, incluindo os que estão naturalmente sujeitos a restrição em B. thurinoiensis e/ou B. cereus; íd) células de Bacx 1.1 us.._thuringiensis e/ou de Baci 11 us cereus são transformadas com o referido vectorp e

Ce) são seleccionados entre os transformantes, usando métodos de rastreic adequados, os que compreendem as novas sequências de DMA desejadas.

Neste caso também a eficiência da transformação pode ser aumentada por meio de metilação adicional do BNA a ser inserido» έ dada especial preferência dentro do contexto do presente invento a um método sm que o referido Bacillus thurinqiensis é uma estirpe que tem um sistema de restrição/modi-ficação comparável ao de Bacillus thurinqiensis estirpe HDlcryB»

Este invento está relacionado ainda com métodos de redução das barreiras de restrição em B. thurinqiensis e/ou Baci11us cereus usando mutantes negativos para a restrição, especialmente usando o mutante negativa para a restrição B, thurinqiensis HDlcryB Res9«

Um outro aumento na eficiência deste método por repetição da redução das barreiras de restrição pode ser conseguido um mutante negativo para a restrição, especialmente o mutante negativo para restrição B. thurinqiensis HDlcryB Res9, em combinação com uma meti1ase especifica que por meti1ação do DMA vector inserido, protege este último de ser digerido por enzimas de restrição inerentes a B» thurinqiensis e/ou B« cereus e aumenta ainda a eficiência do método»

Betaihadamente, é possível proceder como se segues α DMA vector, juntamente com uma meti1ase específica que é capaz de metilar uma ou mais bases dentro da sequência de reconhecimento de uma endonuclease de restrição especifica do hospedeiro, é incubada in vitro numa mistura de reacção adequada e o DMA vector meti lado é então usado para transformar um mutante deficiente em restrição de* B« thurinqiensxs e/ou B« cereus» especialmente no mutante deficiente na restrição B.thurinqiensis HDICryB Res9.

Um exemplo de tal meti 1ase, que não deve ser encarada como lxmitante, è a enzima M—FnuDII, a qual meti la espeoificamen— te a primeira citosina dentro da sequência de reconhecimento da enzima de restrição FnuDII ou dos seus isosquizómeros, tais como 24

BthKI l ÍCGCG3 e portanto protege o DMA vector tratado com a referida metilase de ser digerida por aquela enzima« Desta forma é possível reduzir significativamente ou totalmente eliminar a actividade residual que permanece após exclusão da restrição especifica de Dam., cuja actividade residual é ainda responsável pela redução da frequência de transformação do DMA não modificado por um factor de 1Φ a 5@«

Para ilustrar a descrição geral e para proporcionar uma melhor compreensão do presente invento, é feita referência abaixo a exemplos específicos que no entanto não são de natureza limi-tante, a menos que exista uma indicação especifica em contrário. 0 mesmo se aplica a todas as listas dadas como exemplo da descrição f ei ta..

EXEMPLOS Hm LIMITftNTES

EXEMPLO 1s Isolamento de um mutante negativo na restrição da estirpe HDlcrvB 1.1 Veetores vai-ve-m usados na selecçao de mu tantas tanta deficiente em restrição HDlcryB EStahiy DP et al. i—vem que se seguem, todos eguinte ordem s

Para. o isolamento de um mu. cls Baclllus thurinqiensis estirpe <1987)3, usaram—se os veetores va isolados a partir de E. coli., pela s

Vector

Selecçlo

Origem/Referfn c i a

Cem B»_ thurinaiensis) PAM4Ô1 Cm Wirth et al. . 1986 pHV'300F:‘Li< Tc Toyabo Co«, 0saka,S3© Japan, Ordem NS ΡΗΥ-ΘΘ1 pAM4ôl Cm Wirth et al», 1986 pHP13 Em, Cm Bac i11us Seneti c Stock Center, Ohio State Univ., Columbus, Ohio 4321Θ, USA, Estirpe MS 1P50

Uma vez que o plasmideo pAH4€U é eKtremamente instável e sem selecção é rapidamente perdido de novo, ele pode ser usado para transformação mais de uma vez. Ume. vez que os outros vecto-rss vai.-vem também apresentam uma certa instabilidade em B« thurinqiensis. derivados sem plasmideo podem mais tarde ser obtidos de uma forma relativamente fácil a partir de mutantes negativos para restrição.

1.2 Transformação de Bc

i 11 u3_t.huringiensis HDlcrvB A transformação de BaciI lus thurinciisnsig usando os vectores vai—vem apresentados em 1.1 foi realizada par meio de electroporação, 1.2.1 Protocolo convencional_______pera a transf ormauão de B. thurinaiensis HDlcrvB via electroporação

levedura de B. <1978)3, 1© ml de meio LB (iriptona l©g/l, eKtracto de S g/1, NaCl 5 g/1) foram inoculados com esporos t hu r i η o i ensis var. Kurstaki HDlcryB CStahly DP et al. uma variante sem plasmídeo.

Esta mistura foi incubada durante a noite a uma temperatura de 27 °C num agitador rotativo a 50 rpm. A cultura de B» thurinaiensis foi então diluída 10© vezes de 10© ml para. 4ΘΘ ml de meia LB e crescida ainda à temperatura de 30 °C num agitador rotativo a 250 rpm até se conseguir uma densidade óptica (0D^.;}) de 0,2.

As células foram colhidas por meio cie centrifugação e ressuspensas em 1/40 do volume de tampão PBS arrefecido em gelo <400 mM sucrose, i mH MgCl,,, tampão de fosfatas 7 mM pH 6,0). A centrifugação s subsequente ressuspensão das células de B. thurinqiensis colhidas em tampão PBS foi repetida uma vez.

As células assim tratadas podem ser electreparadas directamente ou guardadas, após adição de glicerol à solução tampão E20% (p/v>3, entre -2©‘-C e -70°C e usadas mais tarde.

Amostras de 400 μΐ de células arrefecidas em gelo foram então transferidas para cuvetes pres'iamente arrefecidas e o EsNfi

de plasmideo fci então adicionado numa concentração adequada e toda a mistura foi incubada entre 0,1 e 10 minuto® a 4°C»

Quando se usa o material congelado, em primeiro lugar uma amostra de células congeladas é descongelada em gelo ou à temperatura ambiente» 0 tratamento subsequente é efectuado de forma análoga ao processo descrito para o material fresco»

A cuvete é então introduzida num aparelho de electropo··· raçIo, onde as células de B« thurinaiensis presentes em suspensão sofrem electroporação ao serem sujeitas numa única descarga de um capacitador a voltagens de 0,1 KV a 2,5 KV. Sendo preferida uma voltagem de 1,3 KV. 0 capacitador usado neste caso tem uma capacitlncia de 25 pF, as cuvetes fim um espaço entre eléctrodos de ©,4 cm, o qual no caso de uma descarga, dependendo do que se marcou, conduz a um decréscimo exponencial da força de campo tendo valores do pico inicial entre ©,25 KV/cm e è,25 KV/cm, especialmente de 3,25 KV/cm» 0 tempo de decaimento exponencial está numa gama entre 10 ms e 20 ms.

Para as experiências de electroporação descritas, por exemplo pode ser usado um aparelho de electroporação fornecido pela Bio Rad ("Gene Pu1ser Apparatus", N2 165-2075, Bio Rad, 1414 Harbour Uíay South, Riehmond, CA 94804, USA),

Certamente qualquer outro aparelho adequado pode ser usada no método de electroporação descrito. e

Após um período de incubação entre 0,1 - 10 minutos a 4*C, a suspensão de células é diluida com 1,6 ml de meio LB incubada durante 2 horas a uma temperatura de 3@°C num agitador rotativo a 25Θ rpm.

As diluções adequadas são então semeadas em agar L (meio LB solidificada com agar, 15 g/1) que contem como aditivo um antibiótico adequado à selecção do novo plasmídeo obtido. No caso de pHY300PLK, este é o antibiótico tetraciclina, o qual é adicionado ao meio numa concentração de 20 mg/1.

As células de Baci 11 ns cereus podens então ser transformadas do mesmo modo que B. thurinqiensis de acordo com o protocolo acima. í ,.22 Modificações especificas dentro dos ciclos individuais de transformação/se1eccão lã electroporacãos A estirpe HDlcryB de Bacillus thurinqiensis foi cultivada de acordo com o protocolo convencional Cver Secção 1.2.13 e concentrada 500 vezes de modo a conseguir—se frequências elevadas de transformação. CA informação detalhada sobre electropo ração de células de Bacillus thurinqiensis pode ser encontrada no Pedido de Patente Europeia EP--A 0342 6333.

Após electroporação das células de Bacillus thurinqiensis HDlcryB com 5 pg de DNA do plasmídeo pAM40i, as células foram diluidas 5 vezes em meia LB e incubado durante 2 horas a 250 rpm e 30 °C. Os transformantes foram então selecciona-dos usando 20 pg/ml de cloranfenicol durante 4 horas a 250 rpm e 30°C e foram então diluídos 2Θ0 vezes em meio LB para a electro-poração seguinte» 2§ electroporacãos Após 2 horas de incubação a 150 rpm e 30°C de acorda com o protocolo convencional Cver Secção 1.2.13, as 29 células foram lavadas e concentradas 400 vezes» Após elsctrupora™ çâo com 12 pg de DMA do plasmídeo pHY300PLK, as células foram diluídas 5 vezes em meio LB e incubadas durante 1,5 horas a 25Θ rpm e 3@°C. Após ma is uma diluição de 5 vezes, os transformar» tes foram seleccionados durante a noite usando 2ô pg/ml de tetraci-clína a 150 rpm e 30 °C e foram então diluídos 200 vezes em meio LB para a electroporação seguinte»

51 electroporação: Após uma incubação de 1,5 horas a 250 rpm e 30*0 de acordo com α protocolo, as células foram lavadas e concentradas 1ΘΦ vezes» Após electreporação com 5 μα de DMA de plasmídeo ρΑΜ4Θ1, as células, tal como descrita para a segunda electroporação, são diluídas em LB, incubadas e diluídas novamente com LB e os transformamtes seleccionados usando 10 pg de cloranfenicol durante 2,5 horas a 250 rpm e 30°C. A cultura assim sleccionada foi então guardada à temperatura ambiente»

41 electroporação: A cultura acima foi diluída 50 vezes e de acordo com o protocolo convencional incubada durante a noite e depois cultivada ainda como uma sub-cultura, lavada e concentrada» Após electroporação com 5 pg de pHP13, as células foram diluídas 5 vezes e incubadas durante um período de 3,5 horas a 250 rpm e 30°C. As células foram então diluídas novamente e colocadas em agsr L com 200 pg/ml de eritromicina.

As 31 e 41 electroporaçSes já apresentaram frequências de transformação marcadamente elevadas, o que é uma primeira indicação do enriquecimento em mutantes deficientes na restrição» 1,3 Preoaracão de derivados sem plasmídeos

Para ana1isar me1hor os mutan tes po tenciaimen te

deficientes na restrição em primeiro lugar preparam-se os derivados sem plasmídeos. Com esta finalidade i€i colónias individuais foram repicadas das placas de selecção acima Sapés a 4s electro-poração, ver Secção I =2:.23 e incubadas em 1® ml de meio LB durante a noite a 5® rpm e 27°C sem selecção.

As culturas foram então diluídas e semeadas em agar L sem marcas selectivas. Diluições adequadas destas culturas foram então replicadas em placas de agar L cada uma contendo uma das seguintes marcas de selecção: tetraciclina £20 pg/ml3, cloranfe-nicol Cl® pq/ffll3 ou eritromicina C2Ô® ug/ml2,

Deste modo das 1® colónias originais é relativamente fácil encontrar derivados de 6 que não apresentem crescimento na presença das tris marcas selectivas. Em nenhum daqueles derivados foram detectados qualquer um dos plasmídeos anteriormente inseridos.

Transformação com o vector vai-vem pHY30®PLK

Para analisar as barreiras de restrição, os 6 isolados restantes foram transformados com .. pHY3®®PLK que deriva por um lado de E. coli e por outro lado de B. thurinqiensis HDlcryB. A transformação foi realizada por meio de electroporação Cver Exemplo 1.2.13.

Os resultados da. Tabela. 3 mostram que 4 dos 6 isolados testados apresentam barreiras de restrição marcadamente reduzidas comparado com a estirpe parental HDlcryB. Daqueles mutantes, designados Res5, 7, 0 e 9, Res5, 7 e 9 ti'm uma barreira de restrição que é aproximadamente 5®-i®®x mais pequena do que HDlcryB. Se bem que ResS apresente uam barreira de restrição extremamente baixa, visto em termos absolutos a sua capacidade de

transformação é de aproximadamente 5€>©x ma.is fraca do que a de HDicryB, o que exclui a vantagem da barreira de restrição reduzida·

Apenas o mutante Res? negativa para resrição se combina vantajosamente com urn elevado grau de eficiência de transformação com as das barreiras de restrição reduzidas»

As vantagens do mutante Res9 torna-se ainda mais clara no caso da transformação com plasmideos recombinantes. έ claro a partir da Tabela 4 que os vectores vai-vem isolados a partir de E. coli que contem um gene da protoxina L ρΧ IΞΘ4, pXI931, podem ser transformados em Bacillus thurinqiensis HDlcryB apenas com uma frequência muito baixa., enquanto que o mutante Res9 permite uma transformação eficiente usando os mesmos plasmídeos.

I

1.5 Caracterização taxonómica das___estirpes de Bacillus t hu. r i n q i en s i s usad as 1,5.1 Estirpe HDlcryB Identificação da estirpe DSM 4574 Características da estirpe

Bacillus Largura/ y.m Comprimento/ \m Ι,Θ-1,2 ·—* , -~f ·. J :: 0

Mobilidade -f·

Esporos + e1i psói des + redondos — esporãnqio inchado

ReacçSta de Oram *·

Cataiase +

Crescimento anaeróbico •f-

Reacção VF* + pH no meio VP <!, * ?

Temperatura máκima

Crescimento positivo a C'C 45

Crescimento negativo a °C 50

Crescimento em

Meio pH5,7 NaCl 5% 10*/. Ácido a partir de glucose L-arabinose xilose manitol Gás a partir de glucose

Lecitinase

Hidrólise de amido aelatina caseína

Utilização de citrato propionato

Degradação de tirosina NO.- a partir de N0T índole fen i1aIan ina-desam inasa arginina-hidralase

Caracterísfciea invulgars nenhuma actividade lecitinase 1.5.2 Estirpe HDlcrvB Res9

Identificação da estirpe DSÍi 5854

Caracteristicas da estirpe

Bacillus Largura/pm Comprimento/pm

Mobilidade

Esporos elipsóides redondos esporãngio inchado Reacção de Oram Cataiase

Crescimento anaeróbico Reacção VP pH no meio VP

Temperatura máxima. Crescimento positivo a *C Crescimento negativo a *C

Crescimento em Meio pH5,7 NaCl 5% 7% i 07. écido a partir de glucose L-arabinose

KÍ1ObS manitol Bás a partir de glucose

Lecitinase

Hidrólise de

45 5Θ 4 + 4- amido + gelatina ·/· caseína -1.

Utilização de citrato + propionato

Degradação de tirosina

NQ^ a partir de N0.T 4- índole fenilalanina-desaminase - arginina-hidrolase +

Característics invulgars nenhuma actividade lecitinase EXEMPLO 2s Caracterização das barreiras de restrição das estirpes HDlcrvB e Res9 2.1 Enzima de restrição BthKl

Nos extractos brutos da estirpe HDlcryB é impossível detectsr enzimas de restrição específicas de sequências» uma vez que α DMA teste é tatalmente degradada par nucleases não específicas. Estas nucleases interferentes podem ser separadas de forma simples par meia de uma distribuição de fases dextrano/polietile-noglicol ESchleif <19Β£?>3. Dependendo das características das nucleases e das endonuclsases de restrição que estão presentes, podem ser encntradas forças iònicas em que as diferentes enzimas preferem diferentes fases. Na casa de HDlcryB as nucleases inespecíficas podem ser removidas em todas as forças iónicas» Em concnetrações de NaCl inferiores a mil ou superiores a 25 Θ mM, pode detectar-se uma nuclease específica de sequências na fase aquosa.

Ulterior purificação e separação das enzimas de restrição presentes na estirpe HDlcryB foi efectuatío como se segue por meio de cromatografia de afinidade numa coluna de heparina CBickle <1977)3. As células foram colhidas a partir de 5 litros de cultura por meio de centrifugação e desintegradas num aparelho

I

de desintegração de células tpor exemplo um French Pressure Cell3 e os detritos celulares separados por centrifugação. Os ácidos nucleicos foram separados por precipitação com polietileneimida (Pirrotta, 198Θ) e as proteínas foram precipitadas com a 7Θ% de saturação e ressuspensas num pequeno volume de tampão. As proteínas foram então aplicadas numa coluna de heparins e eiuidas com um gradiente de NaCl CΦΜ-~ 1M3« Amostras das fracçoes eluidas foram então testadas quanto à presença de enzimas de restrição CBickle (1977)3. 0 substrato usado é ρΗΥ3ΘΘΡί_Κ, um plasmídeo que é se sabe estar sujeito a restrição e que foi isolado a partir de E. coli. Apesar da separação incompleta das nucleases inespecíficas, foi demonstrada uma actividade de restrição especifica de sequências que gera um padrão definido de fragmentos de DMA. A actividade de restrição elui a aproxiroada-mente θ , 6Γ1 - Θ,8Μ, A enzima enriquecida cliva o plasmídeo pH¥3€«3PLK se ele foi previamente isolado a partir de E. coli ou de 6« subtilis. mas não se ele foi isolado a partir de HDlcryB. Assim, Caracte-risticamente, neste caso também o produtor da enzima de restrição está protegido contra a digestão do seu próprio DMA, provavelmente como resultado de uma metilação especifica de sequência.

As características documentadas atrás acima de tudo indicam uma enzima de restrição da classe II. De acordo com a a nomemnclatura aceite ESzybalski et ai» <1988)3, a enzima isoalda a partir de B. thuringiensis HDlcryB recebe a designação BthKi. 0 presente invento está também relacionado com a enzima de restrição BthKi. 2.1.1 Sequência de reconheci menta específica de BthKl A sequfncia de reconhecimento e clivagem específica da encima de restrição isolada a partir de HDlcryB pode ser determinada como se segue. 0 DNA usado como substrato é geralmente cortado em muitas fragmentas mais pequenas, o que leva a assumir-se que ela é uma enzima cuja sequência de reconhecimento consiste em apenas quatro nuclaótidos» Ainda, o DMA tendo um teor média a elevado de SCé frequentemente clivado, DMA tendo um teor baixo de SC é clivado menos frequentemente, o que por outro lado leva à conclusão de que a sequfncia de reconhecimento ê rica em SC, Numa enzima que reconhece uma sequência de quatro, isto indica que a sequência consiste exclusivamente em SC. Usando como substrato DMA dos plasmídeos pC194 CHorinuchi e Weisblum <1982)3 e pBClé CBernhard et al. (1978)3 isolado a partir de B« subtilis e por meio de uma conjparação com enzimas de restrição adquiridas comercialmente, mostrou-se inequivocamente que a enzima de restrição BthKl é um isosquizómero das enzimas adquiridas comer-ciaimente Thal 8SIBC0 BRL, Baithersburg, Maryiand 20877, U5A3, Acc2 CStratagene, La Jalla, CA 92037, USA], BstUl CNew England Biolabs, Beverly, MA 01915-5510, USA3 e ΜνηI EBoehringer Mannheim, D-6800 Mannheim, FRG3, ou seja, ela reconhece e cliva a sequfncia CSCS se esta última não estiver especificamente metila-da. A met.ilase específica M.BhtKl postulada para a enzima de restrição BthKl proporciona protecção não só contra a digestão por BthKl. mas também contra a digestão por Thal ou Acc2. Uma vez que a metilação daquelas duas enzimas é conhecida, pode-se concluir que H,BthKl metila pelo menos o primeiro C e mesmo possivelmente ambos os Cs na sequência CBCB. A enzima de restrição na estirpe Res9 foi analisada do mesmo modo como descrito atrás par-a HDlcryB. O perfil de eluição de uma coluna de afinidade heparina/Sepharose no caso de Res9 é o mesmo de HDlcryB, i.e. BthKl é ainda produzido e portanto não é a causa da barreira de restrição reduzida no caso de Res9. A mutação responsável permanece pois por eKplicar» 2-2 Restrição específica de metilação ft metilação específica de adenina ou citosina é efec-tuada em E« coli í< pela metilase Dam ou Dcm» As estirpes de E. coli B são naturalmente dcm » As estirpes de E. coli B são naturalmente dcm . As enzimas de restrição que reconhecem a mesma sequência da metilase Dam ou Dcm. podem de acordo com o seu tipo, ser inibidas por esta metilação. Estas enzimas de restrição podem portanto ser usadas como diagnóstico para clarificar o estado de metilação de um DNft especifico. Usando este método é posdsível mostrar que B subtilis e £*. thurinoierrsis não apresentam Dam nem Dcm.

As indicações sobre a natureza da mutação na estirpe Res9 podem ser obtidas usando DMA do vector vai-vem pHY30ÔPLK isolado a partir de estirpes tendo um fenótipo Dam/Dcm diferente. A Tabela 5 mostra as frequências de transformação daquele DMA nas estirpes HDlcryB e Res9. 0 fenótipo Dam/Dcm do DNA em cada um dos casos foi cuidadosamente verificado por digestão com as enzimas de restrição sensíveis a metilação correspondentes,

Os resultados da Tabela 5 podem ser resumidos e interpretados como se segue. A metilação Dam do DNA é responsável pela maioria das barreiras de restrição observadas em HDlcryB Res9, por outro

lado, não é influenciada pela fenótipo Dam e aceita igualmente bem DMA metilado par Dam s não metilado» A meti1ação Dcm evidentemente não influencia a capacidade de transformação de B. thurinaiensis HDlcryB» Uma vez que não se dispõe de estirpes isogénicas as diferenças relativamente pequenas mas reprodutíveis entre as estirpes hospedeiras individuais não podem ser expicadas por uni único fenótipo. Permanece no entanto a observação interessante de que DMA de estirpes hospedeiras diferentes tem capacidades de transformação diferentes.

Por meio de meti 1 ação in____vitro com metilase Dam é possível confirmar que a meti1ação Dam é de facto a causa de algumas das barreiras de restrição em HDlcryB (Tab. 6>. A meti-lação in vitro com tris outras meti1ases mostra também que não é uma metilação geral mas especificamente uma metilação Dam que provoca as barreiras de restrição. EXEMPLO 5¾ Maís reduções das barreiras de restrição por meio de metilação específica

Dos dois sistemas de restrição presentes em Bacillus thurinaiensis estirpe HDlcryB, a actividade principal, que se baseia numa restrição especifica de dam, pode ser inactivada por uma mutação no derivado Res9. A actividade residual que permanece, a qual é ainda responsável por uma redução na frequência de transformação do DNft não modificado por um factor de 1Φ-5Φ e baseia-se na enzima de restrição BthKi, pode ser significativamente reduzida por metilação especifica com a metilase M-FnuDII. com_a

3.1 Metilação especifica do vector vai-vem pHY50®FLK metilase M-FnuDII A meti 1ase M—Fnull fornecida pela New England Biolabs CMS 2248, New England Biolabs, 32 Tozer Road, Beverly, MA Θ1915-—5599, USA3 metila especificamsnte a sequência 4CBCB e assim protege-a contra a digestão com FnuDII e seus isosquisómeros, tais como BthKí. 0 DNA do vector vai-vem pHY30©PLK foi isolado a partir de Bacx X1 u.s subti 1 is ou de E, coli e meti lado na seguinte misturas DMA pHY30OPLK 0,3pg

Tris-HCl CpH 7,53 50 mM

EDTA 10 mH

{3-mercaptoetanol 5mM

8-adenosinametion ina ©,©SmM M-FnuDII 2 UN1 1 UN Unidades de metilação. Uma unidade corresponde à quantidade de enzima que é necessária para proteger totalmente um pg de DMA de Lambda Cem uma hora/37°C, em 1© μΐ de volume de reacçãol contra digestão por FnuDII. A metilação é realizada durante um período de uma hora a uma temperatura de 37°CA reacção de metilação é parada por inactivação da metilase. Com esta finalidade a mistura completa é incubada mais uma vez, durante 2© minutos a uma temperatura de 651C. 0 DNA é então precipitado pela adição de etanol e ressus-penso em i© μΐ de tampão TE» Cada uma das misturas é reactivada em triplicado, uma amostra em cada caso sendo usado para transformação subsequente, uma outra para testar o DNA de plasmídeo r e1ati vamen te á ausência de danos. 0 último teste è realisadopor meio de electroforese em gel de agarose» H eficácia da metilação é testada por digestão do DNA de plasmídeo com o isosquisómero de FnuDII Thal. Qs resultados mostram que o DNA é protegido contra a digestão por Thal, ou seja está totalmente metilado, enquanto que as testemunhas não meti-ladas são digeridas pelas encima. 3.2 Combinação de mutação e metilação 0 DNA de plasmídeo ρΗΥ3ΘΦΡί_Κ metilado na Secção 3.1 foi transformado de acordo com o protocolo descrito no Exemplo 1.2.1 no mutante Res9 de B. thurinqiensis deficiente na restrição. Os resultados estão apresentados na Tabela 7. Os resultados mostram que uma combinação da metilação de DNA do plasmídeo por M-FnuDII e a utilização de Res? como estirpe hospedeira permite que sejam tatalmente ultrapassadas as barreiras de restrição encontradas na estirpe HDlcryB de B. thrinaíensis.

MEIOS E TAMPÕES

Meio LB Iq/II triptona 10 extracto de levedura 5 NaCl 5 Agar L lq/ll

Meia LE* solidificado com AGAR 15

Meia Antibiótica N93 (Difca Laboratories) Cg/13 extracto be carne 1,5 extracto de levedura 1,5 peptona 3 glucose 1 NaCl tf ϋ R'.-,HPO, 2 4 3,68 KH.-jFO. 1,32 Meio SC8Y Cg/13 casaíninoácidos i extracto de levedura 0,1 glucose 5 κξηρο4 '14 κηρολ citrato de sódia 1 <nh4)2so4 MgS041.7H.-,0 Λ—Ι 0,2 Meia SYS (Yousten & Roaoíf. 19á9) Cg/1 3 glucose 1 extracto de leveduras **> <nh4)2sq4 K._,HPO ώ 4 6,5 MgSO^.7H_D a r? ? A, CaClo.2H,,0 €>, €18 MnSO a » Η,^Ο ajustar pH a. 7,3 antes de autoclavar. 0,05

Tampão F'BS CmM3 suc rose 40Θ MgCi2 1 tamão de fosfates, ρΗ 6,0 7 Tampão TBST Tween 20* 0,05¾ íp/v) Tris/HCl* <pH 8,0) LíTiH3 10 NaCl 150 Tampão alto CManiatis et al. (1982); página 1043 CmM3 NaCl 100 Tris/HCl* ípH 7,5) 50 MgCl0 10 ditiotreitol 1 Tampão de "Nick—translation" (10x) Cm«3 Tris/HCl* CpH 7,2) 500 MgS0A 100 ditiotreitol í albumina do soro bovina(BSA Pentax Fraction V) pg/ml 500 Tampão TE CmM3 Tris/HCl <pH 8,0) 10 EDTA 1 ST^een 20 1aurato de polietoKissorhitano i ris/HCl α,α,α-trisí hidroííimetil) meti lamina hidrocloreto

DEPÓSITO

Os microorganismos apresentados abaixo, que sSo usados dentro do contexto do presente invento, foram depositados na "Deutsche Sammlung von Mikroorganismen (Berman Collection of Hicroorganisms) “ em Brunswick, Federal Republic of Bermany, um depositário internacional reconhecido, de acordo com os requesi-tos do Tratado de Budapeste sobre o Reconhecimento Internacional do Depósito de Micoorganismos para Processos de Patentes.

1

s 1Microorganismo j Bacillus thurinqiensis jvar. kurstaki HDi

JData de jNúmero dej Data do j Jdepósito Jdepósito J Certificado j I J i Viabilidade I J 4 Março 1986 jDSM 366/ |5 Março ÍV86 j

|Baciilus thurinqiensis jVar„ Kurstaki HDlcryB t------------ 1 |Bacillus thurinqiensis jvar.-, kurstaki HDi cryB 1 Res9 l j 4 Maio 1988 jDSM 4574 J4 Maio 1988 j j 21 Março 1990JDSM5854 j 21 Março 1990j

}Baci1lus thurinqiensis jvar. kurstaki HDi cryS jtransf. com pK6í 1------- 1 JBacillus thurinqiensis jvar» kurstaki HD1cryB jtransf. com pK93 í_____

j 4 Maio 1980 {DSM 4572 |4 Maio 1938 J I Maio 1988 JDSM4571 |4 Maio 1988 1

Uma vez que B. thurinqiensis se pode distinguir de B, csreus usando os critérios selecionados apenas pelos seus cristais parasporais, tanto a estirpe HDcryB (DSM M2 4574) como a estirpe Res9 deficiente na restrição (DSM N2 5854) podem ser classificados como B. cereus. Esta classificação é possível pois a estirpe HDlcryB não tem plasmídeo e portanto um derivada de HDI sem cristais ÍStahly et al., 1978), que automaticamente resulta na sua classificação como Bt csreus» Devido ás diferenças conhecidas entre as trfs estirpes caracterisadas, não se pode esperar identidade taxonómiea. No entanto uma ves que as caracteristicas das trfs estirpes apresentadas na Secção 1.5 não contrariam a sua origem, as estirpes HDlcryB e Res9 continuam a ser descritas como B» thurinqiensis dentro do contento do presente invento.

LITERATURA

Asisbekjan, R. R. et al., Dokl. Akad. Nauk SSSR 274,742-744,1984

Bailey, C. R. and Winstanley, D. J., J, Gen. Microbiol. 132.2945-2947,1986

Bemhard K et al., J. Bacteriol. 133,897-903,1978

Bickle, T. A. et al., Nucl. Acids Res. 4,2561-2572,1977

Bone, E. J. and Ellar, D. J., FEMS Microbiol. Letters 58,171-178,1989

Bron., S. et al., Mol. Gen. Genet. 211,186-189,1988

Engel, P., Appl. Environm. Microbiol. 53,1-3,1987

Haima, P. et al., Mol. Gen. Genet. 209,335-342,1987

Horinuchi and Weisblum, J. Bacteriol. 150, 815-825, 1982

Hoshino, T. et al., Agric. Biol. Chem. 44,621-623,1980

Kessler, C. andHoltke, H.-J., Gene 47,1-153,1986

Kretz, P. L. et al., Nucl. Acids Research 17, 5409,1989

Lereclus, D. et al., FEMS Microbiol. Letters 60,211-218,1989

Macaluso, A., Abstf. Annu. Meet. Am. Soc. Microbiol., 309,1989

MacNeil, D.J., J. Bacteriol. 170,5607-5612,1988

MacNeil, D J., Europ. Patent Appl., Case No. 89201140.4,1989

Matsushima, P. et al., Mol. Gen. Genet. 206.393-400,1987

Miller, J. F. et al., Proc. Nad. Acad. Sei. USA 85,856-860,1988

Orzech, K. et al., J. Gen. Microbiol. 130.203-208,1984

Pirrotta, V. and Bickle, T. A., in: Meth. Enzymol. 65,89-95,1980

Raleigh, E. A. and Wilson, G., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 83* 9070-9074,1986

Schleif, R., in: Meth. Enzymol. 65,19-23,1980

Schurter, W. et al., Molec. Genet. 218, 177-181, 1989

Sladek, T. L. et al., J. Bacteriol. 165,219-225,1986

Stahly DP etal, Biochem. Biophys. Res. Comm., 84» 581-588,1978

Szybalski, W. et al., Gene 74,279-280,1988

Uozumi, T. et al., Mol. Gen. Genet. 152.65-69,1977

Vehmaanperã, J., FEMS, Microbiol. Letters 49,101-105,1988

Wirth R et al, J. Bacteriol. 165, 831-836, 1986

T A.HhLAS

Tabela 1« Barreiras da restrição na transformação de Baeillus thurinqiensis HDicryB com o vector vai-vem ρΗΥ3Θ©ΡΙ_Κ

]Frequências de transfarmação1 pHY3®0PLK isolado a partir des fda estirpe HDicryB s i | tíbsoluta 1 i i ! .......................f relativa B« thurinqiensis HDicryB f 1,2 x 10 j f í 1 Ύ I J 1,8 x 10° | i i 1 E. coli HB1012 _4 1,5 x 10 B. subtilis ISW12143 5 ^ | 7,6 x 10 j 1 1 _________.1_____1_ 6,3 x 10 2 1 para o valor relativo da frequência do plasmideo isolado a partir da estirpe HDicryB é estabelecido 1» 2 1 American Type Cuiture Collection ÍATCC), Rockv.il le, Maryland, USA5 estirpe M9 336943 3 * $1 CToyobo Qo. LTD, Qsaka, 530 Japan, Ordem NS ΡΗΥ-Θ013 5@

Tabela 2. Vectores va.i-vem que foram usados para o enriquecimento do mutantes deficientes em restrição de HDlcryB» i ϊ __1 + I j Vs ctor j Selecção | replição gram I i | 1 (em HD1 crvB) ! .................... 1 1 í _i | i» pfiM40í \ j Cm I ΡΙΡ5Θ1 I i |2- pHY3-00PLK [ Tc j ρΑΜα1 1 i 1 ρΑΜ4Θ1 | Cm j ρΙΡ5Θ1 l \ j4· i pHP13 I Em, Cm ! ρΤΑ1Θ60 i í |

Tabela 3« Comportamento na transformação de potenciais derivado? de B« tHurinq.1 snsis deficientes em restrição j Frequências de transformação® de pHV300pLS< [isolado a partir de?s Ϊ B, thurina. HDlcryB [E. coli BZ234 estirpe [ absoluto J relativo j absoluto I relativo

transformada ! 1 I I HDlcryB i 1 Q nr e a w í a 10 í 1 í-- 1 9,0 X „ , 3 U r_ ..-4 i lõ I ·? , vJ X 1 u Res5 í ς ·«!> y ίθδ [ 10è ] 1 } 1,0 X 5 -o 10 17,7 X 10 * Res7 1 •| ts* a. 3 w Í1 1 I 1,1 X 101-1 17,4 x l©-^ Rsstj j és, 0 ;.í A 10 ‘ ! 1 } 2,0 X Δ * -i 10 ‘ [3,3 x 10 Res9 l 1,1 Λ »7 ! 4 Σ i 7,0 x 105 J é., 4 x 10"^ t para o cálculo do vai or relat: lVu utó T r e q u '8' n c i a do plasmideo isolado a partir da estirpe HDlcrytí estabelece-se 1

Tabele. 4« Caracterização das barreiras de restrição das estirpes HDlcryB s Res9» I; Capacidade de transformação de diferentes plasmídeos recocnbinantes isolados a partir de E. coli ; Frequências de transformação nas i estirpes 1P1asmídeoIiso1ado a partir de|

HDicryB I pHI264S | p.X 1204 1 ! 1 B, t. HD1 cryE-s ! E.C.HB101 j 6 1,3 x 1& <S x 1B1 í | 4 ZZ | 6j4 x 1 10 ib4 1 pX193*1 j pXI93 j B.t, HDlcryB 1 E,c» HB101 j e ό 5 i.í i «·;.< 4 I j Q 5 3 x i * ' í í 104 .....................................\........ s : descrito em EP-A 0 342 6-33 5 tt descrito em Schurter et al. ClvS-9) e EP-A Θ 342 63ò Sí cl referência interna pK que entrou no certificado de depósito publicado pela DSH foi agora, emendado para pXI de acordo com classificação internacional corrente.

Tabela

Carac te ri sacão das HDicryB e Res9« barreiras de restrição d a 11s In f1u?nc ia da est i rpe estirpes hospedeira, especialmente o seu fenótipo Dam/Dcm, na capacidade de transformação do vector vai—vem pHY'300PL.K» 1 jfrequência de transformação ti1 j |reiativa4 em B. thurinqiensis 1 [estirpes | | j

Plasmídeo isolado Jfenótipo j | a partir de j Dam í i Dcm | í i | t HDicryB | I KSS9 B.th. HDicryB I ! ~ f 1 ) - 1 1 •í ! 1 1 t 1 B * th» Res9 } | i } ! - ! 1 ! í 1 1 B. subtilis ISW12Í4 j i f I 1 9,1 x 10 *" j | 8,9 ” 10 J“ E, coli Β21Θ3 í - l+/- i 1,3 x 10 *· | Ô,7 .·; 10 *" E. coli 3225 í i 1 -·· í 0,e X 10 *- j 0,4 κ 10 " E, coli BL21 I + t I ” í 2,4 x 10~4 j 0,7 κ 10 ~ E. coli ΗΒ1Θ1 j 4· { + J 8,2 10~4 J 2,1 x o 10 ^ E, coli W3110 | 4· i + j 1,8 x Í0“4 j 0,9 κ 1Q ^

IcryB ou Res9 transformou com a e foi estabelecido como sendo dos outros isolados são dadas e aplica também às transforma- t pHY3DãF‘Ll< isolado a partir de HD mesma frequência a estirpe HDicryB 1, As frequências de transformação em relação Àquele valor, 0 mesmo s> çSes da estirpe Res9»

Tafasia 6, Metilação in yit.ro específica de sequência do DMA de pHY30€iPLK isolado a partir da estirpe HDicrylB; Influência no comportamento da transformação de HDlcryB e Res'?„ j | Frequências de t r an sformaç ão 1 < | Sequência 1 j , , . + relativas na estirpes 1 1 í Meti 1ase j 1 metilada 1 1 HDicrvB f " ? \ 1 — 1 1 1 i 1 M.Hhal J set· SC i 1 Çt Q ? v q W M.HpalI | ec*GS í ! 054 | 5'"' J & M.PstI j UTBCA&B i Θ,7 ! * ! Θ?7 Dam j BA$TC 1 3,7 x ie~0s i * \ «, 8 + as frequências de transformação na estirpe HDlcryB e Res9 foram estabelecidas como 1« t 5-metilcitosina $ N^-metiladenina 54 Tabela 7, Transformação de Efeito da meti la: B κ t hu r i η o i en s i s HE> i c ryBResv s ão do DMA de ρΗΥ30ΘΡί_Κ pela metil &

M-FnuDII jOrigem do j plasmideo

Tratamento do DNA

Frequência de transfarmação re1ativa j B.t« HDicryB IB.s» ISW1214

testemunha M-FnuDII 1 0 , õéi fj ? Ú2 0,58

|B.s. ISW1214 f r-“ u- U. a col i TBl* i * ---- J E. col i TG1* 1 ! testemunha 1 \ Ll 8 col i TBl* 1 _1 M-FnuDII I l _L 0,0031 0. pela t Componente do Kit de mutagéness in vitro N2 RPN1523 feito Amersham, Buckinghamsh.ire HP7 9NA, Engiand

Claims (3)

1. REIV í ND ϊ CfiCSESs lã. - Mutante caracterizado por ter uma de B. thurinaiensis e/ou deficiência parcial dentro B. csreus, das barrei à estirpe de t r an sfor mado ras de restrição inerentes e por poder, portanto, ser partida não mutagenizada significativamente me1hor do que a referida estirpe de partida não mutagenizada quando se usa o DMA vsctor de um hospedeiro intermediário heterólogo que está naturalmente sujeito a restriç em B. thurinaiensis e/ou B csreus« acordo hospecl· 2ã. - Mutante parcialmente deficiente em restrição de com a reivindicação 1, caracterizado por o referido siro intermediário heterólogo ser um hospedeiro intermediá rio não compatível. acordo com hospedeiro
2. 3. - Mutante parcialmente deficiente a reivindicação 2, caracterizado intermediário não compatível ser E- na restrição de por o referido coli ou Baci11us subtilis. Mutante parcialmente deficiente na restrição de Ή r acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a. referida, estirpe de partida não mutagenizada ser B* thurinaiensis estirpe f~f 131 c rv h 0 acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o referido mutante ter uma capacidade de transformação que é melhor por um factor de > do que a estirpe da partida não mutagenizada. ih§„ - Mutante parcialmente deficiente em restrição de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por ter as seguintes caracteristicas fcaxonómicas que α distinguems Bacillus Largura/pm 13 0-1,2 Compr imen to/ pm 3 5 0-5 5 0 Mobilidade + Esporos elipsóides circulares esporângio inchado ReacçSo de Gram + Cata 1 as-e 4* Crescimento anaerébico 4- Reacçao VP + pH no meio VP 4?7 Tasperatura máxima Crescimento positivo a C‘C 45 Crescimento negativo a °C 50 Crescimento em Meio pH 5,7 ' + NaCl 5% 4· 10% Ácido 3 partir de Cj 1 ucoss L-arabinose κ i I ase manitol Sás a partir de glucose Lecitina.se Hxdrolxse de amido gelatina Cc3.S03.n-S Utilização de citrato propionato Degradação de tirosina NO.-, a partir de NO-, índole fen i1a1an ina—desaminase arginina—di—hidro1ase característica invulgar; sem actividade de lecitinase

   ou um seu mutante ou variante que der tamente daquela estirpe e que ainda redução da restrição que o distinguem iva directamente ou indir tem as características da estirpe de partida. >C"" de

   var dis 7ã. ~ Mutante . Kurstaki cry-B Res9, tintas de DSM5B54 ou deficiente em restrição B. thurinqiensis caracterizado por ter as características um seu mutante ou variante que deriva directa ou. ind irec tamente daquela estirpe e que ainda tem as características distintas de redução- da restrição da estirpe de partida. Sã. - Método para a preparação de um mutante deficiente em restrição de 6. thurinaiensis e/ou. B. carsus , carac ter izado por os mutantes espontâneos tendo uma barreira de restrição reduzida serem enriquecidos por meia de uma série de várias ciclos de transformação e selecçMo? sendo preferencialmente usados na transformação vectores vai—vem que codificam diferentes marcas selectivas e que garantem uma ta;;a suficientemente elevada de transformação e sendo seleccionados os mutantes que para além de terem uma barreira de restrição reduzida, ainda apresentam um elevada qrau de eficiência de transformação.

   9ã. — Método de rizado por as transformaç rem peio menos entre 10“ acordo com a reivindicação 8, oss do inicio do sn r iquec iífjen to g e 10 transformantes. caracte-produzi- rizado 10a. - Método de por a transformação acordo com a reivindicação ser realizada par meia de 8, carac te~ electropo- ração. 1 lã rizado por os - Método de acordo com s. reivindicação vectores efic-szmente caracte* transformáveis que permitem

   uma esc d lha especifica e selectiva dos transf ormarstes positivos serem usados nos diferentes ciclos de transformação/selecção» 12â. - Método de acordo com a reivindicação 8 = caracts-rizado por os referidos vectores compreenderem uma ou mais genes de marcas que conferem à célula hospedeira uma caracteristica que permite ás células transfarmadas com o vector serem reconhecidas e suhsequen temer, te seleccionadas. 13â« - Método de acordo com a reivindicação 12, carácter izado por os referidos qenes das marcas (a) codificarem resistência a antibióticos; (b) codificaremffl uma enzima para a qual existe um substrato cromogénico j ou <c> conferirem uma resistência a metais pesados» Método de acordo com a reivindicação caracte-?1ecçSo de mutantes adequados serem os descendentes sem plasmideos e

   14ã» - Método de rizado por no decorrer da produz idos em primeiro 1 Uj estes serem en tão transf ΟΓ: sofrer res triç ão * sequt-nc usando uma das 15§„ - Método de clonaqem de um qene ou de outra ia de DMA em Bacillus thurinqiensis e/ou Baci11us cereus um mutante deficiente em restrição de acordo com qualquer reivindxcações 1 a /5 caractenzado por ía) o referido gene ou sequência de DMA ser isolado a partir de uma fonte adequada ou ser sintetizados ό€* - ό€* - (fa) α gene ou sequência cicnalroente ligado a funcionar em Bacillus de DMA isolado ou sintetizado ser opera-sinais de eKpressão que são capazes de thuringiensis e/ou Baci11us cereus e que pode ser de origem homóloga ou heteróloga em relação ao gene ou sequência de DMA usada? ι <c> a construção genética quimérica de acordo com a Secção (b) ser transformada usando um vector adequado num mutante deficiente em restrição de Bac11lus thuringiensis e/ou Bacillus cereus de arordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6? e J <d) um produto de gene correspondente ser facultativamente expresso e, caso se pretenda, isolado» 16§. - Método de acordo com a reivindicação 15, carac-terizado por ser incluído um passo adicional pelo qual o DNA vector é incubado in vitro numa mistura de reacção adequada juntamente com uma metilase específica que é capaz de metilar uma ou mais bases dentro da sequência de reconhecimento de uma endonuclease de restrição específica específica do hospedeiro e o DNA vector metilado ser então transformado num mutante deficiente em restrição de B. thuringiensis e/ou S. cereus,
3. 173. - Método de acordo com a reivindicação 15 ou reivindicação lò, caracterizado por o referido DNA vector estar naturalmente sujeito -a restrição em B. thuringiensis e/ou B. cereus. 18â. - Método de acordo com a reivindicação 15 ou reivindicação 16, caracterizado por o referido vector derivar de coli ou de B. subtil is ou ser pelo menos isolado a partir deles 19ã. - Método para o estabelecimento de bancos de genes em B.. t hu r iηgíensis e/ou B. cereus. caracterizado por (a) o DNA fragmento· total de Baci11us thurinaiensis ser desintegrado em mecanicamente ou com a ajuda de enzimas de restrição adequadas5 Cb5 serem isolados fragmentos de tamanho adequado; (c) os referidos fragmentos serem inseridos num yectar adequado; (d) células deficientes em restrição de Bacillus thurinqiensis e/ou Baci. 11 us cereus serem transformadas com o referido vectar; e (e) serem seleccionsdos de entre os transformantes, usando métodos de rastreio adequados, aqueles que compreendem sequências de DNA novas e com interesse» 2®â» - Método como reivindicado na reivindicação 19, caracterizado por um passo adicional ser incluído em que o DNA vector é incubado in vitro numa mistura de reacção adequada juntamente com uma metilase específica que é capaz de metilar uma ou mais bases dentro da sequtncia de reconhecimento de uma endonuc1ease de restrição específica do hospedeiro e o DNA vector metilado foi então usado para transformar um mutante deficiente em restrição de 6. thurinqiensis e/ou B, cereus» 21â. - Método de acordo com a reivindicação 19 ou com a reivindicação 2Θ? caracterizado por o referido Baci1lus thurin-qiensis ser uma estirpe que tem um sistema de restrição-modifica--ção comparável ao de Bac i11us thur inq iensis estirpe HDicryB» 22â. - Método de redução das barreiras de restrição em B„ thuri n g i en s i s e/ou. B „__caraus, caracterizado por ser usado um mutante deficiente em restrição de B» thurinqiensis e/ou B. cereus , especial mente o mutante negativa para restrição B ,· t bu. r i η q i en s i s HDcryB Res9. 23ã» - Método de acordo com a reivindicação 22, caracterizado por um mutante deficiente em restrição de B.__thuringiens e/ou Bu cereus., especialmente o mutante negativo para restrição B, thurinqiensis HDicryB Res9, ser usado em combinação com uma. meti1ase específica que, através da metilação do DNft inserido, protege este último de ser digerido por enzimas de restrição inerentes em B„ thurinqiensis e/ou B. cereus s assim -aumenta a eficácia do método.. Lisboa, 14 de Agosto de 1991

   J. PEREIRA DA CRUZ Agente Oficial da Propriedade Industrial RUA VICTOR CORDON, 10-A 3.8 1200 LISBOA