JPH0556788A - 組換えｄｎａ、組換えベクター、細胞、ｎ−カルバモイルサルコシン−アミドヒドロラーゼ活性を有するタンパク質の取得法、該タンパク質、クレアチニンの測定法 - Google Patents
組換えｄｎａ、組換えベクター、細胞、ｎ−カルバモイルサルコシン−アミドヒドロラーゼ活性を有するタンパク質の取得法、該タンパク質、クレアチニンの測定法Info
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- JPH0556788A JPH0556788A JP3240790A JP24079091A JPH0556788A JP H0556788 A JPH0556788 A JP H0556788A JP 3240790 A JP3240790 A JP 3240790A JP 24079091 A JP24079091 A JP 24079091A JP H0556788 A JPH0556788 A JP H0556788A
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【目的】Ｎ−カルバモイルサルコシン−アミドヒドラー
ゼ（ＣＳＨアーゼ）の良好な富化法の提供。 【構成】（１） 下記のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１ 配列の長さ：７９５塩基対 配列の種類：ヌクレオチド配列（ＣＳＨアーゼ配列） で表わされる配列、（２） 遺伝コードの退行変性範囲
で前記配列に相応する配列、又は（３） 前記の（１）
及び／又は（２）からの配列と、厳密なハイブリッド化
条件下にハイブリッド形成する配列を含有し、かつ（Ｃ
ＳＨアーゼ）活性を有するタンパク質をコードする組換
えＤＮＡ、本組換えＤＮＡを含有する組換えベクター、
（ＣＳＨアーゼ）活性を有する組換えタンパク質の取得
法及びクレアチニン測定へのその使用。
ゼ（ＣＳＨアーゼ）の良好な富化法の提供。 【構成】（１） 下記のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１ 配列の長さ：７９５塩基対 配列の種類：ヌクレオチド配列（ＣＳＨアーゼ配列） で表わされる配列、（２） 遺伝コードの退行変性範囲
で前記配列に相応する配列、又は（３） 前記の（１）
及び／又は（２）からの配列と、厳密なハイブリッド化
条件下にハイブリッド形成する配列を含有し、かつ（Ｃ
ＳＨアーゼ）活性を有するタンパク質をコードする組換
えＤＮＡ、本組換えＤＮＡを含有する組換えベクター、
（ＣＳＨアーゼ）活性を有する組換えタンパク質の取得
法及びクレアチニン測定へのその使用。
Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、組換えＤＮＡ、組換え
ベクター、細胞、Ｎ−カルバモイルサルコシン−アミド
ヒドロラーゼ活性を有するタンパク質の取得法、該タン
パク質、クレアチニンの測定法に関する。
ベクター、細胞、Ｎ−カルバモイルサルコシン−アミド
ヒドロラーゼ活性を有するタンパク質の取得法、該タン
パク質、クレアチニンの測定法に関する。
【０００２】酵素のＮ−カルバモイルサルコシン−アミ
ドヒドロラーゼ（ＣＳＨアーゼ）は液体中のクレアチニ
ン含量を測定するのに必要である。クレアチニンは腎臓
を診断するための基本的パラメータである。全世界で１
年間に約十億回試験が行なわれる。それ故、コスト的に
有利な酵素ＣＳＨアーゼの調製並びに問題のない醗酵の
可能性はクレアチニン測定用診断キットを製造するため
の基本的な前提条件である。
ドヒドロラーゼ（ＣＳＨアーゼ）は液体中のクレアチニ
ン含量を測定するのに必要である。クレアチニンは腎臓
を診断するための基本的パラメータである。全世界で１
年間に約十億回試験が行なわれる。それ故、コスト的に
有利な酵素ＣＳＨアーゼの調製並びに問題のない醗酵の
可能性はクレアチニン測定用診断キットを製造するため
の基本的な前提条件である。
【０００３】
【従来の技術】ＣＳＨアーゼは分子量約３５ｋＤ（サブ
ユニット）、ＫM３×１０-3ｍｏｌ／ｌ及び比活性２Ｕ
／ｍｇを有するタンパク質である。従来ＣＳＨアーゼは
アルトロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）から得
られた（ＥＣ３．５．１．５９）。この方法の欠点は、
アルトロバクターの複雑な栄養素要求及び富化する際に
得られる低い酵素活性１００〜２００Ｕ／ｌである。
ユニット）、ＫM３×１０-3ｍｏｌ／ｌ及び比活性２Ｕ
／ｍｇを有するタンパク質である。従来ＣＳＨアーゼは
アルトロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）から得
られた（ＥＣ３．５．１．５９）。この方法の欠点は、
アルトロバクターの複雑な栄養素要求及び富化する際に
得られる低い酵素活性１００〜２００Ｕ／ｌである。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】それ故、本発明の課題
は、ＣＳＨアーゼの良好な富化法を開示することにより
技術水準の欠点を少なくとも一部解消することであっ
た。
は、ＣＳＨアーゼの良好な富化法を開示することにより
技術水準の欠点を少なくとも一部解消することであっ
た。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明の目的は組換えＤ
ＮＡであり、これは （１） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１ 配列の長さ：７９５塩基対 配列の種類：ヌクレオチド配列（ＣＳＨアーゼ配列）
ＮＡであり、これは （１） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１ 配列の長さ：７９５塩基対 配列の種類：ヌクレオチド配列（ＣＳＨアーゼ配列）
【０００６】
【化２】
【０００７】で表わされる配列、（２） 遺伝コードの
退行変性範囲で前記配列に相応する配列、又は（３）
前記の（１）及び／又は（２）からの配列と、厳密なハ
イブリッド化条件下にハイブリッド形成する配列を含有
し、その際にこのＤＮＡ配列はＮ−カルバモイルサルコ
シン−アミドヒドロラーゼ活性を有するタンパク質をコ
ードする。
退行変性範囲で前記配列に相応する配列、又は（３）
前記の（１）及び／又は（２）からの配列と、厳密なハ
イブリッド化条件下にハイブリッド形成する配列を含有
し、その際にこのＤＮＡ配列はＮ−カルバモイルサルコ
シン−アミドヒドロラーゼ活性を有するタンパク質をコ
ードする。
【０００８】ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１で表わされる本発
明によるＤＮＡはＮ−カルバモイルサルコシン−アミド
ヒドロラーゼ活性を有するタンパク質をコードし、この
タンパク質は次の配列表で表わされるアミノ酸配列を有
する： ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２ 配列の長さ：２６４アミノ酸 配列の種類：アミノ酸配列（ＣＳＨアーゼタンパク質配
列）
明によるＤＮＡはＮ−カルバモイルサルコシン−アミド
ヒドロラーゼ活性を有するタンパク質をコードし、この
タンパク質は次の配列表で表わされるアミノ酸配列を有
する： ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２ 配列の長さ：２６４アミノ酸 配列の種類：アミノ酸配列（ＣＳＨアーゼタンパク質配
列）
【０００９】
【化３】
【００１０】本発明は、遺伝コードの退行変性範囲でＳ
ＥＱ ＩＤ ＮＯ：１で表わされる配列に相応するＤＮ
Ａ配列も包含し、その際にその変化がクローン化に使用
したその都度の宿主生物、特にＥ．コリ（ｃｏｌｉ）中
で改良されたコドンの選択性をもたらすと有利である。
それぞれの宿主生物に好適なコドンの選択性は当業者に
知られている。
ＥＱ ＩＤ ＮＯ：１で表わされる配列に相応するＤＮ
Ａ配列も包含し、その際にその変化がクローン化に使用
したその都度の宿主生物、特にＥ．コリ（ｃｏｌｉ）中
で改良されたコドンの選択性をもたらすと有利である。
それぞれの宿主生物に好適なコドンの選択性は当業者に
知られている。
【００１１】更に、本発明は厳しいハイブリッド化条件
下にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１で表わされる配列及び／又
は遺伝コードの退行変性範囲で前記配列から誘導される
配列とハイブリッド形成するＤＮＡ配列を目的とする。
厳しいハイブリッド化条件下にハイブリッド形成すると
は本発明では、ハイブリッド化シグナルが高い温度、特
に６５℃で及び／又は僅少量の塩を含有する緩衝液中で
洗浄した後でも生じる場合を表わす［Ｍａｎｉａｔｉｓ
及びその他共著、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ，Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ”，Ｃｏ
ｌｄＳｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ在（１９８２年）も参照］。
下にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１で表わされる配列及び／又
は遺伝コードの退行変性範囲で前記配列から誘導される
配列とハイブリッド形成するＤＮＡ配列を目的とする。
厳しいハイブリッド化条件下にハイブリッド形成すると
は本発明では、ハイブリッド化シグナルが高い温度、特
に６５℃で及び／又は僅少量の塩を含有する緩衝液中で
洗浄した後でも生じる場合を表わす［Ｍａｎｉａｔｉｓ
及びその他共著、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ，Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ”，Ｃｏ
ｌｄＳｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ在（１９８２年）も参照］。
【００１２】Ｎ−カルバモイルサルコシン−アミドヒド
ロラーゼ活性を有するタンパク質には、本発明ではＳＥ
Ｑ ＩＤ ＮＯ：２で表わされるアミノ酸配列と共に、
それぞれのアミノ酸の欠失、挿入及び／又は変換により
並びに１個又は数個の他のポリペプチドドメイン（融合
タンパク質で生じる）との結合により得られる前記アミ
ノ酸の変異体及び誘導体も挙げられる。
ロラーゼ活性を有するタンパク質には、本発明ではＳＥ
Ｑ ＩＤ ＮＯ：２で表わされるアミノ酸配列と共に、
それぞれのアミノ酸の欠失、挿入及び／又は変換により
並びに１個又は数個の他のポリペプチドドメイン（融合
タンパク質で生じる）との結合により得られる前記アミ
ノ酸の変異体及び誘導体も挙げられる。
【００１３】本発明による組換えＤＮＡは、アルトロバ
クターＤＮＡフラグメントを宿主生物、殊にＥ．コリ中
にクローニングしかつこの得られたクローンを直接遺伝
子発現に関して選択することにより得られる。有利に
は、ＣＳＨアーゼをコードするクローンの同定は平板活
性試験を介して行なうことができる。そのために、ホス
フェート緩衝処理したアガロース中のサルコシンオキシ
ダーゼ、ペルオキシダーゼ、Ｎ−カルバモイル−サルコ
シン、４−アミノアンチピリン及びトリブロム−３−ヒ
ドロキシ安息香酸を培地に添加する。測定原理は次の通
りである：プラス（ｐｏｓｉｔｉｖ）・クローンから発
現したＣＳＨアーゼは添加したＮ−カルバモイル−サル
コシンをサルコシンに変換し、これはサルコシンオキシ
ダーゼによりグリシン、ホルムアルデヒド及び過酸化水
素に分解される。ペルオキシダーゼが生成した過酸化水
素と共に、添加した染料基質を酸化的結合により暗紫色
の色素に変換する。このようにしてプラス・クローンを
呈色により確認する。
クターＤＮＡフラグメントを宿主生物、殊にＥ．コリ中
にクローニングしかつこの得られたクローンを直接遺伝
子発現に関して選択することにより得られる。有利に
は、ＣＳＨアーゼをコードするクローンの同定は平板活
性試験を介して行なうことができる。そのために、ホス
フェート緩衝処理したアガロース中のサルコシンオキシ
ダーゼ、ペルオキシダーゼ、Ｎ−カルバモイル−サルコ
シン、４−アミノアンチピリン及びトリブロム−３−ヒ
ドロキシ安息香酸を培地に添加する。測定原理は次の通
りである：プラス（ｐｏｓｉｔｉｖ）・クローンから発
現したＣＳＨアーゼは添加したＮ−カルバモイル−サル
コシンをサルコシンに変換し、これはサルコシンオキシ
ダーゼによりグリシン、ホルムアルデヒド及び過酸化水
素に分解される。ペルオキシダーゼが生成した過酸化水
素と共に、添加した染料基質を酸化的結合により暗紫色
の色素に変換する。このようにしてプラス・クローンを
呈色により確認する。
【００１４】従って、本発明の１つの目的は、請求項１
による組換えＤＮＡのコピー少なくとも１個を異種挿入
として含有する組換えベクターでもある。本発明による
ベクターは真核性又は原核性ベクターであってもよくあ
るいは真核生物及びまた原核生物中で発現可能なベクタ
ーであってもよい。原核性のベクターが有利である。更
に、本発明によるベクターは、宿主細胞中で染色体外に
存在するか又は宿主細胞染色体中に統合されていてよ
い。宿主細胞のゲノム中に統合されるベクターは例えば
Ｅ．コリ細胞中のバクテリオファージλベクターであ
る。染色体外に存在するベクターの例はプラスミドであ
る。本発明によるベクターがプラスミドであると有利で
ある。
による組換えＤＮＡのコピー少なくとも１個を異種挿入
として含有する組換えベクターでもある。本発明による
ベクターは真核性又は原核性ベクターであってもよくあ
るいは真核生物及びまた原核生物中で発現可能なベクタ
ーであってもよい。原核性のベクターが有利である。更
に、本発明によるベクターは、宿主細胞中で染色体外に
存在するか又は宿主細胞染色体中に統合されていてよ
い。宿主細胞のゲノム中に統合されるベクターは例えば
Ｅ．コリ細胞中のバクテリオファージλベクターであ
る。染色体外に存在するベクターの例はプラスミドであ
る。本発明によるベクターがプラスミドであると有利で
ある。
【００１５】Ｅ．コリ中にクローニングした長さ５ｋｂ
のアルトロバクターＤＮＡフラグメントによるＣＳＨア
ーゼの発現が著しく不安定であることが明らかになっ
た。２４時間後にはもはや元のプラス・クローン中でＣ
ＳＨアーゼの発現を検出することができなかった。しか
しながらアルトロバクターＤＮＡフラグメントを１．３
ｋｂの長さに短縮した後ではその不安定性を解消できる
ことが明らかに驚異的であった。それ故、本発明による
組換えベクター中の異種挿入体の長さは１．３ｋｂより
も長くはない。
のアルトロバクターＤＮＡフラグメントによるＣＳＨア
ーゼの発現が著しく不安定であることが明らかになっ
た。２４時間後にはもはや元のプラス・クローン中でＣ
ＳＨアーゼの発現を検出することができなかった。しか
しながらアルトロバクターＤＮＡフラグメントを１．３
ｋｂの長さに短縮した後ではその不安定性を解消できる
ことが明らかに驚異的であった。それ故、本発明による
組換えベクター中の異種挿入体の長さは１．３ｋｂより
も長くはない。
【００１６】本発明によるベクター上に異種挿入体は、
有利に本発明によるベクターで形質転換された宿主生物
中でＣＳＨアーゼ発現を可能にするように発現シグナル
の制御下に存在する。この発現シグナルはその都度使用
する宿主生物に好適でなければならない。特に優れた
Ｅ．コリ中での発現には一方で誘導性発現シグナルが好
適である。例えば公知の誘導性Ｅ．コリプロモータのｌ
ａｃ，ｔａｃ又はｔｒｐあるいは殊にＥ．コリベクター
に対して異種である発現シグナルであるサルモネラ−プ
ロモータｍｇｌ（ＷＯ ８８／０９３７３）を使用する
ことができる。
有利に本発明によるベクターで形質転換された宿主生物
中でＣＳＨアーゼ発現を可能にするように発現シグナル
の制御下に存在する。この発現シグナルはその都度使用
する宿主生物に好適でなければならない。特に優れた
Ｅ．コリ中での発現には一方で誘導性発現シグナルが好
適である。例えば公知の誘導性Ｅ．コリプロモータのｌ
ａｃ，ｔａｃ又はｔｒｐあるいは殊にＥ．コリベクター
に対して異種である発現シグナルであるサルモネラ−プ
ロモータｍｇｌ（ＷＯ ８８／０９３７３）を使用する
ことができる。
【００１７】他方では、挿入体に対して同種である発現
シグナル、即ちアルトロバクターに由来する発現シグナ
ルも好適であることが明らかになり驚異的であった。Ｎ
−カルバモイルサルコシン−アミドヒドロラーゼ遺伝子
の真正プロモータ又はそれから誘導した配列を使用する
と特に優れており、これはＥ．コリ中で非常に高い活性
を示し驚異的である。
シグナル、即ちアルトロバクターに由来する発現シグナ
ルも好適であることが明らかになり驚異的であった。Ｎ
−カルバモイルサルコシン−アミドヒドロラーゼ遺伝子
の真正プロモータ又はそれから誘導した配列を使用する
と特に優れており、これはＥ．コリ中で非常に高い活性
を示し驚異的である。
【００１８】このプロモータ領域は３７３塩基対のＤＮ
Ａフラグメント上に含まれていて、次の配列表で表わさ
れる： ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３ 配列の長さ：３７３塩基対 配列の種類：ヌクレオチド配列（ＣＳＨアーゼ：５′非
翻訳領域：−３７３〜−１）
Ａフラグメント上に含まれていて、次の配列表で表わさ
れる： ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３ 配列の長さ：３７３塩基対 配列の種類：ヌクレオチド配列（ＣＳＨアーゼ：５′非
翻訳領域：−３７３〜−１）
【００１９】
【化４】
【００２０】この３７３ｂｐのフラグメントばかりでな
く、短いフラグメント又はそのフラグメントから誘導し
たフラグメントもプロモータ特性を有することが確認さ
れた。
く、短いフラグメント又はそのフラグメントから誘導し
たフラグメントもプロモータ特性を有することが確認さ
れた。
【００２１】更に、本発明の目的は、本発明によるＤＮ
Ａ又は本発明によるベクターで形質転換されている細胞
である。殊にこの細胞は細菌細胞であり、Ｅ．コリ細胞
が特に優れている。
Ａ又は本発明によるベクターで形質転換されている細胞
である。殊にこの細胞は細菌細胞であり、Ｅ．コリ細胞
が特に優れている。
【００２２】更に、本発明の目的は、（１）宿主細胞を
本発明によるＤＮＡ又はベクターにより形質転換して、
Ｎ−カルバモイルサルコシン−アミドヒドロラーゼ遺伝
子のコピー少なくとも１つを含有する形質転換宿主細胞
を形成し、（２）形質転換宿主細胞を好適な培地中で培
養し、（３） 形質転換宿主細胞中のＮ−カルバモイル
サルコシン−アミドヒドロラーゼ遺伝子を発現させ、か
つ（４） 発現生成物を培地又は宿主細胞から取得す
る、Ｎ−カルバモイルサルコシン−アミドヒドロラーゼ
活性を有するタンパク質の取得法である。
本発明によるＤＮＡ又はベクターにより形質転換して、
Ｎ−カルバモイルサルコシン−アミドヒドロラーゼ遺伝
子のコピー少なくとも１つを含有する形質転換宿主細胞
を形成し、（２）形質転換宿主細胞を好適な培地中で培
養し、（３） 形質転換宿主細胞中のＮ−カルバモイル
サルコシン−アミドヒドロラーゼ遺伝子を発現させ、か
つ（４） 発現生成物を培地又は宿主細胞から取得す
る、Ｎ−カルバモイルサルコシン−アミドヒドロラーゼ
活性を有するタンパク質の取得法である。
【００２３】宿主細胞の形質転換及び形質転換宿主細胞
の培養は分子生物学の分野で当業者に公知の方法により
行なうことができる。形質転換宿主細胞中でのＮ−カル
バモイルサルコシン−アミドヒドロラーゼ遺伝子の発現
は、誘導性発現シグナルを適用する場合は誘導工程によ
りあるいは構成的に行なう。培地又は宿主細胞からの発
現生成物の富化は、ヨーロッパ特許公開第０１１２５７
１号明細書の例２ｂに記載されているように、ＤＥＡＥ
−セファデックス及びフェニル−セファロース−クロマ
トグラフィを介して細胞を砕解し、引続いて硫酸アンモ
ニウムで沈降させることにより行なうと有利である。
の培養は分子生物学の分野で当業者に公知の方法により
行なうことができる。形質転換宿主細胞中でのＮ−カル
バモイルサルコシン−アミドヒドロラーゼ遺伝子の発現
は、誘導性発現シグナルを適用する場合は誘導工程によ
りあるいは構成的に行なう。培地又は宿主細胞からの発
現生成物の富化は、ヨーロッパ特許公開第０１１２５７
１号明細書の例２ｂに記載されているように、ＤＥＡＥ
−セファデックス及びフェニル−セファロース−クロマ
トグラフィを介して細胞を砕解し、引続いて硫酸アンモ
ニウムで沈降させることにより行なうと有利である。
【００２４】本発明方法で宿主細胞としてＥ．コリ細菌
を使うと有利である。更に、Ｎ−カルバモイルサルコシ
ン−アミドヒドロラーゼ遺伝子を含有する異種挿入体の
長さが１．３ｋｂ以下であるベクターの使用は優れてい
る。Ｎ−カルバモイルサルコシン−アミドヒドロラーゼ
遺伝子の発現が真正プロモータ又はその誘導配列の制御
下に行なわれるベクターの使用は特に優れている。その
ようなベクターの例はｐＢＭ６２である（図３）。
を使うと有利である。更に、Ｎ−カルバモイルサルコシ
ン−アミドヒドロラーゼ遺伝子を含有する異種挿入体の
長さが１．３ｋｂ以下であるベクターの使用は優れてい
る。Ｎ−カルバモイルサルコシン−アミドヒドロラーゼ
遺伝子の発現が真正プロモータ又はその誘導配列の制御
下に行なわれるベクターの使用は特に優れている。その
ようなベクターの例はｐＢＭ６２である（図３）。
【００２５】更に本発明の目的は、本発明方法により得
られる、Ｎ−カルバモイルサルコシン−アミドヒドロラ
ーゼ活性を有するタンパク質である。このようなタンパ
ク質がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に記載のアミノ酸配列を
有すると有利である。このタンパク質の誘導体及び変異
体も本発明方法により得られる。
られる、Ｎ−カルバモイルサルコシン−アミドヒドロラ
ーゼ活性を有するタンパク質である。このようなタンパ
ク質がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に記載のアミノ酸配列を
有すると有利である。このタンパク質の誘導体及び変異
体も本発明方法により得られる。
【００２６】更に、本発明は本発明によるタンパク質を
クレアチニンの測定に使用することでありかつＮ−カル
バモイルサルコシン−アミドヒドロラーゼ活性を有する
本発明によるタンパク質を含有するクレアチニン測定試
薬に関する。
クレアチニンの測定に使用することでありかつＮ−カル
バモイルサルコシン−アミドヒドロラーゼ活性を有する
本発明によるタンパク質を含有するクレアチニン測定試
薬に関する。
【００２７】
【実施例】次に本発明を配列表及び図１〜図３に関連し
て実施例により詳説する。
て実施例により詳説する。
【００２８】 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１ ＣＳＨアーゼ遺伝子のＤＮＡ配列 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２ ＣＳＨアーゼのアミノ酸配列 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３ ＣＳＨアーゼ遺伝子のプロモータとして有効な ＤＮＡフラグメント 図１は安定なプラスミドｐＣＳＨアーゼＩＩＩを欠失に
よりｐＣＳＨアーゼＩから生成する構成を示す図であ
る。
よりｐＣＳＨアーゼＩから生成する構成を示す図であ
る。
【００２９】図２は発現ベクターｐＢＭ６１の構成を示
す図である。
す図である。
【００３０】図３は発現ベクターｐＢＭ６２の構成を示
す図である。
す図である。
【００３１】明細書及び実施例に挙げられている微生物
及びプラスミド： アルトロバクター・スペック ＤＳＭ２５６３ （Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｅｃ．） Ｅ．コリＥＤ８６５４ ＤＳＭ２１０２ ｐＢＴ ２ａ−１ ＤＳＭ３１４８ｐ はドイツ微生物保存機関（Ｄｅｕｔｓｃｈ Ｓａｍｍｌ
ｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕ
ｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ：ＤＳＭ；
Ｍａｓｃｈｅｒｏｄｅｒ Ｗｅｇ １Ｂ，Ｄ−３３００
Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ在）に寄託した。
及びプラスミド： アルトロバクター・スペック ＤＳＭ２５６３ （Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｅｃ．） Ｅ．コリＥＤ８６５４ ＤＳＭ２１０２ ｐＢＴ ２ａ−１ ＤＳＭ３１４８ｐ はドイツ微生物保存機関（Ｄｅｕｔｓｃｈ Ｓａｍｍｌ
ｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕ
ｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ：ＤＳＭ；
Ｍａｓｃｈｅｒｏｄｅｒ Ｗｅｇ １Ｂ，Ｄ−３３００
Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ在）に寄託した。
【００３２】例１ プラス・クローンの同定 アルトロバクター・スペックＤＳＭ２５６３からＤＮＡ
を常法により単離した［Ｊ．Ｍａｒｍｕｒ，Ｊ．Ｍｏ
ｌ．Ｂｉｏｌ．，３（１９６１）２０８〜２１８；Ｓ．
Ｖｉｓｕｒａｎａｔｈａｎ及びその他，Ｊ．Ｍｉｃｒｏ
ｂｉｏｌ．Ｍｅｔｈ．，１０（１９８９）５９〜６
４］。このようにして単離したＤＮＡを制限酵素Ｅｃｏ
ＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで完全に切断した。市販のベク
ターｐＵＣ１８（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅ
ｉｍ ＧｍｂＨ社）も同様にＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩ
Ｉで切断しかつアルトロバクターからのＤＮＡと連結し
た。生成した組換えプラスミドでコンピテントなＥ．コ
リ ＥＤ８６５４細胞（ＤＳＭ２１０２）を形質転換し
た［Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｍａｎｉａｔ
ｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，第２版
１．７４頁以下］。アンピシリンに対する選択性により
選択平板１個当り約２００個のコロニーが得られた。Ｃ
ＳＨアーゼをコードするクローンの同定はヨーロッパ特
許公開第０１５４２６９号明細書に記載されている呈色
試験により行なった。その際にホスフェート緩衝液ｐＨ
７．８中のサルコシンオキシダーゼ、ペルオキシダー
ゼ、カルバモイルサルコシン、４−アミノアンチピリン
及びトリブロム−３−ヒドロキシ安息香酸を添加した。
を常法により単離した［Ｊ．Ｍａｒｍｕｒ，Ｊ．Ｍｏ
ｌ．Ｂｉｏｌ．，３（１９６１）２０８〜２１８；Ｓ．
Ｖｉｓｕｒａｎａｔｈａｎ及びその他，Ｊ．Ｍｉｃｒｏ
ｂｉｏｌ．Ｍｅｔｈ．，１０（１９８９）５９〜６
４］。このようにして単離したＤＮＡを制限酵素Ｅｃｏ
ＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで完全に切断した。市販のベク
ターｐＵＣ１８（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅ
ｉｍ ＧｍｂＨ社）も同様にＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩ
Ｉで切断しかつアルトロバクターからのＤＮＡと連結し
た。生成した組換えプラスミドでコンピテントなＥ．コ
リ ＥＤ８６５４細胞（ＤＳＭ２１０２）を形質転換し
た［Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｍａｎｉａｔ
ｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，第２版
１．７４頁以下］。アンピシリンに対する選択性により
選択平板１個当り約２００個のコロニーが得られた。Ｃ
ＳＨアーゼをコードするクローンの同定はヨーロッパ特
許公開第０１５４２６９号明細書に記載されている呈色
試験により行なった。その際にホスフェート緩衝液ｐＨ
７．８中のサルコシンオキシダーゼ、ペルオキシダー
ゼ、カルバモイルサルコシン、４−アミノアンチピリン
及びトリブロム−３−ヒドロキシ安息香酸を添加した。
【００３３】この呈色試験ではＣＳＨアーゼが添加した
カルバモイルサルコシンをサルコシンに変換させ、この
サルコシンがサルコシンオキシダーゼによりグリシン、
ホルムアルデヒド及び過酸化水素に分解される。ペルオ
キシダーゼは生成した過酸化水素と共に、添加されてい
る染料基質を暗紫色の色素に変換する。５４６ｎｍで明
光度の上昇を測定する。平板活性試験において１０００
個のコロニー当り２個のプラス・クローンが同定され
た。
カルバモイルサルコシンをサルコシンに変換させ、この
サルコシンがサルコシンオキシダーゼによりグリシン、
ホルムアルデヒド及び過酸化水素に分解される。ペルオ
キシダーゼは生成した過酸化水素と共に、添加されてい
る染料基質を暗紫色の色素に変換する。５４６ｎｍで明
光度の上昇を測定する。平板活性試験において１０００
個のコロニー当り２個のプラス・クローンが同定され
た。
【００３４】例２ ＣＳＨアーゼをコードするＤＮＡの単離 プラス・クローンからのＤＮＡを、コロニーを寒天板上
に塗布しかつこの寒天板のクローンを再懸濁した後で単
離した。再形質転換では、短期にＥ．コリ中で発現が行
なわれるが、このプラスミドが極めて高い不安定性を有
することが明らかになった。平板活性試験で検出可能な
酵素活性は急速に失なわれた。しかしこの平板溶菌液か
ら、ＣＳＨアーゼ遺伝子を含有する５ｋｂのＥｃｏＲＩ
／ＨｉｎｄＩＩＩ−ＤＮＡフラグメントを単離すること
ができた。このＤＮＡフラグメントを制限酵素ＫｐｎＩ
及びＢａｍＨＩで切断することにより２．５ｋｂに短縮
し、更にＥｃｏＲＩ／ＳａｌＩで１．３ｋｂに短縮する
ことにより安定なクローンが得られた。
に塗布しかつこの寒天板のクローンを再懸濁した後で単
離した。再形質転換では、短期にＥ．コリ中で発現が行
なわれるが、このプラスミドが極めて高い不安定性を有
することが明らかになった。平板活性試験で検出可能な
酵素活性は急速に失なわれた。しかしこの平板溶菌液か
ら、ＣＳＨアーゼ遺伝子を含有する５ｋｂのＥｃｏＲＩ
／ＨｉｎｄＩＩＩ−ＤＮＡフラグメントを単離すること
ができた。このＤＮＡフラグメントを制限酵素ＫｐｎＩ
及びＢａｍＨＩで切断することにより２．５ｋｂに短縮
し、更にＥｃｏＲＩ／ＳａｌＩで１．３ｋｂに短縮する
ことにより安定なクローンが得られた。
【００３５】図１は、５ｋｂのアルトロバクターＤＮＡ
フラグメントをｐＵＣ１８中でクローニングすることに
より得られた組換えプラスミドｐＣＳＨアーゼＩ及びそ
れから欠失により生じる安定なプラスミドｐＣＳＨアー
ゼＩＩＩを示す。
フラグメントをｐＵＣ１８中でクローニングすることに
より得られた組換えプラスミドｐＣＳＨアーゼＩ及びそ
れから欠失により生じる安定なプラスミドｐＣＳＨアー
ゼＩＩＩを示す。
【００３６】例３ 発現ベクターｐＢＭＰ６１の構成 ＣＳＨアーゼをコードするＤＮＡをベクターｐＢＴ２ａ
−１（ＤＳＭ３１４８Ｐ）中でクローニングした。その
ために初めにｐＢＴ２ａ−１からクレアチナーゼ遺伝子
をＡｖａＩで切断することにより欠失した。生成ＤＮＡ
フラグメントの末端をクレノウ酵素及び４個のヌクレオ
チドトリホスフェートで平滑にした。ｐＣＳＨアーゼＩ
からＣＳＨアーゼ遺伝子を制限酵素ＳａｌＩ及びＫｐｎ
Ｉで切断して取り出し、クレノウ酵素及び４個のヌクレ
オチドトリホスフェートで平滑にしかつｐＢＴ２ａ−１
の２．６ｋｂのＡｖａＩフラグメントと連結して組換え
プラスミドｐＢＭ６１を生成した（図２参照）。
−１（ＤＳＭ３１４８Ｐ）中でクローニングした。その
ために初めにｐＢＴ２ａ−１からクレアチナーゼ遺伝子
をＡｖａＩで切断することにより欠失した。生成ＤＮＡ
フラグメントの末端をクレノウ酵素及び４個のヌクレオ
チドトリホスフェートで平滑にした。ｐＣＳＨアーゼＩ
からＣＳＨアーゼ遺伝子を制限酵素ＳａｌＩ及びＫｐｎ
Ｉで切断して取り出し、クレノウ酵素及び４個のヌクレ
オチドトリホスフェートで平滑にしかつｐＢＴ２ａ−１
の２．６ｋｂのＡｖａＩフラグメントと連結して組換え
プラスミドｐＢＭ６１を生成した（図２参照）。
【００３７】例４ 発現ベクターｐＢＭ６２の構成 プラスミドｐＢＭ６１はプラスミドｐＢＴ２ａ−１から
のプロモータｌａｃＵＶ５をなおも含有する。このプロ
モータは発現には必要ではない。それ故ｐＢＴ２ａ−１
をＡａｔＩＩ及びＡｖａＩで切断しかつ生成した２．４
ｋｂのＡｖａＩ／ＡａｔＩＩ−フラグメントをクレノウ
酵素及び４個のヌクレオチドトリホスフェートで平滑に
した。生成した２．４ｋｂの大きさの平滑末端のフラグ
メントを同じように平滑にした１．２ｋｂの大きさのｐ
ＣＳＨアーゼＩからのＳａｌＩ／ＫｐｎＩ−フラグメン
トと連結してプラスミドｐＢＭ６２を生成した（図
３）。ＣＳＨアーゼをコードするこのプラスミドはＣＳ
Ｈアーゼ遺伝子の５′−非翻訳領域に約３７３ｂｐのア
ルトロバクター配列を含有し、これは配列表ＳＥＱ Ｉ
ＤＮＯ：３に記載されている。
のプロモータｌａｃＵＶ５をなおも含有する。このプロ
モータは発現には必要ではない。それ故ｐＢＴ２ａ−１
をＡａｔＩＩ及びＡｖａＩで切断しかつ生成した２．４
ｋｂのＡｖａＩ／ＡａｔＩＩ−フラグメントをクレノウ
酵素及び４個のヌクレオチドトリホスフェートで平滑に
した。生成した２．４ｋｂの大きさの平滑末端のフラグ
メントを同じように平滑にした１．２ｋｂの大きさのｐ
ＣＳＨアーゼＩからのＳａｌＩ／ＫｐｎＩ−フラグメン
トと連結してプラスミドｐＢＭ６２を生成した（図
３）。ＣＳＨアーゼをコードするこのプラスミドはＣＳ
Ｈアーゼ遺伝子の５′−非翻訳領域に約３７３ｂｐのア
ルトロバクター配列を含有し、これは配列表ＳＥＱ Ｉ
ＤＮＯ：３に記載されている。
【００３８】例５ Ｅ．コリ中でＣＳＨアーゼの発現 ＣＳＨアーゼをコードするプラスミドｐＢＭＰ６１又は
ｐＢＭＰ６２をＥ．コリＥＤ８６５４（ＤＳＭ２１０
２）中で形質転換し［Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃ
ｈ，Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎ
ｉｎｇ，第２版，１．７４以下］かつアンピシリンに関
して選択した。クローンをＬＢ５ｍｌ中で一晩培養した
後で細胞を収獲しかつ超音波で砕解し、引き続いて活性
試験を実施した。測定原理は例１の平板活性試験と同一
である。波長５４６ｎｍで吸光度上昇を測定する。活性
試験はヨーロッパ特許公開第０１５４２６９号明細書に
記載されている。単位（Ｕ）は、サルコシンオキシダー
ゼ及びペルオキシダーゼによる関連する試験の測定条件
下に２５℃で測定したサルコシン形成μｍｏｌ／分とし
て規定されている。
ｐＢＭＰ６２をＥ．コリＥＤ８６５４（ＤＳＭ２１０
２）中で形質転換し［Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃ
ｈ，Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎ
ｉｎｇ，第２版，１．７４以下］かつアンピシリンに関
して選択した。クローンをＬＢ５ｍｌ中で一晩培養した
後で細胞を収獲しかつ超音波で砕解し、引き続いて活性
試験を実施した。測定原理は例１の平板活性試験と同一
である。波長５４６ｎｍで吸光度上昇を測定する。活性
試験はヨーロッパ特許公開第０１５４２６９号明細書に
記載されている。単位（Ｕ）は、サルコシンオキシダー
ゼ及びペルオキシダーゼによる関連する試験の測定条件
下に２５℃で測定したサルコシン形成μｍｏｌ／分とし
て規定されている。
【００３９】組換え酵素で活性１５０Ｕ／ｌ×ＯＤが得
られる。これは出発培養物（アルトロバクター・スペッ
ク ＤＳＭ２５６３）に比べて係数約５０の上昇に相当
する。
られる。これは出発培養物（アルトロバクター・スペッ
ク ＤＳＭ２５６３）に比べて係数約５０の上昇に相当
する。
【００４０】 菌 株 活性（Ｕ／ｌ×ＯＤ） アルトロバクター・スペックＤＳＭ２５６３ ３ Ｅ．コリ ０ Ｅ．コリ／ｐＢＭＰ６１ １５０ Ｅ．コリ／ｐＢＭＰ６２ １５０ 例６ ＣＳＨアーゼ遺伝子の配列決定 ＣＳＨアーゼ遺伝子を含有するｐＣＳＨアーゼＩＩＩか
らの１．３ｋｂの大きさのアルトロバクターＤＮＡフラ
グメントをＤＮＡフラグメント配列の決定のために使用
した。該ＤＮＡをＭ１３中でサブクローン化しかつ標準
法（ザンガーによるジデオキシ法）により配列決定し
た。転写解読枠が得られ、そのＤＮＡ配列はＳＥＱ Ｉ
Ｄ ＮＯ：１に記載されている。これはＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：２に配列が記載されている２６４個のアミノ酸を
有するタンパク質をコードする。
らの１．３ｋｂの大きさのアルトロバクターＤＮＡフラ
グメントをＤＮＡフラグメント配列の決定のために使用
した。該ＤＮＡをＭ１３中でサブクローン化しかつ標準
法（ザンガーによるジデオキシ法）により配列決定し
た。転写解読枠が得られ、そのＤＮＡ配列はＳＥＱ Ｉ
Ｄ ＮＯ：１に記載されている。これはＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：２に配列が記載されている２６４個のアミノ酸を
有するタンパク質をコードする。
【図１】図１は安定なプラスミドｐＣＳＨアーゼＩＩＩ
を欠失によりｐＣＳＨアーゼＩから生成する構成を示す
図である。
を欠失によりｐＣＳＨアーゼＩから生成する構成を示す
図である。
【図２】図２は発現ベクターｐＢＭ６１の構成を示す図
である。
である。
【図３】図３は発現ベクターｐＢＭ６２の構成を示す図
である。
である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｑ 1/44 6807−4Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/80 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 ギユンター シユーマツハー ドイツ連邦共和国 ベルンリート カペレ ンシユトラーセ 20
Claims (6)
- 【請求項１】（１） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１ 配列の長さ：７９５塩基対 配列の種類：ヌクレオチド配列（ＣＳＨアーゼ配列） 【化１】 で表わされる配列、 （２） 遺伝コードの退行変性範囲で前記配列に相応す
る配列、又は （３） 前記の（１）及び／又は（２）からの配列と、
厳密なハイブリッド化条件下にハイブリッド形成する配
列を含有し、かつＮ−カルバモイルサルコシン−アミド
ヒドロラーゼ活性を有するタンパク質をコードすること
を特徴とする組換えＤＮＡ。 - 【請求項２】 請求項１による組換えＤＮＡのコピー少
なくとも１個を異種挿入体として含有することを特徴と
する組換えベクター。 - 【請求項３】 請求項１によるＤＮＡ又は請求項２によ
るベクターで形質転換されていることを特徴とする細
胞。 - 【請求項４】 （１） 宿主細胞を請求項１によるＤＮ
Ａ又は請求項２によるベクターにより形質転換して、Ｎ
−カルバモイルサルコシン−アミドヒドロラーゼ遺伝子
を含有する形質転換宿主細胞を形成し、 （２） 形質転換宿主細胞を好適な培地中で培養し、 （３） 形質転換宿主細胞中のＮ−カルバモイルサルコ
シン−アミドヒドロラーゼ遺伝子を発現させ、かつ （４） 発現生成物を培地又は宿主細胞から取得する ことを特徴とするＮ−カルバモイルサルコシン−アミド
ヒドロラーゼ活性を有するタンパク質の取得法。 - 【請求項５】 請求項４の方法により得られたＮ−カル
バモイルサルコシン−アミドヒドロラーゼ活性を有する
タンパク質。 - 【請求項６】 請求項５によるタンパク質を使用するこ
とを特徴とするクレアチニンの測定法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE4029844A DE4029844A1 (de) | 1990-09-20 | 1990-09-20 | Carbamoylsarcosinhydrolase, kloniert |
| DE4029844.2 | 1990-09-20 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0556788A true JPH0556788A (ja) | 1993-03-09 |
| JP2627587B2 JP2627587B2 (ja) | 1997-07-09 |
Family
ID=6414642
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3240790A Expired - Fee Related JP2627587B2 (ja) | 1990-09-20 | 1991-09-20 | 組換えｄｎａ、組換えベクター、細胞及びｎ−カルバモイルサルコシン−アミドヒドロラーゼ活性を有するタンパク質の取得法 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5416014A (ja) |
| EP (1) | EP0476670B1 (ja) |
| JP (1) | JP2627587B2 (ja) |
| AT (1) | ATE180015T1 (ja) |
| DE (2) | DE4029844A1 (ja) |
| ES (1) | ES2133275T3 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB0602173D0 (en) | 2006-02-03 | 2006-03-15 | Avecia Ltd | Expression system |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS59132891A (ja) * | 1982-12-27 | 1984-07-31 | ベ−リンガ−・マンハイム・ゲゼルシヤフト・ミツト・ベシユレンクテル・ハフツング | Ｎ−カルバモイルサルコシンの測定法及び測定試薬 |
| JPS60203190A (ja) * | 1984-02-24 | 1985-10-14 | ベーリンガー・マンハイム・ゲゼルシヤフト・ミツト・ベシユレンクテル・ハフツング | １‐メチルヒダントイナーゼ、その製出法およびクレアチニンの測定法および測定試薬 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IL61982A (en) * | 1980-02-15 | 1984-01-31 | Cpc International Inc | Genetically engineered microorganisms for massive production of amyloytic enzymes and process for preparing same using the corresponding recombinant dnas containing amylase coding genes |
| US4464473A (en) * | 1982-04-23 | 1984-08-07 | The Regents Of The University Of California | Ice nucleating microorganisms |
| US4472502A (en) * | 1982-08-16 | 1984-09-18 | The Regents Of The University Of California | Malolactic gene |
| DE4000668A1 (de) * | 1990-01-11 | 1991-07-18 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren und reagenz zur enzymatischen bestimmung von creatinin |
-
1990
- 1990-09-20 DE DE4029844A patent/DE4029844A1/de not_active Withdrawn
-
1991
- 1991-09-19 EP EP91115974A patent/EP0476670B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1991-09-19 DE DE59109126T patent/DE59109126D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1991-09-19 ES ES91115974T patent/ES2133275T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1991-09-19 AT AT91115974T patent/ATE180015T1/de not_active IP Right Cessation
- 1991-09-20 JP JP3240790A patent/JP2627587B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1993
- 1993-08-17 US US08/107,042 patent/US5416014A/en not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS59132891A (ja) * | 1982-12-27 | 1984-07-31 | ベ−リンガ−・マンハイム・ゲゼルシヤフト・ミツト・ベシユレンクテル・ハフツング | Ｎ−カルバモイルサルコシンの測定法及び測定試薬 |
| JPS60203190A (ja) * | 1984-02-24 | 1985-10-14 | ベーリンガー・マンハイム・ゲゼルシヤフト・ミツト・ベシユレンクテル・ハフツング | １‐メチルヒダントイナーゼ、その製出法およびクレアチニンの測定法および測定試薬 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0476670A2 (de) | 1992-03-25 |
| ATE180015T1 (de) | 1999-05-15 |
| US5416014A (en) | 1995-05-16 |
| ES2133275T3 (es) | 1999-09-16 |
| EP0476670B1 (de) | 1999-05-12 |
| EP0476670A3 (en) | 1992-10-07 |
| JP2627587B2 (ja) | 1997-07-09 |
| DE59109126D1 (de) | 1999-06-17 |
| DE4029844A1 (de) | 1992-03-26 |
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|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |