JPH05506457A - 非哺乳類の有核細胞と血液物質の混合物の凍結乾燥及び再構成法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 非哺乳類の有核細胞と血液物質の 自　混合物の凍結乾燥及び再構成法 む凍結乾燥され、再構成された新規な細胞組成物に関する。

いて、風土病であるだけでなく、オーストラリア、南太平洋諸島、南アジアでも Ｉ　流行している。アメリカ合衆国においては、すべての隣接する州から報告さ れてＶ　いるが、南西部、西部山間部およびカリフォルニア州において、最も流 行している最初の個体からなり、その後、小胞中で４−８の個体からなる封入体 を形成するために、２分裂を数回（り返す。この封入体は赤血球の辺縁部で発見 される傾向があり、直径１．０μに達する。そのためこれらのりッケチアは細胞 内の偏性寄ヒツジやヤギにみられ、ストレスの多い状況では、病気をおこす。Ａ ｎａｐｌａＳＩＩｋｌΣ上はシカや玲羊のような種々の野生の育蹄類にも感染し 、これらは畜生に対し感染の貯蔵庫としての機能をはだすことができる。

これらおよび他のウィルス性の血液の寄生体、例えばネコの寄生生物であるト感 染した血液標品が必要であり、持続的な供給を確実にするため、標品は凍結乾燥 品として長期間貯蔵されることが必要である。従って、凍結乾燥及び再構成の方 法は、非有核細胞と血小板を含む血液の有用な特性を、有核細胞を含む寄生体を 殺すことなく、保存することか必要である。

マのような有核細胞を凍結乾燥し再構成する方法を考案することか望まれるであ の宿主である赤血球とともに、高貯蔵温度（４℃から室温）において良好な貯蔵 た赤血球は、アナブラスマのような偏性寄生体を支えられず、それゆえワクチン として感染した細胞を利用する際、生きている状態で完全な赤血球を保存するこ とは重要である。

好ましくは約３％またはそれ以下の水分の重量を含む新規の凍結乾燥された細胞 を回収するよう凍結した溶液を乾燥する。そして、その細胞は再構成されると、 生きていて有効な赤血球と活性のある有核細胞をかなりのパーセンテージで産生 する。再構成の方法もまた提供されている。

（ＰＢＳ）中、約７．０から３７．５重量パーセント、好ましくは約２６パーセ ント、の最終濃度である場合が好ましい。キシロース、グルコース、リポース、 マンノである生きている宿主赤血球、並びに、生きた有核細胞（寄生生物）をも 保持することは、とくに存利な点である。再構成された寄生体細胞は、長期間乾 燥状態で貯蔵されたあとワクチンの製造に利用される。再構成された赤血球と寄 生体の混合物は、ワクチンの処方物として直接注射できる。

ポリマーは、溶液中に最終濃度約０．７重量パーセントから飽和までの濃度で存 在でき、約１ｋから約６００にの範囲の分子量を持つ。ポリマーは好ましくは、 約２．５ｋから約３６０ｋ、最も好ましくは約５ｋから５０にの分子量を持ち、 約３．６重量パーセントからポリマーの溶解の限界までの濃度で溶液中に存在す る。

ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）およびポリビニルピロリドン誘導体、デキスト ランおよびデキストラン誘導体からなる群から選ばれたポリマーは、非常に好結 果を与える。ｌＯから４０にの範囲内の平均分子量で、１２から２０重Ｆ容量パ ーセントの範囲のポリビニルピロリドン（両親媒性ポリマー）を凍結乾燥の前の 溶液中に用いるのか、最も好ましい。アミノ酸をベースにしたポリマー（すなわ ちタンパク質）、デキストランまたはヒドロキシエチル化したでんぷんも使用で きる。ボロキサマー（ｐｏ　Ｉｏｘａａｅｒ）のような、他の両親媒性ポリマー もその多様な形態の内どのような形態でも使用できる。凍結乾燥の際、炭化水素 ポリマー溶液を使用することは、完全な赤血球の回収を可能にし、かなりのパー センテージでその赤血球は、正常な形態を育し、ＡＴＰ産生の測定により生きて いる細胞の代謝を示す。いかなる理論にも拘泥するわけではないが、ポリマーの 両親媒性という特質により細胞膜にポリマーが結合でき、水性の環境の中に親水 性部分を伸長させることにより細胞膜の表面を保護する。これが、細胞凝集のよ うな他の問題の原因となる細胞膜のダメージを軽減しているのかもしれない。

凍結乾燥という語句は、広義には物質を凍結し、その後溶媒、すなわち水、の濃 度をそれ以上の生物学的または化学的な反応か支持できなくなるレベルにまで、 昇華および除去により減少させることと定義される。通常は、乾燥のステップは 高度の真空中で達成される。もっとも、細胞の貯蔵に関しては、乾燥の程度（残 存する水分量）が、細胞が室温で長期貯蔵に耐えうるかという点で決定的に重要 である。本発明の方法では、細胞は、ｌＯパーセント以下、好ましくは３％以下 の残存水分量に凍結乾燥されるが、それでもなお有効な細胞に再構成される。

凍結乾燥用の溶液は、ｐＨ７，０から７．４の範囲内に好ましくはリン酸緩衝食 塩水（ＰＢＳ）により緩衝化される。典型的なリン酸緩衝溶液は、リン酸−およ び二ナトリウム塩（通常約１０ｍＭ＞　、塩化ナトリウム（通常約１５０ｍＭ） を含む。

この溶液はｐＨを約７，２に保つ。

凍結乾燥に用いられる好ましいリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）は、ピルビン酸、イ ノシン、アデニン、塩化カリウム、塩化ナトリウム、リン酸二カリウムを含み、 これらのものはすべて、ｐＨを約７．２の基本的な塩緩衝剤として、役にたつ。

更にこの凍結乾燥用緩衝溶液は、最終濃度で約３０重Ｆ容量パーセントの単糖類 、好ましくは、１．７Ｍグルコース、および、最終濃度で約１６重Ｆ容量パーセ ントのポリマー、好ましくはポリビニルピロリドン（平均分子量２４ｋ）を含む 。

ポリマー、好ましくは両親媒性のポリマー、の混合物が、単一のポリマーの代り に、使用できる。ポリマーの混合物は、凍結乾燥用緩衝液中、総濃度で、０．７ （重量）パーセントから飽和濃度まで存在できる。好ましくは混合物中のそれぞ れのタイプのポリマーは約１ｋから約６００ｋ　（平均分子量数）の範囲内の分 子量を持つ。混合物中の少なくともひとつのタイプのポリマーは、好ましくはｌ ｋから４００　ｋ、最も好ましくは、１５ｋから３６０にの分子量を持つ。それ ぞれのポリマーのタイプは、約３重量パーセントから溶解の限度までの濃度で、 凍結乾燥用緩衝液中に存在できる。また、混合物のうちひとつのタイプのポリマ ーは、約１００ｋから約６００に、Ｉｋも好ましくは、約１００から５００にの 範囲内の分子量を持つ。ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリビニルピロリド ン誘導体、デキストラン、デキストラン誘導体、アミノ酸をベースにしたポリマ ー（すなわちタンパク質）およびヒドロキシエチル化でんぷん（ＨＥＳ）からな る群より選ばれたポリマーが使用できる。ポロキサマーのような他の両親媒性の ポリマーは、多様な形態中のどれでも使用できる。好ましい態様として、３％Ｐ ＶＰ　（分子量約３６０　ｋ）または３％ＨＥＳ　（約１００ｋから５００にの 範囲内の分子量）が、凍結乾燥用緩衝液中に使用できる。

好ましくは、宿主の赤血球と寄生性の有核細胞は、寄生体、寄生体の変異株、ま たは弱毒化した寄生体変異株に感染した赤血球を含む血液を炭化水素およびポリ マーの最終的に希釈された濃度が必要な範囲に保たれるような上述の凍結乾燥用 緩衝液とともに、遠心分離することにより１ｌＩ１１！される。

その代わりに、寄生体、寄生体の変異株または弱毒化した寄生体の変異株を含み 、ＣＰＤＡ　（クエン酸、リン酸、デキストラン、アデニンを含む商品化された 溶液）中で調製された赤血球のパックドセル濃縮物を用いてもよい。

水分含有を１０％以下、好ましくは３％以下にする、通常の技術による凍結乾燥 法により、凍結乾燥された細胞は、耐圧容器中で真空下に、あるいは窒素または 不活性ガスの下で、再構成に用いられる際に望まれる特性が非常に失なわれるこ となく、室温で長期間係たれる。凍結乾燥された細胞が、室温でまたは冷蔵下に 長期間貯蔵できることが、本発明の特に有利なところである。

凍結乾燥された細胞は、通常の温度、すなわち、約１７°Ｃ以上で正常なヒトの 体温と一致する約３７°Ｃまで、好ましくは室温（約２２℃）において、再構成 できることが、本発明の更なる利点である。再構成用の媒質は、約１ｋから３６ ０に１好ましくは５ｋから約３６０にの分子量をもつ、ポリマーまたはポリマー 混合液を含む、約１０から３０重Ｆ容１パーセントの範囲内の濃度で存在する溶 液か望ましい。このポリマーは、上述の赤血球を凍結乾燥する為に用いたポリマ ーと同じものでよい。従って、ポリマーはポリビニルピロリドン、ヒドロキシエ チル化でんぷん、およびデキストランが特に望ましく、最も望ましくは再構成用 溶液中に約１９重Ｆ容量パーセントの濃度で、ポリビニルピロリドンか存在する ものである。再構成用溶液もまた上述した通り、ｐＨ値を約７．０から７．４の 範囲内に保つため、リン酸緩衝食塩水により、典型的に緩衝される。最も好まし いポリマーは、平均分子量約１０にのポリビニルピロリドンである。

最も好ましい再構成用緩衝液は、塩化カリウム、塩化ナトリウム、リン酸ナトリ ウム、リン酸二カリウムを含み、それらの全てはｐＨ約７，２において、基本的 な塩緩衝液を形成し、さらに約１９型量／容量パーセントのポリビニルピロリド ン（平均分子量約１０ｋ）を含む。

再構成用溶液は、好ましくは約７．０から３７．５重量パーセントの範囲内の濃 度で存在する単糖類も任意に含むことができる。好ましい単糖類はキシロース、 グルコース、リボース、マンノースおよび果糖である。

最も好ましい態様において、凍結乾燥された細胞は、約３７°Ｃで等量の再構成 用緩衝液と混合することにより再構成でき、十分に水和されるまで混ぜることが できる。“等量”といつ語句は、凍結乾燥に先立ち、開始時の容量と同じ容量を 意味している。再構成の後、好ましくはその溶液をデキストラン−生理食塩水溶 液で、ｐＨ７，２９０ｍｏｓｍにｌ対ｌに希釈する。

その後、再水和された細胞は、以下の方法で洗浄されるのが好ましい。もっとも 、ひとたび細胞か再構成用緩衝液で再構成されれば、細胞は有効な形態となるが 、以下にのべる洗浄方法の組みあわせか特に完全な細胞の保持を最も効果的にす るために好ましいということか理解されよう。

遠心分離により、再構成用緩衝液から分離した後、得られたパックドセルは、通 常ペレットの形態にあるが、（再構成に用いたのとほぼ等容量の）上述のｐＨ７ ，２の基本的な塩緩衝液を含み、更に約１０重Ｆ容量パーセントのポリビニルピ ロリドン（分子量約２．５ｋ）を含む緩衝液に再懸濁するのが好ましい。遠心に よる分離で、初回の水和後のステップ、すなわち洗浄のステップが、完了する。

細胞は、そのまま使用でき、または注射に先立ち冷蔵で貯蔵できる。

凍結乾燥された有核細胞とその宿主細胞は、周囲の環境温度（すなわち室温２０ 〜３０°Ｃ）で都合よく貯蔵でき、生存可能な状態で再構成できる。これは、寄 生体に対するワクチンを製造するのに宵月な、生きている寄生体、または弱毒化 した寄生体の貯蔵と製造を可能にする。生きていない寄生体の細胞や、小胞を含 むワクチンもまた宵月ではあるか、ある例では弱毒化した寄生体が好ましいワク チンであるから、生きている寄生体を回収することは好ましいことである。

本発明の好ましい態様を記述したが、以下の実験例は、具体的に示すために提供 されており、本発明をどのようにも制限する意図はない。

実施例！ アナプラズマ　マルジナーレ（Ａｎａｐｌａｓｍａ　ｍａｒｇｉｎａｌｅ）に感 染したウシおよびヒツジの赤血球の標品を、デキストロース−生理食塩水で、バ ッフイーコートを除去するため洗浄した。三種の異なる凍結乾燥用緩衝液を試み た。すなわち、ヘマトクリットｌＯパーセント、３０パーセントおよび４０パー セントにおいて：１、Ｚ３Ｍグル：Ｉ−，１，＋Ｚ５パーセントＣ−３０ＰＶＰ 。

２、Ｚ３Ｍグルコース＋３パーセント３６０ＨＥＳ。

３、　１．７Ｍグル：＋−ス＋３パーセンｔ−ａｓｏｐｖｐ＋ｔ、ｓパーセント ＨＥＳ。

用いた凍結乾燥サイクルのパターンは、凍結−一一一一ゆっくり 乾燥時間−一−６日間 標品の大きさ−１，４ｍｆｓ 標品は、最初と同じ容量の以下に述べる再構成用緩衝液と、乾燥した物質を３７ ℃において混合することにより再構成された。

再構成用緩衝液 ＫＣｆ　１ｍＭ ＫＨｔＰＯａ　１．４程 ＮａＣｆ　１１０．７ｍＭ　ｐＨ７，２０±０．０５ＮａｔＨＰＯａ　ｇ、１ｍ Ｍ　６０５±１５ｏ＋Ｏｓ＋ｓプラストンＣ−１５１９０，０ｇ＃ すべての乾燥した物質が再び水和するまで、この溶液を攪拌した。その後、標品 を染色し、生存している生物を数えた。蛍光のジアセテート−エチジウム　ブロ マイド　ヴアイアヴイリティー染色法を用いた。生きているものは緑に、死んだ もの　はオレンジに染色される。数多くの生きた生物が完全な宿主の赤血球中に 見られた。これは多数のＡ、　ｍａｒｇｉｎａｌｅが凍結乾燥と再構成の工程で 生きのびたことを示している。

前述の記述から、当業者は本発明の目的及び範囲から離れることなく、本発明の 本質的な特徴を容易に理解でき、本発明を種々の用法や条件に適応できる。状況 に応じであるいは都合をよくする際には改変や均等物のおきかえが考慮されよう 。ここでは特定の語句が用いられているが、それらは説明を意図したものであり 、限定を目的としたものではない。

要約書 国際調査報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．有核細胞と血液物質の混合物の凍結乾燥する方法であって、以下の工程：約 ７．０から３７．５％の濃度で、溶液中に存在する単糖類及び約０．７％から飽 和までの全ポリマー濃度で溶液中に存在する平均分子量約１ｋから約６００ｋの 範囲のポリマーを含む、緩衝液中に当該混合物を浸す工程、及び 水を除去して細胞を乾燥する工程 を含む方法。 ２．前記のポリマーが両親媒性である請求の範囲第１項記載の方法。 ３．前記のポリマーが少なくとも２種の型のポリマーを含み、一方は約２０ｋか ら約３６０ｋの範囲の分子量を有し、他方は約１００ｋから５００ｋの範囲の分 子量を有する、請求の範囲第１項記載の方法。 ４．単糖類が五炭糖と六炭糖からなる群から選ばれる請求の範囲第１項記載の方 法。 ５．単糖類が、キシロース、グルコース、リボース、マンノース及びフルクトー スからなる群から選ばれる請求の範囲第４項記載の方法。 ６．前記ポリマー混合物がポリビニルピロリドンおよびハイドロキシエチル化さ れたでんぷんを含む請求の範囲第３項記載の方法。 ７．前記の細胞が赤血球を含む、請求の範囲第１から６項のいずれか１項に記載 の方法。 ８．前記の細胞が血小板又は白血球を含む、請求の範囲第１から６項のいずれか １項に記載の方法。 ９．前記の有核細胞が、細胞の奇生体、弱毒した寄生体の菌株およびそれらの断 片からなる群から選ばれる請求の範囲第１から６項のいずれか１項に記載の方法 。 １０．前記の寄生体が生存している請求の範囲第９項記載の方法。 １１．前記の奇生体がアナプラズマ属を含む、請求の範囲第１０項記載の方法。 １２．前記の寄生体がＡｎａｐｌａｓｍａ　ｍａｒｇｉｎａｌｅを含む請求の範 囲第１１項記載の方法。 １３．凍結乾燥した有核細胞と血液物質を含む組成物の再構成方法であって、以 下の工程： 前記の有核細胞を有益な状態に再構成ために、前記の組成物を、約７．０から７ ．４の範囲のｐＨ値を持つ十分量のリン酸−緩衝食塩水の再構成溶液に約１５か ら５０℃の範囲の温度で混合する工程を含み、前述の再構成溶液が、分子量約１ ｋから３６０ｋの範囲のポリマーを、最終濃度で約０．７重量パーセントからポ リマーの飽和濃度で含む方法。 １４．前記のポリマーが両親媒性である、請求の範囲第１３項記載の方法。 １５．前記のポリマーが約２．５ｋから３６０ｋの範囲の分子量を有する、請求 の範囲第１３項記載の方法。 １６．前記の有核細胞が、細胞内の奇生体、弱毒化した奇生体の菌株、およびそ れらの断片からなる群から選ばれる、請求の範囲第１３項記載の方法。 １７．前記の寄生体が生存している請求の範囲第１６項記載の方法。 １８．前記の寄生体がアナプラズマ属を含む請求の範囲第１７項記載の方法。 １９．前記の寄生体がＡｎａｐｌａｓｍａ　ｍａｒｇｉｎａｌｅを含む請求の範 囲第１８項記載の方法。 ２０．請求の範囲第１３項記載の方法であって、さらに以下の工程：前記の有核 細胞と血液物質を遠心分離し、ｐＨ約７．０から７．４の範囲のデキストロース ー生理食塩水緩衝液中に前記の細胞を再懸濁し、遠心により前記の細胞を分離す る、少なくとも１回のサイクルにより洗浄する工程を含む方法。 ２１．凍結乾燥した有核細胞と血液物質を含む組成物を再構成する方法であって 、約１７℃より高温において、分子量約１ｋから６００ｋを持つ一のポリマー又 は混合物が１０から３０重量パーセントの範囲の最終濃度で存在するポリマー水 溶液に前述の細胞を接触させる工程を含む方胞。 ２２．前記のポリマーが両親媒性である請求の範囲第２１項記載の方法。 ２３．前記のポリマーが約２．５ｋから３６０ｋの範囲の分子量を有する請求の 範囲第２１項記載の方法。 ２４．前記のポリマーがポリビニルピロリドン、ヒドロキシエチル化でんぶん、 デキストランおよびそれらの混合物よりなる群から選ばれる請求の範囲第２１、 ２２または２３項に記載の方法。 ２５．前述のポリマーが、平均分子量約１０ｋのポリビニルピロリドンを含む請 求の範囲第２２項記載の方法。 ２６．前述の溶液が、さらに、最終濃度で約７．０から３７．５重量パーセント の単糖類を含む、請求の範囲第２１、２２または２３項記載の方法。 ２７．前述の有核細胞が、細胞内寄生体、弱毒化した寄生体の菌株およびそれら の断片からなる群から選ばれる請求の範囲第２１項記載の方法。 ２８．前述の寄生体が生存している請求の範囲第２７項記載の方法。 ２９．前述の奇生体がアナプラズマ属を含む請求の範囲第２８項記載の方法。 ３０．前述の寄生体がＡｎａｐｌａｓｍａ　ｍａｒｇｉｎａｌｅである請求の範 囲第２９項記載の方法。 ３１．有核の非哺乳類の細胞と宿主の哺乳類の血液の細胞とを含む凍結乾燥した 組成物であって、周囲の環境温度で貯蔵することができ、かつ前述の有核の非哺 乳類の細胞と前述の哺乳類の血液細胞を生きている状態に再生するために再構成 できる組成物。 ３２．該血液の細胞が赤血球を含む請求の範囲第３１項記載の組成物。 ３３．前述の有核細胞が、細胞内寄生体、弱毒化した寄生体の菌株およびそれら の断片を含む群から選ばれる請求の範囲第３２項記載の組成物。 ３４．前述の有核細胞がアナプラズマを含む請求の範囲第３３項の組成物。 ３５．前述の有核細胞がＡｎａｐＩａｓｍａ　ｍａｒｇｉｎａｌｅを含む請求の 範囲第３４項記載の組成物。 ３６．請求の範囲第３１から３５項のいずれか１項に記載の組成物を含むワクチ ン。