JPH05505724A - ファネロカエート クリソスポリウムによるリグニン分解酵素の生成方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ファネロカエート　クリソスポリウムによるリグニン分解酵素の生成方法 本発明は、ファネロカエート　クリソスポリウム（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅ　ｔ ｅｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕ＋ｗ）によるリグニン分解酵素の生成方法に関する 。

過去１０年間、産業レベルでリグニン分解酵素の生成のために孔腐れ真菌を使用 することがくり返して試みられて来た。たとえば、撹拌発酵器における実験が存 在する（Ｈ，Ｊａｎｓｋｅｋａｒ　ａｎｄ　Ａ、　Ｆｉｅｃｈｔｅｒ。

Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、　８　（１９８８）、　 ９７〜１１２）。しかしながら、これらの実験は、撹拌発酵器においてファネロ カエート　クリソスポリウムにより形成されるペレットは再三、粉砕されるので 、ひじょうに好都合なものではなかった。しかしながら、ファネロカエート　ク リソスポリウムは、それがペレット形又は固定形で存在する場合、単に酵素を生 成するので、最適な酵素生成は、撹拌発酵器においては現実化され得ない。

さらに、生物技法が、敏感な細胞のために特に企画された反応器を開発して来た 、たとえば、いわゆる、敏感な動物及び植物細胞のためにも適切である１振動ミ キサー（ｖｉｂｒｏｍｉｘｅｒ）”が開発された（Ｅｉｎｓｅｌｅ、　Ｆｉｎｎ 、　Ｓａ＊ｈａｂｅｒ　：　Ｍｉｋｒｏｂｉｏｌｏ　１ｓｃｈｅ　ａｎｄ　ｂｉ ｏｃｈｅｍｉｓｃｈｅＶｅｒｆａｈｒｅｎｓｔｅｃｈｎｉｋ　（Ｍｉｃｒｏｂｉ ｏｌｏｇｉｃａｌ　ａｎｄ　Ｂｉｏｃｈｅ＊１ｃａｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ） 。

ｉｌｅｉｎｈｅｉｍ　１９Ｂ５．１５０ページ；　Ｅｉｎｓｅｌｅ　：　Ｃｈｅ ｗ、　Ｉｎｇ、　Ｔｅｃｈ、　４５　（１９７３）＋１３６８　：　Ｒｅｂｓ＋ 　：　Ｃｈｅｗ、　Ｉｎｇ、　Ｔｅｃｈ、　４２　（１９７０）、　５８３）。

振動ミキサーの効果はＢｅｒｎｏｕｌｌｉ効果に基づかれている。撹拌機の代わ りに、垂直シャフトに結合される水平プレートがこの容器内に配置され、ここで 前記プレートは下方に向かって先細になる穴を開けられている。

それはシャフトにより上下に動かされる。この動きは、開口部における液体が大 きな直径から小さな直径に逆流するので、孔開けされた穴に圧力差を引き起こす 、細胞がその手段で十分に動かされる場合でさえ、実際の損傷は存在しない、し かしながら、そのような振動ミキサーは、ファネロカエート　クリソスポリウム の怒受性ペレットのためには十分に好都合ではない欠点を有する。さらに、その ように振動ミキサーは、今日まで商業的規模で使用され得ない。

最後に、機械的シェーカーにより動かされるガラス容器はまた、微生物のペレッ トの形成のために適切である（ＨｌＪ、　Ｒｅｈｍ　：Ｅｉｎｆｕｈｒｕｎ　ｉ ｎ　ｄｉｅ　１ｎｄｕｓｔｒｉｅｌｌｅ　Ｍｉｋｒｏｂｉｏｌｏ　ｉｅ　（Ｔｎ ｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎｉｎｔｏ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏ ｇｙ）、　Ｂｅｒｌｉｎ−［１ｅｉｄｅｌｂｅｒｇ−Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ１９７１ ）　、このためには、容器（はとんどの場合、ボトル又は三角フラスコ）は、多 段層で機械的シェーカーにクランプされる。容器の振盪の結果として、空気がそ の表面から溶液中に混合される。振盪のためには、通常、種々の速度を有する振 幅、回転及び振動機械が使用される。これらの容器は、平面のふくらみ、すなわ ちそらせ板プレートを有することができる。これらのシステムの欠点は、それら が実験室規模でのみ適切であることである。大規模な商業的適用のためには、多 くのボトル又は三角フラスコが必要であり、その結果、そのような装置の使用は 適切ではない。

撹拌反応器を用いることでの上記の問題を解決するために、科学者は、固定され たセルによる研究をますます試みて来た（Ｓ、　Ｌｉｎｋａ。

Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、　８　（１９８８）＋１ ６３〜１７０　；　Ｈ，Ｗｉｌｌｅｒｓｈａｕｓｅｎ。

Ａ、　Ｊ冨ｇｅｒ、　Ｈ，Ｇｒａｆ、　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｔｅｃｈ ｎｏｌｏｇｙ、　６　（１９８７）＋　２３９〜２４３　；　Ｙ、　Ｌｉｎｋｏ 、　Ｍ、　Ｌｅｉｓｏｌａ、　Ｎ、　Ｌｉｎｄｈｏｌｍ、　Ｊ、　Ｔｒｏｌｌｅ ｒ＋　Ｐ、　Ｌｉｎｋｏ。

Ａ、　Ｆｉｅｃｈｔｅｒ、　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇ Ｖ　４　（１９８６Ｌ２８３〜２９１）、　Ｌかしながら、これらの方法はまた 、大規模で失敗した。一般的に、それらは、４０１以上の発酵器体積でもはや実 用的ではなかった。特に、その理由は、ペレット形でのファネロカエート　クリ ソスポリウムが最適な表面を有し、そして従って、この状態で存在する場合、酵 素を最適に生成する事実に見出され得る。

従って、４０ｆ以上の発酵容器においても実用的である、ファ不ロカエート　ク リソスポリウムによるリグニン分解酵素の生成方法を提供することが本発明の目 的である。

その目的は、撹拌手段を有さない密閉容器中にファネロカエートクリソスボリウ ムを配置し、そして前記容器を回転し、そしてねじることによってその中でファ ネロカエート　クリソスポリウムのペレットを生成することによって解決され； 次に前記ペレ・ントは、酵素生成が生じるまで振盪され、又はペレットの形成後 すぐに、従来の反応器に移され、この反応器において、次に酵素生成が生じるで あろう。

ペレットの形成は、本発明の方法のために特に開発された新規反応器で生じる。

これは、撹拌手段を有さす、そしてカルダン固定手段で自由に回転的及びねじれ 的に吊下げられている宙閉発酵容器である。前記容器下に、モーターが配置され 、前記モーターのプロペラシャフトが偏心を通して前記容器の底に連結される。

前記容器の傾き及び振動増幅器の角度は、前記偏心により調節され得る。従って 、前記容器の回転及びねじれ動きは、無限に可変的にｆｆｌ！ｆｆできるモータ ーによりもたらされ得る。

このようにして動かされる発酵器においては、ファネロカエートクリソスボリウ ムは、機械的影響により再三破壊されないペレットを形成する。一般的に、その ペレットは、酵素生成のために最適である形状を得る。他方、反応器のカルダン 固定の振動は最少であり、そして従って、１〜３ｎ（の間の反応器体積の構成を 可能にするので、これまで不可能であると思われて来た生成を伴っての商業的規 模でのリグニン酵素の生成が上記装置により達成され得る。

ファネロカエート　クリソスポリウムのペレットは、振盪発酵器又は撹拌発酵器 における酵素生成が完結した後すぐに、酵素生成のために再使用され得ることが もう１つの利点である。この目的のためには、残存する懸濁液からペレットを分 離し、そして酵素の分離の後、撹拌反応器にそれらを再循環し、又はＣ−源（炭 素源）を有さない新しい基質を添加する（前記基質は低い窒素含有率であり、又 は窒素を有さない）ことが好都合である０本発明によれば、分離は、限外濾過に よりもたらされ得る。

本発明の方法を実施する前、ファネロカエート　クリソスポリウムは、それ自体 既知の手段、たとえばペトリ皿又は標準培養物において培養され得る。次に、こ のようにして形成された菌糸体は、粉砕され、そして本発明の方法に使用される 。

ファネロカエート　クリソスポリウムの培養は、知られている条件下で行なわれ 、すなわち前記培養は一般的に、３０〜４０℃の間の温度及び４．５〜５のｐｉ 値で生じる。ファネロカエート　クリソスポリウムの培養の間のガス抜きは、連 続的又は断続的に行なわれる。純粋な酸素又は圧縮空気がこの目的のために使用 され得る。

次に、本発明は、図に間して、より詳細に記載される。

図は、ファネロカエート　クリソスポリウム　ペレットの生成のための反応器を 示す。ペレットの形成は容器１において生しる。前記容器１は、開底８、側壁、 蓋９及び視検窓７を有する書間容器である。種々の測定センサー（０□、　ｐＦ Ｉ、消泡）のための並びに基質及び接種培養物の供給及び回収のための開口部が 側面又は底に供給される。それはフレーム１１に吊下げられ、そしてグリップア ーム１０により固定される。前記容器ｌは、前記グリップアーム１０によりカル ダン固定手段で自由に回転的及びねじれ的に吊下げられる。回転及びねじれの動 きは、モーター６によりもたらされる。これは、プロペラシャフト５及び偏心４ により前記容器１の前記底８に連結される。前記容器１の傾き及び振動増幅は前 記堰偏心４により調節される。前記容器１の回転及びねじれの動きの速度は、モ ニターの回転数によりｍ！ｆｆできる。

本発明は、次の例によりさらに例示される。

例 ファネロカエート　クリソスポリウムＡＴＣＣ３２６２９を、菌株として得ル。

７／Ｌ、ズアガー（Ｍａ　Ｉｚａｇａｒ）スラブを接種し、そして次に、２７° Ｃで約１０〜１２日間培養する。半分の増殖を、それらのスラブから除去し、そ して標準培養物５０ａｆを、５００ｍの三角フラスコ中に接種する（３７°Ｃで 約５日間の培養時間）、このようにして得られた予備培養物をデカントし、アゾ スト（ａ、　ｄｅｓｔ、）により元の体積まで満たし、そして次に、段階３で、 ２×３０秒間、Ｂｒａｕｎ　Ｓｔａｒｍｉｘにより細断する。１５ａｉの予備培 養物を、振盪反応器における培地１２当りに添加し、すなわち７５ｍが５２によ り満たされた１０ｆｆｉの振盪反応器に添加される。培養温度は３８°Ｃであり 、時おりの振盪は９０ｒｐｍ＋であり、そして変位（ｅｘｃｕｒｓ　１ｏｎ）は 約５ｃｍである。それぞれの日、それはＣ２により３０秒間ガス供給される（１ ００　ｆｆｉ　７時）。培養期間は４〜５日である。酵素収穫物は、約５０〜１ ００Ｕ＃！　（ＩＵ＝１分当たりのベラトリルアルコールのベラトリルアルデヒ ドへの１Ｊモルのターンオーバー）である。最大１０Ｕ＃！が、従来の撹拌反応 器において同し条件下で達成され得る。

培地は次のとおりにして達成される： 予備培養培地： １）無機塩溶液（ＭＥ）　：　（１ｆ当たり）１０．５ｇのニトリロトリアセテ −）；２１ｇのＭｇ５Ｏａ　；　３．５ｇのＭｎ５Ｏ，；７ｇのＮａＣ１；　０ ．７　ｇのＦｅＳＯ４；　０．７ｇのＣｏＣ１ｚ　；　０．７　ｇのＣａＣ１ｚ 　；０．７ｇのＺｎ５Ｏａ　；　０．０７　ｇのＣｕ５Ｏａ　；　０．０７　ｇ のＡｌＫ２Ｓ０Ｊ　；０．０７ｇのＨ３ＢＯ３；０．０７ｇのＮａＭｏ０ａ。

２）溶液１（塩溶液）（ｉｆ当たり） ２０ｇのＫ）ＩＺＰＯ４；　５　ｇのＭｇ５Ｏａ　；　１　ｇのＣａＣ１ｚ　１ １３）緩衝液（ｐＨ４，５〜５．５） ｌａｆのＮａＨ２ＰＯａ　〜ＮａＨｚＰＯａ−緩衝液培地Ｉｆ当たりの組成： ０．２ｇの酒石酸アンモニウム １００ａｆの溶液１ １．４３ｄのＭＥ溶液 Ｌｏｇのグルコース １０ａｆの緩衝液 ＋０．９ｍのチアミン（１００ｍｇ／　ｌ　）　（オートクレーブにおける処理 の後、殺菌濾過された形で添加される） 主要培養培地： 培地１２当たりの組成： ０．２ｇの酒石酸アンモニウム １００＋ｄの溶液１ １０ｄのＭＥｉ液 １０ｇのグルコース １０ｄの緩衝液 ６７．３■ノヘラトリルアルコール ２ｄのＴｗｅｅｎ　８０ ＋０．９ａｄのチアミン（１００ｍｇ／　Ｉ！　）要約書 本発明は、ファネロカエート　クリソスポリウム（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｓ＋）によりリグニン分解酵素を生成するための方法 に間し、ここで ａ）孔腐れ真菌ファネロカエート　クリソスポリウムの培養物が、撹拌手段を有 さない密閉容器（１）中に配置され、ｂ）ファネロカエート　クリソスポリウム のペレットが、前記容器（１）を回転し、そしてねじることによって生成され、 そしてＣ）酵素が収穫されることを特徴とする方法。

λ　前記ベレ７）を含む懸濁液が、酵素収穫の前、従来の撹拌反応器中に移され 、そして前記酵素がベレットによりそこで生成されることを特徴とする特 −一−１”””−”ＰＣＴ／ＥＰ　９１１００７１２Ｓ＾　４６４１９

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. １．ファネロカエートクリソスポリウム（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅｃｈｒｙ ｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）によりリグニン分解酵素を生成するための方法であって、 ａ）孔腐れ真菌ファネロカエートクリソスポリウムの培養物が、撹拌手段を有さ ない密閉容器（１）中に配置され、ｂ）ファネロカエートクリソスポリウムのペ レットが、前記容器（１）を回転し、そしてねじることによって生成され、そし てｃ）酵素が収穫されることを特徴とする方法。
2. ２．前記ペレットを含む懸濁液が、酵素収穫の前、従来の撹拌反応器中に移され 、そして前記酵素がペレットによりそこで生成されることを特徴とする請求の範 囲第１項記載の方法。
3. ３．前記ペレットが、酵素生成が完結した後、培地から分離され、そして前記撹 拌反応器における酵素生成のために再使用されることを特徴とする請求の範囲第 １項記載の方法。
4. ４．前記ファネロカエートクリソスポリウムが純粋な培養形で存在しないことを 特徴とする請求の範囲第１又は２項記載の方法。
5. ５．前記ファネロカエートクリソスポリウムがそれ自体既知の手段で標準培養物 において又はスラブ上で、まず培養され、そして前記工程が、続いて、ファネロ カエートクリソスポリウムのフラグメント化された菌糸体により行なわれること を特徴とする請求の範囲第１〜４のいづれか１項記載の方法。
6. ６．前記培養物が酸素又は圧縮空気により酸素供給されることを特徴とする請求 の範囲第１〜５のいづれか１項記載の方法。
7. ７．請求の範囲第１〜６のいづれか１項記載の方法に使用するためのファネロカ エートクリソスポリウム真菌のペレットを生成するための手段であって、撹拌手 段を有さず、そしてカルダン固定手段（３）で自由に回転可能的及びねじれ可能 的に吊下げられている密閉発酵容器（２）から成ることを特徴とする手段。
8. ８．前記容器（１）の回転及びねじれをもたらすために、モーター（６）が前記 容器（１）の床（８）下に配置され、前記モーター（６）のプロベラシャフト（ ５）が偏心（４）を通して前記容器（１）の前記床（８）に連結されることを特 徴とする請求の範囲第７項記載の手段。
9. ９．前記モーターの回転速度がひじょうに可変的に調節できることを特徴とする 請求の範囲第８項記載の手段。
10. １０．前記容器（１）の傾き及び振動増幅の角度が前記偏心（４）により調節で きることを特徴とする請求の範囲第８項記載の手段。