JPH05505403A - ヒトｂＦＧＦの誘導体、その類似体及びこれらの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ヒトｂＦＧＦの誘導体、その類似体及びこれらの製造方法本発明はヒト塩基性繊 維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）の誘導体、機能的に同等なその類似体、及びこれ らの製造方法に関する。

ヒトｂＦＧＦは、正常組織及び腫瘍組織から単離した構造的に関連するタンパク 質の族に属している。

この族は塩基性ＦＧＦの他に、酸性ＦＧＦと始原腫瘍遺伝子生成物（ｉｎｔ−２ ，ｈｓｔ／ｋｓ、ＦＧＦ−５゜ＦＧＦ−６，ＦＧＦ−７／ＫＧＦ）を含んでいる 。

単離すべき、また生物学的に特徴づけるべき最初の因子たる塩基性ＦＧＦは、そ の仲間よりも徹底的に調査されている。

塩基性ＦＧＦは組織（中枢神経系、末梢神経系、網膜、腎臓及び心筋）及び腫瘍 （乳癌、膀胱癌、肝癌及び神経膠層）中に広く分布している。

ｂＦＧＦは最初、繊維芽細胞及び内皮細胞へのマイトジェン活性を示す因子とし て下垂体から抽出されていた（Ｇｏｓｐｏｄａｒｏｗｉｃｚ；Ｎａｔｕｒｅ、２ ４９，１２３．１９７４）、ｂ　Ｆ　Ｇ　Ｆのヘパリン及び関連グリコサミノグ リカンへの親和性が高いことが発見されるとすぐに、ヘパリン親和性クロマトグ ラフィーを使用して、塩基性ＦＧＦと非常に類似した又はそれと同一のマイトジ ェンが幾つか単離された。

これらのマイトジェンには元の組織又はターゲット細胞の特異性に基づいて名前 が付けられ、とりわけ軟骨誘導成長因子（ＣＤ　Ｇ　Ｆ　）　（Ｓｕｌｌｉｖａ ｎ　Ｒ，、Ｋｌａｇｓｂｒｕｍ　Ｍ、：　Ｊ。

Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　２６０．２３９９−２４０３；　１９８５）、ヘパリ ン結合成長因子β（ＨＢＧＦ−β）　（Ｌｏｂｂ　Ｒ，Ｒ，、等、Ｂｉｏｃｈｅ ｍ。

Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、Ｃｏ５５＋、１３１，５８６−５９２．１９８５） 、目誘導成長因子１　（ＥＤＧＦ−１）（Ｃｏｕｒｔｙ　Ｊ、等、Ｂｉｏｅｈｉ ｍｉｅ　６７．２６５−２６９゜１９８５）及びアストログリア成長因子−２（ ＡＧＦ−２）（Ｐｅｔｔａ＋ａｏ　Ｂ、、等、ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒ　１８９ ，１０２−１０８；１９８５）が含まれる。前記全ての因子は約１．６Ｍ　Ｎａ Ｃ１を使用してヘパリン−セファロースカラムからｐＨ７，０で溶離し、約８〜 １０の見掛ｐＩｓを有し、アミノ酸配列の相同性は高い。

ヘパリンを使用すると、このような因子の最初の精製が簡単になったが、これら のマイトジェンをコードする遺伝子及びｃＤＮＡの同定（＾ｂｒａｈａｍ　Ｊ、 ＾１等、ＥＭＢＯＪ、　巨、２５２３−２５２８；１９８６．Ｋｕｒｏｋａｗａ 　Ｔ等、ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒ　２１３，１８９−１９４゜１９８７）及び太 １１発現系の発生（Ｋｕｒｏｋａｗａ　Ｔ、等、ＦＥＢＳＬｅｔｔｅｒ　２１３ ，１８９−１９４４９８７）により、これらの密接に関連する因子間の関係をよ り良く理解することができた。

塩基性マイトジェンは１つだけ（ｂＦＧＦ）であり、異なる組織から単離した分 子間の違いが翻訳後処理によって可変Ｎ末端の切断を反映していると遺伝研究は 示唆している（Ｇｏｓｐｏｃｌａｒｏｗｉｅｚ　Ｄ、等、Ｅｎｄｏｃｒ、Ｒｅｖ 、　８．９５−１１４．１９８７゜Ｅｓｃｈ　Ｆ、等、ＰＮＡＳ　ＵＳＡ　８２ ，６５０７−６５１１４９８５）。

調査したところ、これらの長さの違いはマイトジェン活性にもヘパリン親和性に もそれほど作用しないことが判明した。（Ｇｏｓｐｏｄａｒｏｗｉｃｚ　Ｄ、等 、Ｅｎｄｏｃｒ、Ｒｅｖ、８．９５−１１４．１９８７）。

Ｎ末端伸張形態の存在が組織特異調節に重要であり得ると主張されていた。塩基 性ＦＧＦは広範な活性を有することが示されていた。塩基性ＦＧＦは中胚葉源及 び神経外胚葉源細胞のＤＮＡ合成及び細胞分裂を増し、タンパク質合成及び（例 えばプラスミノーゲン活性化因子の）分泌を調節し、く例えばダリアの）細胞運 動及び移動に作用し、特に神経細胞及び内分泌細胞（例えば下垂体）の分化機能 を変え、また細胞（例えば損傷を受けたニューロン）の生存及び（例えば副腎皮 質細胞の）老化現象に影響を与え得る。

塩基性ＦＧＦ分子の分裂促進性、走化性及び分化性は、塩基性ＦＧＦが胚の発達 に関与し、恐らく胚形成の全ての段階で機能する主要栄養因子であることを示唆 している（Ｓｌａｃｋ　Ｊ等、Ｎａｔｕｒｅ　３２６，１９７−Ｚｏｏ、１９８ ７）。

ｂＦＧＦによる血管形成の調整は生殖組織では特に重要である。生殖細胞ではｂ ＦＧＦは黄体又はａｒｔｒｅｓｉａの形成に備えて黄体の顆粒層細胞の成長及び 分化をも調整し得る（Ｇｏｓｐｏｄａｒｏｗｉｃｚ　Ｄ、、Ｓｅｗ、Ｒｅｐｒｏ 、Ｅｎｄｏｃｒ、、７．２１−３９；１９８９）。

更には、ｂＦＧＦは高度に管を含む他の内分泌器官（例えば下垂体、精巣、甲状 腺及び副腎皮質）を調節するのに役立ち得る。何故ならば、そのタンパク質がこ れらの組織に免疫組織化学的に局限され、またホルモン合成を調節し得るからで ある（Ｂａ　ｉ　ｒｄ＾、ａｎｄ　Ｂｏｈｌｅｎ　Ｐ、ＦｉｂｒｏｂｌａｓｔＨ ｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒｓ、　Ｉｎ：　５ｐｏｒｎ　ＭＢ、　Ｒｏｂｅｒｔｓ 　ＡＢ　ｅｄｓ。

Ｈａｎｃｌｂｏｏｋ　ｏｆ　ｅｘｐｅｒｉ＋ａｅｎｔａｌ　ｐｈａｒｍａｃｏｌ ｏｇｙ、Ｖｏｌ、９５／ｌ。

Ｐｅｐｔｉｄｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒｓ　ａｎｄ　ｔｈｅｉｒ　ｒｅｃ ｅｐｔｏｒｓ　ｒ、　Ｂｅｒｌｉｎ：　５ｐｒｉｎｔｅｒ、１９９０：３６９− ４１８＞。

種々のｂ　Ｆ　Ｇ　Ｆの機能及びその広範な組織分布は、このマイトジェンが広 範な生理学的意義と潜在的な臨床価値とを有することを示唆している。

考えられる多くの臨床使用の中で、ｂＦＧＦは傷（特に皮膚の深い外傷）の治癒 を早め、虚血性組織の血管を再形成し、損傷を受けた神経細胞を再生し、組織移 植及び骨移植の治癒の成功を高めるために適用され得る。

本発明者等は、天然分子と比較して生物活性及び安定性がかなり増したことを特 徴とするヒトｂＦＧＦの誘導体及び機能的に同等なその類似体を開発した。この 発明は前述したｂＦＧＦの治療への適用に非常に重要である。

１１α毘亙皇盈朋 本発明はヒト塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）の誘導体、機能的に同等な ぞの類似体、及びこれらの製造方法に関する。

ヒトｂＦＧＦは、分子量が約１６．５００ダルトンの単鎖非グリコジル化タンパ ク質である。ｂＦＧＦは最初ヒト脳に存在すると報告されて、ヒト脳から抽出さ れていた（Ｇｉｍｅｎｅｚ−Ｇａｌｌｅｇｏ、Ｇ、等、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉ ｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍ＋ｅ。

１３５．５４１−５４８．１９８６＞。

ＥＭＢＯＪｏｕｒｎａｌ　（ｖｏｌ、５．ｎｏ、１０゜ｐｐ、２５２３−２５２ ８．１９８６）及びＰＣＴ国際特許出願公開第ＷＯ１０１７２８号では、ウシｂ ＦＧＦをプローブとして使用してヒトｂＦＧＦのｃＤＮＡを夕ロ一二ングして製 造したクローンに基づいて、ヒトｂＦＧＦを構成するアミノ酸を演鐸的に特定し たことが示されている。

更には、ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒ（ｖｏｌ、２１３．Ｐ２Ｓ５．１９８７）は、 ヒトｂＦＧＦのｃＤＮＡのクローニングにより得られた形質転換細胞を培養して 行うヒトｂＦＧＦの製造を説明している。

ヒトｂＦＧＦをコードする核酸配列は１５５個のアミノ酸翻訳生成物を予示して いるが、Ｎ末端長さの異なるより短い、またより長い幾つかの形態が種々の組織 から単離されている。Ｎ末端でタンパク質が部分的に分解するために、組換えに より生成された分子でさえしばしば種々の形態の混合物として出現している。

このように長さが異なるにも拘わらず、これら全ての形態はｂＦＧＦの生物活性 を保持しているように思われる。

ヒトｂＦＧＦの共通の１４６個のアミノ酸配列は以下の式で表される。

Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　 Ｇｌｙ　入１ａ　Ｐｈａ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　ＨｉｓＩ’ｈｅ　Ｌｙｓλ ｓｐ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｔｙｒ　Ｃｙｓ　Ｌｙｓλｓｎ　Ｇａ ｙ　Ｇｌｙ　Ｐｈｅ　Ｐｈａ　ＬｅｕＡｒｇ　工１ｅ　）！ｉｓ　ｐｒｏ　入ｓ ｐ　Ｇｌｙ　入ｒｇ　Ｖａｌ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　入ｒｇ　Ｇｌｕ　Ｌｙ ｓ　Ｓｅｒ　Ａｓ■ Ｐｒｏ　Ｈ’ｒｓ　１１−ｅ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｇｉｎ　Ｌｅｕ　Ｇｉｎ　Ａｈ ａ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕλｒｇ　Ｇａｙ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　５ａ■ １１ｅ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　ＶａＩ　Ｃｙｓ　入１ａ　Ａｓｎ　入ｒｇ　Ｔｙｒ　 Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｍｅｔ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ人ｒｇ　Ｌｅｕ　Ｌ ｅｕ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　Ｃｙｓ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ｇｌｕ　Ｃ ｙｓ　Ｐｈｅ　Ｐｈｅ　Ｐｈｅ　Ｇｌｕｌｏｏ　１ｌ１ ０Ａｒ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ａｓｎ　Ａｓｎ　Ｔｙｒ　入ｓｎ　Ｔｈｒ　 Ｔｙｒ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　入ｒｇ　Ｌｙｓ　Ｔｙｒ　’Ｉ’■■ ｚＯ ５ｅｒ　Ｔｒｐ　Ｔｙｒ　Ｖａｌ　入１ａ　Ｌａｕ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ｔｈｒ　 Ｇｌｙ　Ｇｌｎ　Ｔｙｒ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　５ｅｒＬｙｓ　Ｔｈｒ　Ｇ ｌｙ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｇｌｎ　Ｌｙｓ　入１ａ　Ｉｌｅ　Ｌａｕ　Ｐｈｅ　Ｌ ｅｕ　Ｐｒｏ　Ｍｅｔ　Ｓｅｒ　ＡｌａＬｙｓ　Ｓｅｒ この配列は、以下の１１個のアミノ酸配列：ｉ　）　Ｇ　ｌ　ｙ−Ｔｈ　ｒ−Ｍ ｅ　ｔ−Ａ　Ｉ　ａ−Ａ　ｌ　ａ−Ｇ　１　ｙ　−３ｅ　ｒ−１１ｅ−Ｔｈｒ− Ｔｈｒ−Ｌｅｕ、例えば特に以下の９個のアミノ酸： ｉ　ｉ）Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｉ　１ｅ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ −Ｌｅｕ 又は以下の８個のアミノ酸： ｉ　ｉ　１）Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｉ　ｌｅ　−Ｔ　ｈ　ｒ　−Ｔ 　ｈ　ｒ　−Ｌ　ｅ　ｕ又は以下の７個のアミノ１１２： １ｖ）Ａｌａ−Ｇｌｙ−３ｅｒ−Ｉ　１ｅ−Ｔｈｒ−ＴｈｒＬｅｕ の全てを又はその一部分を含むＮ末端伸張部分を有し得る。

１４６個のアミノ酸長さの分子というより短い形態も単離した。これらは１個以 上のアミノ酸残基の欠如したＮ末端欠失ｂＦＧＦである。

匹敵し得る生物活性を有するヒトｂＦＧＦの類似体も本発明のヒトｂＦＧＦの定 義に含まれる。

類似体は前述した形態から得られるムティンにより示され得る。この類似体は、 そのアミノ酸配列が、アミノ酸の置換、欠失、逆位及び／又は付加によって天然 の配列とは異なっていることを特徴とする。塩基性ＦＧＦ類似体の例はヨーロッ パ特許出願公開第３６３６７５号に記載されている。

前述したあらゆる異なる形態のヒトｂＦＧＦ及びその類似体をそのＣ末端でアミ ド化してもよい。更には２種以上の異なる形態のヒトｂＦＧＦの混合物を天然分 子の機能等漬物と考える。

特に例えば、天然の１４６個のアミノ酸長さの分子に対してそれぞれ７個及び８ 個のアミノ酸残基からなるＮ末端伸張部分を有する２種の異なる形態の混合物を 本明細書で考察する。

本明細書ではこの混合物を内部コードＦＣＦ２６１８４で示す。このコードは１ ５３−１５４個のアミノ酸からなるヒトｂＦＧＦを、正確には、ａ）ヒトｂＦＧ Ｆについて先に示した１４６個のアミノ酸配列と、８ページの項ｉｖ）に示すよ うな７個のアミノ酸のＮ末端伸張部分とからなる１５３個のアミノ酸分子と、ｂ ）ヒトｂＦＧＦについて先に示した１４６個のアミノ酸配列と、８ページの項１ ｉｉ）に示すような８個のアミノ酸のＮ末端伸張部分とからなる１５４個のアミ ノ酸分子との約５０　：　５０の混合物を示し従って、本特許出願明細書で使用 する“ヒト塩基性線維芽細胞成長因子”という用語は、天然タンパク質並びに前 述した類似体及び混合物を包含している。

天然ヒト塩基性ＦＧＦは、４個のシスティン残基を含んでいるが、ジスルフィド 結合があるにせよ、その数は知られていない。

組換えＤＮＡ技術によるｂＦＧＦの製造中に、高濃度のｂＦＧＦを含む大腸菌抽 出物中で不均質な配座が認められた。

細菌中で生成したシスティン含有タンノ〈り質がしばしくｆ不正確な分子内ジス ルフィド結合を形成し、このジスｌレフイド結合が生物学的機能を阻害し得るこ とは知られてνＡる（Ｈａｎｇ等による°’ｈｕｍａｎ　１ｎｔｅｒｌｅｕｋｉ ｎ−２”（Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８４）２２４゜１４３１−１４３３）及びＭａ ｒｋ等による“ｈｕｍａｎ　ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ”（Ｐ ｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ（１９８４）８１　。

５６６２−５６６６＞を参照されたい）。

天然ｂＦＧＦタンパク質中に存在する１個以上のシスティン残基を修飾すると、 不正確なジスルフィド架橋の形成が最小限に抑えられ、ｂＦＧＦタンＲり質を安 定化させるための還元剤を使用する必要がなくなり、従ってマｌレチマー化（ｍ ｕｌｔｉｓｅｒｉｚａｔｉｏｎ　）又は不正確なジスルフィド結合が低減し得る 。それにより、組換えにより製造された類似体の回収率が増し、ｂＦＧＦを始終 モノマー形態で維持することによりｂＦＧＦ製造の均一性が増し、その保存性力 く改善され、また傷に施用するとその半減期が延長される。

ごく最近の研究では、５ｅｎｏ等［Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ。

在する４個のシスティンの各々を個々にセリンに変え、このようにして、６９位 及び８７位のシスティン残基をセリンで置換すると、ヘパリン親和性カラム又は 逆相ＨＰＬＣから溶離したｂＦＧＦの幾つかのピークとして認知された不均質性 が低減することが判明した。これらの位置でのシスティンが分子（ｂＦＧＦ）面 にさらされて、分子間又は分子内ジスルフィド結合を形成し、この結合が不均質 配座を減少させることをこれらのデータは示唆している。

５ｅｎｏ等は更に、セリン６９．８７の類似体が天然配列のｂＦＧＦの場合と比 較して、生物活性が何等増していないと報告している。

更には、Ｆａｘ、Ｇ、Ｍ、等（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　２８３゜１８４ ５２−１８４５８．１９８８〕は、組換えにより製造したヒトｂＦＧＦの２５位 及び９２位のシスティンが恐らく分子内ジスルフィド結合により結合されると示 唆している。

ごく最近、国際特許出願公開ＰＣＴ　ＷＯ２０／１３３１０号は、ｂＦＧＦ分子 内に含まれる少なくとも１個のシスティンとＳ−８結合を形成し得る添加剤での システイン残基のチオール化によるｂＦＧＦの安定化に関するデータを提示した 。

グルタチオンジスルフィドを保護剤として使用して得られた結果によると、誘導 化ｂＦＧＦは短期間（５日）インキュベーションアッセイでは安定性が高まり、 耐マルチマー化性が増した。

本発明者等はとりわけＰＣＴ　Ｗ○９０／１３３１０号に記載されている同一の 誘導化生成物を合成、単離して、これらの生成物の安定性を長期１ｆｌ（２５日 ）インキュベーションアッセイで試験した。

室温貯蔵の後に又はアルカリ性ｐＨでのインキュベーションの後に、ＰＣＴ　Ｗ ０９０／１３３１０号のＳ−チオール化ｂＦＧＦは更に分子（ｂＦＧＦ＞の修飾 を受け得ることが判明した。恐らく、システィン９６位とシスティン１０１位と の間で少なくとも１つの分子内Ｓ−８結合が生じる分子種混合物を形成するジス ルフィド架橋が再度混ぜられる（　ｒｅｓｈｕｆ　ｆ　ｌ　ｉｎｇ　＞ためであ る。

ＰＣＴ　Ｗ○９０／１３３１０号に開示されているシスティン誘導化化合物につ いても同様の結果が得られた。

本発明者等は、組換えにより製造したヒトｂＦＧＦをこのように不可逆的及び化 学的に誘導化して、ダイマー生成による凝集のない誘導化分子を得ることに成功 した。この誘導化分子は回収がより簡単になるだけでなく、長期間インキュベー ションアッセイでもより安定し、更には中でも予期に反して対応する未修飾タン パク質より遥かに活性があることが判明した。

本発明の目的は、４個のシスティンアミノ酸残基の少なくとも１つを、システィ ン残基と直接Ｓ−Ｃ結合を形成し得る誘導化剤で誘導化して得られる、組換えヒ ト塩基性繊維芽細胞成長因子又は機能的に同等なその類似体を提供することであ る。

特に本発明の目的は、天然ヒト塩基性繊維芽細胞成長因子の１４６個のアミノ酸 形態の６９位及び８７位に存在するシスティンに相当する２つのシスティンを、 システィン残基と直接Ｓ−〇結合を形成し得る誘導化剤で誘導化して得られる、 組換えヒト塩基性繊維芽細胞成長因子又は機能的に同等なその類似体を提供する ことである。

中でも特に、本発明の目的は、ヒトｂＦＧＦの６９位及び８７位に存在するシス ティンに相当する２つのシスティンを、例えば（−ＣＨ，Ｃ００）！＞、（−Ｃ Ｈ（ＣＯＯＨ）（Ｃ）（２）。Ｃ００Ｈ）、（−ＣＨ２ＣＯＮＲ３Ｒ，）、（Ｒ ５）、（−（ＣＨ２）。５ｏ−ａ）、（−ＣＨＣＨ２ＣＯＮＲ，ＣＯ）、（−（ ＣＨ２）、ＮＲ１Ｒ２）及び （−ＣＨ２０ＣＯＣＨ，Ｒ，）（式中、Ｒ１及びＲ１はそれぞれＨｌ（−（ＣＨ ２）、Ｃ００Ｈ）、［：ＣＨ（ＣＯＯＨ）（ＣＨ２）、Ｃ０ＯＨ：］又はＣｌＣ ｓアルキ７Ｌ／テあり、Ｒ１はＣＩ−〇、アルキル又はＣ１Ｃ４アルコキシメチ ルであり、ｎはゼロ又は１〜４の整数であり、ｍは２〜４の整数であり、Ｘは１ 〜３の整数である）からなる群の中から選択したＷ換基で誘導化して得られる、 誘導化組換えヒトｂＦＧＦ又は機能的に同等なその類似体を提供することである 。

本発明により得られる誘導化ｂＦＧＦを、有機化学で通常使用されている手順に 基づく公知の方法で、未誘導化ｂＦＧＦ分子念、例えば前述したものの中から選 択した所望の誘導化部分を有する適切な試薬と反応させて製造してもよい。

従って、組換えヒトｂＦＧＦを水又はＥＤＴＡ含有ｙｌ衝水溶液に溶解し、この 溶液のｐＨを例えば約８．０の値に調整し、ｐＨ調整溶液を所望の誘導化剤で処 理し、得られた混合物をモノＳカラム上に充填してこの混合物から過剰誘導化剤 を除去し、カラムを緩衝液で十分洗浄し、誘導化ヒトｂＦＧＦを直線濃度勾配を もつ塩化ナトリウムで溶離し、それを５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−２５カラムに通し て誘導化ヒトｂＦＧＦを脱塩することからなる方法により、例えば本発明の誘導 化組換えヒトｂＦＧＦを製造し得る。

使用する誘導化剤は、所望される誘導化の種類に応じて選択する。

従って、システィン残基の一５Ｈ基を−Ｓ−ＣＨ２−Ｃ０ＯＨ基に誘導化した誘 導化ｂＦＧＦを得るには、例えばハロ酢酸、特にヨード酢酸又はこれらの塩（例 えばアルカリ金属塩、特にこれらのナトリウム塩）の中から誘導化剤を選択する 。

システィン残基の−ＳＨ基を＝Ｓ　Ｃ８２ＣＯＮＨ２に変えた誘導化ｂＰＧＦを 得ることが所望されるときには、該当するハロアセトアミドを誘導化剤として使 用してもよい。

当業者には公知の如く、アルカリ金属テトラチオネート、Ｃ，−Ｃ４アルキルメ タンチオスルホネート又はＣＩＣＭアルキルスルホンは、とりわけ先に記載した ものの中から他の誘導化ｂＦＧＦを製造するのに役立つ誘導化剤であり得る。

本発明で特に好ましい誘導化ｂＦＧＦは、システィン６９位及び８７位（７）− ３Ｈ基を−５−ＣＨ，−ＣＯＯＨ基に誘導化するヒトｂＦＧＦである。

ヒトｂＦＧＦが１４６個のアミノ酸長さの形態の分子のときには、誘導化化合物 を以ｒ＆ｃＭ−ｂＦＧＦ（カルボキシメチル化ｂＦＧＦを意味する）と称する。

本発明の他の好ましい誘導化ｂＦＧＦは、システィン６９位及び８７位の−ＳＨ 基を−３−ＣＨ２−ＣＯＮＨ２に誘導化するヒトｂＦＧＦである。ヒトｂＦＧＦ が同様に１４６個のアミノ酸長さの形態の分子のときには、誘導化化合物を以後 ＣＡＭ−ｂＦＧＦ　（カルボキシアミドメチル化ｂＦＧＦを意味する）と称する 。

本発明の誘導体用ＦＧＦ出発化合物は一般に、前記国際特許出願公開ＰＣＴ　Ｗ Ｏ３７１０１７２８号又はヨーロッパ特許出願第３６３６７５号に記載の如きよ く知られた手順からなる組替えＤＮＡ技術により得られる。

有利には、本発明の誘導化ヒトｂＦＧＦは、天然ｂＦＧＦと同一の適用分野で、 例えば虚血性組織の血管の再形成、損傷を受けた神経組織の再生、傷、潰瘍及び 熱傷の治癒で、又は例えば移植中の他の治療養生法への補佐剤として有用である 。

本発明の誘導化ヒトｂＦＧＦは、１種以上の異なる形態の誘導化ｂＦＧＦと１種 以上の医薬として許容し得る賦形剤とからなる医薬組成物の形態で投与し得る。

実際にはこれらの組成物を、リン酸塩緩衝液の非経口注射により又はゲル、ペー スト、ミクロ粒子等の特効性組成物として投与してもよい。

誘導化ヒトｂＦＧＦの医薬組成物は、リン酸塩Ｍ衝液として投与するときには、 医薬として許容し得る賦形剤、例えば担体及び／又は希釈剤を含み得る。

誘導化ヒトｂＦＧＦをそのまま、又は医薬として許容し得る無機酸（例えば塩酸 、臭化水素酸、硫酸及びリン酸）若しくは医薬として許容し得る有機酸く例えば 酢酸、マレイン酸、リンゴ酸、クエン酸、琥珀酸及び酒石酸）の医薬として許容 し得る塩として投与してもよい０本発明の医薬組成物を従来の方法に基づく公知 の技術で製造することができる。

本発明を以下の実施例により更に詳しく説明する。

諷Ｗ ＦＣＥ２６１８４の調製 ｂＦＧＦの合成りＮＡ配列及びかかる配列を担う発現プラスミドを、欧州特許第 ３６３６７５号に記載の方法に従って構築した。発酵及び精製プロセスは以下の ように実施した。

（ａ）光ｌし乙ココＬ冬 ｔｈｅ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　Ｐａ５ｔｅｕｒ　ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから得た 細菌株Ｂ型Ｅ、ｃｏｌｉを、ｂＦＧＦをコードするヒト遺伝子及びテトラシフリ ン耐性に対する遺伝子の両方を担うプラスミドを用いて形質転換した。

この形質転換株を使用して組換え非グリコジル化ｈ−ｂＦＧＦ（ヒトｂＦＧＦ） を生産した。この株のマスターセルバンク（Ｍａｓｔｅｒ　Ｃｅ　ｌ　Ｉ　Ｂａ ｎｋ）（Ｗ、Ｃ，Ｂ。

）（−１９０℃の液体窒素中に保管された７９個のバイアル）を調製した。Ｗ、 Ｃ，Ｂ、の１つのバイアルの内容物を発酵段階の植え込み細胞（ｉ　ｎｏｃｕ　 ｌｕｍ）として使用した。

１０１の発酵器中に４ｐの培地を満たして発酵プロセスを実施した。

株選択条件を維持するために、培地にテトラサイクリンヒドロクロリドを加えた 。

３７°Ｃで２０時開場殖させると、最終バイオマスは４２±２　ｇ／ｌ乾燥重量 であり、ｂＦＧＦの産生は、競合ゲル電気泳動によって測定すると２５００±５ ００ｍｇ／ｌであった。

細菌を大きく増殖させるために、発酵段階の間に純粋酸素リッチであることが必 要であった。

（ｂ）拡ｍ 細胞（微生物）を遠心分離によって全発酵ブロスから分離した。得られたベレッ トを、塩化ナトリウムを含むリン酸ナトリウム緩衝液中に再懸濁させた。細胞を 効率的に破壊するために、高圧ホモジナイザーに最低３回通すことが必要であっ た。得られた細胞溶解物を遠心分離によって清澄化し、更に処理するために上清 を回収した。

（Ｃ）ｕ 清澄化した上清を５ｅｐｈａｒｏｓｅ　（商標）Ｓ　ＦａｓｔＦｌｏｗ（カチオ ン交換体）のカラムに入れ、リン酸Ｍ衝液（商標）中の塩化ナトリウム増加濃度 勾配を使用して上記カラムから生成物を溶出させた。Ｈｅｐａｒｉｎ５ｅｐｈａ ｒｏｓｅ　６Ｂのカラムでリン酸ｍｔｉ液中の塩化ナトリウム増加濃度勾配を用 いて溶出することにより、生成物を更に精製した。最後に、５ｅｐｈａｄｅｘ　 （商標）Ｇ２５樹脂上で緩衝液交換を行って、大量の生成物緩衝液くリン酸ナト リウム−ＥＤＴＡ）中に生成物を得た。

５ｅｐｈａｒｏｓｅ　Ｓ　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗカラム及び５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ ２５カラムを、水酸化ナトリウム溶液で洗浄することにより清浄化した。

Ｈｅｐａｒｉｎ　５ｅｐｈａｒｏｓｅは、３Ｍ塩化ナトリウムを含むｐＨ＝８． ５及びｐＨ５，５いずれ牟の溶液を用いて洗浄した。

ｍユ １４６個のアミノ酸の形態のヒトｂＦＧＦの調製天然ヒトｂＦＧＦ　（１４６個 のアミノｗｉ）に対応する組換え生産タンパク質は、例えば国際特許出願公開第 ＷＯ３７１０１７２８号に記載の方法に従って得ることができる。

火見■ユ ヒト　ルボ　シメ　ル　ｂＦＧＦ　ＣＭ−ＦＧＦ）の：　１１、１０　ｍ　ｌの ２５ｍＭリン酸ＭＨ液ｐＨ８，０／ＳｍＭＥＤＴＡ中に、１００ｍｇの１４６個 の長鎖アミノ酸の形態の組換えヒト塩基性線維芽細胞成長因子（ｒｈｂＦＧＦ） を含む溶液に、同じ緩衝液１１０ｍ１中の４００ｍｇのヨード酢酸を加えた。暗 所において室温で２時間反応させた。

次いで反応混合物を、２５ｍＭリン酸ｗ１衝液ｐ８７．５で平衡化しておいたＭ ｏｎｏＳカラム（ＨＲ１０／１０゜Ｐｈａｒｍａｃ　ｉ　ａ）に直接入れた。過 剰な試薬を除去するために、カラムを平衡化緩衝液でよく洗浄し、２５ｍＭリン 酸緩衝液ｐＨ７，５中の０〜１Ｍ　ＮａＣ１直線濃度勾配を用いて、カルボキシ メチル化ｒｈｂＦＧＦ　（ＣＭ　−ＦＧＦ＞を溶出させた。ＣＭ−ＦＧＦを含む フラクションを、１０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ６，０１０，１ｍＭ　ＥＤＴＡで平 衡化しておいた５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−２５カラム（Ｐｈａｒｍａｃ　ｉ　ａ） 上で脱塩した。

及胤■ユ ヒト　ルボ　ミドメ　ル　ｂＦＧＦ　ＣＡＭ−ＦＧＦＱＪＬ製 １１０ｍ１の２５ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ８，５／ＳｍＭＥＤＴＡ中に、１００ｍ ｇの１４６個の長鎖アミノ酸の形態の組換えヒト塩基性線維芽細胞成長因子（ｒ ｈｂＦＧＦ＞を含む溶液に、同じ緩衝液１１０ｍ１中の４００ｍｇのヨードアセ トアミドを加えた。暗所において室温で３時間反応させた０次いでインキュベー ションの間に形成された微細沈澱物を除去するために反応混合物を遠心分離し、 透明な上清を、２５ｍＭリン酸緩衝１ｐＨ７，５で平衡化しておいたＭｏｎｏＳ カラム（ＨＲ１０／１０．Ｐｈａｒｍａｃ　ｉ　ａ）に直接入れた。過剰な試薬 を除去するために、カラムを平衡化緩衝液でよく洗浄し、２５ｍＭリン酸Ｍ衝液 ｐＨ７，５中の０〜ＬＭ　ＮａＣ１直線濃度勾配を用いて、カルボキシアミドメ チル化ｒｈｂＦＧＦ　（ＣＡＭ−ＦＧＦ）を溶出させた。ＣＡＭ−ＦＧＦを含む フラクションを、１０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ６，０１０，１ｍＭ　ＥＤＴＡで平 衡化しておいた５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−２５カラム（Ｐｈａｒｍａｃ　ｉ　ａ） 上で脱塩した。

叉１■ユ ｒｈｂＦＧＦ’　のＳＩ（ ＣＭ−ＦＧＦ、ＣＡＭ−ＦＧＦ及びｒｈｂＦＧＦに、Ｈａｂｅｅｂ、Ａ、Ｆ、Ｓ 、Ａ、２５　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏ　１．４５７−４６５　＜１９７２ ）に実質的に従つて５，５゛−ジチオビス−（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ ）を使用し、６Ｍグアニジンヒドロクロリド、０．ＩＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ、１． ５ｍＭ　ＥＤＴＡ、ｐＨ８，０中でＳＨ滴定を行った。

ｒｈｂＦＧＦ及びその誘導体の種々の溶液のタンパク質濃度をアミノ酸分析によ って定量した。ＳＨ滴定の結果、全ての誘導体分子において１分子当たりちょう ど２モルの遊離スルフヒドリルが検出され、ｒｈｂＦＧＦにおいては１分子当た り４モルの遊離スルフヒドリルが検出された。

これは、精製ｒｈｂＦＧＦでは４つ全てのスルフヒドリル基が遊離であるが、Ｃ Ｍ−ＦＧＦ及びＣＡＭ−ＦＧＦは２つの遊離スルフヒドリル基と２つの誘導シス ティンとを有することを示している。

見立■Ａ ＣＭ−ＦＧＦのプローアーゼ　びペプ　ドマツプＣＭ−ＦＧＦにおいてとのシス ティンがアルキル化されているか知るために、２種の異なるタンパク質加水分解 処理によって、即ちトリプシン及びＶ８　５ｔａｐｈｉｌ。

Ｃ０ＣＣｕＳ　ａｕｒｅｕｓプロテアーゼを用いてペプチドマツプ作成を試みた 。

比較のために、天然組換えｂＦＧＦ及び全てのシスティンがアルキル化されてい る誘導体であるピリジルエチル化ＣＭ−ＦＧＦ　（ＰＥ−ＣＭ−ＦａＦ＞におい ても、同じ条件下でペプチドマツプ作成を行った。

方法 各消化に対して、２０〜５０μｇの種々のｂＦＧＦ試料（天然または変性体）を 、終容ｆｆ１ｏｏμｌのＭｉ衝液中で使用した。得られたペプチドをＲＰ−ＨＰ ＬＣによって分離し、システィンを含むペプチドをＮ末端配列分析によって同定 した。

トリプシン消化−ｐＨ８の０．１Ｍ重炭酸アンモニウム中で、ｂＦＧＦ試料を、 ＴＰＣＫ処理したトリプシンを酵素対基質比が１　：　５０　（ｗ／ｗ）で用い て３７℃で２４時間消化した。

Ｖ８プロテアーゼ消化−ＰＨ４の５０ｍＭ′＃酸アンモニウム中でＥ　：　Ｓ＝ １　：　２５　（ｗ／ｗ）として、■８プロテアーゼによる消化を３７℃で１６ 〜２４時間実施した。

ＲＰ−ＨＰＬＣ−消化産物に−μＢｏｎｄａｐａｋ　Ｃ１８カラム（Ｗａｔｅｒ ｓ　；　３．９Ｘ３００ｍｍ、ＩＣ１μ）で、流１１　ｍ　ｌ　／分の０．１％ ＴＦＡ中で６０または９０分間にアセトニトリルが５％から６５％に変化する直 線濃度勾配を用いて溶出させる逆相ＨＰＬＣを実施した。ＷａｔｅｒＷｉｓｐ自 動抽出装置によって試料を注入し、更に分析するためにフラクションを手作業で 回収し、２２０ｎｍにおいてモニターした。

Ｎ−末端配列分析−オンラインＨＰＬＣＰＴＨアナライザーモデル１２０Ａ（Ａ ｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を備えた気相シークエンサモデル４７０ Ａまたはパルス液相シークエンサモデル４７７Ａ　（ＡＰｐｌ　ｉ　ｅｄＢｉｏ ｓｙｓｔｅｍｓ）において、自動Ｎ末端配列分析を実施した。

分析には、製造業者によって備えられた標準プログラムを少し変更して使用した 。

結果 ＣＭ−ＦＧＦにおいてどのシスティン残基がアルキル化されているか同定するた めの最初の試みとして、トリプシンマツプ作成を行った。ｂＦＧＦの一次構造及 びトリプシンの特異性に基づくと、３つのシスティン含有ペプチド、即ち２３− ２６　（Ｃｙｓ２５）、６７−７２　（Ｃｙｓ６９）、８７−９７　（Ｃｙｓ８ ７及び９２）が期待された。ＣＭ−ＦＧＦとｂＦＧＦのトリプシンマツプを（区 １）比較すると２つの異なる主要ピークを示し、これらは、アミノ酸配列分析す ると、システィン６９がカルボキシメチル化（ＣＭ　−Ｃｙ　ｓ　）されている ペプチド６７−７２と、ジスルフィド架橋によって結合されておりＣｙｓ８７の みがＰＴＨ−ＣＭ−Ｃｙｓとして同定されたペプチド２Ｂ−２６及び８７−９７ とであった。上記知見は、ＣＭ−ＦＧＦ中に当初存在していた２つの遊離ＳＨ（ 実施例５参照）は、通常はトリプシン消化に対して使用されるアルカリ条件下で ３７℃で長時間インキュベートすると、鎖内のジスルフィド結合を形成し易いこ とを示している。実際、ＣＭ−ＦＧＦを塩基性ｐＨにおいて数時間インキュベー トすると、−３ＨがＤＴＮＢを用いて実質的に滴定されない。

ＣＭ−ＦＧＦにおいてＣｙｓ６９及び８７のみがカルボキシメチル化されている ことを立証するため、天然組換えｂＦＧＦ、ＣＭ−ＦＧＦ及びＰＥ−ＣＭ−ＦＧ Ｆにおける■８プロテアーゼ消化を酸性ｐＨにおいて実施した。後者は、Ｄｕｐ ｏｎｔ、Ｄ、ｅｔ　ａｌ、（Ｄｅｒｉｖａｔｉｚｅｒ−Ａｎａｌｙｚｅｒ　Ｕｓ ｅｒ　ＢｕｌｌｅｔｉｎＮｏ、１．Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｉ ｎｃ、、１９８９）に実質的に従って６ＭグアニジンヒドロクロリドＧｎｄ−Ｍ ＣＩｌｏ、２５Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌを用いて非還元条件下に４−ビニル−ピリ ジンでアルキル化し、次いで安定性実験に対して記載した条件（実施例７参照） に従ってＣ４−ＨＰＬＣ精製するステップの後に得られたものである。

ＣＭ−ＦＧＦ及びＰＥ−ＣＭ−ＦＧＦのＶ８１０テアーゼ消化（図２）によって 、ペプチド６０−７８においてはＣＭ−Ｃｙｓ６９、ペプチド７９−９１におい てはＣＭ−Ｃｙｓ８７、ペプチド９２−９６においてはＰＥ−Ｃｙｓ９２を直接 同定することができたが、Ｃｙｓ２５は、■８ペプチドマツプ作成において期待 されたペプチド５−４５は収量が低いことから、ｂＦＧＦのＰＥ−ＣＭ誘導体の 直接Ｎ末端配列によってピリジルエチル化のみに高感度を示すことが立証された 。

上記結果は、ＣＭ−ＦＧＦにおいてはＣｙｓ６９及び８７が定量的にカルボキシ メチル化されており、一方、ｃｙｓ２５及び９２は還元形態のままであることを 示している。

叉箇１ ２５℃　４℃にお（るＣＭ−ＦＧＦの ２５ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７，５１０，１２５Ｍ　ＮａＣ１１０，１ｍＭ　ＥＤ ＴＡ中に３００Ｍｇ／ｍｌを含む濃度のＣＭ−ＦＧＦ及びｒｈｂＦＧＦ溶液をＭ ｉ　１１　ｉｐ。

ｒｅ無菌Ｍｉ　ｌ　１ｅｘ−０，２２μフイルター装置によってヂ過し、２５℃ 及び４℃でインキュベートした。

１．２及び３週間後に各溶液の幾っがのアリコートをとり、Ｖｙｄａｃ　Ｃ４カ ラム（ＣＴＲ２１４Ｃ４；０゜４６Ｘ２５ｃｍ）を使用し、流量１ｍｌ／分の０ ．１％ＴＦＡ中の１０％から９０％のアセトニトリル直線濃度勾配を用いて溶出 する逆相ＨＰＬＣを実施した。

ＨＰＬＣ分析から得られた溶液中のタンパク質の量を初期の量と比較し、安定性 の変化を記録した。

図３には、ＣＭ−ＦＧＦ及びｂＦＧＦの初期の量に対する割合を、２５℃でイン キュベートした時間に対してプロットしである。

図４には、４℃で３週間インキュベートした場合を同様にプロットしである。

２５℃でインキュベートした結果は、２１日後の溶液中ではｒｈｂＦＧＦの初期 量の５７％しか得られなかったのに対して、同じ時間でＣＭ−ＦＧＦの９８％が 得られたことを示している。４℃で３週間インキュベートした後には、ＣＭ−Ｆ ＧＦ及びｂＦＧＦの回収率はそれぞれ９９％及び８０％であった。

即ち、ｂＦＧＦでは、２つのシスティンのカルボキシメチル化によって、分子中 の２つの最も反応性のスルフヒドリルの変性を主に含む劣化に対するｉｎ　ｖｉ ｔｒｏの安定性が増大した誘導体がもたらされている。

え胤■亙 々の庁のＣＭ−ＦＧＦの３７℃にお本 生理学的条件下での挙動を模擬するために、ＣＭ−ＦＧＦ及びｒｈｂＦＧＦを、 無菌状町の２５ｍＭリン酸Ｍ衝液ｐ８７．５１０．１２５Ｍ　ＮａＣ１１０，１ ｍＭ　ＥＤＴＡ中で３００．１００．５０及び２５　ｔｔ　ｇ　／　ｍ　ｌのタ ンパク質濃度で３７℃においてインキュベートした。１．２及び７日後に、各溶 液のアリコートをとり、前記と同じ条件を使用するＨＰＬＣ分析を実施した１図 ５は、インキュベーション緩衝液中の各タンパク質濃度における、種々の時点で のＣＭ−ＦＧＦ及びｒｈｂＦＧＦの初期量に対する割合を示している。初期タン パク質量と比較した、種々の濃度における７日後のｒｈｂＦＧＦ及びＣＭ−ＦＧ Ｆの実際の量は下記の通りである。

０．３ｍｇ／ｍｌ　０．１ｍｇ／ｍｌ　０．０５ｍｇ／ｍｌ　０．０２５ｍｇ／ ｍ１ｒｈｂＦＧＦＪｌ　６５．３％　４２．０％　４０．１％　５．３％ＣＭ− ＦＧＦＩ　９０．８％　８２．０％　７６．３％　７２．３％初期濃度０．０２ ５ｍｇ／ｍｌにおいて、３７℃で７日間インキュベートした後に溶液中で測定さ れたｒｈｂＦＧＦは初期量全体のたった５％であったが、この時間でＣＭ−ＦＧ Ｆの７２．３％が回収された。更に、ＨＰＬＣによって安定性を評価するのに使 用したｒ　ｈ　ｂ　Ｆ　Ｇ　Ｆ及びＣＭ−ＦＧＦの試料の生物学的活性を、後述 する３Ｔ３細胞におけるｉｎ　ｖｉｔｒｏマイトジェンアッセイに従って評価し た。生物学的活性データは上記表に示した分析データと一致し、ｒｈｂＦＧＦに おいては活性がかなり損失していること及びＣＭ−ＦＧＦにおいては損失ははる かに少ないことが確認された。極めて低い濃度においてさえカルボキシメチル化 ｂＦＧＦの安定性は増大されていることから、新たな製剤及び治療方法と考え得 る。同じくより高い生成物のｉｎ　ｖｉｖｏ生体有用性（ｂｉｏａｖａｉ　１ａ ｂｉ１ｉｔｙ）から、治療時の用量をより少なくすることができ、従って副作用 が低減される。

炙１医ユ ＣＭ−ＦＧＦの　パ ＦＧＦは最初は３Ｔ３！！維芽細胞中のマイトジェンとして記載され、次いで、 内皮細胞を含む他の細胞に対しても強力なマイトジェンであることが認められた 。このことから、ＣＭ−ＦＧＦ及びｒｈｂＦＧＦのマイトジェン活性を比較する ために、それらをＢａ１ｂ／ｃ　３Ｔ３＊維芽細胞及びウシ大動脈内皮細胞中で アッセイした。更に、単離細胞上でのｉｎ　ｖｉｔｒｏ受容体結合競合アッセイ を使用し、親のそのままの組換えｂＦＧＦと比較した場合の変性ｂＦＧＦ分子、 即ちＣＭ−ＦＧＦの親和性を評価した。

ヘパリンに強力に結合するというｂＦＧＦの能力も文献に広く報告されている。

従って本発明者らはこの能力についてＣＭ−ｂＦＧＦとｒｈｂＦＧＦを比較した 。ヘパリンへの結合は、ヘパリンアフィニティーＨＰＬＣ分析を使用して測定し た。

方法 安定性評価のためのＢａ１ｂ／ｃ３Ｔ３細胞におけるマイトジェン分析 Ｂ　ａ　ｌ　ｂ　／　ｃマウス胚由来の細胞系であるＡ３１−１−１細胞を、１ ０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１００単位／ｍｌのペニシリン及び１００μｇ　 ／　ｍ　ｌのストレプトマイシンを補充したイーグル最小必須培地（ＭＥＭ）中 で増殖させた。

細胞ＤＮＡ内への３Ｈ−チミジンの取込みを測定することにより、マイトジェン 活性を測定した。

アッサイ１日目は、トリプシン処理することにより準集密培養体を解離し、９６ ウエルマイクロタイタープレートにおいて平板培養した（２００μｌ／ウエル中 ｌＸｌ０’細胞）、“播種培地”は、少ない量（３％ｖ　／　ｖ　）のウシ胎児 血清（ＦＢＳ）を含んでいた。培養液を、５％ＣＯ２及び９５％加湿雰囲気中で ３７℃でインキュベートし、２２時間後に、“播種培地”を、０．１％（ｖ／ｖ ）ＦＢＳを含むイーグルＭＥＭからなる“飢餓培地（ｓｔａｒｖａｔｉｏｎ　ｍ ｅｄｉｕｍ）”で置き換え、２２時間の第２周期のインキュベーションを続けた 。その後、細胞をリンｆｌｉｐ＠溶液（ＰＢＳ）で１回洗浄し、次いで、０．１ ％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を補充したＭＥＭからなる新鮮な血清非含有の “照射培地（ｅｘｐｏｓｕｒｅ　ｍｅｄｉ　ｕｍ）”に再度供給し、この中で試 料を試験する濃度に希釈した。

照射を開始してから８時間後、３Ｈ−チミジン（ｓｐ、ａｃ、２０Ｃｉ／ｍｍｏ ｌ　；０．２５μＣｉ／ウエル）を加えることによりＢａ１ｂ／３Ｔ３細胞を標 識し、更に１６時間照射を続行した０次いで培地を取り出し、各ウェル内の細胞 をＣａ”／Ｍｇ”を含まないＰＢＳで２回洗浄した。

次いで０．０２％ＥＤＴＡ及び０．２５％トリプシンを含むＰＢＳ　（１００μ ｌ／ウエル）を加え、プレートを１０分間インキュベートして培養体を完全に解 離した。各ウェル内の細胞を、細胞回収装置を使用してガラスファイバーフィル ター上に回収し、適正な細胞溶解と未結合３Ｈ−チミジンの洗浄除去とを保証す るために、ウェルを蒸留水で１５回洗浄した。空気乾燥したフィルターを、４ｍ ｌの液体シンチレーションカクテルを含むバイアル内に入れた。

フィルター上に保持された放射能をシンチレーションカウンターにおいて測定し た。

各実験条件において６回の反復実験を実施した。

効力評価のためのＢＡＥ細胞における増殖ア・ンセイ細胞を、９６マイクロタイ タープレート内の抗生物質（ペニシリン１００Ｕ／ｍｌ、ストレプトマイシン１ ００μｇ／　ｍ　ｌ　）とＦＢＳ　（１３％ｖ／ｖ　）を補充したダルベ’ｙコ 改良イーグル培地（ＤＭＥＭ）中に２５００細胞／ウエルで入れた。細胞を６時 間性着させた０次いで培地を取り出し、実験培地（０，５％ＦＢＳ、０．１％Ｂ ＳＡを補充したＤＭＥＭ）中に所望の濃度に希釈した試料を細胞に加えた。

培養液を３日間インキュベートし、この時点でそれらを１０％リンａ！ｆｔｉホ ルマリンを用いて固定し、０．５％クリスタルバイオレットを用いて１０分間染 色した。染色後、ウェルを完全に洗浄して取り込まれなかった染料を除去した。

各ウェルにメタノール（９５％ｖ／ｖ；１００μｌ／ウェル）を加え、２０分間 インキュベートして、１ウエル当たりの増殖細胞数に比例する程度に培養体によ って保持されている染料を抽出した。

自動読取りのために、プレートを、５４０ｎｍフィルターを備えた分光光度測定 マイクロプレートリーダーに移した。各実験条件において４回の反復実験を実施 した。

親和性評価のための高アフイニテイ受容体結合アッセイ集密のＢＨＫ細胞を、２ ４ウエルプレート内の抗生物質（ペニシリン１００　Ｕ　／　ｍ　ｌ　、ストレ プトマイシン１００μｓ／ｍｌ）を含む１０％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ中に播 種した。

結合アッセイの前に、細胞を、血清は含まず０．１％ゼラチン及び２０ｍＭ　Ｈ ｅｐｅｓ（結合緩衝液）を含むＤＭＥＭ中で３７℃で２時間インキュベートした 。

１２５ヨウ素標識ｂＦＧＦ　（ｓｐ、ａｃ、１０００Ｃｉ／ｍｍｏ　ｌ　；　２ ０ｎＣｉ／ウェル）及び結合緩衝液で希釈した試験化合物を細胞に同時に加えた 。

４℃で３時間結合させ、次いで細胞をまずＣａ”／Ｍｇ゛°を含まない冷たいＰ ＢＳで２回洗浄し、次いで２Ｍ　ＮａｃｌｐＨ７，５で２回洗浄した。０．５Ｎ 　ＮａＯＨを用いて細胞に結合した放射性物質を回収し、バイアル内に移し、γ 計数管によって測定した。

ヘパリンアフィニティアッセイ ＣＭ−ｂＦＧＦ及びｒｈｂＦＧＦのタンパク質試料を、２５ｍＭリン酸緩衝液Ｐ Ｈ７，５で平衡化しておいた５ｈｏｄｅｘ　ＡＦ　ｐａｋ　ＨＲ−８９４カラム （０，８Ｘ５ｃｍ、昭和電工、東京１日本）中に注入し、流量１ｍ１Ｚ分の同じ 緩衝液中のＮａＣｌ直線濃度勾配（０〜２Ｍ）を用いて溶出した。

各試料のヘパリンに対する親和性は、伝導率によって評価されるように、特定の タンパク質をカラムから溶出するのに必要なＮａＣｌのモル濃度として表わされ る。

結果 ｒｈｂＦＧＦと比較したときのＣＭ−ＦＧＦの１ｎｖｉｔｒｏ生物学的活性を、 ＢＡＥ細胞を用いた増殖アッセイにおいて調査した。図６に示したデータは、こ の１ｎｖｉｔｒｏ系においてＣＭ−ＦＧＦが親のｒｈｂＦＧＦよりも約２５倍強 力であることを示している。

これに反して、ＢＨＫ細胞において実施した受容体結合競合アッセイは、２種の 分子がかかる細胞に結合することにおいて統計上有意な相違を示さなかった（図 ７）。

ヘパリンアフィニティーアッセイからＣＭ−ｂＦＧＦ及びｒｈｂＦＧＦは、いず れも１．１Ｍ　ＮａＣ１において単一ピークとして溶出し、固定ヘパリンに対し て同様の親和性を有することが判った。

ｔｉｍｅ　（ｍｉｎ） Ｆｉｇ、１　−ｂＦａＦ（Ａ）及びＣＭ−ＦＧＦ　（Ｂ）のトリプシンマ・ツブ ｔｉｍｅ　（ｍｉｎ） Ｆｉｇ、２−　ＰＥ−ＦＧＦ　（Ａ）及びＣＭ−ＦＧＦ　（Ｂ）　のＶ８プＯテ ７−セマ−）ｆ２５℃における安定性 ４℃における安定性 最大応答に対する％ Ｅ／ＰＣＩ 要約 ４つのシスティンアミノ酸残基のうち少なくとも１つが誘導されでいる組換えヒ ト塩基性繊維芽細胞成長因子またはその機能的に等価の想縁体を提供する。通常 は、１４６個のアミノ酸形態の天然ヒト塩基性繊維芽細胞成長因子の位置６つ及 び８７に存在するものに対応する２つのシスティンが、例えば−ＣＨ２Ｃ○ＯＨ または−ＣＨ，ＣＯＮＨ２のような基によって誘導されている。このような誘導 組換えヒト塩基性繊維芽細胞成長因子は、創傷、潰瘍もしくは火傷の治癒、損傷 神経組織の再生、組織移植の補助もしくは骨継ぎの治癒、または虚血組織の再血 管形成に使用することができる。

国際調査報告 国際調査報告

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. １．４つのシステインアミノ酸残基のうち少なくとも１つが、システイン残基と 一堵に直接共有Ｓ−Ｃ結合を形成し得る誘導剤を用いて誘導されている、組換え ヒト塩基性線維芽細胞成長因子またはその機能的に等価な類縁体。
2. ２．１４６個のアミノ酸の形態の天然ヒト塩基性線維芽細胞成長因子の位置６９ 及び８７に存在するものに対応する２つのシステインが、システイン残基と一緒 に直接共有Ｓ−Ｃ結合を形成し得る誘導剤を用いて誘導されている、請求項１に 記載の組換えヒト塩基性線維芽細胞成長因子またはその機能的に等価な類縁体。
3. ３．前記システインが、（−ＣＨ２ＣＯＯＨ）；［−ＣＨ（ＣＯＯＨ）（ＣＨ２ ）ｘＣＯＯＨ］；（−ＣＨ２ＣＯＮＲ３Ｒ４）；（Ｒ５）；［−（ＣＨ２）ｎＳ Ｏ−３］；（−ＣＨＣＨ２ＣＯＮＲ３ＣＯ）；［−（ＣＨ２）ｍＮＲ３Ｒ４］ま たは（−ＣＨ２ＯＣＯＣＨ２Ｒ５）〔ここでＲ３及びＲ４は各々が、Ｈ；［−（ ＣＨ２）ｘＣＯＯＨ］；［−ＣＨ（ＣＯＯＨ）（ＣＨ２）ｘＣＯＯＨ］；Ｃ１− Ｃ６アルキルであり、Ｒ５はＣ１−Ｃ６アルキルまたはＣ１−Ｃ４アルコキシメ チルであり、ｎはゼロまたは１〜４の整数であり、ｍは２〜４の整数であり、ｘ は１〜３の整数である〕からなる群から選択される置換基を用いて誘導されてい る請求項１または２に記載の組換えヒト塩基性線維芽細胞成長因子またはその機 能的に等価な類縁体。
4. ４．前記２つのシステインが（−ＣＨ２ＣＯＯＨ）を用いて誘導されている請求 項２に記載の組換えヒト塩基性線維芽細胞成長因子またはその機能的に等価な類 縁体。
5. ５．前記２つのシステインが（−ＣＨ２ＣＯＮＨ２）を用いて誘導されている請 求項２に記載の組換えヒト塩基性線維芽細胞成長因子またはその機能的に等価な 類縁体。
6. ６．誘導ヒト塩基性線維芽細胞成長因子またはその機能的に等価な類縁体を得る 方法であって、前記組換えヒト塩基性線維芽細胞成長因子またはその機能的に等 価の類縁体を、水中またはＥＤＴＡを含む緩衝水溶液中に溶解し、前記溶液のｐ Ｈを約８．０の値に調整し、前記ｐＨ調整溶液を所望の誘導剤を用いて処理し、 得られた混合物から過剰な前記誘導剤を、カチオン交換樹脂を充填したカラムに 前記混合物を入れて更に前記カラムを緩衝溶液でよく洗浄することにより除去し 、塩化ナトリウムの直線濃度勾配を用いて誘導タンパク質を溶出し、誘導タンパ ク質をセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ−２５カラムに通すことにより脱 塩することからなる方法。
7. ７．有効量の請求項１から５のいずれか一項に記載の誘導組換えヒト塩基性線維 芽細胞成長因子またはその機能的に等価の類縁体と、医薬的に容認可能な賦形剤 とを含む医薬組成物。
8. ８．創傷治癒を促進するため、虚血組織を再血管形成するためまたは損傷神経組 織を再生するために有利に使用し得る薬剤の調製に使用するための請求項１から ５のいずれか一項に記載の誘導組換えヒト塩基性線維芽細胞成長因子またはその 機能的に等価の類縁体。
9. ９．創傷、潰瘍もしくは火傷の治癒、損傷神経組織の再生、組織移植の補助もし くは骨継ぎの治癒、または虚血組織の再血管形成に使用するための請求項１から ５のいずれか一項に記載の誘導組換えヒト塩基性線維芽細胞成長因子またはその 機能的に等価の類縁体。