JPH05504147A - 複数のポリペプチドの同時合成方法及び装置 - Google Patents
複数のポリペプチドの同時合成方法及び装置Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
複数のポリペプチドの同時合成方法及び装置レセプター結合性試験による生物学
的活性ペプチドの構造/活性因子の緊急の評価あるいはペプチドおよび蛋白質の
免疫学上のエピトープの緊急の決定においては、比較的少量(20■未満)の複
数のペプチドを必要とする。これらのペプチドは固相ペプチド合成により調製す
るのが好都合である。この合成は、R,B。
メリフィールドによって開発された方法〔ニューヨークのGross、Meie
nhofer Acad−emic press社によって発行されたG、 B
arany、 R,B、 Merrif 1eld、 The Peput 1
desA An−
alysis、 5ynthesis、 Biology、 Vol、2.3−
284 (1980) ’Jに基づいており、ペプチド鎖を1つ1つ合成してい
る。その合成工程は次のように要約し得る:a) ペプチド鎖の第1アミノ酸を
アンカー基を介して高分子担体に結合させる、
b) ペプチド鎖の残りのアミノ酸について1つ1つ縮合させる、C) 洗浄、
保護基の開裂および中和からなる個々の縮合間の中間工程、d) 必要に応じて
、末端アミノ基をアシル化する、e) ペプチドを担体から開裂させる。
このペプチド合成においては、アミノ酸当たり18時間までの通常4時間までの
時間を合成に掛けねばならない。(個々の縮合は1〜2時間の反応時間を通常要
し:各線合間においては、約lOの中間工程を一般に必要とし、各中間工程は約
2〜15分を要するであろう)。従って、多数のアミノ酸からなるペプチドの調
製は極めて面倒で労力を要し費用高である。
同族ペプチドの固相合成法は、R,A、ハーウテンにより開示されている(P−
roc、 Najl、 Acad、 Sci、、 USA、 Vol、82.5
131−5135.1985年8月、 Tanunolog凵j。
この方法によれば、合成用の高分子担体を多孔質ポリプロピレンzjv<コグに
50〜]、 00■のバッチで詰め込み、各バッグを溶融密封し、合成に共通す
る中間工程(洗浄、中和、保護基の開裂)は全てのバッグについて1つの反応容
器内で同時に行い、個々の縮合は別個に行う。この方法はペプチド シンセサイ
ザーを用いて手動または部分自動化によって行い得る。
上述の方法の欠点は、バッグの取扱がむしろ煩わしく、バッグを再使用できず、
各バッグを異なるペプチドの縮合においては互いに分離しなければならず、さら
に、対照サンプルを合成全体に亘って採取できないことである。
ドイツ特許用!Ji’NO,P 3828576、2号およびG、 Schno
rrenbergとH,Gerhardtとによる刊行物、Tetrahedr
on Vol、45. No、24.7759−7764.1989は、多数の
ポリペプチドを自動的に同時に合成せしめる方法と装置を記載しており、上述の
欠点を回避している。上述の固相合成法を改変して適当に改造したピペッティン
グロボットの助けによって実施することができるようにしている。従来、ピペッ
ティングロボットは連続分析に用いられている。例えば、テカン(TECAN)
社製のピペッティングロボット、R8P5052を用いることができる。ピペッ
ティングロボットは以下の外部コンポーネントを有する 計量ピペットを有する
少な(とも1個のアーム、貯蔵容器を有するクランプ、および96個以下のウェ
ルを含むマイクロタイター プレート。ロボットアームは試剤を貯蔵容器から運
び、試剤をマイクロタイター プレートの個々のウェルに入れ、必要に応じて、
ウェルから液体を吸引する。計量ピペットのカニユーレは頂部から底部までの仕
切壁により2つの部分に分割するように構築し得る。(この仕切カニユーレによ
り、1個のアームで、2つの異なる計量量を供給するかあるいは1つの量を供給
し1つの量を吸い出すことができる)。この装置の作業パターンはコンピュータ
ープコグラムにより制御し得る。上述のドイツ特許出願NO,P 382857
6、2号によれば、この種のピペッティングロボット内での固相ペプチド合成は
次のようにして行う:担体材料(好ましくは、粒状化担体材料)をマイクロタイ
ター プレートの各ウェル内に入れる。担体材料は初期量の所定ペプチドと一緒
に装填し得る。反応と洗浄工程で必要な液体を装置の貯蔵容器内に準備のために
保つ。合成終了時にペプチドを担体から分離させる場合および/または遊離のア
ミノ酸をアシル化する場合には、これらの反応に必要な試剤も貯蔵容器内に準備
のために保つ。所要反応時間は、96個以下のウェルを含むマイクロタイター
プレートを使用することが推奨され得ることを示唆している。従って、最高96
種のポリペプチドを1つのプログラム操作によって合成し得る。これらのペプチ
ドの合成に適合するようにしたプログラムによれば、ピペッティングロボットに
より、個々のウェル内に試剤と洗浄液を導入し、所定の滞留時間後に、担体から
上清液を吸い出す。
この方法およびこの方法への装置の必要な適合化は、Messrs TECAN
社製の2本アーム型ピペッティングロボット R8P 5052に関連してより
詳細に説明されている。しかしながら、この方法の応用はこの装置に限定されて
いない。異なる構築のピペッティングロボット、特に、1本または多数本アーム
型も本発明の方法に適合し得る。96ウエルを有するマイクロタイター プレー
トを使用する。1つのウェルは、例えば、アミノ酸を一緒に装填し得るlO■の
樹脂を含有し、また300μm以上の液体を保持するであろう。この樹脂量は約
5μモルのアミノ酸に相当するかまたは約5μモルのペプチドの調製に適する。
ポリスチレンまたはポリアクリルアミド系の通常の担体材料を使用し得る。20
個以下のアミノ酸を含有するペプチドを合成するのが好ましい。これに必要な試
剤溶液と洗浄液はこの目的のために備えた貯蔵容器内で調製する。装置のアーム
lに、計量ピペ・ソトと、すすぎ装置を有する吸引チャンネルを有するアーム2
とを備え付ける。このすすぎ装置は好ましくは使用する溶媒用に別個に設置する
貯蔵容器に連結する。
合成は付属PCのプログラムに従って行う。アームlは開放貯蔵容器から採取す
るすべての試剤溶液を計量する。計量ピペットが1つの試剤溶液から次の試剤溶
液に変わる前に、計量ピペットを溶媒で特定のすすぎ位置内ですすぐ。アーム2
はフィルターをはめたカニユーレを通して試剤と洗浄液を吸い上げる。樹脂の損
失と隣接ウェルの汚染を防止するために、このカニユーレの外側を、各吸引工程
後に、この外面に取り付けたラインによって溶媒ですすぐ。次の洗浄工程はこの
溶媒により同時に開始させる。次いで、カニユーレをカニユーレすすぎ位置です
すぐ。ペプチドを樹脂から分離するためには、例えば、トリフルオロ酢酸をアー
ム1から各ウェル中に導入する。開裂させた後、溶液を吸引カニユーレで吸い上
げて第2のマイクロタイター プレートに移し、次いで、そこから溶液を仕上処
理する。
上記の装置は複数のポリペプチドの自動同時合成を行うのを可能にする。しかし
ながら、1つの満足できない点は液体を完全に吸い上げることができなLAこと
および試剤と洗浄液を吸い上げるのに比較的長時間を要することである。本発明
はこれらの欠点を克服する。さらにまた、25μモルまでのペプチドを反応容器
を変えることなしに合成し得る。
本発明は、複数の反応容器とこれらの反応容器用の保持装置とを含み、これらの
反応容器は頂部と底部で開放されており、個々の反応容器の底部開口はフィルタ
ーでカバーされており、保持装置は、内部ガス供給ラインおよび吸引装置用の潜
在的連結部、および各反応容器の頂部開ロカ恰成工程において必要とする液体の
添加に対して上から受入れ可能でありかつ各反応容器の底部開口が保持装置の内
部と連結するような方法で各反応容器を固定する開口とを有する密閉可能な容器
であることを特徴とする固相合成法による複数のポリペプチドの同時合成用の装
置に関する。
本装置は、例えば、上述したピペッティングロボットと一緒に操作し得る。
本発明は、さらに、上記の装置を用いての固相合成法による複数のポリペプチド
の同時合成方法にも関し、この方法は、高分子担体材料または第1のアミノ酸ま
たはペプチドを装填した高分子担体材料を各反応容器に入れ、次いで、ペプチド
を各反応容器内でそれ自体は公知である固相合成法によって合成し、必要に応じ
て、ペプチドの遊離のアミノ基および/またはヒドロキシ基をアシル化するかお
よび/またはペプチドをその後その担体材料から分離し、個々の工程で必要とす
る試剤と洗浄液をカニユーレを有する1本以上のロポ・ソトアームにより相応す
る貯蔵容器から各反応容器に導入し、試剤と洗浄液の所定の滞留時間後に、フィ
ルター上の各反応容器内に含有させた液体を保持装置を通して同時に吸い出し、
プロセスの個々の段階を上記ロボットに接続したコンピューターのプログラムに
よって制御することを特徴とする。好ましい実施態様においては、液体を吸0出
す局面を除いては不活性ガスを合成工程全体に亘って保持装置に、<イブ注入し
、この不活性ガスを液体が反応容器内のフィルターを通して浸出するのを防止す
るような低圧力下に保つ。
上記装置の好ましい実施態様においては、保持装置はプレート状カッく−を有す
るタブ型容器からなり、このカバーは複数の開口を有し、各開口が反応容器を保
持する。
保持装置と各反応容器はガラス、金属(好ましくは、ステンレススチール)、ポ
リプロピレン、テフロンまたはポリアミド66、またはこれらの組み合わせから
有利に製造する。
保持装置と各反応容器は互いに適合して各反応容器が保持装置内にしっかりと合
うようにすべきである。このことは、例えば、各反応容器を保持装置中にねじ込
むかまたははめ込むことによって達成し得る。装置の好ましい実施態様において
は、保持装置のカバーは適当な円錐状開口を有し、好ましくは、テフロンまたは
ポリアミド66から製造する。各反応容器は円筒状ガラス容器であり、保持装置
内に挿入させたすりガラス部分を底部に有する。反応容器の底部開口を覆うフィ
ルターはフリットガラスフィルターまたはフリットテフロンフィルターである。
(有利なのはフリットテフロンフィルターをはめ込むかまたは押し込む底部内孔
を有する反応容器を用いることである。合成サイクル終了後、これらのフリット
フィルターは新しいものと交換し得る。)本発明による装置を前述のピペッティ
ングロボットと一緒に操作するときには、48個以下の反応容器を有する装置を
構築することを推奨する。
しかしながら、本発明方法の応用はこの装置に限定されない。異なる構造のピペ
ッティングロボット、特に1本アーム型または多数本アーム型のロボットも本発
明の方法に適応し得る。
本発明方法を実施するためには、例えば、10〜50■の樹脂を各反応容器に入
れる。この樹脂量は約5〜25μモルのアミノ酸に相当するかまたは約5〜25
μモルのペプチドを調製するのに適する。ポリスチレンまたはポリアクリルアミ
ド系の通常の担体材料を使用し得る。30個以下のアミノ酸を含有するペプチド
を合成することが推奨される。これに必要な試剤溶液と洗浄液はこの目的のため
に設けた貯蔵容器内で調製する。ピペッティングロボットのアームは計量ピペッ
トと適合させる。合成は接続PCのプログラムに従って行う。この方法で、試剤
溶液すべてを、テフロン仕切りで密閉した貯蔵容器から取り出して計量する。
計量ピペットが1つの試剤溶液から次の試剤溶液に変わる前に、計量ピペットを
特定のすすぎ位置で溶媒ですすぐ。必要な洗浄液は同様にして導入する。所望ペ
プチドの担体材料からのトリフルオロ酢酸を用いての取り出しは自動的にまたは
手動的に同様にして行い得る。
特定の反応または洗浄工程における反応容器からのすべての液体吸い出しは、保
持装置に取り付けた吸引装置(例えば、水噴射ポンプまたは膜ポンプ)により全
反応容器内で同時に行う。
一般的には、DMFまたはN−メチルピロリドンを溶媒として用いる。従って、
各反応容器と備え付けたすべての洗浄装置は、耐溶媒性の材料、例えば、ガラス
、テフロンまたはポリエチレンから製造しなければならない。標準の市販装置に
おいては、計量ピペットはステンレススチール製である。この材料は本発明の方
法においても適し得る。
本発明方法は、例えば、次の方法によって実施する(ウェル当たりの量)二出発
物質はFmoc−アミノ酸を装填した樹脂(粒度200〜400メツシユ)であ
り:Fmoc−保護アミノ酸は各個々のカップリング工程において10倍までの
過剰で用いる、即ち、50μモルのFmoc−アミノ酸と50μモルの1−ヒド
ロキシベンゾトリアゾールのDMF溶液200μlと75μモルのN、 N−ジ
シクロへキシル−カルボジイミドのDMF溶液100μlを加え:カップリング
時間は約1時間である。Fmoc保護基をDMF中ピ中ピンリジン40%溶液3
00μl裂させる。
開裂時間は約20分である。洗浄工程は各々300μlのDMFで行う。
遊離基(NH,、OH)のアシル化は、適当な酸無水物、例えば、無水酢酸とピ
リジンとを加えることによって同様にして行い得る。これらの反応を終えた後、
溶液を吸引濾過し処理用に採取する。
最終ペプチドはトリフルオロ酢酸の手動での添加により各反応容器内で担体から
分離し得る(20分の反応時間)。各ペプチドは別々に単離する。上記の説明か
ら明白であるように、ペプチド合成のすべての工程を開放容器で行う。本発明に
よる合成方法は、それにもかかわらず、ペプチドが極めて高純度で生成する。
図1〜3は本発明の装置の1例を図式的に示す。
図1はタブ(2)とカバー(1)からなる保持装置を示す。タブ(1)はカバー
(2)により、好ましくはタブのフランジをカバーにネジ付けするネジ蓋により
強固に密閉し得る。カバー(1)は表面全体に亘って等間隔で配列させた開口(
3)を有する。(図は幾つかの開口のみを示している)。反応容器(4)をこれ
らの開口に挿入する。本発明の方法をカバーの開口よりも少ない数の反応容器で
実施する場合、使用しない開口はすりガラスストッパーにより密閉する。
2個の連結部(5)と(6)をタブ(2)の壁に設ける。連結部(5)は吸引装
置に接続し、連結部(6)は不活性ガスの供給用として働く。
図2は保持装置の好ましい実施態様の断面を示す。この装置は、連結部(5)の
丁度真下に、タブ(2)内に第2の基部のように取付けたガイドIくン(7)を
含む。このガイドパンは連結部(5)に向かって僅かに傾斜するように配置させ
て吸い出した液体すべてを完全に排出させるようにする。
図3は反応容器の概略図を示す。容器の上部は円筒状である。容器の下部(よ先
細りし、すりガラス部分(9)にしっかりと連結されている。反応容器の底部間
Diマフリントガラスまたはフリットテフロンフィルター(8)により力l\−
されている。
この実施態様においては、タブ(2)は金属(好ましくは、V2aスチール)か
ら作られ、カバー(1)はテフロンまたはポリアミド66から作られ、反応容器
(4)はガラスから作られている。開口(3)は円錐状であり、反応容器のすり
ガラス部分(9)の正確な大きさに相応する。フィルター(S)+tフIノット
ガラスフィルターG2またはG3、あるいはG、 T、ベーカー ケミカ1ツエ
ン社(DE−6080、Groβ−Gerau)により注文番号7329103
として製造されたフリットテフロンフィルターである。本発明の装置をテカン社
(二より製造されたピペッティングロボット、RPS5052と一緒に用G)る
場合、タブ(2)は便宜上約165 x l 27 x 45 (mm)の寸法
で製造する。その場合、各反応容器は約70anの総高さを有し、その約25[
lはフリ・ノドガラスフィルター上の円筒状部分からなる。この上部部分の直径
は13anである。48個以下の反応容器用の装置を構築するのが有利である。
保持装置は連結部(5)を介して吸引装置、例えば、前の方に51ルソトルの吸
引びんを有する膜ポンプと接続する。保持装置はまた連結部(6)を介して不活
性ガス供給源(例えば、窒素ガスびん)とも接続する。圧力開放ノ<バルブ(通
常約0、 1バールにセットされている)はこのラインに設置する。例えif、
Pci二よって調整可能な調整手段もこのラインに設ける。
本装置の別の実施態様は、タブ(2)が1個のみの連結部を有してこの連結部を
PC制御可能な3つロバルブにより2つのライン(不活性ガス/吸弓1手段)(
こ接続するように構築する。
実施例
以下の実施例は本発明方法の過程を具体的に説明するものである:上述の装置を
ピペッティングロボットと一緒に使用する。工程はコンピューター制御する。
保護アミノ酸または短ペプチドをすでに装填させた担体材料を各反応容器に入れ
る。
l バルブN2開放、真空遮断
2 DMFの計量(3分) 洗浄
3 バルブN、遮断、真空開放 吸引
4 バルブN2開放、真空遮断
S DMF中4中入0%ピペラジン量(3分) 保護基の開裂6 バルブN8遮
断、真空開放 吸引
7 バルブN2開放、真空遮断
a DMF中4中入0%ピペラジン量(3分) 保護基の開裂9 バルブN2遮
断、真空開放 吸引
lOバルブN2開放、真空遮断
器 DMFの計量(30秒) 洗浄
12 バルブN、遮断、真空開放 吸引13 バルブN、開放、真空遮断
14〜40 工程1.1−13の繰り返し 洗浄(9回)41 DMF中での所
望F[[IOCアミノ酸/HOBt 第1カツプリンの計量 グ
42 DIC/DMFの計量(40分) 第1がツブリング
43 バルブN2開放、真空開放 吸引44 バルブN、開放、真空遮断
45〜48 工程41〜44の繰り返し 第2カップリング
49〜78 工程11〜13の繰り返し 洗浄(10回)前述したドイツ特許比
l1llIO,P 3828576.2号による方法および装置と比較して、本
発明による装置は合成サイクルに要する時間を実質的に(約半分に)短縮してい
る。合成は、使用液体を完全に吸い上げるので、信頼性があり清浄である。
合成の過程は、各反応容器が開放であるので、容易にモニターできる。
ERSATZBし■丁
要 約 1
国際調査報告
Claims (7)
- 1.複数の反応容器とこれらの反応容器用の保持装置とを含み、これらの反応容 器は頂部と底部で開放されており、個々の反応容器の底部開口はフィルターでカ バーされており、保持装置は、不活性ガス供給ラインおよび吸引装置用の潜在的 連結部、および各反応容器の頂部開口が合成工程において必要とする液体の添加 に対して上から受入れ可能でありかつ各反応容器の底部開口か保持装置の内部と 連結するような方法で各反応容器を固定する開口とを有する密閉可能な容器であ ることを特徴とする固相合成法による複数のポリペプチドの同時合成用の装置。
- 2.保持装置かプレート状カバーを有するタブ型容器であり、このカバーか複数 の開口を有し、これら開口の各々が反応容器を保持することを特徴とする請求項 1記載の装置。
- 3.各反応容器が円筒状ガラス容器であり、その下部末端に保持装置に挿入させ るすりガラス部分を有することを特徴とする請求項1又は2記載の装置。
- 4.各反応容器の底部開口を覆うフィルターがフリットガラスフィルターまたは フリットテフロンフィルターであることを特徴とする請求項1〜3のいずれか1 項記載の装置。
- 5.合成過程において必要とする各液体をピペッティングロボットによって各反 応容器中に導入することを特徴とする請求項1〜4のいずれか1項記載の装置。
- 6.請求項1〜5のいずれか1項に記載の装置を用い、高分子担体材料または第 1のアミノ酸またはペプチドを装填した高分子担体材料を各反応容器に入れ、次 いで、ペプチドを各反応容器内でそれ自体は公知である固相合成法によって合成 し、必要に応じて、ペプチドの遊離のアミノ基および/またはヒドロキシ基をア シル化し、個々の工程で必要とする試剤と洗浄液をカニューレを有する1本以上 のロボットアームにより相応する貯蔵容器から各反応容器に導入し、試剤または 洗浄液の所定の滞留時間後に、フィルター上の各反応容器内に含有させた液体を 保持装置を通して同時に吸い出し、工程の個々の段階を上記ロボットに接続した コンピューターのプログラムによって制御することを特徴とする固相合成法によ る複数のポリペプチドの同時合成方法。
- 7.液体を吸引する場合を除いた合成過程全体に亘って、不活性ガスを保持装置 中にポンプ注入し、この不活性ガスを液体が反応容器内のフィルターを通して浸 出するのを防止するような低圧に保つことを特徴とする請求項6記載の方法。
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