JPH05504055A - ピリミジンデオキシリボヌクレオシドの製造用発酵方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ビリミジンデオキシリボヌクレオシドの製造用発酵方法発明の背景 本発明は、回収可能な量のとりミジンデオキシリボヌクレオシド（ＰｄＮ）を製 造するために遺伝的に改変した細菌又は酵母細胞＜Ｖｔ生物）を使用する微生物 発酵法に係る。

チミジン（ＴｄＲ）及びデオキシウリジン（ＵｄＲ）のようなとりミシンデオキ シリボヌクレオシドは、アジドチミジン（ＡＺＴ）又はアジドデオキシウリジン （ＡＺｄＵ）のようなピリミジンの合成顕似体を含む抗ウィルス化合物を製造す るために商業的に有用な出発化合物である．例えば、チミジン及びデオキシウリ ジン（ＵｄＲ）は現状では、非常に高価な多段階法を使用する有機合成により製 造されている．従って、チミジンのコストが高いため、抗ウイルス治療薬のコス トは高くなり、例えば、製造される薬剤ＡＺＴの費用は高くなる。しかしながら 、チミジン、又はＡＺＴのような抗ウイルス治療薬の製造で使用するのに適した 他のＰｄＮを得るための代替方法は知見されていない。

従って、商業的に有用な量のＰｄＮを製造するための廉価な方法を実現すること は長年且つ緊急の課題であった。

ＰｄＮの例は、１一窒素が夫々糖２ーデオキシリボースの１゜一炭素に共有結合 した塩基チミン及びウラシルから構成されるチミジン及びデオキシウリジンであ る．これらのヌクレオシドは一般に、七ノー、ジー又はトリヌクレオチドとして 細胞中に存在する．チミジンは主にＤＮＡｃｒ）構成成分として機能する。微生 物及び真核生物の大部分の細胞において、ＰｄＮは新生（ｄｅ　ｎｏｖｏ）ビリ ミジン生合成経路の産物である。

ＰｄＮ　Ａ　の　、より廉価な代替ＰｄＮ製造方法を提供するためには、ＰｄＮ 新生合成の代謝経路を分析することにより、微生物発酵器又は細胞培養バイオリ アクターの使用を介してＰｄＮを産生し得る細胞突然変異体に関する有用な情報 が提供されよう．ピリミジン、ピリミジンヌクレオシド及びビリミジンヌクレオ チドは、国１に示す多段階経路により（グルタミン及びＣｏ２から誘導される） アスパラギン酸及びカルバモイルリン酸から合成される．参考資料としてその内 容を本明細書の一部とするＯ′Ｄｏｎｏｖａｎ　＆　Ｎｅｕｈａｒｄ，　Ｂａｃ ｔｅｒｉｏｌ．Ｒｅｖ．　３４：２７８−３４３　（１９７０）を参照されたい 。大腸菌遺伝子記号によりＺｌに指示した経路の酵素を以下に列挙する。

ｍＡ又はｃ　ａ　ｒＡＢ　一　カルバモイルリン酸シンターゼ（ＥＣ６．３、５ ．５） ＬＬＬＢ■　−　アスパラギン酸トランスカｌレバモイラーゼ（ＥＣ　２．１． ３．２＞ ＬＬＬＣ　−　ジヒドロオロターゼ（ＥＣ　３．５．２。

３》 ＬＬＬＤ　−　ジヒドロオロトオキシダーゼ（ＥＣ　１。

３、３．１） ＸＬＬＬＥ　−　オロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＥＣ　２．４． ２．１０） ＬＬＬＦ　−　オロチジン５゜−リン酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ　４．　１． 　１．　２３＞ ＬＬＬＧ　−　シチジン三リン酸（ＣＴＰ）シンターゼ（ＥＣ　６．３．４．２ ） ＬＬＬＨ　−　ヌクレオシドリン酸キナーゼ（ＥＣ　２。

７、４．４） ｎｄｋ　−　ヌクレオシドニリン酸キナーゼ（ＥＣ　２。

７、４．６＞ ｎｒｄ　−　リボヌクレオシドニリン酸レダクターゼ（ＥＣ　１．１７．４．１ ＞ ｄｃｄ　−デオキシシチジン三リンｉ！！２（ｄＣＴＰ）デアミナーゼ（ＥＣ３ ，５，４，１３） ｄｕｔ　−デオキシウリジン三リン酸ヌクレオチドヒドロラーゼ（ｄＵＴＰアー ゼ）（ＥＣ３，６，１，２３）（坦ＩＡ　−チミジル酸シンターゼ（ＥＣ１，２ ，２゜経路の最終産物は、いずれもＲＮＡ又はＤＮＡ及び他の細胞成分の組立ブ ロックとして機能するウリジン三リン酸（ＵＴＰ）、シチジン三リン酸（ＣＴＰ ）、デオキシシチジン三リン酸（ｄＣＴＰ）及びチミジン三リン１ｉｌｉ（ＴＴ Ｐ）として一般に定義することができる。この経路では最終産物、エネルギー要 件及び酵素段階が多数であるため、ピリミジンのｄｅ　ｎｏｖｏ生合成は多くの 調節段階を有する。

例えば、Ｎｅｕｈａｒｄ、Ｉｎ　ＴＨＥ　ＭＯＬＥＣＵＬＡＲＢＩＯＬＯＧＹ　 ＯＦ　ＢＡＣＴＥＲＩＡＬ　ＧＲＯＷＴＨ，Ｊｏｎｅｓ　＆　Ｂａｒｔｌｅｔｔ 、ＢｏｓＬｏｎ　（１９８５）、　１７３−１８４頁を参照さ産物又は他の代謝 ￥＠（単独又は組み合わせ）の集中による主要酵素のフィードバック阻害、及び （Ｂ）酵素合成の抑制及び／又は減衰によりｉｎ　ｖｉｖｏで調節される。Ｂｅ ｃｋｗｉｔｈ　ｅｔ　ａｌ、Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ。

５：６１８−６３４　（１９６２）；　Ｐｏｔｖｉｎｅｔ　ａｌ、　Ｊ、Ｂａｃ ｔｅｒｉｏｌ、　１２３：６０４　６１５　（１９７５）；　Ｒｏｌａｎｄ　ｅ ｔ　ａｌ。

Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１６３：９９１−９９９（１９８５）、細菌における この経路は詳細に研究されている。Ｎｅｕｈａｒｄ　＆　Ｎｙｇａａｒｄ、　Ｉ ｎ　ＥＳＣＨＥＲＩＣＨＩＡ　Ｃ０ＬＩ　ＡＮＤ　ＳＡＬＭＯＮＥＬＬＡ　ＴＹ ＰＨＩＭＵＲＩＵＭ、ＣＥＬＬＵＬＡＲＡＮＤ　ＭＯＬＥＣＵＬＡＲＢＩＯＬＯ ＧＹ、Ａｍｅｒｉｃａｎ　５ｏｃｉｅｔｙ　ｆｏｒ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ 、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、Ｄ、Ｃ，（１９８７＞、４４５−４７３頁。

Ｎｅｕｈａｒａｄの上記文献によると、ピリミジン生合成の主要調節酵素は、カ ルバモイルリン酸シンターゼ（ＰＬＬＬＡ又はｃａｒＡＢ）、アスパラギン酸ト ランス力ルバモイラーゼ（ＬｌゴーＢＩ）、ＣＴＰシンターゼ（ＬＬＬＧ）及び デオキシシチジン三リン酸デアミナーゼ（ｄｃｄ）である。カルバモイルリン酸 シンターゼ活性はウリジンヌクレオチドにより阻害され、その合成はアルギニン 及びウラシルにより集積的に抑制される。カルバモイルリン酸はアルギニン及び ピリミジンの生合成における中間体であるので、アルギニンによる調節が必要で ある。大腸菌では特定のリプレッサータンパク質ＬＬＬＣが同定されている。枯 草菌では２種のカルバモイルリン酸シンターゼイソ酵素が同定されている（Ｐａ ｕｌｕｓ　＆　５ｗ１ｔｚｅｒ。

Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１３７：８２−９１　［１９７８］）。一方はアルギ ニンにより、他方はピリミジン（主にウラシル誘導体）により特異的に調節され る。

アスパラギン酸トランス力ルバモイラーゼ（ＡＴ）は、ピリミジン生合成におけ る第１段階を触媒し、従って、ピリミジンによる代謝調節を受ける。酵素ＡＴは 、触媒サブユニット（ＬＬＬＢ）と調節サブユニット（ＬＬＬ■）との２種の型 のサブユニットから構成される。ＡＴの活性は、経路の最終産物の１種であるＣ ＴＰによるアロステリック阻害と、細胞のエネルギー状態に依存する濃度のアデ ノシン三リン酸（ＡＴＰ＞による活性化とを受ける。細胞中に存在するＡＴのレ ベルはＣＴＰ及びＵＴＰにより調節されると思われる。コーディング遺伝子及び 関連する調節領域は、クローニングされ、そのＤＮＡ配列は決定されている。

Ｌａｎｄｔｃｋ　＆　Ｙａｎｏｆｓｋｙ、　Ｉｎ　ＥＳＣＨＥＲＩＣＨＩＡ　Ｃ ０Ｌｒ　ＡＮＤ　ＳＡＬＭＯＮＥＬＬＡ　ＴＹＰＨＩＭＵＲＩＵＭ、ＣＥＬＬＵ ＬＡＲＡＮＤ　ＭＯＬＥＣＵＬＡＲＢＩＯＬＯＧＹ、１２７６−１３０１；　Ｒ ｏｌａｎｄ　＆　Ｐｏｗｅｌｌ、前出；　及びＴｕｒｎｂｏｕｇｈ　ｅｔ　ａｌ 、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ’ｌ　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ　ＵＳＡ　８０：３６８−７２　（ １９８３）。

ＡＴレベルを通常抑制レベルの約３０倍にした構成大腸菌突然変異体が報告され ている。一方、ピリミジンの大腸菌ピリミジン栄養要求株の飢餓の結果、ＡＴ酵 素のレベルが約１０００倍になったという実験も報告されている（Ｓｈｅｐｈｅ ｒｄｓｏｎ　＆　Ｐａｒｄｅｅ、Ｊ、Ｂｉ。

１、ｃｈｅｍ、２３５：３２３３−３７　［１９６０］）、このように、酵素レ ベルの範囲は非常に広く、細胞中の最終産物のレベルに依存し、通常の抑制条件 下では、酵素は完全に調節解除した条件下で可能なレベルよりも著しく低いレベ ルで存在する。

枯草菌におけるＡＴの調節は、酵素活性のｉｎ　ｖｉｔｒｏ活性化又は阻害が立 証されていないという点において、大腸菌及びネズミチフス菌におけるその調節 と異なる（Ｂｅｔｈｅｌｌ　＆　Ｊｏｎｅｓ、Ａｒｃｈ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉ ｏ　ｈ　ｓ、１３４：３５２−６５　［１９６９］　）、一方、酵素合成はウラ シルにより調節され、これは、他の生物に提案されているメカニズムに想似する 減衰メカニズムにより行われると予想される。Ｌｅｒｎｅｒ＆　５ｗ１ｔｚｅｒ 、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　２６１・１１１５６−６５　（１９８６）。

第３の主要な酵素は、ＵＴＰのアミン化を触媒してＣＴＰを形成するＣＴＰシン ターゼ（ＬＬＬＧ）である。大腸菌からの酵素は複合アロステリック調節を受け る。１ｎｖｉｔｒｏ研究により、ＧＴＰ、ＡＴＰ及びＵＴＰによる刺激が立証さ れている。しかしながら、その遺伝的調節メカニズムは解明されていない。第４ の主要な酵素は、ｄＣＴＰからｄＵＴＰへの脱アミン化を触媒するｄＣＴＰデア ミナーゼである。基質ｄＣＴＰはＤＮＡに取り込まれるか又はＴＴＰ合成用前駆 物質として使用されるので、分岐点化合物である。酵素ｄＣＴＰデアミナーゼは ＴＴＰによるフィードバック阻害を受ける。枯草菌においてｄＣＴＰ又はｄＣＤ ＰはｄＣＭＰに転化され、ｄＣＭＰはその後、ｄＣＭＰデアミナーゼの基質とし て使用され、産物としてｄＵＭＰを生成する。しかしながら、ｄＵＭＰは酵素チ ミジル酸シンターゼによりＴＭＰに直接転化されるので、細胞中に蓄積されない 、Ｍｕｎｃｈ−Ｐｅｔｅｒｓｅｎ編、ＭＥＴＡＢＯＬｒＳＭ　ＯＦ　ＮＵＣＬＥ ＯＴＩＤＥＳ。

ＮＵＣＬＥＯＳＩＤＥＳ　ＡＮＤ　ＮＵＣＬＥＯＢＡＳＥＳ　ＩＮ　ＭＩＣＲＯ ＯＲＧＡＮＩＳＭＳ、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　１４９−２０１　（１ ９８３）。

酵素ｄＣＭＰデアミナーゼは、ｄＣＴＰによるアロステリ・ツク活性化及びＴＴ Ｐによる阻害を受ける。

別の酵素であるリボヌクレオシドニリン酸レダクターゼ（ｎｒｄ）は、とリミジ ンデオキシリボヌクレオチドの生合成で主要な役割を果たし、複合調節を受ける 。Ｔｈｅｌａｎｄｅｒ　＆　Ｒｅ１ｃｈａｒｄ、Ａｎｎ、Ｒｅｖ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ　４８：１３３−５８　（１９７９）、この酵素は、リボヌクレ オシドニリン酸からデオキシリボヌクレオシドニリン酸への還元を触媒し、プリ ン及びピリミジンヌクレオチドの両方に作用する。しかしながら、はとんどの阻 害研究は精製酵素で行われており、酵素が通常は膜に結合していることを考慮す ると、これらの研究は１ｎｖｉｖｏ状況を正確に反映しないと思われる。酵素活 性のレベルは一般に、細胞中の総ヌクレオチド濃度及びＤＮＡ合成率の関数であ ると考えられる。

大腸面及びネズミチフス菌においてピリミジン生合成遺伝子は染色体中に散乱し ており、カルバモイルリン酸シンターゼのサブユニット（ｃａｒＡ及びｃａｒＢ ）及びアスパラギン酸トランス力ルバモイラーゼのサブユニット（ＬＬＬＢ及び Ｐ！ｌｊ−Ｉ　、　）以外のオペロンを構成しない（Ｂｅｃｋｗｉｔｈ、前出； 　Ｎｅｕｈａｒｄ、　Ｉｎ　ＴＨＥ　ＭＯＬＥＣＵＬＡＲＢＩＯＬＯＧＹ　ＯＦ 　ＢＡＣＴＥＲｒＡＬ　ＧＲＯＷＴＨ，前出（１９８５）　１７３−８４頁）、 上記のように、これらの酵素の発現は減衰メカニズムによりＣＴＰ及びＵＴＰの 細胞内濃度に依存する転写率に調節されると思われる。ＣＴＰ又はＵＴＰのレベ ルが低いと、これらの酵素の発現は増加する。

これまでにピリミジン生合成遺伝子に作用する特定のリプレッサータンパク質は 発見されておらず、また、遺伝子の相関発現も解明されていない、枯草菌におい て、遺伝子ＬＬＬＡ　、　ＬＬＬＥＩ　Ｉ　、　Ｊ２Ｊ乙ニーｃ、Ｐ：仁ｒＤ、 ２」仁ｒＥ及びＰ！ＪＬＬＦは染色体上で相互に近接する位置に配！されており （参考資料としてその内容を本明細書の一部とするＬｅｒｎｅｒ　ｅｔ　ａｌ、 Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ。

１６９：２２０２−２６　（１９８７）を参照されたい）、生物がウラシルの存 在下で成長するときに非常に低レベルで発現される（Ｐｏｔｖｉｎ　ｅｔ　ａｌ 、Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１２３：６　０４−１５　［１９７５コ　）が、 これまでに減衰メカニズムによる調節も指摘されている（ｌｅｒｎｅｒ＝前出、 １９８６）、Ｌかしながら、オペロン型の遺伝子機構もリプレッサータンパク質 の存在も明確には解明されていない。

ビ１ミジン−シ１ボ　し　シトの　の１０代表的なＰｄＮ　（チミジン）に関す る酵素反応を図２に示す。

非飢餓条件下で増殖する野生型細胞中では、前駆物質デオキシウリジン−リン＃ 　（ｄＵＭＰ）は直接チミジン−リン酸（ＴＭＰ）に転化され、その後、チミジ ンニリン酸（ＴＤＰ）及びチミジン三リンＩｆ（ＴＴＰ）に転化されるので、こ のような細胞中にチミジンは存在しないか、又は存在するとしても非常に低レベ ルである。チミジンはＤＮＡの組立ブロックであるＴＴＰとして主に存在するの で、調節下の生合成により、通常合成されるや否や使用され、蓄積しない、同一 の理由で、デオキシウリジンも通常は細胞中に見いだされない。したがって、既 存のピリミジン代謝経路は通常、過剰のデオキシウリジン（ＵｄＲ）−ｄＴＭＰ 又はチミジン（ＴｄＲ）を蓄積することができない。

別の代謝メカニズムでチミジンを合成することもできるが、チミジンはチミジン ヌクレオチドの合成のために細胞により分解又は使用されるので、チミジンを蓄 積することはできない０例えば、チミジンを製造するために非特異的ホスファタ ーゼをＴＭＰに作用させると、生成されるチミジンはｄｅｏＡ遺伝子の産物であ るチミジンホスホリラーゼの作用によりチミン及びデオキシリボース−１−リン 酸に迅速に分解される（Ｍｕｎｃｈ−Ｐｅｔｅｒｓｏｎ、前出、２０３−５８＞ か、又はチミジンキナーゼによりリン酸化されてＴ　Ｍ　Ｐを生成するので、チ ミジンを蓄積することはできない、枯草菌では、ヌクレオシド基質としてチミジ ン又はウリジンを使用することが可能な唯一のピリミジンヌクレオシドホスホリ ラーゼが存在すると思われる。この酵素は逆にも機能し、外来チミンをチミジン に取り込むことができる。多くの生物は同様にチミジンを取り込み、チミジンキ ナーゼの作用によりＴＭＰに転化させることができる。したがって、チミジンは 生物中に存在する代謝経路により蓄積しない、非特異的ホスファターゼによりｄ ＵＭＰから生成されるデオキシウリジンはチミジンキナーゼの基質として機能し 、ｄＵＭＰをもたらすか、又はチミジンホスホリラーゼの基質として機能し、ウ ラシル及びデオキシリボース−１−リン酸をもたらす。

ヌクレオシド、ピリミジン様化合物及び関連産物の発酵による製造例は数例ある が、これらの場合、既存の経路の突然変異により所望のピリミジン又はピリミジ ンリボヌクレオシドを蓄積できるとしても、ピリミジンデオキシリボヌクレオシ ドの蓄積については何ら提案していないので、同様に発酵によりＰｄＮ製造が得 られることを示した提案は皆無といえる０例えば、Ｋｏｎｉｓｈｉ、Ｃｈｅｍ。

Ａｂｓ、７０：１８９１７ｊ　（１９６９）；　Ｎａｋａｙａｍａ、Ｃｈｅｍ、 Ａｂｓ、８４：１１９９５１ｋ　（１９７６）；及びＮａｋａｙａｍａ、Ｃｈｅ ｍ。

８８：１９４４２ｃ　（１９７８）を参照されたい。

実際に、このような突然変異又は上述の他の代謝は、上記のようにＴＭＰ　（又 はｄＵＭＰ）をチミン（又はウラシル）及びデオキシリボース−１−リン酸に合 成又は分解することによりチミジン（又はデオキシウリジン）登除去するので、 商業的に有用な量のチミジン又はデオキシウリジンを蓄積することはできなかっ た。ピリミジン生合成のための調節メカニズムは主に各遺伝子が個々に調節され る減衰メカニズムであると思われるので、経路全体で高度に抑制解除された突然 変異体を作成し、回収可能な量の特異的ＰｄＮを蓄積できるとは予想し難い、ま た、ＴＭＰ又はｄＵＭＰはｉｎ　ｖｉｖｏで形成されるので、生物の既存の代謝 経路を利用してＴＭＰからチミジン又はｄＵＭＰからデオキシウリジンへの迅速 且つ特異的な不可逆的加水分解により実際的なＰｄＮ製造を達成することは従来 不可能であった。これは、チミジンキナーゼ反応の平衡がＴｄＲ又はＵｄＲ製造 に好ましくないという事実に起因するものであった。

従って、比較的低コストで商業的に有用な量のＰｄＮを製造する問題の解決方法 を提供又は提案するアプローチは皆無であった。更に、既存の代謝経路の既知の 修正手段では、該当合成段階における長時間の調節及び望ましくな１１１反応平 衡により、微生物発酵中に回収可能な量のＰｄＮ　（例えばＴｄＲ）を蓄積する ことはできなかった。そこで、回収可能な量のＰｄＮを商業的に製造するという 問題の解決が必要とされている。

発明の要約 従って、本発明の１つの目的は、炭素源から商業的に有用な量のＰｄＮを産生す る遺伝的に改変された微生物細胞を提供することである。この点で、「遺伝的に 改変された細胞」なる用語は、タンパク質をコードする異種ＤＮＡによる形質転 換又は化学的もしくは物理的突然変異誘発物質による処理により実施される改変 を含む細胞又は細胞子孫を意味する。

本発明の別の目的は、炭素源からＰｄＮを発酵的に製造する方法を提供すること である。

以上の目的を達成するために、本発明の一態様によると、ＰｄＮ−リン酸をピリ ミジンデオキシリボヌクレオシドに転化するピリミジンデオキシリボヌクレオチ ドホスホヒドロラーゼ（ＰｄＮＰアーゼ）をコードするＤＮＡ配列を含み且つこ の配列を発現する複製可能な微生物が提供される。

所定の好適態様によると、ＰｄＮＰアーゼコーディングＤＮＡ配列は、チミジル 酸ホスホヒドロラーゼをコードし、微生物は回収可能な量のチミジン又はデオキ シウリジンを発現する。

本発明の別の態様によると、上記のようにＰｄＮＰアーゼをコードするＤＮＡ配 列を発現する微生物から主に構成される微生物培養物が提供され、培！Ｉ物は炭 素源の代謝後、回収可能な量のＰｄＮを蓄積する。この関連で「〜がら主に構成 される」なる用語は、本発明の微生物培養物が、場細胞を含むとしても、その２ 著な特性である回収可能な量のＰｄＮの製造に悪影響を与えるほど多数のこのよ うな細胞を含まないことを意味する。

本発明の別の！ｇ様によると、炭素源がらＰｄＮを発酵的に製造するための方法 も提供され、該方法は、（Ａ）炭素源を含む培地を収容する発酵反応器を準備す る段階と、（Ｂ）回収可能な量のＰｄＮを産生ずる微生物培養物を反応器に加え る段階と、次いで（Ｃ）炭素源が微生物培養物により発酵され、培地中にＰｄＮ を蓄積するような条件を反応器の内側に設定し、これを維持する段階と、（Ｄ） 反応器からＰｄＮを回収する段階とを含む１段ｔｉｌｔ（Ｄ＞から得られるＰｄ Ｎは、少なくとも１ｇ／ｌ、好ましくは少なくとも約３０ｇ／ｌ、特に約７０ｇ ／ｊ！以上のＰｄＮ濃度で培地から回収することができる。

本発明の他の目的、特徴及び利点は、以下の詳細な説明に明示される。以下の詳 細な説明及び実施例は本発明の好適実施態様を示すものであるが、単なる例示に 過ぎず、当業者は以下の詳細な説明から本発明の範囲内で種々の変形に想到でき よう。

図面の簡単な説明 添付図面は本発明を説明するものである。

図１は、ピリミジン生合成経路を示す。

図２は、チミジンの生化学反応を示す。

図３は、チミジル酸ホスホヒドロラーゼのＮ末端アミノ酸配列及び対応する核酸 コーディング配列を示す。

図４は、ｄＴＭＰアーゼコーディング核酸配列を単離するために使用した２種の オリゴヌクレオチド混合物からなる代替プローブ配列を示す。

図５は、ニトロセルロースフィルター上で大引り枯草菌及びＰＢＳ　１−ＤＮＡ フラグメント（夫々レーン１．２及び３）にハイブリダイズしたオリゴヌクレオ チドプローブのハイブリダイゼーションを示すオートラジオグラムの写真である 。

図６は、ｄＴＭＰアーゼコーディングＤＮＡの推定クローンのコロニーハイブリ ダイゼーションを示すオートラジオグラムの写真である。

図７は、ＰＢＳ　１バクテリオフアージから得られるフランキングＤＮＡ配列を 含む代表的なｄＴＭＰアーゼコーディングＤＮＡ配列を示す。

図８は、ｄＴＭＰアーゼ遺伝子の部分的及び完全クローンの例を示す、制限エン ドヌクレアーゼ切断部位をＲ（ＥｃｏＲＩ）、Ｂ（ＢＡＭＨＩ）−Ｈ（Ｈｉｎｄ ＩＩＩ）及び５（ＳｃａＩ）で示す。

図９は、プラスミドｐｃＧ１００の部位特異的突然変異誘発に使用した代表的オ リゴヌクレオチドである。

図１０は、ｐｃＧｌｏｏのｄＴＭＰアーゼフラグメントの部位特異的突然変異誘 発の例を示すフローチャートである。

図１１は、ベクターｐＫｃ３０にクローニングしたクローンｐＣＧ１００及びｐ ｃＧ１０３からの代表的ｄＴＭＰアーゼ遺伝子の再構築を示す。

図１２は、ｄＴＭＰアーゼ活性及び細胞生存率の誘導温度依存性を示すグラフで ある。

図１３は、ｄＴＭＰアーゼをプラスミドｐＥＹＤＧ１のトランスポゾンＴｎ５に 挿入したｐｃＧ１３２の構築を示す。

図１４は、所定の代表的な遺伝的に改変した大腸菌株の系列を示すフローチャー トである。

の；　ｆユ 商業的量のＰｄＮを得るための源として組換微生物細胞を発酵法で使用できるこ とが知見された。特に、組換技術により微生物細胞のピリミジンデオキシリボヌ クレオシドｄｅ　ｎｏｖｏ生合成経路に付加的酵素段階を加えて所望のＰｄＮを 蓄積することができ、こうして得られた組換細胞を更に修飾して商業的に有用な Ｊｌｃｒ）ＰｄＮを製造することができる。この関連で「商業的に有用な」量の ＰｄＮとは、従来技術の抽出又は他の産物回収技術により供給可能なＰｄＮ製造 レベルに結び付けられる。

本発明に従って実施される形質転換は、ピリミジンデオキシリボヌクレオシド− リン酸をＰｄＮに転化させる酵素（即ちＰｄＮＰアーゼ）をコードするクローン 化（異種）ＤＮＡを使用する。このような酵素を発現するように加工した細胞に 代謝突然変異を導入するか、又はＰｄＮ産生な増進させる代謝酵素もしくは酵素 モジュレータ−をコードする異種ＤＮＡを導入するにより、該細胞を更に修飾す る。

意外なことに、ＰｄＮＰアーゼをコードするＤＮＡ配列で形質転換した細胞をこ のように操作すると、有用な量のＰｄＮを回収する前に形質転換細胞を死滅させ ることなくＰｄＮを発酵的に製造することができる。

本発明に従って微生物細胞を形質転換させるために適切な外来ＤＮＡは、ウラシ ル含有ウィルスからも得られるし、ＤＮＡ合成でチミンの代わりにウラシル又は ヒドロキシメチルウラシルを使用する他の複製可能な生物及びウィルスからも得 られる。この群の生物又はウィルスはＰｄＮＰアーゼ酵素、例えばＥＣ３，１， ３，３５と命名され、ＴＭＰをチミジン、又はｄＵＭＰをデオキシウリジンに転 化させるチミジル酸ホスホヒドロラーゼ（ｄＴＭＰアーゼ）を産生する。

この群の例は、例えばオハイオ州立大学（Ｃｏ　Ｉ　ｕｍｂｕｓ、０ｈｉｏ）の Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ＧｅｎｅｔｉｃＳｔｏｃｋ　Ｃｅｎｔｅｒから容易に入手可 能な既知のバクテリオファージＰＢＳＩ及びＰＢＳ２である。これらのファージ は両者とも枯草菌に感染し、酵素ｄＴＭＰアーゼを発現する。Ｈｅｍｐｈｉｌｌ 　＆　Ｗｈｉｔｅｌｅｙ。

Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、Ｒｅｖ、３９：２５７−３１５（１９７５＞、ＰＢＳＩ及 びその透明プラーク変異体ＰＢＳ２は、そのＤＮＡ中にチミンでなくウラシルを 含む。

Ｔａｋａｈａｓｈｉ　＆　Ｍａｒｍｕｒ、Ｎａｔｕｒｅ１９７：７９４−９５　 （１９６３）。ｄＴＭＰアーゼを発現するバクテリオファージの他の例としては 、特にＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ（ Ｒｏｃｋｖｉｌｌ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）から市販されているＢａｃｉ　Ｉ　ｌｕ ｓファージＳＰ８及びＳＰ　５Ｃｔ−挙げることができる。Ｎ１５ｈａｒａ　ｅ ｔ　ａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ　６：１８７７　（１９６７）；　Ａｐｏｓ ｈｉａｎ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉ。

ｈ　ｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍ、１８：２３０　（１９６も参照されたい。（特に指 定しない限り、木用及びこの詳細な説明の他の項に引用した文献は参考資料とし て本明細嘗の一部とする。） 回収可能な量のＰｄＮを産生できるように本発明の微生物細胞を改変するために は、クローン化酵素がＰｄＮ−リン酸から回収可能な量のＰｄＮへの転化を触媒 するために十分な量で発現されるように、ＰｄＮＰアーゼをコードする遺伝子を 適切な宿主細胞にクローニング及び導入する。

ＰｄＮ合成経路を更に修飾するための従来の突然変異又は組換技術を使用して、 商業的に有用な量のＰｄＮが産生及び回収されるように、こうして形質転換した 宿主細胞を更に改変させる。このような細胞の例は、回収可能な量のＰｄＮ（チ ミジン）を産生する大腸菌株ＣＭＧ　１１２８（下記実施例１１参照）である。

従って本発明によると、ＰｄＮ　（例えばチミジン）がＴＭＰを形成するために チミジンキナーゼにより使用されず且つチミン及びデオキシリボース−１−リン 酸を形成するためにチミジンホスホリラーゼにより使用されず、その結果として 回収可能な量のチミジンを蓄積できるように、突然変異又は付加的代謝遺伝子コ ーディングＤＮＡと共にＰｄＮＰアーゼを組換技術により微生物細胞に導入する 。

あるいは、ＰｄＮＰアーゼコーディングＤＮＡで形質転換する以外に、ｄＵＭＰ からのＴＭＰの形成を阻止してｄＵＭＰの蓄積を増加するチミジル酸シンターゼ 突然変異を導入することにより、デオキシウリジンは本発明の微生物培養物の培 地中に蓄積することができる。ｄＵＭＰの蓄積は、ＰｄＮ、デオキシウリジンを 生成するために適切なＰｄＮＰアーゼの基質を提供する。このような生物は成長 のために別のチミジン源を必要とする。あるいは、温度域受性酵素の使用、又は 例えば従来手順を使用してファージφＥ、５Ｐ８２Ｇ又はＳＰ８のようなしドロ キシメチルウラシル含有Ｂａｃｉｌｌｕｓバクテリオファージから得られるチミ ジル酸シンターゼインヒビターをコードする遺伝子の調節発現により、チミジル 酸シンターゼを阻害することもできる。Ｈａｓｌａｍ　ｅｔ　ａｌ、　Ｂｉｏｃ ｈｅｍ。

影二Ｕ拡ＬＬ工Ａｃ見ａ　１３４：３１２　（１９６７）；　Ｈａｙｗａｒｄ、 Ｖｉｒｏｌｏ　３８：５３８（１９６９）；　Ｒｏｓｃｏｅ　＆　Ｔｕｃｋｅｒ 。

ＬＬＬ二匠ｅｍ工り二ｕ匠ｎｕ−引ｅｓエニｏｍｍ。

１６：１０６　（１９８４）；及びＲｏｓｃｏｅ　＆　Ｔｕｃｋｅｒ、　Ｖｉｒ ｏｌｏ　２９：１５７　（１９６６）参照０組換体の成長中にチミジル酸シンタ ーゼ活性は有効である。デオキシウリジンの産生が所望される場合、チミジル酸 シンターゼ活性は無効にされ、ｄＵＭＰはこのとき、ＰｄＮＰアーゼ（例えばｄ ＴＭＰアーゼ）によりデオキシウリジンに転化され得る。従って、本発明の組換 細胞は回収可能な量のＰｄＮを培地中に蓄積する。

本発明に従ってＰｄＮの産生量を増加させるために使用可能なＰｄＮ合成代謝経 路で酵素に作用する突然変異は特に、（１）基質類似体耐性及び薬剤耐性突然変 異、（２）代謝最終産物耐性突然変異、（３）プリン−、ピリミジン−及びヌク レオシド−輸送突然変異及び（４）代謝酵素活性に影響する突然変異を含む。本 発明のＰｄＮ産生細胞は更に、ピリミジン代謝経路酵素又は酵素阻害酵素をコー ドするクローン化ＤＮＡと再結合され得、経路中の律速酵素の濃度を増加するこ とにより又はＰｄＮ産生を減少させる律速酵素を阻害することによりＰｄＮ産生 量の増加を助長する。

本発明の組換細胞に適切な突然変異を導入するためには従来の技術と利用するこ とができる１例えば、Ｒｏ　ｗ　ｌ　ａｎｄｓ、　Ｅｎｚ　ｍｅ　Ｍｉｃｒｏｂ 、Ｔｅｃｈｎｏｌ。

６：３−１０　（１９８４）、及びＭｉｌｌｅｒ、　ｒｎ　ＥＸＰＥＲＩＭＥＮ ＴＳ　ＩＮ　ＭＯＬＥＣＵＬＡＲＧＥＮＥＴＩＣＳ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ 　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　（１９７２）参 照、このような突然変異のプラスミド及び細胞源は、例えばエール大学（Ｎｅｗ 　Ｈａｖｅｎ、Ｃｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔ　ＵＳＡ）のＥ、ｃｏｌｉ　Ｇｅｎｅｔ ｉｃ　５ｔｏｃｋ　Ｃｅｎｔｅｒ及びオハイオ州立大学（Ｃｏｌｕｍｂｕｓ、０ ｈｉｏ　ＵＳＡ）のＢａｃｉｌｌｕ５　Ｑ６Ｈ６ｊｉ（５ｔｏｃｋ　Ｃｅｎｔｅ ｒから市販産生細胞に従来の化学的又は物理的突然変異誘発処置を施した後、選 択物質（即ち耐性がめられる化合物）濃度を漸増しながら突然変異誘発細胞を培 地に＆露することにより、基質類似体耐性又は薬剤耐性突然変異を導入すること ができる。こうして、耐性突然変異により生存し続ける細胞を選択することがで きる。あるいは、所望の耐性を与える１種以上の遺伝子を含むプラスミドを使用 してＰｄＮ産生細胞を形質転換させ、ＰｄＮ産生量を増加させることもできる。

このような突然変異のプラスミド及び細胞源は、上記のようにＥ、ｃｏｌｉ　Ｇ ｅｎｅｔｉｃ　５ｔｏｃｋＣｅｎｔｅｒ及びＢａｃｉｌｌｕｓ　Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｔｏｃｋ　Ｃｅｎｔｅｒから市販されている。

適切な薬剤耐性突然変異の例は、リボヌクレオチドレダクターゼの活性又は量を 増進させてＰｄＮ産生量を増加させるヒドロキシ尿素耐性突然変異である。別の 適切な薬剤耐性突然変異は、チミジル酸シンターゼによるｄＵＭＰがらＴＭＰへ の転化速度及び程度に影響して高レベルのジヒドロ葉酸レダクターゼによりトリ メトプリム耐性を与え、その結果としてチミジン産生率を増加させるような突然 変異である。

基質類似体耐性突然変異は、ＰｄＮの蓄積を増加させるために本発明に従って同 様にＰｄＮ産生細胞に組み込まれ得るピリミジン票似体耐性突然変異を含む。耐 性突然変異を与えることができるピリミジン類似体としては、チオウラシル、６ −アザウラシル、５−フルオロウラシル、５−フルオロオロト酸、５−フルオロ シチジン、５−フルオロデオキシウリジン、５−フルオロデオキシシチジン、５ −フルオロウリジン、３°−アジドチミジン及びピリミジン−２’　、３’−ジ デオキシヌクレオシド及び他のピリミジン類似体（例えば表１に示すようなアジ ドピリミジン、シアノピリミジン）を挙げることができる。これらの類似体は、 例えばＳｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａ１社、Ｓｔ、Ｌｏｕｉｓから容易に入手可能 である。

１：ピリミジン Ｎ゛−アセチルシチジン ３゛−〇−アセチルチミジン アデノシンＮ°−オキシド アロプリノールリボシド ４−アミノ−５−アミノメチル−２−メチル−ピリミジン１−アミノバルビッー ル酸 ２−アミノ−５−プロモー６−メチルビルミシノール４−アミノ−５−カルベト キシ−２−エチル−メルカプトピリミジン ５−アミノ−６−カルボキシ−２，４−ジヒドロキシ−ピリミジン ２−アミノ−４−クロロ−６−メチル−ピリミジン３°−アミノ−３′−デオキ シチミシン５′−アミノ−５゛−デオキシチミジン５°−アミノ−２′−デオキ シウリジン５°−アミノ−２°、５′−ジデオキシ−５−ヨードシチジン ５°−アミノ−２°、５′−ジデオキシ−５−ヨードウリジン ４−アミノ−２゛、６−シヒドロキシー５−ニトロソピリミジン ２−アミノ−４，６−シヒドロキシビリミジン４−アミノ−２，６−シヒドロキ シビリミジン５−アミノ−２，４−ジヒドロキシピリミジン２−アミノ−４，６ −シメチルビリミジン４−アミノ−２−ヒドロキシ−５−ヒドロキシ−メチルピ リミジン ４−アミノ−６−ヒドロキシ−２−メルカプト−５−二トロンピリミジン ４−アミノ−６−ヒドロキシ−２−メルカプト−ピリミジン ２−アミノ−４−ヒドロキシ−６−メチルピリミジン４−アミノ−２−ヒドロキ シ−５−メチルピリミジン２−アミノ−４−ヒドロキシピリミジン４−アミノ− ２−ヒドロキシピリミジン４−アミノ−６−ヒドロキシ−２−チオピリミジン２ −アミノ−４−メチルピリミジン ４−アミノオロト酸 ４−アミノ−２−チオピリミジン ６−アミノ−２−チオウラシル ５−アミノ−２，４，６−ドリヒドロキシビリミジン４−アミノウラシル ５−アミノウラシル ６−アミノウラシル ５−アミノウリシンアモバルビタール ２．３′−アンヒドロチミジン ５−アザ−２°−デオキシシチジン ６−アザ−２°−デオキシウリジン ６−アザ−２−チオチミン ６−アザチミン ５−アザウラシル ６−アザウラジルリボシド ６−アザウリジン ２′−アジド−２′−デオキシシチジン３′−アジド−３”−デオキシチミジン ２°−アジド−２°−デオキシウリジンバルビッール酸 ５−ブロモ−２゛−デオキシシチジン ５−ブロモ−２，３°−ジデオキシウリジン５−ブロモ−２，４−ジヒドロキシ ピリミジン５−ブロモ−２°、３°−イソプロピリデン−ウリジン５−ブロモ− １−メチルウラシル ５−ブロモオロト酸 ５−ブロモウラシル ５−ブロモウリジン （Ｅ）−５−（２−ブロモビニル）ウリジン３−ブチルウラシル ５−力ルベトキシシトシン ５−力ルベトキシ−２，４−ジヒドロキシピリミジン５−力ルベトキシ−２−エ チルメルカプト−４−ヒドロキシピリミジン ３−カルベトキシ−２−チオウラシル ５−カルベトキシラシル ５−カルボキシシトシン ５−カルボキシ−２，４−ジヒドロキシピリミジン６−カルボキシ−２，４−ジ ヒドロキシピリミジン５−カルボキシ−２−エチルメルカプト−４−ヒドロキシ ピリミジン ５−カルボキシ−４−ヒドロキシ−２−チオピリミジンカルボキシメチルウラシ ル ６−カルボキシ−５−二トロー２．４−ジオキシピリミジン ５−カルボキシ−２−チオウラシル ５−カルボキシウラシル ５−クロロシトシンアラビノシド ５′−り四ロー５゛−デオキシシチジン２′−クロロ−２°−デオキシ−４−チ オウリジン２′−クロロ−２′−デオキシウリジン５°−クロロデオキシウリジ ン ２−クロロ−４，５−ジアミノピリミジン６−クロロ−２，４−ジメトキシピリ ミジン２−クロロピリミジン ５−クロロウラシル ４．５−ジアミノ−２−クロロピリミジン４．５−ジアミノ−２，６−ジヒドロ キシピリミジン２．５−ジアミノ−４，６−ジヒドロキシピリミジン４．６−ジ アミツー２−エチルメルカプトピリミジン４．６−ジアミツー５−（ホルミルア ミノ）−ピリミジン４．５−ジアミノ−６−ヒドロキシ−２−メルカプトピリミ ジン ４．６−ジアミツー２−ヒドロキシ−５−二トロンピリミジン ４．５−ジアミノ−６−ヒドロキシピリミジン２．４−ジアミノ−６−ヒドロキ シピリミジン４．６−ジアミツー２−ヒドロキシピリミジン４．６−ジアミツー ２−メチルメルカプトピリミジン２．４−ジアミノ−６−メチル−５−二トロピ リミジン４．５−ジアミノ−６−メチル−２−チオピリミジン２．４−ジアミノ −５−二トロビリミジン４．５−ジアミノピリミジン ４．５−ジアミノ−２−チオピリミジン４．５−ジアミノ−６−チオピリミジン ４．６−ジアミツー２−チオピリミジン５．６−ジアゾウラシル ５−ジアゾ−２゛−デオキシウリジン ５−ジアゾウラシル ４．６−ジクロロ−５−アミノピリミジン２．４−ジクロロ−６−メチルピリミ ジン２．４−ジクロロピリミジン ４．６−ジクロロピリミジン ２°、３°−ジデオキシシチジン ２°、３゛−ジデオキシウリジン ２．４−ジェトキシピリミジン ５．６−シヒドロデオキシウリジン ５．６−シヒドロー２，４−ジヒドロキシ−６−メチルピリミジン ５．６−シヒドロー２．４−ジヒドロキシピリミジンジヒドロ−６−メチルウラ シル ジヒドロウラシル ジヒドロウリジン ２．６−シヒドロキシー４−アミノ−５−ニトロンピリミジン ２．６−シヒドロキシー４−アミノピリミジン２．４−ジヒドロキシ−６−メチ ル−５−ニトロピリミジン ２．４−ジヒドロキシ−６−メチルピリミジン２．４−ジヒドロキシ−５−ニト ロピリミジン４．６−シヒドロキシー５−二トロン−２−チオピリミジン ４．６−ジヒドロキシピリミジン ２．４−ジヒドロキシピリミジン−６−メチルスルホン２．４−ジヒドロキシ− ２−チオピリミジン１．５−ジメチルシトシン Ｎ、Ｎ−ジメチル−２°−デオキシシチジン１．３−ジメチルウラシル ５．６−シオキシウラシル ２．４−ジチオピリミジン ３、Ｎ′−エテノシチジン ５−エチル−２゛−デオキシウリジン ２−エチルメルカプト−４，６−ジアミツピリミジン５−フルオロ−２°−デオ キシウリジンヘキソバルビタール ５−ヒドロキシメチルシトシン ５−ヒドロキシメチル−２′−デオキシウリジン４−ヒドロキシ−６−メチル− ２−チオピリミジン５−ヒドロキシメチルウリジン ４−ヒドロキシピラゾロ−（３，４−ｄ）ピリミジン２−ヒドロキシピリミジン ４−ヒドロキシピリミジン ４−ヒドロキシ−２−チオピリミジン ５−ヒドロキシウラシル ５−ヒドロキシウリジン ６−ヒドロキシウリジン ５−ヨード−２′−デオキシシチジン ５−ヨードオロト酸 ５−ヨードウラシル ５−ヨードウリジン ２゛、３°−０−イソプロピリデンシチジン２“、３°−イソプロピリデンウリ ジン５″−トリリン酸５−メルカプトウラシル ５−メチルシトシン ５−メチル−２°−デオキシシチジン ５−メチル−２−チオシトシン ４−メチル−２−チオウラシル ２−０−メチルチミジン ３−メチルチミジン ４−〇−メチルチミジン ３〜メチルウラシル ６−メチルウラシル ２°、Ｏ−メチルウリジン ３〜メチルウリジン ３゛−０−メチルウリジン ５〜メチルウリジン ５−二トロバルビツール酸 ５−二トロー６−メチルウラシル ５−ニトロオロト酸 ５−ニトロソチオバルビツール酸 ５−ニトロソ−２−４−６−）リアミノピリミジン５−二トロウラシル ３′−オキサウラシル ５−プロピル−２−チオウラシル ６−ｎ−プロピル−２−チオウラシル リバビリン ５−スルファミノウラシル ２−スルファニルアミドピリミジン テトラヒドロウリジン ２−チオ−６−アザウリジン ２−チオ−５−カルボキシウラシル ４−千オー２′−デオキシウリジン チオメチルウラシル ２−チオピリミジン ２〜チオウラシル ５〜チオウラシル ２−チオウラシル−５−カルボン酸 ４−チオウリジン ２．４．５−トリアミノ−６−ヒドロキシピリミジン４．５．６−）リアミノ− ２−ヒドロキシピリミジン２．４．６−トリアミノ−５−ニトロソピリミジン２ ．４．６−トリアミノピリミジン ４．５．６１−リアミノピリミジン ２．４．６−１リクロロピリミジン トリフルオロチミジン ２．４．５−トリヒドロキシピリミジンウラミル。

更に、ホスホリボシルビロリン酸シンテターゼのレベルを高めることにより、ヒ スチジン類似体及びトリプトファン類似体のようなアミノ酸票似体に対する耐性 を高め、これによってＰｄＮ蓄積を増加するような本発明の基質類似体耐性突然 変異を導入することができる。あるいは、アルギニン類似体耐性を使用してカル バモイルリン酸シンテターゼの量又は活性と増加させ、同様にＰｄＮ産生量を増 加させることができる。ＣＴＰシンテターゼ（ＬＬＬＧ）を阻害するグルタミン 類似体６−ジアシー５−オキソノルロイシンに対する耐性の結果、ＰｄＮ産生量 を増加させることもできる。

−７然亦　１本発明によると、ＰｄＮ産生量を増加するために、代謝最終産物耐 性突然変異をＰｄＮ産生細胞に導入することができる。生存細胞が最終産物耐性 を与える突然変異を有するように、最終産物濃度を漸増させながら突然変異誘発 又は非突然変異誘発細胞を培地に暴露することにより、最終産物耐性突然変異を ＰｄＮ産生微生物細胞に導入することができる。上述のように、最終産物耐性を 与える１種以上の遺伝子を含むプラスミドを使用してＰｄＮ産生細胞を形質転換 させ、こうしてＰｄＮ産生Ｉを増加させることができる。このような突然変異に 使用されるプラスミド及び細胞源も同様に、例えばＥ、ｃｏｌｉ　Ｇｅｎｅｔｉ ｃ　５ｔｏｃｋ　Ｃｅｎｔｅｒ及びＢａｃｉｌｌｕｓ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　５ｔｏ ｃｋ　Ｃｅｎｔｅｒから市販されている。

適切な最終産物耐性突然変異は、例えばチオウラシル、アザウラシル、フルオロ ウラシル、フルオロオロト酸、フルオロシチジン、フルオロデオキシウリジン、 フルオロデオキシシチジン、フルオロウリジン、アンドチミジン、ピリミジンジ デオキシヌクレオチド、及び他のピリミジン票似体（例えばアジドピリミジン、 シアノピリミジン及び表１に示すような顕似体）に対する耐性を与えるような突 然変異である。これらの突然変異体は本発明によると、毒性票似体に対する耐性 がしばしばＰｄＮの過剰産生により達せられるという事実により、ＰｄＮ合成及 び蓄積を増加することができる。

更に、組換微生物によるＰｄＮの産生を増加させるために、リボヌクレオチドレ ダクターゼ活性、又は別のピリミジン生合成酵素の活性の調節に影響するような プリン最終産物頭似体耐性突然変異を導入することもできる。プリン想似体の例 を表２に列挙する。こうして本発明によると、ＰｄＮ最終産物耐性突然変異を使 用して、類似のＰｄＮ感受性株よりも多量のＰｄＮを産生ずることができる。

２ニブリン ３′−〇−アセチルー２′−デオキシアデノシン３°−０−アセチル−２′−デ オキシシチジンＮ゛−アセチル−２′−デオキシシチジンＮ゛−アセチルグアニ ン ２−アミノ−６−ペンジルメルカブトプリン２−アミノ−６−ベンジルチオプリ ン ２−アミノ−８−ブロモ−６−ヒドロキシプリン２−アミノ−６（α−カルボキ シエチル）−メルカプトプリン ２−アミノ−６−カルボキシメチル−メルカプトプリン２−アミノ−６−クロロ プリン ２−アミノ−６−クロロプリンリボシド６−アミノ−２，８−ジヒドロキシプリ ン８−アミノグアノシン ２−アミノー６−メルカプトプリン Ｎ゛−ジメチルグアノシン １．７−シメチルキサンチン ３．７−シメチルキサンチン ２．８−ジチオ−６−オキシプリン ５’−（Ｎ−エチル）−カルボキサミドアデノシン９−エチルグアニン ６−ニチルメルカブトプリン ６−ｎ−へブチルメルカプトプリン Ｎ’−（２−ヒドロキシエチル）アデノシン６−（β−ヒドロキシエチルアミノ ）プリン１−ヒドロキシ−イソ−グアニン ２−ヒドロキシ−６−メルカプトプリン６−ヒドロキシ−２−メルカプトプリン ２−ヒドロキシ−６−メチルブリン ６−ヒドロキシー１−メチルプリン ２−ヒドロキシプリン ６−ヒドロキシプリン ２−ヒドロキシ−６−チオプリン ６−ヒトロキシー２−チオプリン ５゛−ヨード−５°−デオキシアデノシン６−ヨードプリン Ｎ’−（Δ゛−イソペンテニルアデノシン６−イソプロポキシプリン ２°、３’　−０−イソプロピリデンアデノシン２゛、３°−〇−イソプロピリ デングアノシン２°、３°−○−インプロピリデンイノシン２′、３°−０−イ ソプロピリデン−６−チオイノシン２−メルカプトイノシン ２−メルカプトプリン ６−メルカプトプリン ６−メルカプトプリンアラビノシド ６−メルカブトブリン２′−デオキシリボシド６−メルカプトプリンリボシド ２−メルカブトピリミジン プリン−、ピリミジン−及びヌクしオシド−輸送突然変１．ヌクレオシド輸送タ ンパク質３コードする突然変異遺伝〒分担持する同定株から形質導入することに より、プリン−、ピリミジン−又はヌクレオシド−輸送突然変異を本発明のＰｄ Ｎ産生細朧に導入することができる。輸送突然変異が細胞培地中のＰｄＮ濃度な 増加させるように、直接突然変異により適切な輸送突然変異を行うこともてきる 。

いずれの場合も、ＰｄＮ蓄積の増加はヌクレオシド輸送タンパクの活性又は濃度 の減少の結果として得られる１例えば、ＬＬＬＧ及びＬＬＬＣ（ヌクレオシド取 り込み突然変異）及びｔｓｘ　（ファージＴ６耐性及びヌクレオシド輸送突然変 異）のようなヌクレオシド取り込みレセプター突然変異が存在する。このような 突然変異のために使用されるプラスミド及び細胞源は、例えば上記大字から市販 されている。このような輸送突然変異を有する細胞の例としては、大腸習株ＣＭ Ｇ　１１１８及びＣＭＧ　１１５８（下記実施例９参照）を挙げることができる 。

にり　″′然１　。ＰｄＮ産生と増加させるためには、酵素活性を増減させるプ ラスミドで本発明のＰ　＋Ｊ　Ｎ産生細泡念形質転換させる二とにより、代謝突 然変異を導入することしてきる０例是ば、突然′Ｘ異がチミジンの分解金触媒す る酵素チミジンホスホリラーゼ（ｄｅ。

Ａ）のき成又は活性な阻害するように、ｄｅリオベロン突然変異をＰｃ１Ｎ産生 細胞に導入することができる（例えば実施例９の株（ＭＧ　１００４１照）、更 に、ウリジ〉・ホスホリラーゼの１及び活性を低下させるウリジンホスホリラー ゼ（上止Ｌ）突然変異を導入し、ウソジンホスホリラーゼの基質であるチミジン 又はデオキシウリジンの分解を減少させることができる（例えば、実施例９の株 ＣＭ　Ｇ１０９６及びＣＭＧ　１１０５９照）、更に、炭水化物代謝をヘキソー ス−リン酸経路にシフトさせ、細胞中のリボースレベルを増加させることにより 、ＰｄＮ産生を更に増加させるホスホグルコースイソメラーゼ（ＬＬＬ）突然変 異体を導入することらできる０本発明の別の態様によると、チミジンからＴ　Ｍ 　Ｐへのリン酸化を阻止するチミジンキナーゼ阻害突然変異を導入することによ り、チミジンの産生き増加させることができる。

あるいは、ｄ　Ｕ　Ｍ　ＰからＴＭＰの形成を阻止することによりｄ　Ｕ　Ｍ　 Ｐ及びデオキシウリジンの蓄Ｔｌｅ増加させるチミジル酸シンターゼ突黙変異と 導入することができる。このような突、′ム変異′３：存する生物は、成長のた めにチミシ′ンを使用できるように活性千ミジ〉キナーゼ酵素を必要とする。チ ミジル酸シンターゼの阻害は、温度恣受性＃素の使用により、又は例えば従来の 手順３朗用してファージφＥ、５Ｐ８２Ｇ又はＳＰ８のようなしドロキシメチル ウラレル含有Ｂａｃｉｌｌｕｓバクテリオファージから得られるチミジル酸シン ターゼインヒビターをコードする遺伝子の調節発現により得られる。Ｈａｓｌａ ｍ　ｅｔ　ａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏ　ｈｖｓ、Ａｃｔａ　１３４：３１ ２　（１９６７）；　Ｈａｙｗａｒｄ　Ｖｉ＋−ｏｌ、）・ｖ３８：５３８　（ １９６９）；　Ｒｏｓｃｏｅ　＆　Ｔｏｅ　＆　Ｔｕｃｋｅｒ、　Ｖｉｒｏｌｏ 　２９：１う７　（１９６６）フ照、この場き、ｄ　Ｕ　Ｍ　ＰはＰｄＮＰアー ゼ（例えばｄ　Ｔ　ｈＩ　Ｐアーゼ）によりデオキシウリジンに転ｆヒされ得る 。従って、デオキシウリジ〉は本発明のＰｄＮ産生紀胞により産生される凹成可 能な量を培地中に特異的に蓄積することができる。

本発明によると、ＰｄＮの産生３増加させるために、池の代ｊ（酵素をコードす る他のＤ　Ｎ　Ａを導入ノーることらてきる。この点て適切なりＮＡは、カルバ モイルリン酸シンター　（’　（ｃ　ａ　ｒ　Ａ　Ｂ　）　、ア、スパラギン酸 トランス力ルバモイラーゼ（Ｊ＝ＬＬ二ＢＩ）、ジヒドロオロターゼ（ＬＬＬｃ ）、ジヒドロオロトオキシダーゼ（ＬＬＬＤ）、オロト酸ホスホリボシルトラン スフェラーゼ（ＬユニＥ　）　、オロチジン５°−リ〉酸デカルボキシラーゼ（ １にＦ）、ＣＴＰシンターゼ（ＬＬＬＧ）、ヌクレオシドリン酸キナーゼ（Ｌ： ＬＬＨ）、ホスホリボシルトビロリン酸シンテターゼ（Ｊ？ＬＬＳ）−ヌクレオ シドニリン酸キナーゼ（Ωｄｋ）、リボヌクレオシドニリン酸レダクターゼ（ｎ ｒｄ）−ｄＣＴＰデアミナーゼ（ｄｃｄ）　、ｄＵＴＰアーゼ（ｄａｔ）、チミ ジル酸シンターゼくニーカーΣ−Ａ）、セリ〉ヒドロキシメチルトランスフェラ ーゼ（ＬＬＬＡ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ｆｏｌＡ）、チオレドキシン° （ｔ　ｒｘＡ）、チオレドキシンレダクターゼ（ｔ　ｒｘＢ）、グルタチオンレ ダクターゼ、グルタチオンシンターゼ、ゲルタレトキシン、ｄＴＴＰアーゼ、ｄ ＣＴＰアーゼ及びｄＣＭＰデアミナーゼをコードするＤＮＡ３含む、これらの！ ！云子は、上記大学の所蔵及びＡＴＣＣ（ＲｏｃｋｖｉＬｌｅ　Ｍａｒｙｌａｎ 　ｄ　）　’ｉ：　ａｉむ商業的・ノースから容易に入手可能である。報告され ているＤＮＡ配列又は遺伝子マ・ｌピング情報に基づき、これらの遺伝子を従来 の手順（例えばＡｕ５ｕｂｅｌｅｔ　ａｌ！Ｊｉ、ＣＵＲＲＥＮＴ　ＰＲＯＴＯ ＣＯＬＳＩＮ　ＭＯＬＥＣＵＬＡＲＢＩＯＬＯＧＹ、Ｗｉｌｅｙ　Ｉｎｔｅｒｓ ｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ。

［１９８７，１９８９］参照）によりクローニングすることしてきる。

本発明に従って回収可能な量のＰｄＮを発現させるために逍切な培養ｊＢｎは、 回収可能なｌのＰｄＮを蓄積し得るＰｄＮＰアーゼ酵素をコードする組換ＤＮＡ 配列を発現する培養原核及び真核細胞を含む、好適耶様によると、回収可能な量 のＰｄＮを製造するために、従来の技術（例えば−最にＡｕ５ｕｂｅｌ　ｅｔ　 ａｌ、前出の文献参照）を使用して、枯草旦（例えばＨａｒｄｙ、二ｎ　ＤＮＡ ＣＬＯＮＩＮＧ、　ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ、０ｘｆｏｒｄ２：１−１７　［１９８ ５］参照）、大腸菌又はコリネバクテリウム（例えばＤｕｎｉｃａｎ　＆　５ｈ ｉｖｎａｎ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏ＝・　７：１０６７−７０こ１つＳつコ讐 照）のような培養細菌細胞、及びＳ　ａ　ｃＣｈ　ａ　＋〜ＯＩｌｌ・（−Ｃ５ のよ〕な真手亥上ａ養細朧に、クローン１ＰｄＮＰアーゼコーデイングＤＮＡを 組み込むことができる。乙つとも、ＰｄＮ産生のための一最代ａ（経路はほとん どの型のａ胞で類似しているので、本発明のＰｄＮを産生させるために池の細胞 型も適切である。

大腸菌及び枯草面は、ピリミジン生合成の遺伝現象が詳しく解明されており、従 来の遺伝子及び組換ＤＮＡ技術の両方による株構築のための技術が発達されてお り、株がエンドトキシンのような毒性副産物を産生しないので、本発明では大腸 菌及び枯草面を使用すると好適である。好適態様では、親株として野生型枯草菌 株、又はより好ましくは上記突然変異の１種以上を既に有する株を使用する。

以下、実施例により本発明と更に説明する。

ＬＬＬＬ二代表的なピリミジンデオキシリボヌクレオチドホスホヒドロラーゼ（ ＰｄＮＰａｓｅ）の精製ＰｄＮＰａ５ｅ、即ちｄＴＭＰａｓｅを産生及び精製す るために、Ｗ。

５ｕｂｔｉｌｉｓ　ＣＭＧ３５６（＾ＴＣＣ３３２３４）を３７℃でＯＤ、、、 １．０まで増殖させ、バクテリオファージＰＢＳＩを怒染の多重度約２．５〜５ で添加した。振蕩しながら３０分インキュベーション後、培養物を氷上で冷却し 、遠心分離により細胞を集めた。細胞を、［衝液Ａ　［１ｍＭエチレンジアミン 四酢酸（ＥＤＴ＾）を含む１０−ＭＴｒｉｓ−ＦＩＩＪ、　ｐＨ７，５］中で再 懸濁させ、フレンチプレッシャーセルに一度通して破壊した。細胞破片を遠心分 離により除去し、最終濃度１．１５＄（ｗ／ｖ）まで硫酸ストレプトマイシンを 添加して抽出物から核酸を沈澱させた。沈澱した核酸を遠心分離により除去し、 ストレプトマイシン上清溶液を酵素の精製に使用した。

硫酸アンモニウムを硫酸ストレプトマイシン上清に添加して、最終濃度５０１（ ｗ／ｖ）とした、沈澱した蛋白質を遠心分離して除去し、上清溶液と、緩衝液Ａ 中５０１硫酸アンモニウムで平衡させたＰｈｅｎｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ’″ （商標）カラム（２，６ｘＺＯｃｚ）（Ｐｈａｒｍａｅｉａ　ＬＫＢ製）に加え た。カラムを約１００ｚ１の緩衝液Ａ　＋０．１Ｎ　ＮａＣ１で洗浄し、酵素を ２００ｘ１のＭ街液Ａ＋０、ＩＮ　ＮａＣ１及び２００ｚｌの＆！衝液Ａから作 成した直線勾配Ｍ衝液、次いで蒸留水２００口でカラムから溶離した０次いで画 分をｄＴＭＰａｓｅ活性について分析した。

ｄＴＭＰａｓｅの分析を以下の如〈実施した。分析混合物を、１０ｕｆ　ＬＭ　 ＭＥＳ（ｐＨ６，２＞：　５ｕｔ’　１００ｍＭ　ＭｇＣｌ２　；　５μｌ　１ ０ｍＭ　ＥＤＴ＾；１５ｐ１２０ｍＭ　ｄＴＭＰ　；及び酵素を含んで最終容積 が１２５１１になるまでの量のＩｆ２０として作成した。分析混合物をミクロフ ユージ（ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ）管に入れ、酵素を含む画分を添加し、３７℃で１ ５分インキュベートした１次に、酸モリブデート試薬（Ｓｉｇｍａ製）２００Ｉ Ｉｆ、次いでＦｉｓｋｅ−３ｕｂｂａｒｏｗ還元剤（８，６ｍｇ／水ｗｆ、新し く製造した）９２５μｌを添加した。この混合物を室温に２０分放置し、次いで ７５０ｎｎに於ける吸光度（Ａｔｓｏ）を測定した。標準曲線に基づいて無機Ｐ ｉを計算した。

ｄＴＭＰａｓｅ活性を含む画分をプールし、＃ＩＬ衝液Ａで平衡させたＤＥＡＥ −イオン交換カラム［好適なカラムは５ｅｐｈａｃｅ！（商標）カラム；　Ｐｈ ａｒｍａｃｉａ−ＬＫＢ製である］　（１，６ｘ　ＺＯｃｌ）に直接ロードした 。カラムを５０１１の＊＊液Ａ　＋　０．１Ｍ　ＮａＣ１で洗浄し、酵素を２０ ０ｍＭのＩｌｌ液Ａ　＋　０．１Ｎ　Ｍａｃｌと２００ｍ１の緩衝液Ａ＋０．３ Ｍ　Ｈａ（Ｊから作成した直線勾配液で溶離した。酵素は約０．２〜０．２５１ ４のｔｈｃｌ濃度で溶離した。

ＤＥＡＥ−５ｅｐｈａｃｅ　Ｉ　（商標）カラムがちの活性画分をプールし、緩 衝液Ａの溶液１：１で希釈し、酵素をＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｃｅ　ｌ　（商Ｗ） の小さなカラム（２ｔｌ）に結合させ、次いでこれを０．５８　ＮａＣ１を含む 緩衝液Ａの最小容積で溶離することにより濃縮した。

濃縮した酵素調製物を１１！衝液Ａで平衡させた５ｅｐｈａｄｅｘ（商標）Ｇ− １００（１，６ｘ　ＬＯＯｃｍ）にロードし、同緩衝液で溶離した。

活性画分を上述の如く小さなりＥＡＥカラムで濃縮し、緩衝液Ａで透析した。４ ［胞２０ｇ（湿重量）がら酵素的２１１９を単離した。精製した酵素をＳＤＳポ リアクリルアミドゲル電気泳動で分析し、純度が少なくとも９ｏｚで、分子量約 ２９，０００ダルトンであると決定した。酵素調製物的ｉｏｏ、、を蛋白質のア ミノ末端（Ｎ−末端）配列の決定に使用した６１１λ１１精製したＰｄＮＰａｓ ｅ（ｄＴＭＰａｓｅ）の蛋白質シーフェンシング 実施例１で得られた精製ｄＴＭＰａｓｅ蛋白質調製物を、慣用法［Ｎｅｅｄｌｅ ｎａｎ、ＰＲＯＴＥＩＮ　５ＥＱＵＥＮＣＥ　ＤＥＴＥＲＭＩＮＡＴＩＯＮ、Ｓ ｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎ、Ｙ、（１９７０）を参照コによるアミノ末 端シーフェンシングに使用した。　ｃｌＴＮＰａｓｅのアミノ末端での最初の２ ０個のアミノ酸の配列及び酵素をコードするための考えられ得るヌクレオチド配 列を図３に示す。

アミノ酸配列から推理し得る種々のヌクレオチド配列に基づいて、市販品から混 合オリゴヌクレオチドプローブの２セツトが得られた。１０一プ混合物の配列及 び対応するアミノ酸配列を図４に示す、最初の７つのアミノ酸をツー塩基オリゴ ヌクレオチドプローブ中に含まれていた。

オリゴヌクレオチドプローブの両方の混合物を３２ｐで末端標識し、バクテリオ ファージＰＢＳ　ＤＮＡ並びにＢ、５ｕｂｔｉｌ　ｉｓ及びＥ、ｃｏｌｉゲノム ＤＮ＾のＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレアーゼ消化物のササンプロットにハイブリ ダイズするために使用した。

末端標識、ハイブリダイゼーション、ササンプロット及び同様の実験は、一般に Ｍａｎｉａｔｉｓら、１４０ＬＥｃＵＬＡＲＣＬＯＮＩＮＧ　：＾ＬＡＢＯＲＡ ＴＯＲＹ　ＮＡＮＵＡＬ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒ ａｔｏｒｙ、ＮｅｗＹｏｒｋ　、　（１９８２）によった、低いストリンジェン ト（ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ）条件下で、ＰＢＳＩ由来の５−ｋｂ　ＥｃｏＲ［フ ラグメントはプローブに強くハイブリダイズしく図５）、幾つがの軽いバンドが Ｂ、５ｕｂｔ　ｉ　Ｉ　ｉｓゲノムＤＮ＾レーンで観察できた。しかしながら、 町、竺匡ゲノムＤＮ＾へのハイブリダイゼーションは検出できなかった。　ＰＢ ＳＩ　ｃｔＴＭＰａｓｅ　ＤＮＡの強いシグナルを得るために必要な低いストリ ンジェントハイブリダイゼーション条件（２７℃）及び洗浄条件（３８℃）は、 オリゴヌクレオチドで計算した融点（Ｔｍ）に基づいた予想より低かった。

１１λ１：代表的なＰｄＮＰａ５ｅ（ｄＴＨＰＡｓＥ）ＤＮＡの単離バクテリオ ファージＰＢＳＩ　ＤＮＡを、ＤＮＡライブラリーを調製するためにファージ粒 子から単離した。　ＰＢＳＩファージ溶解物（１０００ｘ＆、約５　Ｘ　１０” ｐｆｕ／１１）をデオキシリボヌクレアーゼＩ　（１ｚＮ／Ｌ）及びリボヌクレ アーゼＡ　（１ｘｉ’／Ｌ）で処理し、宿主核酸を除去した。ヌクレアーゼ消化 後、溶解物を０．４５ミクロン膜を通過させて、ＰＢＳＩの感染によっても溶解 しなかった総ての細胞及び細胞の破片を除去した。　ＮａＣ４を０．５Ｍまで、 及びポリエチレングリコール５ｏｏｏを濃度６　！（ｗ／Ｖ）まで添加すること によりファージ粒子を沈澱させ、遠心分離により集めた。混じっている宿主核酸 及び細胞破片を、ファージを０．１Ｎ　［酸ナトリウム、ｐＨ７、ｏ、Ｏ，ＬＭ 　ＮａＣ１（ｉｔ酸塩緩衝液）で作成した５〜４０１グリセロールブロツク勾配 でペレット化することによりさらに除去した。ファージ粒子を硫酸塩Ｍｔｌｔ液 に再懸濁させ、ＤＮＡを２＄ＳＤＳで処理し、次いでフェノール、ｎ−ブタノー ルで数回抽出し、次いで０．ＯＩＮ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、０．００１Ｍ　ＥＤＴ ＾、　ｐＨ８，０で透析することにより単離した。

溶解物１リツトルから、約８．６１の高分子量ＤＮＡが得られた。

東」１舅」−：　ＰｄＮＰａｓｅ（ｄＴＭＰＡｓＥ）をコードするＤＮＡを含む ＤＮＡライブラリーの産生 ＰＢＳＩゲノム（例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ、上記参照）のランダム代表を有す るＤＮＡライブラリーを製造するために、Ｐｅ５ｔ　ＤＮＡを部分的にＤＮａｓ ｅｌで消化して、ＤＮＡをランダムに切断して１〜５キロ塩基対（ｋｂ）範囲の フラグメントとした０次いでＤＮＡを７４　ＤＮＡポリメラーゼで処理し、末端 を平滑とし、フラグメントをゲル電気泳動でサイズ分画して１〜５ｋｂの範囲の フラグメントを得た。　５ＬＩＩａｒで線状としたアラスミドｐＵＣ１９とフラ グメントのプラント端連結反応及びＥ、ｅｏｌｉ　ＫＴ８０５２株の形質転換［ Ｋｕｎｋｅｌら、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚ　ｓｏｌ、　１５４：３６７ 〜８２（１９８７）］により、頻度約７ｚで組換形質転換体を産出した。平均挿 入サイズ（ＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲｒ　２回消化フラグメントの合計より推定） は、少なくとも２ｋｂであることが知見された。この平均挿入サイズは、フラン キング調節配列（ｆｌａｎｋｉｎｇ　ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　５ｅｑｕｅｎｃｅ ）と共にｄＴＭＰａｓｅ遺伝子（約９００ｂｐの推定コード配列）を含むのに十 分な大きさであった。

大」１脛ｊ−：　ＰｄＮＰａ５ｅ（ｄＴＮＰＡｓＥ）をコードするＤＮＡにツい てのＤＮＡクローンライブラリーのスクリーニングＤＵＣ１９内のＤＮａｓｅｌ で生成したＰ［ｌＳＩ　ＤＮＡフラグメントの遺転子ライブラリーを、ポリヌク レオチドキナーゼを用いて３２ｐで放射性標識したオリゴヌクレオチドプローブ でコロニーハイブリダイゼーションすることによる慣用法（例えば、Ｍａｎｉａ ｔｉｓ、上記参照）を用いてスクリーニングし、幾つかの強い陽性のクローンを 比較的高いバックグラウンドで同定した。推定上の陽性クローンを取り出し、ｌ ａｃインデューサーＩＰＴに及びｘ−ｇａｌインディケータ−を含むＬＢ＋アン ピシリンプレート上に低いコロニー密度でプレートした。

各プレート由来の幾つかの白いコロニー（組換体クローン）をＬＢ＋アンピシリ ンプレート上に拾い出し、クロラムフェニコールに露出して増殖且つプラスミド 増幅後、ニトロセルロース膜に移した。コロニーをオリゴヌクレオチドプＸ　。

−ンし、再スクリーン物の陽性コロニーの幾つかを図６に示す１強くハイブリダ イズしたコロニーをさらに、ＥｃｏＲＩで消化したプラスミドＤＮ＾のササンプ ロット分析によりスクリーンした。　ｄＴＭＰａｇｅ遺伝子の５゛末端を含んで いた２つのコロニー（ｐｃＧｌｏｏ及びｐＣ［：１０１）を同定し、ｄＴＭＰａ ｇｅをコードすることをＤＮＡ配列分析により確認した１両方のクローンは、各 クローンのコード領域の長さにより表されるように、その各々の３′末端で配列 を失っていた。

さらに２２の推定上の陽性クローンが、３２ＰでプローブしたｄＴＭＰａｓｅ− 特異性オリゴヌクレオチドプローブで、ＤＮａｓｅＩで生成したＰＢＳＩ　ＤＮ Ａライブラリーをスクリーニングすることにより得られた。この場合のプローブ は、図７に示されている（全コード配列を単離後、慣用法により配列決定したよ うに）ｄＴＭＰａｇｅ遺伝子の２１２〜１９６塩基と相補の１７塩基のオリゴヌ クレオチドであった。再スクリーニング後、ｄＴＭＰａｓｅ遺伝子配列を含む１ ０個の陽性クローンを同定した。

制限分析によるこれらの１０個の陽性クローンの特徴付けにより、全ｄＴＭＰａ ｇｅ遺伝子を含むに十分な長さく４．５ｋｂ）のＰＢＳＩＤＮ＾を有する１個の クローン（ＧＩＣに１０３）を得た。残りの９個のクローンは、クローン１９（ ｐｃＧｌｏｏ）及び２０（ｐｃＧｌｏｌ）と同様であった。これらは、ｄＴＮＰ ａｓｅ遺伝子の５°末端由来の配列を含み、遺伝子の３′末端であると予想され たよりも前で終端していた。プラスミドｐＣに１０３に存在するｄＴＭＰａｓｅ 遺伝子配列の正確な上流の境界を、ＤＮＡ配列分析により決定し、これがｄＴＮ Ｐａｓｅ遺伝子のヌクレオチド８８に位！していることが知見された。　ｐｃｔ ｌ：１０３は全ｄＴＭＰａｓｅ遺伝子を含んでいなかったが、ｐｃＧｌｏｏ及び ｐｃＧｌｏｌ（図８）由来の重複フラグメント上に存在する８日オリゴヌクレオ チドだけを損失していた。

これらの重複フラグメントを結合させて、１本のフラグメント上に全ｄＴＭＰａ ｇｅ遺伝子を再生する。

え１１［：代表的なＰｄＮＰａｓｅ（ｄＴＭＰ＾ＳＥ）遺伝子の」、願ハへのク ローニング 遺伝子を再構築してｄＴＭＰａｇｅに所望の酵素活性を発現させるために、部分 クローンの２つの重複フラグメントを、ｄＴＭＰａｓｅをコードする完全な遺伝 子を作成するように組み替えた。使用した２つのクローンは、ｐＣに１００及び ｐｃＧ１０３であった（図８）、プラスミドｐｃｔ；１００に配置したｄＴＭＰ ａｓｅの部分配列をバクテリオファージ８１３にサブクローンし、オリゴヌクレ オチド＾ＹＯＯ６を使用して特定部位の突然変異誘発により修飾しく図９）、図 示の如く遺伝子の予想プロモーターとリポソーム結合サイトとの間にＥｃｏＲＩ サイトを配置したく図１０）。

図１０に示されているように、突然変異した８１３　ＲＦ　ＤＮＡから、ｃｌＴ ＮＰａｇｅリポソーム結合サイトとコード配列の１〜１７６塩基を有する１９６ ｂｐ　ＥｃｏＲＩ−Ｓｃａｒフラグメントが得られた。

図１１に示されているようにｐｃＧ１０３からは、ｄＴＭＰａｇｅコード領域の 残りと遺伝子の３′末端の約７５０塩基対を含む１３００ｂｐ　５ｃａＩ−Ｈｉ ｎｄｌｌｌフラグメントが得られた。２つのフラグメントを５ｃａｒサイトで連 結して、ｄＴＭＰａｓｅの全コード配列からなるＤＮＡフラグメントを製造した 。　ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄｌｌＩ末端をＤＮＡポリメラーゼ（フレノウ）で充 填した後、フラグメントをラムダＰＬプロモーターより下流のプラスミドρＫＣ ３０のＨｐａＩサイトにプラント端連結した（図１１）、このプラスミドで、染 色体上に温度−感受性のラムダｃ　１８５７リプレツサーを有するｊ、ｃｏｌｉ 　Ｋ−１２Δｉｌｌ　（ＡＴＣＣ３３７６７）を形質転換した。３０℃ではリプ レッサーは活性であり、ｐ５を不活（ｔｕｒｎｏｆｆ）のままにする、４２℃で ｃ１８５７リプレツサーは失活し、ｐＬ、から高レベルで発現した。　Ｅ、ｅｏ ｌｉΔＩＩＩに於ける形質転換体の１つは、予想された制限地図を有するプラス ミド（＋）Ｃに１２９）を有しており、これをさらに分析した。　ｐｃＧ１２９ を有するＥ、ｃｏ１ｉΔＨ１は、ＣＭＧ１０８５と命名した。

′！ＪＬＬＬ：【、到」に於けるｄＴＭＰ＾ＳＥの発現ＣＭＧ１０８５株を、ア ンピシリン０．１ｇ／Ｌを含むＬＢブイヨンで００、。。約０．１に増殖させ、 培養物を４２℃に１５分シフトさせ。

３７℃に４５分戻した。培養物ＩＲ１を遠心分離管１．５ｚｌ内で回転させて沈 澱させ、上清を除去した０次いで細胞を生理食塩水または水で洗浄して、再び回 転させた。細胞ベレットを凍結−解凍させ、丁Ｅ（１０ｍＮ　Ｔｒｉｓ−■Ｃ１ ，ｐＨ７，５，ｂ＋Ｍ　ＥＤＴ＾）１００１１１に再懸濁させた。リゾチーム（ ５履ｇ／ＴＥｉ＋０１μｌを添加し、室温で２０分インキュベートした。ＤＮａ ｓｅｒ混合物（ＴＥ＋１０ａＭ　ＨｇＣＴｏ中の２　ｐｇ７ｍｌ　ＤＮａｓｅ　 Ｉ　）１００１Ｉｆｆｉを添加し、室温で１０分インキュベートした１次いで溶 液を２０，０ＯＯｒｐ−で１０分回転させた。上清を、実施例１と同様にｄＴＮ Ｐａｇｅ活性について分析した。

分析結果を表３に示す。

宍旦、粗抽出物のｄＴＭＰａｓｅ活性 抹　比活恒（μ−０１７分／ｍｙ） バクテリオファー：／ｐＢＳＩで感染させたＢ、５ｕｂｔｉｌｉｓ　ＣＭ（：３ ５６　０．１１４酵素含有抽出物も、ウェスタンプロット分析で分析し、３０℃ では交差反応物質が存在しないことが知見されたが、抑制解除したｍ胞に間して は多量の酵素が生成し、酵素は、バクテリオファージＰＢＳＩから精製されたｄ ＴＭＰａｓｅと弁移動（ｃｏ−ｍｉｇｒａｔｅ）　した、これらの結果は、バク テリオファージＰＢＳＩのｄＴＭＰａｓｅ遺伝子がクローンされ且つ発現したこ とを示している。上述のコード領域はｄＴＭＰａｓｅをコードし、５ＯＳ−ＰＡ ＧＥにより決定したその分子量は約２９，０００であり、これはＰＢＳＩで感染 させたＢ、５ｕｂｔｉｌｉｓから単離した精製ｄＴＭＰａｓｅから得られた値と 一致している。温度誘導後、培養物を細胞生死判別試験にかけ、酵素活性が存在 すると直ちに生存率が低下したことが知見された。

酵素活性及び生存率に於ける温度誘導の効果をさらに検討するために、培養物を ３０℃でＯＤ、。。約１．０まで増殖させ、次いで幾つかの高温にシフトさせた 。高温で９０分後、細胞を回収し、抽出して分析した。同時に、この培養物を細 胞生死判別試験にかけた。結果を図１２に示す、この図は、生存率及び酵素活性 が密接に関連していること並びに活性が少しでもあると生存率が大きく減少する ことを示している。

！ｕＬＬＬ：染色体へのｄＴＩ４Ｐ＾ＳＥ遺伝子の組込みｄＴＭＰａｇｅ活性が 低く且つプラスミド上に遺伝子を持たない株を得るために、ｄＴＭＰａｇｅ遺伝 子を」、阻■染色体に組込んだ、ｄＴＭＰａｓｅ／ラムダＰＬレギユロンを染色 体に組込むために、遺伝子及びプロモーターと有するプラスミドｐｃＧ１２９由 来のフラグメントを、図１３に示す如くプラスミドｐＥＹＤＧ１（＾ＴＣＣ３７ ３１６）上に担持されたトランスポゾンＴｎ５　（Ｔｎ５　）［Ｙａｋｏｂｓｏ ｎ及びＧｕｉｎｅｙ、　Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１６０　：　４５１〜４５３ （１９８９）参照］にクローンすると、プラスミドｐＣに１３２が得られた。

このプラスミドを次いでＣＭ、：１０９６株に導入した。検出可能なプラスミド を有さない形質転換体は極めて少ながった。

プラスミドを有し従ってｄＴＭＰａｓｅ遺伝子の多量の複製物をより組込まれた 株だけが得られた。

Ｐ１形質導入により異なる株に容易に移動し得るように、遺伝子をＴｎ５のカナ マイシン耐性遺伝子に組込んだ。プラスミド含有株と比較して染色体組込みｄＴ ＭＰａｓｅ株のｄＴＭＰａｇｅ遺伝子活性は、約５倍活性が低いことが知見され た。

１１１Ｌ：　Ｅ、ＣｏＬＩ株の構築 染色体ｄＴＭＰａｓｅ遺伝子を含む総てのｊ−、ｃｏｌｉ株は、染色体内に欠陥 ラムダ溶原菌（Ｉｙｓｏｇｅｎ）の温度感受性のラムダｃ　ｌ８５７リブレツサ ーを有すると、ラムダＩ）Ｌプロモーター由来のｄＴＭＰａｓｅが制御できる［ Ｂｅｒｏａｒｄら、　Ｇｅｎｅ　５：５！ｌ−７６（１９７９）］。種々の株を 、ＰｄＮ使用を削除して、細胞内のＰｄＮｉ積を減少させて、ピリジミン経路の 調節を解除した突然変異か、またはＰｄＮ感応性を減少させた突然変異を導入す ることにより構築した。殆どの場合、突然変異はＴｎｌＯ挿入変異体を使用する ことにより導入されるか、またはテトラサイクリン耐性を選択することにより密 接に結合したＴｎｌＯ挿入物を共形質導入することにより導入される。他のマー カーも同様に導入し得るように、これらの株より、自発性ＴｎｌＯ欠失を有する テトラサイクリン惑受性誘導体を選択する。構築された幾つかの代表的な株を表 ４に列記した。これらの構築経路は図１４に示されている。

ＰｄＮ耐性変異体は、ＰｄＮの阻害レベルの存在下に増殖させることにより得ら れ、例えば、培地中チミジン２０ｇ／Ｌに対し耐性であった。ラムダＰＬの制御 下、ｄＴＭＰａｇｅ遺伝子を含む総ての株は、４２℃でＬＢプレート上で温度感 受性であった。

表土、　Ｅ、ｃｏｌｉ株 ＣＭＧ１０３１　ＣＭＧ１００４堕 ＣＭＧ１０９６　ＣＭ（：１０９４曲 ＣＭ（：１１１８　ＣＭＧ１１０５　ｔｓｘ：：ＴｎｌＯ本発明のチミジン産生 細胞に導入され得るように、代表的な生合成酵素を発現プラスミドにクローンし た。クローニングは、公知配列（例えば、チミジレートシンターゼ及びリボヌク レオチドレダクターゼ）を元にし、これらの遺伝子を有するプラスミドを表５に 列記した。

飢、プラスミドのリスト プラスミド　説−朋 ｐｃＧ１２９　ラムダＰＬにより制御したクローンしたｄＴＭＰａｇｅを有する ｐＫｃ３０ｐｃＧ１３８　１ａｅプロモーターにより制御されたチミジレートシ ンターゼを有するｐＵＣ１８ １）Ｃに１４４　１ａｃプロモーターにより制御されたりボヌクレオチドレダク ターゼを有するｐＵｃ１８ ｐｃｃ１４８　同調して発現される、チミジレートシンターゼより下流にリボヌ クレオチドレダクターゼ遺伝子を有するｐｃＧ１３８１１１役、操作された株を 使用するＰｄＮ５の産生図１４に示され且つ表４に列記されたように新しい株を 作成し、他の入手可能な株とＰｃ１Ｎ　（チミジンとして）産生力を比較するた めに、振蕩フラスコ実験で試験した。振蕩フラスコ実験を以下の如〈実施した。

ｍ胞を表６に示した培地組成２５ｚｔ’　（２５０ｚ１バツクルフラスコ）でイ ンキュベートした。

ＬＬ、振蕩フラスコ培地（最終濃度：　ｙ／Ｌ）Ｋ、ＨＰｏ、　７ ＮａＨｚＰＯ−４Ｊ　３ ＮＨ，ＣＩ　１ （ＮＨ４）２Ｓ０．　５ Ｍｇ５Ｏ，・７Ｈ２０３ 炭素源　２ ニコチンＷｉＯ・２ チアミンＨＣＩ　０．２ 葉Ｍ　Ｏ，０２５ ｐ−アミノベンゾエート　０．０２５ カナマイシン　０．０１ テトラサイクリン　０．０１２５ 細胞を３０℃及び２５０ｒ、ｐ−１１，で対数増殖相で増殖させた。

培養物がＯＤ、。。０．５〜１．０に達したら、ウリジンまたはウラシルを添加 し、温度を３６〜３７℃にシフトさせて、ｄＴＮＰａｓｅの発現を誘発させた。

！１つかの時点毎にサンプルを採取し、チミジン及び他のヌクレオシドをＭｉｌ ｌｅｒら、　Ｊ、Ｃｈｒｏｍａｔｏ　。

２２８：１６５〜７６（１９８２）に記載の如＜　ＨＰＬＣにより測定しな、細 胞密度が低い場合、力価はＯ〜０．１ｇ／Ｌチミジンであった。

これらの実験に於いて、グリセロールは、チミジン産生に関してはグルコースよ りも良好な炭素源であり、　ｄＴＭＰａｓｅ誘発時にウリジンまたはウラシルを 供給するとへ生産性は殆ど等しく並びに、ＣＭＧ１１２８及びＣＭ（：１１５８ を含む、チミジンに対し耐性である株は、−貫して最高の力価を与えることが知 見された。試験した総ての株は、その染色体上にｄＴＭＰａｇｅの遺伝子を有し ていた。

え１１１：高い細胞密度に於ける振蕩フラスコでのＰｄＮの産生 ＣＭＧ１１２８（ｐｃｃ１３８を含む）、ＣＭに　１１２８　（ｐｃｃ　１４４ を含む）、０ＭＧ１１５８（ｐｃＧ１４４を含む）及び０ＭＧ１１５８（ｐｃＧ １４８を含む）の培養物を１００μｇ／ａＬアンピシリンを有するＬＢ寒天プレ ート上に画線培養し、３０℃で増殖させた。シングルコロニーを、２５０ｇ１バ ツクルフラスコ中の１００ｕｙ／ｚ１アンピシリンを有するＬＢブイヨン２５− Ｌに取り出し、３０℃で８時間インキュベートした。

この培養物（０，５ｍＬ）を使用して、表７に記載の組成を有するチミジン産生 培地を有するフラスコに接種した。

ｆＥ７．チミジン−産生培地 ＫＨＰＯ４３，５ｙ／Ｌ ＫＨ２ＰＯ４１，５ｇ／Ｌ （Ｎｔｌ−）ｚＳＱ−２，０ｇル Ｍｇ５０４０．４　ｙ／Ｌ クエン酸ナトリウム　０．５　ｇ／Ｌ 炭酸カルシウム　１０　ｇ／Ｌ ＰＰ９０ＢＴ（Ｄｅｌｔｏｗｎ）　８　ｇ／Ｌグリセロール　５０　ｇ／Ｌ ビオチン　Ｑ、Ｚ　ｚｙ／Ｌ チアミン　１．０　ｍｌＦ／Ｌ ニコチン酸　１．Ｏｚｇ／Ｌ ｐ−アミノベンゾニー）−１，０ｍｙ／Ｌアンピシリン　０．１　ｇ／Ｌ ＺｎＳＯ，・７Ｈ２００，２３２ｕ／ＬＭｎＳＯ，０，１７８１５１／Ｌ Ｈ３ＢＯ３０，０５６ｚｙ／Ｌ ＣｕＳＯ４・５１（２００，１００ｚｙ／ＬＮａ２ＭｏＯ，０，０３９ｍｇ／Ｌ ＣｏＣ１ｚ４Ｌ０　０．０４２　ｍｙ／ＬＫｌ　Ｏ，０６６ｍｇ／Ｌ ＦｅＳＯ＜４ｆｌｚ０　０．０４０　ｍｇ／ＬＮｉＣＩ・６Ｈ２００，０００４ ｚｙ／Ｌフェノールレッド　０　、１　ｇ／Ｌ ２５０ｘ１バッフルフラスコは産生培地２５１１を含んでおり、ＮＢＳ　Ｇ２５ 振蕩機内で３０℃、４００ＰＰＭでインキュベートした。

培養物が６００ｒｎ＋に於ける光学密度１０［希硫酸、１００ｚｆ当たり２１Ｌ 濃ｎ、ｓＯ，（培地中にＣａＣ０＊を溶解させるために）で１＝１１に希釈後に 読取］に達したとき、フラスコを同−ＲＰＭの３０℃の振蕩機から３７℃の振蕩 機に移した。同時に、培地に１．１４ｇ／Ｌ　Ｄ、Ｌ−メチオニン、２．８６ｇ ／Ｌ　グリシン、１４．３ｙ／Ｌ自己溶解した酵！（＾ｒｄａｍｉｎｅ　ＹＥＰ −Ｓ、Ｃｈａｍｐｌａｉｎ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ製）、ウラシル２．８ｇ／Ｌ 及び０．２５ｍＭ　ＩＰ丁（：を補った。フラスコ内のｐＨを、フェノールレッ ド指示染料の色により判別して、４ＮＮＨ，０１１を添加することにより約７． ０に保持した。

チミジン及びデオキシウリジン濃度を実施例１０に記載の如（ＩＩＰＬｃで測定 した。接種３０〜３５時間後の産生物濃度は表８に示した。

ＣＮ０１１２８（ρＣ０１３８）　６４．９　３８５　２０．３ＣＭｆ；１１２ ８（ｐｃＧ１４４）　４０６　２２０　１７．３ＣＭに１１５８（ｐＣ（：１４ ４）　４１６　２６９　２１．５ＣＭＣ１１５８（ｐｃＧ１４８）　４２．０　 ４６０　１６．９因ｕ、１４リットル発酵器内のＰｄＮの１０リツトル産生Ｐｄ Ｎ　（例えば、チミジンなど）の１０リツトル産生を例示するために、ＣＮ０１ １２８−ｐｃＧ１３８株を上述の通りであるが１４リットル発酵器内で増殖させ た。培地組成を表９に示した。

ＬＬ、培地組成（最終濃度＋　ｙ／Ｌ）Ｋ２ＨＰ０．　７ ＮＩＬＨ２ＰＯ４’ＬＯ３ Ｎｌ（、ＣＩ　１０ （ＮＨ，）、Ｓ０４Ｓ Ｏ４５Ｎ　、・７Ｈ２０３ グリセロール　１２５ ニコチン酸　０．２ チアミンｕｃｌｏ、ｚ 葉酸　０．０２５ ｐ−アミノベンゾエート　０．０２５ 酵母抽出！ＰＪ１０ ００６００が１０に到達したとき、培養物に以下の成分を供給し、表示最終濃度 （ｇ／Ｌ）とした、ウラシル、３；グリシン。

１；メチオニン、０．２．セリン、１．温度を３６℃に上げ、種々の時点でサン プルを採取し、実施例１１の記載通りに分析した。最大チミジン力価は、１８時 間後で１．ｈ／Ｌであり、デオキシウリジンは少量であった。

別に、ＣＭＧ１１５８／ｐｃＧ１４８株を実施例１２の通りであるが、表１０の 培地組成中で増殖させた。

Ｌ股、培地組成（最終濃度：　ｙ／Ｌ）Ｋ２ＨＰ０４Ｚ Ｋ２ＨＰ０４２ （ＮＨ４）２ＨＰＯ４３ （ＮＦｌ、＞２Ｓ０．　２ ＮｇＳＯａ・７１１２０　０．４ ソルビトール　１００ 酵母抽出物　３０ ニコチンｒ！ｉ０．１ チアミンｌＩＣ４０，１ 葉酸　０．０２５ ｐ−アミノベンゾエート　０．０２５ ００ｉ。。が１０に到達したら、培養物に以下の成分を供給し、表示最終濃度（ ｙ／Ｌ）とした、ウラシル、２；グリシン、１：メチオニン、０．２及びセリン 、１．温度を３９℃に上げ、そのまま１５分放置し、次いで温度を３６℃に下げ て保持し、実施例１１の記載通りに時点で分析した。最大チミジン力価は、１８ 時間後で１．１ｙ／Ｌであった。

他のまたは追加の変異及びクローン遺伝子を、ｄＴＭＰａｓｅ遺伝子を発現する も、仙及びＢ、５ｕｂｔｉｌｉｓの株に導入し、上述の如くチミジンの産生につ いて試験した０選択した株はＰｄＮ（例えば、チミジンなと）を少なくとも１０ ｇ／Ｌ、１リットル当たり少なくとも３０グラムまたは１リットル当たり少なく とも７０グラムの培地濃度で産生し、そのいずれもが医薬的に許容可能な、抗− ウィルス性化合物の工業的生産に好適であった。

！Ｊ！！ｕ：高い細胞密度での振蕩フラスコ内のＰｄＮ（デオキシウリジン）の 産生 ＣＭＧ１１１５（上記表４参照）株を修飾して、本発明に従ってデオキシウリジ ンを産生ずるためにｔｄｋ責チミジンキナーゼ）及び」＾−（チミジンシンター ゼネガティブ）をさらに含む遺伝子型とした。このように（ｐｃｃ：１４４を含 む）ＣＭＣ１１１５株から誘導した修飾様を、１００νｇ／−Ｌアンピシリン及 び５０Ｈｅａ１チミジンを含むＬＢ寒天プレートに画線培養し、３０℃で増殖さ せた。シングルコロニーを、２５０ｘｌバツクルフラスコ内の１１００ｕ／＋１ アンピシリンを含むＬＢブイヨン２５ＪＩＬに取り出し、３０℃で８時間インキ ュベートした。この培養物産生培地２５１１を含む２５０ｚ１バツフルフラスコ を、ＮＢＳ　Ｇ２５Ｌ■、デオキシウリジン産生培地 に２ＨＰＯ４３，５１Ｆ／Ｌ Ｋｌ（２ＰＯ−１，５９／Ｌ （ＮＨ４）２Ｓ０．　２．０　ｙ／Ｌ ＭｇＳＯ，０，４ｇ／Ｌ クエン酸ナトリウム　０．５　’ｉ／Ｌ炭酸カルシウム　１０　９／Ｌ ＰＰ９０ＢＴ（Ｄｅｌｔｏｗｎ）　８　ｉ？／Ｌグリセロール　５０　ｙ／Ｌ チミジン　０．２　ｇ／Ｌ ビオチン　０．２　１１１７Ｌ チアミン　１．０　Ｋｇ／Ｌ ニコチン酸　１．Ｏｘｔｔ／Ｌ ｐ−アミノベンゾエート　１．０　１ｇ／Ｌアンピシリン　０．１　ｉＦ／Ｌ ＺＩＩＳＯ，−７８２００，２３２１１Ｆ／ＬＭｎＳＯ，０，１７８ｚ＃／Ｌ ＨＪＯｙ　Ｏ，０５６ｚｇ／Ｌ ＣｕＳＯ，−５Ｈｚ０　０．１００　ｍｇ／ＬＮａ２Ｍｏ０４　０．０３９　１ １Ｆ／ＬＣｏＣＩｘ　・７ＨｚＯＯ，０４２ｍｙ／ＬＫｌ　０．０６６　１ｇ／ Ｌ ＦｅＳＯ−４Ｈｘ０　０．０４０　ｚｇ／ＬＮｉＣＩ・６Ｈ２００，０００４ｍ ｙ／Ｌフェノールレッド　０．１　ｇ／Ｌ 、ｉｉｉ＋２・憤佛］１昌駄遺麿　ａノ１１ウリジンの産生について試験した０ 選択した株は、少なくとも１０ｇ／Ｌ、１リットル当たり少なくとも３０グラム または、１リツトル当たり少なくとも７０グラムの培地の濃度でＰｃ１Ｎ（例え ば、デオキシウリジン）を産生じ、そのいずれもが医薬的に許容可能な、抗−ウ ィルス性化合物の工業的生産に好適であった。

ｒ　ｌ　／−“ツ 暑　−＼ノ　、　−ノ −・　・　・拳・ 、声　Φ ＦＩＧ、　６ ＦＩＧ、７ａ ＡＡＡ　ＴＡＣＴＡＧ　ＡＡＡ　ＣｊｌｌＡσＡＡＡＣαＡσｃ　ＡＡＴ　’ロ ℃αＡαＡ司ＡπゴＴＡＡ　（Ｊｒ　ＴＣＴ　ＡＡＡＡＧＣＡＴＴ　ＴＡＴ　Ａ ＴＴ　ＡＴｒ　＋１９　ｆｆＡ　ＴＡＡ　ＴＧＧ　ＴＡＴ　ＴＡＴ　ＴＣＴ　Ａ ＡＴ　ＡＴＴ　ＣＣＴ　ＴＣＧ　sＧＣＡＴＺＩ　ＴＴＡ −乙　−Ｋ）　ｌ　ｔｏ　２０　３０ ＭｅｔＰｈｅＳｉｒＩｌｅＬｙｓＧｌｕＰｒｏρｈｅＳｅｒＩＩｓＶａｌＴｈｒ ＡＡＣＴＧＣＧＡＴ　％　ＧＴＡ　ＴＴＡ　ｊｌＶゴＧＱＣＩＴ　ＡＧＴαココ πｉａ了ｔＪｒ　Ａｆｆｉ　ＡＴＴα６−Ａｓｎ　Ｃｙｓ　Ａｓｐ　Ｇｌｕ　Ｖ ａｌ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ｉｔｓ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　ＴｒｐＶａ ｌｉｓ　Ｌｙｓ　Ｉｌ■@ＧＩｎＧｌｎ Ａｓｎ　Ａｈａ　Ａｓｐ　Ｔｙｙ　Ｐｈｅ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｔｙｒ　ＰＩｖＡ ｓｐ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　kｓｕＧＩｕ　Ｐｒ ｙ ＧＧＴ　ＫＡｍ　ＧＡＡ　（Ａｒ　Ｔｆｆ　ＣＡＡ　ＡＣＡ　ＧＴＡσｍπＡα ｉａ　ＣＣＡ　ＧＱＡ　ｍ　ｃａゴーＮ「Ｎ鴇Ｇｌｙ　Ｔｌｖ　Ｐｈ１ＩＧｌｕ 　Ｈｓ　Ｔｙｒ　Ｇｌｎ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　ＳｅｒΔｒｑ　Ｐｒｏ　Ｇ ｌｕ　Ｐｈｅ　Ｈｉｓ　Ｌm　Ａｓｎ　Ｌｙｓ 浄書（内容に変更なし） ＴＴＡ　ＡＡＴ　ＴＵＴｔｉ　Ａ＾へＣ；’ＴＡＧＷ；ｒＩＴ　ｍ７　Ｔτ了Ｇ ＴＴＧＧＧ　４４４ＡハＴＧ＾＾ＡＡＧ　ＡＡＡ　ＴＣＡ　fａＴ Ｌｅｕ　Ａｓｎ　Ｓｓｒ　Ａｓｎ　Ｌｙｓ　Ｖａ夏Ｇｌｕ　Ｉｌｅ　ｌｌｅ　Ｐ ｈｉ　Ｖｏｌ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　kｙｓ　Ｓｅｒ　Ａ ｇＱ ＴＡＴ　ＡＴＴ　ＡＩＩＩＧ〜訂口ＡｆｆｉＡＩ狂−Ｎ澁Ａπ１可丁ユα鎮ばＧ 顛ＴＴＡπＡＡＩ狂に了Ｔｙｒ　ＩＩｓ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　ＬｙｓＡｓ ｎ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ｍｅｔ　Ｉｔｓ　Ｖａｌ　ＧｌｕΔｓｏ　Ｇｌｕ　ｕｕ　 Ｓｅ秩@Ａｓｎ　ｌｌ５ ＡＡＴ　（３ＡＴ　ｒ　Ｇ’＠　ＣＡＡ　Ｍｒ　ｍ　Ｍｒ　ＧＩＸ　ＧＧＴＴＴ Ｔ　ＧＡＡ　ＧＡＡσｒａｍｍ了−Ｔ　ｍＣＣＡＡｓｎ　Ａｓｏ　Ｉｌｅ　Ｖａ ｔ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　ＣｙｓＡｓｎ　ＡｓｏＧｌｙ　Ｐｈ１Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｖ ａｔ　Ａ卸ｌｉｅ　Ｔｙ　Ｉhｓ　Ｐｒ。

ｓｌｏ　６２０　６３０　６４０　６５０　６６０ＧＴＡ　ＴＡＡ　ｔｉＧＩＣ Ａｍ　ＡＧＡＧＥＴＴＡＴＡＡＧＴＣＴＣＴ　ＴＡＴ　Ｇｒｒ　ＴＴＴＩＴ　Ｔ ＴＴ　ＴＧｒ　Ｃｍ　ＣＱＡＡＧＧ　ＡＧＡ　（ｊ澁πムアα鎗π℃司℃Ｔ［Ｔ ＣＡバロ°Ｎ鎮Ｔαンπ℃πムχＣ〜℃Ｎ℃π℃コ了Ｎ−π工χα〔π＝Ｎ鎮− 「ゴτＮ℃暑℃ＣＴＡＣ心π℃゛口’　ＴＡＡ　ＣＴＡ　ＣＣＴＣＴＡ　ＴＧＱ 　ＡＧＱ　ＴＧＡ　ＴＡＡ　ＡｊｌｌＧ　ＴＡＧ　萬μＩπテ）下ＡＡＧπＡ　 ＴＣＣＴＡＴ　Ｗ　ＡＴＡ　ＧＡＴＦＩＧ、７ｃ ＡＴＴ　にＡＡＭｍ（、（℃ＡＱＡ　ＣＩＩＩＡ　ＡＥ　Ｗ　ＡｌＺＩ　ＡＡＴ 酊Ｔ　ＡＡＡ　ＴＡＧ　ＡＡＡ　ＴＧＧ　ＧＡＡ　ＡＭ　Ｔ`Ａ ＋０７０　＋０８０　１０９０　＋＋ＯＯｌｌｌ。

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ｐｃＧＩｏ６−一一一一一一一一。

５’−ＣＣＴ　ＣＴＣＣＣＴ　ＧＧＡ　ＡＴＴ　ＣＴＡ　ＡＴＡ　ＴＧＣＡＣＧ 　−３゜５°　ＡＴ　ＡＴＴ　ＣＣ丁ＴＣＧ　ＴＧＣＡＴＡ　ＴＴＡ　ＴＡＡ　 ＴＴＡ　ＣＡＧ　ＧＧＡ　ＧＡＧ　ＧＡＴ　ＴＴＡ　ＡＴＧ　ＴＴＴ３’−ＧＣ ＡＣＧＴＡＴ　ＡＡＴ　ＣＴＴ　ＡＡＧ　ＧＴＣＣＣＴ　ＣＴＣＣ−５’　煎旦 匹ＦＩＧ、１２ 栃傅爆Ａ　（’（１ ＦＩＧ、１３ ２」Σ 本発明は、ピリミジンデオキシリボヌクレオシドを蓄積させる少なくとも１種の 酵素をコードするＤＮＡと、代謝突蕉変異又は同様にピリミジ〉デオキシリボヌ クレオシド産生を増加させる代謝酵素３コードする異種ＤＮＡとを併用すること により、回収可能な量のピリミジンデオキシリボヌクレオシド（ＰｄＮ）を発現 するための培簑細ｉ＝工学的に作成し、ＰｄＮの商業的に有用な発酵源を提供す るものである。

補正書の写しく翻訳文）提出書（特許法第１８４条の８）

Claims (26)

【特許請求の範囲】
1. １．ピリミジンデオキシリボヌクレオシドーリン酸をピリミジンデオキシリボヌ クレオシドに転化するピリミジンデオキシリボヌクレオチドホスホヒドロラーゼ をコードするＤＮＡ配列を含む複製可能な微生物であって、該ＤＮＡ配列が該微 生物により発現されることを特徴とする複製可能な微生物。
2. ２．（Ａ）該ピリミジンデオキシリボヌクレオシドがチミジンであり、（Ｂ）該 ピリミジンデオキシリボヌクレオチドホスホヒドロラーゼがチミジル酸ホスホヒ ドロラーゼであり、（Ｃ）該ピリミジンデオキシリボヌクレオシドーリン酸がチ ミジン−リン酸であることを特徴とする請求項１に記載の複製可能な微生物。
3. ３．該微生物が更に、ＴＭＰの蓄積を増加させる少なくとも１種の遺伝的改変を 含むことを特徴とする請求項２に記載の複製可能な微生物。
4. ４．（Ａ）該ピリミジンデオキシリボヌクレオシドがデオキシウリジンであり、 （Ｂ）該ピリミジンデオキシリボヌクレオチドホスホヒドロラーゼがチミジル酸 ホスホヒドロラーゼであり、（Ｃ）該ピリミジンデオキシリボヌクレオシドーリ ン酸がデオキシウリジン−リン酸であることを特徴とする請求項１に記載の複製 可能な微生物。
5. ５．該微生物が更に、デオキシウリジンの蓄積を増加させる少なくとも１種の遺 伝的改変を含むことを特徴とする請求項２に記載の複製可能な微生物。
6. ６．請求項１に記載の微生物から主に構成される微生物培養物であって、該培養 物が、炭素源の代謝後に回収可能な量の該ピリミジンデオキシリボヌクレオシド を蓄積することを特徴とする微生物培養物。
7. ７．炭素源からピリミジンデオキシリボヌクレオシドを発酵的に製造するための 方法であって、（Ａ）該炭素源を含む培地を収容する発酵反応器を準備する段階 と、（Ｂ）請求項６に記載の微生物培養物を該反応器に加える段階と、次いで（ Ｃ）該炭素源が該微生物培養物により発酵され、該培地中に該ピリミジンデオキ シリボヌクレオシドを蓄積するような条件を該反応器の内側に設定し、これを維 持する段階と、（Ｄ）該ピリミジンデオキシリボヌクレオシドを該反応器から回 収する段階とを含むことを特徴とする方法。
8. ８．該微生物が更に、その発現により該培地中の該ピリミジンデオキシリボヌク レオシドの蓄積を更に増加させるように少なくとも１種の代謝酵素又はポリペプ チドをコードするＤＮＡセグメントを含むことを特徴とする請求項１に記載の微 生物。
9. ９．該微生物が更に、該培地中の該ピリミジンデオキシリボヌクレオシドの該蓄 積を更に増加させる少なくとも１種の突然変異を代謝経路中に含むことを特徴と する請求項１に記載の微生物。
10. １０．該代謝酵素が、カルバモイルリン酸シンターゼ、アスパラギン酸トランス カルバモイラーゼ、ジヒドロオロターゼ、ジヒドロオロトオキシダーゼ、オロト 酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ、オロチジン５′−リン酸デカルボキシラ ーゼ、ＣＴＰシンターゼ、ヌクレオシドリン酸キナーゼ、ホスホリボシルピロリ ン酸シンテターゼ、ヌクレオシドニリン酸キナーゼ、リボヌクレオシドニリン酸 レダクターゼ、ｄＣＴＰデアミナーゼ、ｄＵＴＰアーゼ、チミジル酸シンターゼ 、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、チ オレドキシン、チオレドキシンレダクターゼ、ｄＴＴＰアーゼ、ｄＣＴＰピロホ スファターゼ、ｄＣＭＰデアミナーゼ、ウラシルホスホリボシルトランスフェラ ーゼ、チオレドキシンレダクターゼ（ｔｒｘＢ）、グルタチオンレダクターゼ、 グルタチオンシンターゼ、グルタレドキシン及びチミジル酸シンターゼインヒビ ターポリペプチドから構成される群から選択されることを特徴とする請求項１に 記載の微生物。
11. １１．該突然変異が、基質類似体又は薬剤耐性突然変異、代謝最終産物耐性突然 変異、プリン−、ピリミジン−又はヌクレオシドー輸送突然変異、及び代謝酵素 活性突然変異から構成される群から選択される選択突然変異により該微生物に導 入されることを特徴とする請求項６に記載の微生物培養物。
12. １２．該基質類似体又は薬剤耐性突然変異が、ヒドロキシ尿素、トリメトプリム 、チオウラシル、アザウラソル、フルオロウラシル、フルオロオロト酸、フルオ ロシチジン、フルオロデオキシウリジン、フルオロデオキシシチジン、フルオロ ウリジン、アジドチミジン、ピリミジンジデオキシヌクレオチド、アジドピリミ ジン、シアノピリミジン、アジドヌクレオシド、シアノヌクレオシド、ハロノン 化ヌクレオシド、及びハロゲン化ヌクレオ塩基から構成される群から選択される 化合物に対する耐性を含むことを特徴とする請求項１１に記載の微生物培養物。
13. １３．該代謝最終産物耐性突然変異が、表１に列挙した化合物から構成される群 から選択されるピリミジン類似体に対する耐性を含むことを特徴とする請求項１ １に記載の微生物培養物。
14. １４．該代謝最終産物耐性突然変異が、チオウラシル、アザウラシル、フルオロ ウラシル、フルオロオロト酸、フルオロシチジン、フルオロデオキシウリジン、 フルオロデオキシシチジン、フルオロウリジン、アジドチミジン及びピリミジン ジデオキシリボヌクレオシドから構成される群がら選択されるピリミジン類似体 に対する耐性を与えることを特徴とする請求項１３に記載の微生物培養物。
15. １５．該代謝最終産物耐性突然変異が、表２に列挙した化合物から構成される群 から選択されるプリン類似体に対する耐性を含むことを特徴とする請求項１３に 記載の微生物培養物。
16. １６．該代謝最終産物耐性突然変異が、チミジンに対する耐性を含むことを特徴 とする請求項１３に記載の微生物培養物。
17. １７．該基質類似体耐性突然変異が、アミノ酸類似体に対する耐性を合むことを 特徴とする請求項１１に記載の微生物培養物。
18. １８．該基質類似体耐性突然変異が、ヒスチジン類似体、トリプトファン類似体 、アルギニン類似体及びグルタミン類似体から構成される群かち選択されるアミ ノ酸類似体に対する耐性を含むことを特徴とする請求項１７に記載の微生物培養 物。
19. １９．該ヌクレオシド又はヌクレオチドが、ピリミジンを含むことを特徴とする 請求項１１に記載の微生物培養物。
20. ２０．該ヌクレオシド又はヌクレオチドが、チミジンを含むことを特徴とする請 求項１９に記載の微生物培養物。
21. ２１．該代謝酵素活性突然変異が、該酵素の活性又は量の阻害を含むことを特徴 とする請求項１１に記載の微生物培養物。
22. ２２．該酵素が、チミジンホスホリラーゼ、ウリジンホスホリラーゼ、チミジン キナーゼ及びチミジル酸シンターゼから構成される群から選択される酵素を含む ことを特徴とする請求項２１に記載の微生物培養物。
23. ２３．該基質類似体又は薬剤耐性突然変異が、表１に列挙した化合物から構成さ れる群から選択される化合物に対する耐性を含むことを特徴とする請求項１１に 記載の微生物培養物。
24. ２４．段階（Ｄ）で回収される該ピリミジンデオキシリボヌクレオシドが、少な くと６約１ｇ／ｌのピリミジンデオキシリボヌクレオシド濃度で培地から得られ ることを特徴とする請求項７に記載の方法。
25. ２５．該ピリミジンデオキシリボヌクレオシド濃度が少なくとも約３０ｇ／ｌで あることを特徴とする請求項７に記載の方法。
26. ２６．該ピリミジンデオキシリボヌクレオシド濃度が少なくとも約７０ｇ／ｌで あることを特徴とする請求項７に記載の方法。