JPH05502868A - レトロウィルス感染症を治療又は予防する薬学的組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 レトロウィルス感染症を治療又は予防する薬学的組成物本発明は、レトロウィル ス感染症、特に後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）を治療する薬学的組成物に関 する。

ＡＩＤＳは、化アメリカ、ヨーロッパ及びアフリカで広（発生しているウィルス 感染症である。ワクチンまたは治療の研究が、多くの世界的な研究チームの主な 目的となっている。

レトロウィルスＨＩＶ　（ヒト免疫不全ウィルス）、ＨＩＶＩ又はＨＩＶ２は、 ヒトにおいてＡＩＤＳの発生源として同定されている。ＨＩＶに加えて、種々の 動物種において類似の病理を誘導する他のレトロウィルス、例えば、ヒツジビス ナウィルス（ｏｖｉｎｅ　Ｖｉｓｎａ　ｖｉｒｕｓ　）　、Ｓ　Ｉ　Ｖウィルス （シミアン（Ｓｉｍｉａｎ）免疫不全ウィルス）、ＦＩＶウィルス（ネコ（Ｆｅ ｌｉｎｅ）免疫不全ウィルス）又はＢＩＶウィルス（ウシ（Ｂｏｖｉｎｅ）免疫 不全ウィルス）が存在する。

簡潔に言えば、レトロウィルスは、以下のような構造を有している。種々の蛋白 質と結合したゲノムＲＮＡ分子からなり、蛋白質そのもののカプシドによって保 護されたヌクレオカプシドであり、全体はウィルス蛋白質が、それにも拘らず導 入された細胞由来の膜によって覆われ（ｅｎｖｅｌｏｐｅｄ　）ている。

ｇ　８ｇ％　ｐ　Ｏ１及びｅｎｖ遺伝子はレトロウィルスに特徴的なものである 。ｇａｇ遺伝子は、切断されてヌクレオカプシドを構成する種々の蛋白質を与え るプレカーサー（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ　）をコードする。ｐｏｌ遺伝子は、切断 されてプロテアーゼ、即ち感染された細胞内でウィルスＲＮＡをＤＮＡに転写す る逆転写酵素を与えるプレカーサー及びこのＤＮＡを宿主細胞のゲノムに統合さ せるインテグラーゼ（ｉｎｔｅｇｒａｓｅ　）をコードする。ｅｎｖ遺伝子は、 グリコジル化され大きいサブユニット（ｌａｒｇｅ　５ｕｂｕｎｉｔ　）と小さ いサブユニット（ｓｍａｌｌ　５ｕｂｕｎｉｔ　）に切断されるウィルスのエン ベロープ（ｅｎｖｅ　１ｏｐｅ）蛋白のプレカーサーをコードする。感染された 細胞内でのウィルスの増殖の間、小さいサブユニットはそのトランスメンブレン ドメイン（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ　ｄｏｍａｉｎ）を経由して細胞膜に固 定される。

そのＣ末端部分は細胞質と接触し、細胞内細胞質ドメイン（ｉｎｔｒａｃｙｔｏ ｐｌａｓｍｉｃ　ｄｏｍａｉｎ　）を構成する。−万Ｎ末端部分は細胞の表面に 存在し、細胞外ドメインを構成する。大きいサブユニットは、細胞の外に放出さ れ、そこで小さいサブユニットの細胞外ドメインと相互作用する。この様にエン ベロープ蛋白の２種のサブユニットは、コンプレックスの形態で結合しつづける 。ウィルス粒子か形成されると、それらは細胞の表面上に芽（ｂｕｄｓ）を発達 させ、ウィルスのエンベロープ蛋白の分子が固定された細胞膜内に覆われる。

ＨＩＶＩウィルスの場合、ｅ　ｎ、　ｖ遺伝子は、切断されて小さいサブユニッ ）ｇｐ４１及び大きいサブユニットｇｐ１２０に切断されるプレカーサー糖蛋白 質ｇｐ１６０をコードする。

ｇａｇＸｐｏｌ及びｅｎｖ遺伝子に加えて、ある種のレトロウィルス、特に後天 性免疫不全症候群を引き起こすレトロウィルスに一般的な他の遺伝子が存在する 。ウィルスの感染性を決定する因子をコードするｖｉｆ遺伝子は（ｖｉｆ：ビリ オン感染性因子（ｖｉｒｉｏｎ　１ｎｆｅｃｔｉｖｉｔｙｆａｃｔｏｒ）　）　 、後者の他の遺伝子に属する。２０から３０ｋＤａのＭＷ（ＨＩＶＩの場合２３ ｋＤａ）のこの因子は、感染された細胞の細胞質中で検出される。研究によって 、ｖｉｆ蛋白を不活性化する変異を含有する株由来のピリオンが、正常なＲＮＡ と複製（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ　）酵素を有するが、それらの感染性は１００ から１０００倍以下であることが判明した。

多くの研究グループが、一般的な方法で種々のＨＩＶ型ウィルス（ＨＩＶｌ、Ｈ ＩＶ２．５ＩＶＸＦＩＶ及びビスナ）から得られるｖｉｆ蛋白質は、互いに重要 なホモロジーを保有していないことを観察した（ニス、ワインーポプリンら（Ｓ 、　Ｖａｉｎ−Ｈｏｂｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、）　、セル（Ｃｅｌｌ）、（１９８ ５）、４０．９−１７　、ピー、ソニゴら（Ｐ、　Ｓｏｎｉｇｏ　ｅｔ　ａｌ、 ）、セル（Ｃｅ１１．）、（１９８５）　、４２．３６９−３８２　、アール、 ニー、オルムステッドら（Ｒ，Ａ、　０１ｍ５ｔｅｄ　ｅｔ　ａｌ、）　、Ｐｒ ｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　（１９８９）　、８６．８０８８−８０９２　、エル、チャ クラパルティら（Ｌ、　Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｉ　ｅｔ　ａｌ、）　、ネイチャ ー　（Ｎａｔｕｒｅ）、。しかしながら、これらｖｉｆ蛋白質の中で、等価のア ミノ酸同定の力で、互いに一定のホモロジーを示す非常に短い配列が同定された 。更にこれら配列のいくらかは、チオール−プロテアーゼ活性を有する蛋白質、 例えば、カテプシンＢ又はＨ１パパイン及びアクチニジン（ａｃｔｉｎｉｄｉｎ ｅ）中のみに認められるものである。例として第７図参照。

従って、チオール−プロテアーゼ活性とｖｉｆ蛋白質とが関連があり、この活性 の基質がエンベロープ蛋白の小さいサブユニットであることが判明した。それゆ え、ｖｉｆ蛋白質は、エンベロープ蛋白の構造に作用するか及び／又は構造が規 定される方法に作用することによりエンベロープ蛋白の変異過程に関与して、高 レベルのピリオン感染性を生じている可能性がある。

結果として、本発明は、 （ｉ）ロイペプチン（ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ　）以外のチオール−プロテアーゼイ ンヒビターを治療薬として含有するレトロウィルス感染症を治療又は予防する薬 学的組成物、（１１）そのような治療を必要とする対象者（ｓｕｂｊｅｃｔ　） に治療的に効果的な量のチオール−プロテアーゼインヒビターを投与する行動を 含むレトロウィルス感染症を治療又は予防する方法、 （ｉｉｉ）レトロウィルス疾患を治療又は予防するためのチオール−プロテアー ゼインヒビターの使用、（ｉｖ）レトロウィルス感染症を治療又は予防するため に医薬物質を生産するためのチオール−プロテアーゼインヒビターの使用、 を提供する。

レトロウィルス感染症の中でも、ＨＩＶ−型ウィルス感染症及び特にＨＩＶ−１ 感染症について特に述べる。

チオール−プロテアーゼインヒビターは、公知の生成物、例えばシスタチン類（ ｃｙｓｔａｔｉｎｅｓ）及びその誘導体、アンチパイン　［（Ｓ）−１−カルボ キシ−２−フェニルエチルコーカルバモイルーＡｒｇ−Ｖａ　１−Ａｒｇ−ａ　 １、Ｅ−６４（Ｌ−トランス−エポキシスクシニル−ロイ゛シルアミド−（４− グアニジノ）−ブタン）　、Ｎ−［Ｎ−（Ｌ−３−１ランスカルボキシイラン− ２−カルボニル）−１，−ｏイシル］−アグマチン（ａｇｍａｔｉｎｅ）、ロイ ペプチン、ヨード酢酸／ヨードアセタミド又はＮ−Ｃｂｚ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−ジ アゾメタン等である。

しかしながら、本発明の目的達成のために、より好ましい化合物は、ｖ１ｆ蛋白 に特異的なインヒビターである。

後者のｖｉｆ蛋白に特異的な型のインヒビターは、例えばその三次構造がエンベ ロープ蛋白の小さいサブユニット上に局在的に存在するｖｉｆ蛋白−認識部位に 類似するオリゴペプチドが含まれる。

本発明の目的達成のために使用されるチオール−プロテアーゼインヒビターの活 性は、ＨｒＶウィルス又はｅｎｖ／　ｖ　ｉ　ｆダブル発現システムのような適 当なターゲットを使用して、インビトロ（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）の試験で検出され る。

ＡＩＤＳの症状に応じて、投与される量は広い範囲にわたり、投与される対象者 の状態、使用される特定の化合物の活性に依存する。

ｖｉｆ蛋白は感染された細胞の細胞質中に局在しているので、チオール−プロテ アーゼインヒビターはｖｉｆに到達するために細胞内に貫通できる必要がある。

このため、細胞内に貫通でき、他の分子と修飾又は結合し、或いはリポソームの 中にカプセル化されるインヒビターが選択される。好ましくは、チオール−プロ テアーゼインヒビターを非感染細胞にのみ作用させる様なシステムが選択される 。

使用される薬学的な投与形態は、非常に多様であり、その特徴が当業者に知られ ている注射形態又はその他の形態であっても良い。

以下の実施例は、本発明を限定すること無く本発明の他の特徴および利点を示す ものであり、以下の図を参照する。

第１図は、大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）の発現プラスミド及びワクシニアウィルスの ゲノムに挿入されたｖｉｆ蛋白の野生型（ｗｉｌｄ　ｔｙｐｅ　）および変異型 （ｍｕｔａｎｔ　ｔｙｐｅｓ）をコードするＤＮＡフラグメント（第１図ａ）、 及びワクシニアウィルスのゲノムに挿入されたｅｎｖ蛋白をコードするＤＮＡフ ラグメントを図式的に示したものである；Ｓはシグナル配列（ｓｉｇｎａｌ　５ ｅｑｕｅｎｃｅ　）を示し、Ｈは疎水性配列を示し、ＴＭはトランスメンブレン 配列を示す。矢印は、ｇｐ１２０及びｇｐ４１を与えるプレカーサーの切断部位 を示す（第１図ｂ）。

第２図は、以下のプラスミドで形質転換された大腸菌株ＴＧＥ　９０１から得ら れる音波処理上清を１１０ＡｔのＥ６４の存在（＋）又は非存在（−）下でイン キュベーション後、ヨードアセタミドでラベルされた音波処理上清のポリアクリ ルアミドゲル電気泳動（３０ｍＡ）から得られるオートラジオグラフの２Ｏ−２ ５Ｋｄａ付近の部分を示したものである： 十 一カラム１　及び１　：ｐＴＧ９５９、ネガティブコントロール 一カラム２−及び２＋、野生型ｖｉｆ蛋白を発現するｐＴＧ４１９０ ＋ 一カラム３　及び３　：１１４位で変異されたｖｉｆ蛋白を発現するｐＴＧ４１ ９３ ＋ 一カラム４　及び４　：１３３位で変異されたｖｉｆ蛋白を発現するｐＴＧ５１ ０６ ＋ 一カラム５　及び５：１．１４位及び１３３位で変異されたｖｉｆ蛋白を発現す る ｐＴＧ５１１５ 第３図は、上述の試料をＨＩＶ−陽性ヒト血清で免疫沈降したもののポリアクリ ルアミドゲル電気泳動（５ｍＡ；２００ｍＭの燐酸ナトリウムを添加した通常の 負荷（ｌｏａｄｉｎｇ　）緩衝液）から得られるオートラジオグラフの３５−４ ５Ｋｄａ付近の部分を示したものである。試料は、（ｅｎｖ蛋白を発現する）ワ クシニアウィルスＶＶＴＧ９−１及び野生型ワクシニアウィルスＶＶＷＴ　（コ ントロール）テ共に感染された（ｃｏｉｎｆｅｃｔｅｄ）　Ｂ　ＨＫ　−２１細 胞（Ｗ）培養、並びにワクシニアウィルスＶＶＴＧ９−１及び（野生型ｖｉｆ蛋 白を発現する）ワクシニアウィルスＶＶＴＧ１１６０で共ニ感染すＦＬｆ：ＢＨ Ｋ−２［胞（Ｖ）培養の細胞抽出物（Ｐ）又は上清（Ｓ）である。矢印は、ｇｐ ４１を示す。

第４図は、ｇｐ４１のＣ末端部分に対するウサギポリクローナル血清で免疫沈降 されたＢＨＫ−２１細胞の抽出物のポリアクリルアミドゲル電気泳動（３０ｍＡ ）から得られるオートラジオグラフの１００−２００ＫＤａ及び４Ｏ−４５Ｋｄ ａ付近の部分を示したものである。ＶＶＷＴで感染された（カラム１）、又は（ ｅｎｖ蛋白を発現する）ＶＶＴＧ９−１及び（野生型ｖｉｆ蛋白を発現する）Ｖ ＶＴＧ１１６０　［カラム２及び５コ、又はＶＶＴＧ９−１及びｖｖＷＴ［カラ ム３コ、又はＶＶＴＧ９−１及び（１１４位で変異されたｖｉｆ蛋白を発現する ）ＶＶＴＧ４１８５で共に感染されたＢＨＫ−２１細胞は、Ｅ６４−Ｄの非存在 下［カラム１から４コ又は１０μＭのＥ６４−りの存在下［カラム５］で培養さ れている。

第５図は、ＨＩＶ−陽性ヒト血清で免疫沈降されたＢＨＫ−２１細胞の抽出物［ カラム１から３］及び上清。

［カラム４から６］のポリアクリルアミドゲル電気泳動（３０ｍＡ）から得られ るオートラジオグラフの１００−２００ＫＤａ付近の部分を示したものである。

（ｅｎｖ蛋白を発現する）ＶＶＴＧ９−１及びＶＶＷＴ　［カラム１及び４コ又 はＶＶＴＧ９−１及び（野生型ｖｉｆ蛋白を発現する）ＶＶＴＧ１１６０　［カ ラム２．３．５及び６］で共に感染されたＢＨＫ−２１細胞は、Ｅ６４−Ｄの非 存在下［カラム１．２．４及び５］又は１０μＭのＥ６４−Ｄの存在下［カラム ３及び６］で培養されている。矢印はｇｐ１６０及びｇｐ１２０を示す。

第６図は、ｍＲＮＡから最初に合成されるＨＩＶＩ。

Ｂｒｕ　アイソレート（ｉｓｏｌａｔｅ）由来のｖｉｆ蛋白のアミノ酸配列を示 す。Ｎ−末端部分のメチオニン残基Ｎ０１１は通常その後除去される。

第７図は、ウィルスＨＩＶＩ−Ｂｒｕ、ＨＩＶ２ＲＯＤ／ＳＩＶ　ｍａｃ、ビス ナ、ＦｒＶのｖｉｆ蛋白並びに種々のチオール−プロテアーゼの（アミノ酸同定 または同等の効力による）ホモロガスな領域を示す。保存されていないアミノ酸 は、イタリック体で表す。配列中の番号は存在するアミノ酸の数を表す。

実施例　１：ｖｉｆ蛋白に関連するチオール−プロテアーゼ機能の検出 チオール−プロテアーゼはその活性部位にシスティン残基を保有する。更にチオ ール−プロテアーゼは特異的にＥ６４によって阻害されることが知られている。

チオール−７’ロチアーゼがＥ６４と接触する状態におかれた時、Ｅ６４は活性 部位に結合し、この部位のシスティン残基をブロックする。

チオール−プロテアーゼの活性部位の特性を検出するために、Ｅ６４を用いてヨ ードアセタミドのラベリングによる阻害試験を行う。ヨードアセタミドはほとん どの蛋白質のシスティン上に、非特異的に結合する。

最後に、ｖｉｆ蛋白中の活性部位の位置を正確に同定するために、野生型ｖｉｆ 蛋白を、オリジナルの１１４位及び１３３位のシスティン残基の位置で変異させ た。ｖ　ｉ　ｆ蛋白と同様に試験する。

ＩＡ、大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）での野生型ｖｉｆ蛋白の発現ＨＩＶＩ、Ｂｒｕ　 アイソレートのｖｉｆ蛋白をコードするＤＮＡ配列を含有する、ワイ、リビエル ら（Ｙ。

Ｒｉｖｉｅｒｅ　ｅｔ　ａｌ、、’）　、Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　（１９８９）、 ６６　：　２２７０に記載されたファージＭ１３ＴＧ１８５由来のＢｇｌＩＩ− ＥｃｏＲＩフラグメントを、酵素ＢｇｌＩＩ及びＥｃｏＲＩで切断された（特許 出願ＥＰ−Ａ−２９２，４０４に記載された）プラスミドｐＴＧ９５９に挿入し 、ｖｉｆ蛋白をコードするＤＮＡ配列がラムダファージｐＬプロモーターの支配 下にあるプラスミドｐＴＧ４１９０を得る。

ゴッテスマン　エム、イー、ら（Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ　Ｍ、Ｅ、ｅｔ　ａｌ。

、）により、Ｊ、Ｍｏｌ、　Ｂｉｏｌ、（１９８０）　１４０　：５７にＮ４８ ３０／ｐＫＣ３０という名称で記載されたＴＧＥ９０１株をプラスミドｐＴＧ４ １９０により形質転換し、０Ｄ６ｏｏが０．　１になるまで３０℃で培養する。

ｖｉｆ蛋白をコードするＤＮＡフラグメントの発現を４２℃で４時間誘導する。

細胞を遠心分離によって収得し、培養物５００ｍ１あたり２０ｍ１のＰＢＳに再 溶解させ、氷にアルコールを加えた洛中で８分間音波処理を行う。その後溶液を 遠心し、発現された約１％のｖｉｆ蛋白を含む上清を試験のために維持する。

１Ｂ、１１４位、又は１３３位、又は１１４位及び１３３位で変異されたｖｉｆ 蛋白の大腸菌での発現ファージＭ１３７Ｇ１８５を、アマジャム（Ａｍｅｒｓｈ ａｍ）のキット及び０ＴＧ２５４０オリゴヌクレオチド＝５−　ＧＣＡＧＡＧＴ ＣＴＧＡＡＡＡＧＡＧＣＴＣＡＡＡＧＴＡＡＴＡＣＡＧ　３− を使用して、ｖｉｆ蛋白の１１４位のアミノ酸に対応するＢｇｌＩＩ−ＥｃｏＲ Ｉフラグメントのコドンを目標として部位突然変異にかける。これは１１４位の オリジナルなシスティン残基のロイシンへの置換に相当する。その後変異Ｂｇｌ ＩＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントを、あらかじめ酵素Ｂｇｉｆｆ及びＥｃｏＲＩで 切断された発現プラスミドｐＴＧ９５９に挿入し、プラスミドｐＴＧ４１９３を 得る（第１図）。

同様にして、１３３位のシスティンを、０ＴＧ２６５８オリゴヌクレオチド： ５−　ＧＣＴＴＧＡＴＡＴＴＣＡＡＧＣＴＴＡＧＧＧＣＴＡＡＣＴ　３− を使用してロイシンに変異させる。この様に変異されたＢｇｌｌＩ−ＥｃｏＲＩ フラグメントを、酵素ＢｇｌＩＩ及びＥｃｏＲＩで切断された発現プラスミドｐ ＴＧ９５９に挿入し、プラスミドｐＴＧ５１０６を得る（第１図）。

同様にして、１１４位及び１３３位のシスティンを、０ＴＧ２５４０及び０ＴＧ ２６５８オリゴヌクレオチドを使用して同時にロイシンに変異させる。この様に 変異されたＢｇｌｎ−ＥｃｏＲＩフラグメントを、酵素Ｂｇ１ｍ及びＥｃｏＲＩ で切断された発現プラスミドｐＴＧ９５９に挿入し、プラスミドｐＴＧ５１１５ を得る（第１図）。

大腸菌株ＴＧＥ９０１をプラスミドｐＴＧ４１９３、ｐＴＧ５１０６又はｐＴＧ ５１１６により形質転換する。

培養及びバクテリア音波処理はパラグラフＩＡに記載のように行い、音波処理上 清を同様に回収する。

ＩＣ，Ｅ６４によるヨードアセタミドのラベル化の阻害試験： １Ａ及びＩＢで得られる試料の各上清４０μｌを２検体づつ、ＰＢＳバッファー （ダベルッコ−（Ｄｕｂｅｌｃｃｏ）の食塩加リン酸緩衝液；セロメト（Ｓｅｒ ｏｍｅｄ）　）中で３０分間３７℃でインキュベートする。但し試料の一つに前 もって１０μＭのＥ６４（シグマ（Ｓｉｇｍａ）　）を添加する。その２つの試 料をその後１０μＭの１４０−ラベルされたヨードアセタミド（アマジャム）の 存在下ＰＢＳバッファー中で３０分間３７℃でインキュベートする。ネガティブ コントロールは、プラスミドｐＴＧ９５９により形質転換された大腸菌株ＴＧＥ ９０１の培養後得られる音波処理上清を用いる。

これら試料を５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかける（第２図）。

野生のｖｉｆ蛋白は、ヨードアセタミドによってラベルされ、ブロードのバンド の形態で移動する。Ｅ６４とのブレインキュベーションは、ｖｉｆ蛋白の見掛け の移動を修飾し、その移動は、Ｅ６４がｖｉｆ蛋白と複合体を形成することがで きることを示す。

１３３位で変異され、その結果１１４位のみにシスティンを保有するｖｉｆ蛋白 は、もはや事前にＥ６４とブレインキュベーションしても、ヨードアセタミドで ラベルされない。対照的に、Ｅ６４とのブレインキュベーションは、１１４位で 変異され１３３位のシスティンのみ保有するｖｉｆ蛋白の、ヨードアセタミドに よるラベル化を阻害しない。１１４位及び１３３位の２つのシスティンを変異さ れたｖｉｆ蛋白は、ヨードアセタミドでラベルされない。

上記に記載した阻害試験を、Ｅ６４の代わりにフェニルメタンスルホニルフルオ ライドや大豆トリプシンインヒビターのようなセリンプロテアーゼインヒビター １００μＭで置き換えて繰り返す。そのようなインヒビターは、ｖｉｆ蛋白が野 生型であっても変異型であっても、ｖｉｆ蛋白のラベル化を修飾しない。

これらの結果によって、 −ＨＩＶＩ　ｖｉｆ蛋白はチオール−プロテアーゼの活性部位に類似する構造を 有するドメインを保有し、−１１４位のシスティンはこのドメインの一部である ことが判明する。

実施例　２：ＨＩＶｌ　ウィルス由来のｇｐ４１蛋白の変異におけるＥ６４の阻 害効果の検出 野生型又は１１４位で変異されたｖｉｆ蛋白を、以下の方法によってＢＨＫ−２ １細胞（子供の（ｂａｂｙ）ハムスターの腎臓）中でｅｎｖ蛋白と共に発現させ る（ｃｏｅｘｐｒｅｓｓｅｄ）　：最初に、ＢＨＫ−２１細胞中で種々の形態の ｖｉｆ蛋白及びｅｎｖ蛋白を発現するベクターは以下のとおりである：野生型ｖ ｉｆ蛋白をコードするＤＮＡフラグメントを含有するリコンビナントワクシニア ウィルスＶＶＴＧ１１６０は、ワイ、リビエルら（Ｙ、　Ｒｉｖｉｅｒｅ　ｅｔ 　ａｌ、、）らにより、（１９８９）Ｊ、　Ｖｉｒｏｌｌ、競：　２２７０−２ ２７７、に記載されている。

１１４位で変異されたｖｉｆ蛋白をコードするＤＮＡフラグメントを含有するり コンビナンドワクシニアウィルスＶＶＴＧ４１８５は、エム、ピー、キーニーら （Ｍ、Ｐ。

Ｋｉｅｎｙ　ｅｔ　ａｌ　、、）　、（１９８４）、ネイチャー　（Ｎａｔｕｒ ｅ）、３１２　。

１６３−１６６頁に従って、ツクシュアウィルスゲノム中にプラスミドｐＴＧ４ １９３由来のＢｇｌＩＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントを挿入することによって得ら れる。

ＨｒＶｌ、Ｂｒｕ　アイソレートの天然のｅｎｖ蛋白をコードするＤＮＡフラグ メントを含有するリコンビナントワクシニアウィルスＶＶＴＧ９−１は、キーニ ー　エム。

ピー、ら（Ｋｉｅｎｙ　Ｍ、Ｐ、ｅｔ　ａｌ、）　、（１９８６）、バイオテク ノロジー（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　）　４．７９０−７９５頁に記載され ている。

全てのリコンビナントワクシニアウィルスは、ワクシニアウィルスのコペンハー ゲン株（Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ　５ｔｒａｉｎ　）から得られる。

１０６個のＢＨＫ−２１細胞を（ｉ）コントロールであるＶＶＴＧ９−１　（ｅ ｎｖ）及びＶＶＴＧＷＴ　Ｃワクシニアウィルスの野生型のコペンハーゲン株） 、又は（ｉｉ）ＶＶＴＧ９−１　（ｅｎｖ）及びＶＶＴＧ１１６０　（野生型ｖ 　ｉ　ｆ）　又Ｉ；！（ｉｉｉ）　ＶＶＴＧ９−１及びＶＶＴＧ４１８５（１１ ４位で変異されたｖｉｆ）によって共に感染させる。

コノ感染は、ＶＶＴＧ９−１の場合には、１０ｐｆｕの多重度で、他の場合は１ ５ｐｆｕの多重度で行う。

ウィルスを２０℃で１時間吸着した後、ＢＨＫ−２１細胞を、１０〜１００μＭ のＥ６４−Ｄ（エチル　（２５゜３５）−３［（５）−３−メチル−１−（３− メチルブチルカルバモイル）ブチルカルバモイル］オキシラン−２−カルボキシ レート１；これは細胞内に貫入するＥ６４の誘導体であり、ネオシステム（Ｎｅ ｏｓｙｓｔｅｍ）　（ストラスプール）によって合成）の存在下又は非存在下に 、１００μＣｉのメチオニン３５Ｓ（アマジャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）　）を添 加したメチオニン−フリーのＭＥＭ培地（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）　）中で培養す る。３７℃で４時間インキュベート後、溶解した細胞と上清を別々に回収するた めに培養物を遠心する。ｅｎｖ蛋白の存在は、上述のキーニー　エム、ピー、ら （Ｋｉｅｎｙ　Ｍ。

Ｐ、ｅｔ　ａｌ　）　、（１９８４）の記載の方法に従って、ＨＩＶ−陽性ヒト ポリクローナル抗血清との免疫沈降によって、上清中及び細胞溶解物中に検出さ れる。この免疫沈降物を、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（第３図及 び第５図）にかける。野生型又は変異型のｖｉｆ蛋白の存在は、ｖｉｆ蛋白に対 するマウスモノクローナル抗体を使用して、ウェスタンブロッティング法によっ て細胞溶解物中に同時に検出される。

第３図に示すように、野生型のｖｉｆ蛋白の存在において、ｇｐ４１蛋白の相対 移動度は、試験した他の試料中に存在するｇ　Ｉ）　４．１のそれよりも実質的 に大きいことが観察される。これは約ＩＫＤａの減少に相当する。

更に、１１４位を変異されたｖｉｆ蛋白は、野生型のｖｉｆ蛋白の存在下で観察 されるｇｐ４１の翻訳後調節を誘導しない。この翻訳後調節はｖｉｆ蛋白と関連 するチオール−プロテアーゼ活性によるものであろう。これは、ｖｉｆ蛋白の効 果を消失させるＥ６４−Ｄの作用によって確認される。

結論としては、実施例２は、Ｅ６４の様なチオール−プロテアーゼインヒビター は、ｖｉｆ蛋白に関連する蛋白質分解機能を阻害することによって、ｇｐ４１の 成熟を阻害することを示す。

上述で得られる細胞溶解物を、同様に、蛋白質ｅｎｖ及びｇｐ４１に共通の１５ 個のＣ−末端アミノ酸残基に対するウサギ抗血清（ネオシステム（Ｎｅｏｓｙｓ ｔｅｍ）製、ストラスプール）を使用して免疫沈降テストにかける。この免疫沈 降物を、第４図に示すように５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかける 。同程度の量のｇｐ１６０プレカーサーが、共感束（ｃｏｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　 ）のタイプに関係なく免疫沈降される。一方、ｇｐ４１の量は、ＶＶＴＧ９−１ 及びＶＶＴＧ１１６０での共感束の場合、Ｖ　Ｖ　Ｔ　Ｇ　９−１及びＶ〜’Ｔ Ｇ４１８５での共感束の場合又ｉ；！ＶＶＴＧ９−１及びＶＶＷＴでの共感束の 場合よりも少ない。ｇｐ４１はｇｐ１６０プレカーサーのＣ−末端側に対応する ので、上述の観察を考慮すると、ｖｉｆ蛋白は、ｇｐ１６０プレカーサーがｇｐ １２０とｇｐ４１に切断された後、特異的にｇｐ４１に作用するように考えられ る。

第４図のカラム５に示すように、ＶＶＴＧ９−１及びＶＶＴＧ１１６０で共に感 染された細胞の培養物中のＥ６４−Ｄの存在は、ｖｉｆ効果を消失させる。Ｅ６ ４−りの存在下又は非存在下においてコントロールでは差は認められない。

更に、第４図に示すように、ＶＶＴＧ９−１及びＶＶＴＧ１１６０で共に感染さ れた細胞の培養物中のＥ６４−Ｄの存在は、免疫沈降されたｇｐ１６０の量に影 響を及ぼさない。Ｅ６４は、非特異的なチオール−プロテアーゼインヒビターで あるため、これによって、ｇｐ４１の翻訳後修飾は、細胞の異化に関与するチオ ール−プロテアーゼによって引き起こされないことを効果的に示す。

ＢＨＫ−２１細胞を、実施例２と同様に、Ｅ６４−Ｄの存在下又は非存在下で、 ＶＶＴＧ９−１　（ｅｎｖ）及びＶＶＴＧＷＴ、又はＶＶＴＧ９−１　（ｅｎＶ ）及びＶＶＴＧ１１６０　（野生型ｖｉｆ）とで共に感染させる（ｃｏｉｎｆｅ ｃｔｅｄ）。このようにして得られた細胞溶解物及び上清を、ＨＩＶ−陽性ヒト ポリクローナル抗血清を使用して、免疫沈降試験にかける。

第５図に示すように、Ｅ６４−Ｄの非存在下、細胞溶解物中に存在するｇｐ１６ ０プレカーサー及びｇｐ１２０の総量は、ｖｉｆが合成されているいないにかか わらず、同一であり（カラム　ＰＶ及びＰＷ）、対照的に、上清中に存在するｇ ｐ１２０の量は、実質的にコントロール（ＳＷ）、ｅｎｖがｖｉｆと共感束され る時（ＳＶ）に比較して高い。Ｅ６４−Ｄの存在下でｖｉｆがｅｎｖと共感束さ れると、ｇｐ１２０の上清の放出が、コントロール試験（ＳＷ）中に観察される 量と同等になる。

ｖｉｆ蛋白が、Ｅ６４によって阻害されると、直接的でない効果が、ｇｐ１２０ の行動に関して観察され、この場合、ｅｎｖ蛋白（ｇｐ１２０−ｇｐ４１複合体 ）が欠失していることもある。このことは、Ｅ６４の存在下に、ピリオンが、自 らのカプシドに欠失したエンベロープを組み込んで、その構造を修飾するのでは ないかと推測させる。

Ｅ６４は、この様にしてピリオンの感染性を弱めることができるであろう。

実施例　４ ＢＨＫ細胞中天然のｅｎｖ蛋白の発現は、ベクターとしてリコンビナントワクシ ニアウィルスＶＶＴＧ９−１を使用して得られる。ＢＨＫ細胞中に狂犬病糖蛋白 と融合されたｅｎｖ蛋白の発現は、ベクターとして、キーニーら（Ｋｉｅｎｙ　 ｅｔ　ａｌ、、　）　、Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｎｇ、、（１９８６）、２：２１０ によって記載されたリコンビナントワクシニアウィルスＶＶＴＧ１１３１を使用 して得られる。ＢＨＫ細胞中でのｖｉｆ蛋白の発現は、ベクターとしてリコンビ ナントワクシニアウィルスＶＶＴＧ１１６０を使用して得られる。

感染条件は以下のとおりである：細胞当たり１０ｐｆｕの多重度で、天然のｅｎ ｖ蛋白または狂犬病糖蛋白と融合されたｅｎｖ蛋白を発現するＶＶＴＧ９−１又 はｖｖＴＧ１１３１を、及び／又は２０ｐｆｕの多重度で、ｖｉｆ蛋白を発現す るＶＶＴＧ１１６０又は野生型ワクシニアウィルス（ｖｖＷＴ）を、１０”　個 （７）ＢＨＫ２１細胞！、［染させる。

１時間のウィルス吸着の後、ＢＨＫ細胞を、１０　個の細胞あたり、１００μＣ ｉのメチオニン３５Ｓを添加したメチオニン−フリーのＭ　Ｅ　Ｍ培地（ギブコ （Ｇｉｂｃｏ）　）中で培養する。ラベル化の５．６又は７時間後、それらを溶 解させ、ペレットと上溝を分離する。ｅｎｖ蛋白の発現は、ＨＩＶ−陽性ヒトポ リクローナル抗体を使用する免疫沈降（メチオニン３５Ｓラベル化）によって、 検出され、ｖｉｆ蛋白の発現は、抗−ＨＩＶ−１ｖｉｆ蛋白モノクローナル抗体 を使用するウェスタンブロッティングによって検出される。

ＶＶＴＧ９−１単独のＢＨＫ細胞への感染に続いて、及びＶＶＴＧ９−１＋ＶＶ ＷＴの感染に続いて得られるｅｎｖ蛋白の発現は、同様である。

ｅｎｖ蛋白のみを発現するとき、ｇｐ１２０蛋白は完全な成熟の後放出される上 清中に検出される。ｅｎｖ蛋白とｖｉｆ蛋白が共に発現される時、２種のタイプ の効果が観察される。第１は、一般に、翻訳へのｖｉｆ蛋白の作用に対応しく非 特異的として記載されている効果）、ある種の蛋白質の合成のレベルを低下させ 、他の蛋白質のそれを増大させる。第２の効果は、エンベロープ蛋白に対するｖ ｉｆ蛋白の特異的な活性に対応する。ｇｐ１６０蛋白の成熟の加速現象が、細胞 の表面及び上清中に存在するｇｐ１２０蛋白の量の増大と共に観察される。他方 、トランスメンブレン領域及び細胞内細胞質部分が、狂犬病ウィルス糖蛋白のト ランスメンブレン領域及び細胞内細胞質部分により置き換えられているエンベロ ープ蛋白が観察されると、ｖｉｆ蛋白の特異的な作用は、もはや観察されない。

チオール−プロテアーゼインヒビターであるヨードアセタミド１０μＭの濃度の 存在下、同じ実験を行うと、ｇｐ１２０蛋白は実質上上清中には検出されない。

これは、ｅｎｖ蛋白の成熟がブロックされるか又は実質的に減少することを示唆 している。ヨードアセタミドの存在は、翻訳に対するｖｉｆ蛋白の非特異的な作 用及びエンベロープ蛋白へのその特異的な作用を阻害する。

Ｆｉｇｕｒｅ　１ ３　大腸菌　ワクシニア ＣＣｐＴＧ　ＶＶＴＧ 二１＝１３ −ＪＩｓ−拳雷　、藁［１，）噛轡 １　２　３４　Ｓ ４二二 し！ゼ１」 １目−！！！　４ＧＰ１６０ シＥ凹１ｊ 二鮎毘厚り玉 Ｍｅｔ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　Ａｒｇ　Ｔｒｐ　Ｇｌｎ　Ｖａｌ　Ｍｅｔ工ｌｅ　Ｖ ａｌ　Ｔｒｐ　Ｇｌｎ　Ｖａｌ　１３Ａｓｐ　Ａｒｇ　Ｍｅｔ　Ａｒｇ　工１ｅ 　Ａｒｇ　Ｔｈｒ　Ｔｒｐ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ｌａｕ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　２６Ｈ ｉｓ　Ｈｉｓ　Ｍｅｔ　Ｔｙｒ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　Ａ ｒｇ　Ｇｌｙ　Ｔｒｐ　Ｐｈｅ　３９ｒｙｒ　ｐｉ−ｑ　ｓｉｓ　ｎｉｓ　Ｔｙ ｒ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｈｌｓ　ｐｒｏ　Ａｒｇ工１ｅｓｅｒ５２Ｓｅｒ 　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ｈｉｓ　工１ｅ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　ＧＩＹ　Ａ！ＩＰ　Ａｌ ａ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　６５工ｌｅ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｔｙｒ　Ｔｒｐ　 Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｈｉｓ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ａｒｇ　Ａｓｐ　７８Ｔｒ ｐ　Ｈｉｓ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｇｌｎ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｘ１ｅ　Ｇｌ ｕ　Ｔｒｐ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　９１Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ｔｙｒ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　 Ｇｌｎ　Ｖａｌ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ａｓｐ　１０４Ｇ ｉｎ　Ｌｅｕ工１ｅ　Ｈｉｓ　Ｌｅｕ　Ｔｙｒ　Ｔｙｒ　Ｐｈｅ　Ａｓｐ　Ｃｙ ｓ　Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　１１７Ｓｅｒ　Ａｌａ　工Ｉｓ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ 　Ａｌａ　Ｌａｕ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｈｉｓ　Ｉｌｅ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　１３０ Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ｃｙｓ　Ｇｌｕ　Ｔｙｒ　Ｇｉｎ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｈｉｓ　 Ａｓｎ　Ｌｙｓ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　１４３Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｇｌｎ　Ｔｙｒ　Ｌ ｅｕ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｌｅｕ工ｌｅ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　１５ ６Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｉｌｅ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｌａｕ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ 　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　１６９Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ａｒｇ　 Ｔｒｐ　Ａｓｎ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｇｌｎ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　 １８２Ｈ１！Ｉ　ｋｒｑ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ日ｉ、ｓ　Ｔｈｒ　Ｍｅｔ　Ａｓｎ　 Ｇｌｙ　Ｈｉｓ　１９２二と■二しニ ー　Ｆｌ　−Ｇ　Ｙ／％４−　Ｙ　賢□Ｗ□讐要約書 活性成分としてチオール−プロテアーゼインヒビターを含有するレトロウィルス 疾患を治療又は予防する薬学的組成物。チオール−プロテアーゼインヒビターは 公知の生成物、例えば、シスタチン類及びその誘導体、アンチパインＪ（Ｓ）− １−カルボキシ−２−フェニルエチルコーカルバモイルーＡｒｇ−Ｖａ　ｌ−Ａ ｒｇ−ａ’Ｌ　Ｅ−６４（Ｌ−４ランス−エポキシスクシニル−ロイシルアミド −（４−グアニジノ）−ブタン’）　、Ｎ−［Ｎ＝　（Ｌ−３−トランスカルボ キシイラン−２−カルボニル）−Ｌ−〇イシル］−アグマチン、ロイペプチン、 ヨード酢酸／ヨードアセタミド又はＮ−Ｃｂｚ−Ｐｈｅ−Ａｌ　ａ−ジアゾメタ ン等である。

補正書の翻訳文提出書（特許法第１８４条の８）平成４年６月１８日 特許庁長官　深　沢　亘　殿　い ＰＣＴ／ＦＲ９０１００９２１ 、発明の名称 レトロウィルス感染症を治療又は予防する薬学的組成物３　特許出願人 住　所　フランス国　６７０００　ストラスプール　リュドゥ　モルシャイム　 １１ 名　称　トランスジーン　ソシエテ　アノニム４代理人 住所〒５４１ 大阪市中央区平野町２−１−２　沢の鶴ビル・ｆ１０６　（２０３）　０９４１ 請求の範囲 １、後天性免疫不全レトロウィルス感染を治療又は予防するための医薬物質の生 産へのチオールプロテアーゼインヒビターの使用。

２、ＡＩＤＳを治療又は予防するための医薬物質あ生産へのチオールプロテアー ゼインヒビターの使用。

国際調査報告 ″””　”’　ＰＣＴ／ＦＲ９０１００９２１−１向−＾−一。−ＰＣＴ／ＦＲ ９０１００９２１国際調査報告 ＦＲ９０００９２１ Ｓ＾　４３２２７

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．活性成分としてロイペプチン以外のチオーループロテアーゼインヒビターを 、薬学的に許容される担体又は希釈剤と共に含有するレトロウイルス感染症を治 療又は予防する薬学的組成物。 ２．レトロウイルス感染症を治療又は予防するための医薬物質の生産へのチオー ループロテアーゼインヒビターの３．ＡＩＤＳを治療又は予防するための医薬物 質の生産へのチオーループロテアーゼインヒビターの使用。 ４．活性成分として、後天性免疫不全レトロウイルスのｖｉｆ蛋白の特異的なイ ンヒビターを含有する請求項１に記載の薬学的組成物。