JPH05502169A - シュークロースリン酸シンテターゼ（ｓｐｓ）、その製造方法、その相補的ｄｎａ及びその相補的ｄｎａの植物細胞中でのｓｐｓの発現を修飾するための利用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 シュークロースリン酸シンテターゼ（ＳＰＳ）、その製造方法、その相補的ＤＮ Ａ及びその相補的ＤＮＡの植物細胞中でのＳＰＳの発現を修飾するための利用本 発明は、サツカロ−スリン酸シンテターゼ（ＳＰＳ）、その製造方法、その相補 的ＤＮＡ及びその相補的ＤＮＡの植物細胞中でのＳＰＳの発現率を修飾するため の利用に関係する。

この発明の主題は、サツカロ−スリン酸シンテターゼ（ＳＰＳ）の活性を有する 蛋白質である。

植物細胞とは、カルス等の未分化組織又は胚、植物のある部分、全植物又は種子 等の分化した組織を形成することの出来るすべての植物細胞を意味する。

植物とは、例えば、麦わら等の草類、小麦、大麦、トウモロコシ又はカラス麦等 の穀類、大豆等の豆類、ヒマワリ等の油を産する植物、ジャガイモ等の塊茎を有 する植物、サトウダイコン等の根菜類又はトマト等の果実等の種子を生じる植物 を特に意味する。

一層詳細には、この発明の主題は、サツカロ−スリン酸シンテターゼ及び特に植 物のサツカロ−スリン酸シンテターゼである。

植物とは、例＾ば、イネ科植物（例えば、小麦、大麦、カラス麦、サトウキビ） 、野菜（トマト及び大豆等）、果物（リンゴ及びバナナ等）を意味する。

サツカロ−スリン酸シンテターゼはサッカロースの制御機構において鍵となる酵 素であるが、光合成における澱粉とサッカロースとの間の炭素の分配の制御ａ１ 嘴においても鍵となる酵素である（この主題については、ＪａｃｋＰＲＥＩＳＳ 　（ＴＩＢＳ　１９８４年１月　２４頁以降）又はＭａｒｋＳＴＩＴＴ等による 論文（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ｏｆ　Ｐｌａｎｔｓ　ｖｏｌ、１０、１９８ ７．３２７頁以降）を参照されたい１０ＳＰＳは関係のある種に特異的であるよ うである。ホウレンソウのサツカロ−スリン酸塩を精製して予備的な特性決定を 行なったＪＯａ（１ｌ　−Ｗａｌｋｅｒと５ｔｅｖｅｎ　Ｃ，Ｈｕｂｅｒは、得 られた抗体が専らホウレンソウのＳＰＳを認識することを明確に示した（ＰＬＡ ＮＴ　ＰＨＹＳＩＯＬ　（１９８９）　８９．５１８−５２４を参照されたい） 。

一層正確には、この発明の主題はトウモロコシのＳＰＳである。

トウモロコシのＳＰＳは純粋又は実際上純粋な形態で存在し得る。

一層正確には、この発明の主題は、前に定めた、モノマー、ダイマー又はテトラ マー形態で見られ且つそれらの誘導体がアミノ酸配列が下記のものである少なく とも１つのペプチドを有する、１１０〜１３０ｋＤのオーダーの分子量の蛋白質 である； ＴｈｒＴｒｐＨｅＬｙｓ ＴｙｒＶａｌＶａｌＧ１ｕＬｅｕＡ１ａＡｒｇＳｅｒＭｅｔＰｒｏＰｒｏｌｌｅ ＴｒｐＡｌａＧｌｕＶａｌＭｅｔＡｒｇＬｅｕＡｒｇＰｒｏＡｓｐＧｌｎＡｓｐ ＴｙｒＬｅｕＭｅｔＨｉｓｌｌｅＳｅｒＨｉｓＡｒｇＴｒｐＳｅｒ）ＩｉｓＡｓ ｐＧｌｙＡｌａＡｒｇ特に、前に定めた図７に記載されたアミノ酸配列を有する 蛋白質は、この発明の主題である。

遺伝子工学技術により改変され且つＳＰＳの活性を与λる、前に定めた蛋白質の 誘導体も又、この発明の主題である。

下記により特徴付けられる製造方法も又、この発明の主題である： ａ）低温に保存した植物の部分から、破砕、遠心分離及び濾過によって抽出物を 作成し、 ｂ）得られた抽出物を、適当な溶媒中での沈殿、得られた沈殿物の緩衝溶液中で の遠心分離及び可溶化によりＳｐｓ蛋白質を豊富にし、 Ｃ）こうして得られた活性な蛋白質をクロマトグラフィーによって精製し、且つ 所望であれば、ｄ）上記のａ）、ｂ）及びＣ）段落にて得られた標品の１つから 得られる抗原溶液からハイプリドーマ及びモノクローナル抗体を製造し、 ｅ）そのハイブリドーマをスクリーニングし、ＳＰＳに特異的なモノクローナル 抗体を選択し、ｆ）得られたＳＰＳを、この方法で製造した抗体により精製する 。

一層正確には、下記により特徴付けられる方法は、この発明の主題である。

ａ）低温に保存したトウモロコシ植物の部分から、破砕、遠心分離及び濾過によ って抽出物を作成し、ｂ）得られた抽出物を、ポリエチレングリコール中での沈 殿、得られた沈殿物の緩衝溶液中での遠心分離及び可溶化により蛋白質を豊富に させ、 Ｃ）こうして得られたＳＰＳ蛋白質を低圧アニオン交換クロマトグラフィーによ り、次いでヘパリンセファロース上でのクロマトグラフィーにより、次いで高圧 アニオン交換クロマトグラフィーにより精製し、ｄ）活性画分を２つの高圧クロ マトグラフィーカラムを通すことにより精製し、且つ所望であれば、ｅ）製法ａ ）、ｂ）、ｃ）から得られた抗原溶液からハイブリドーマ及びモノクローナル抗 体を製造し、ｆ）そのハイブリドーマをスクリーニングし、ＳＰＳに特異的な抗 体を選択し、 ｇ）前に得られたＳＰＳを、こうして製造した抗体により精製する。

好ましい実施態様においては。

−用いるトウモロコシはＰＩＯＮＥＥＲ３１ｇ４株のトウモロコシであり、 −用いるトウモロコシ植物の部分は、例えば、−５０〜−９０℃の低温に保存し 、 −　ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）中での精製を下記の２段階にて行ない： ・ＰＥＧの終１度が６％に近い第１の沈殿、・ＰＥＧの終濃度が１２％に近い第 ２の沈殿−各種のクロマトグラフィーを下記のように行なう。

第１クロマトグラフィー：ＤＥＡＥセファロース、第２クロマトグラフイ一二ヘ バリンセフアロース（こうして得られた標品は活性の大部分を失うことなく数日 間保存することが出来ることは注意すべきである）第３ＨＰＬＣクロマトグラフ イー＋　Ｍｏｎｏ　Ｑクロマトグラフィー、 第４ＨＰＬＣクロマトグラフィー：ヒドロキシルアパタイト、 第５ＨＰＬＣクロマトグラフィー：ＤＥＡＥ。

−　これらの様々な精製段階及びその後の過程において、ＳＰＳ活性の測定を、 好ましくは、下記の２つの異なる方法を用いて行なう： ａ）比色定量試験又はレゾルシノール試験に基づく方法、 ｂ）トランスホーメーション反応中に形成されるＳＰＳを含む生成物の１つの測 定に基づく方法。これらの２つの方法を後述の実験部分において詳述する。

−マウスを精製した酵素標品の数回の注射により免疫する。

種々のマウスの型を用いることが出来る（例えば、ＢＡＬＢ／Ｃマウス）。

抗原を完全フロインドアジュバント中にて、次いで、不完全フロインドアジュバ ント中にて用いる。

マウスに抗原の数回の注射を行なう・セフ０画分の３回の注射の後に最終画分の ３回の注射を行なうと良い結果が得られた（例えば、０．１４．２７．６０．９ ０及び１０５日にて行なう）。

先の注射を、例えば、肉祉における皮下経路により行ない、最後の注射を、例え ば、尾における静脈経路により行なう。

−　こうして免疫化した膵臓細胞懸濁液の標品を間代的（ｃｌｏｎｉｃ）方法に て処理する。

ミエローマ細胞との融合、ハイブリドーマの保存、抗体のクローニング及び生成 を既知の方法により達成する。

この抗原に対する抗体を分泌するハイブリドーマを検出するために、免疫化抗原 に対する分泌性バイプリドーマの検出抗体を選択するために下記の２つの方法を 用いるニ ー　ｓｐｓ活性の抗体インヒビターの検出の方法、−ｓｐｓ活性に対する抗体活 性の方法。

これらの方法は、好ましくは、実験部分にて記載する方法である。

得られたバイプリドーマの細胞系統、特に、下記のハイブリドーマの細胞系統も 又、この発明の主題である：’ＳＰＡ　２−２−３　：　Ｉ−９７１ＳＰＡ　２ −２−２２　：　ｌ−９７０ＳＰＡ　２−２−２５　：　ｌ−９７２ＳＰＢ　３ −２−１９　：　ｌ−９７３ＳＰＢ　５−２−１０　：　ｌ−９７４ＳＰＢ　５ −４−２　：　ｌ−９７５ ＳＰＢ　１３−１−７　：　ｌ−９７６ＳＰＢ　１３−２−２　：　ｌ−９７７ （これらは、１９９０年６月１１日に、Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎＮａｔｉｏｎａｌ 　ｄｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　ｄｅ　Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ　（ＣＮＣＭ− パスツール研究所）に、記した番号の下に寄託した。

ＳＰＳに特異的なモノクローナル抗体も又、この発明の主題である。

前記の蛋白質を含む標品が前記の蛋白質に特異的なモノクローナル抗体を含むク ロマトグラフィーカラムを通過し且つこの方法にて所望の蛋白質が得られるとい うことで特徴付けられる蛋白質製造方法も又、この発明の主題である。前に定め た蛋白質、特にトウモロコシの５ＰＳ（その配列を図７に示す）の配列をコード しているＤＮＡも又、この発明の主題である。

サツカロ−スリン酸シンテターゼ（ＳＰＳ）酵素をコードしている相補的ＤＮＡ 　（ｃＤＮＡ）を下２のように調製した： １−　精製したＳＰＳペプチド断片の配列決定前に得たトウモロコシのＳＰＳの 精製標品は、アクリルアミドゲル上での分離において、１２０ｋｄの弱いバンド （全蛋白質配列に対応する）並びに９０及び３０ｋｄの２つの主要なバンドを与 える。これらの２つのポリペプチドを電気泳動によって分離し、次いで、泳動溶 出させる。トリプシン消化に続いての得られた断片の配列決定は、決定すべき５ つのペプチドのアミノ酸配列を与えた（図３）、これらのペプチドのアミノ酸配 列の知識は、決定すべき対応する核酸配列を与える。

２−　トウモロコシの葉のＲＮＡの単離全ＲＮＡをＴＵＲＰＥＮとＧＲＩＦＦＩ Ｔ）Ｉの方法（１９８６年、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ｖｏｌ、４　ｐｐ　 １ｌ−１５）によって単離する。

ＲＮＡポリＡ＋を、既知の技術により、オリゴｄＴセルロースのカラムを通すこ とによって調製する。

３　−　ｃＤＮＡライブラリーの構築 ｃＤＮＡ合成をＰＲ０ＭＥＧＡ”合成キットを用いて行なう。ＭＭＬＶの逆転写 酵素をＡＭＶ逆転写酵素の代わりに用いる。得られたｃＤＮＡのサイズは５００ 〜数千塩基対に含まれる。ＥｃｏＲｒアダプターを、ラムダｇｔｌ１発現ベクタ ー中でクローニングする前に、ＣＤＮＡの端に付加する。このｃ　ＤＮＡライブ ラリーは約１．５Ｘ１０’のトランスホーマントを含む。

４　−　ＳＰＳに特異的なヌクレオチドの合成のためのＰＣＲの利用 図３に記載されたＢｌｌペプチド配列（３０ｋｄに由来）及び４Ｋ　（９０ｋａ に由来）から誘導体化されたオリゴヌクレオチドをＰＣＲ型反応におけるイニシ エーターとして使用する。出発の仮定は、３０及び９０ｋｄのポリペプチドは１ ２０ｋｄのＳＰＳ蛋白質の分解産物であるというものである。それ故、５ＰＳ３ ０及び５ＰＳ９０断片から生じるペプチドは同じＲＮＡメツセンジャーの翻訳か ら由来しなければならない。この仮定において、ＰＣＲ型反応におけるペプチド 配列に対応するオリゴヌクレオチド対の利用は、これらのオリゴヌクレオチだサ イズの’Ｄ　Ｎ　Ａ断片の合成を生じなければならない。

ＳＰＳ蛋白質中のこれらのペプチドのそれぞれの位置は分からないので、様々な 組合せを試みる。ＣＤ３オリゴヌクレオチド（図４）の対のみが測定されたサイ ズ（１２００塩基対）のＤＮＡ断片を与える。

５　−　ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング：２５０．０００のラムダｇｔ ｌｌｈランスホーマントを、ＰＣＲ反応（前述）により得られた１２００塩基対 のＤＮＡ断片を用いてスクリーニングにかけた。１６の陽性クローンが得られた 。挿入サイズは０．３〜２．８ｋｂで変化する。得られた配列はＲ゛側において は完全ではない、このライブラリーの、ＳＰＳクローンの５゛部位に相当する４ ００ｂｐのＤＮＡ断片を用いる第２のスクリーニングは、得られるべきクローン （ＳＰＳ６１）を与える（それは、５°末端を有さないが更に５゛部位にて伸長 している）。

６　−　ＳＰＳをコードするｃＤＮＡの５゛部位のクローニングを可能にする第 ２のｃＤＮＡライブラリーの生成及びスクリーニング ５ＰＳ６１クローンの５゛配列に相補的なオリゴヌクレオチドをｃＤＮＡの合成 のためのイニシェーターとして用いる。第２鎖の合成の後、ｃＤＮＡをラムダフ ァージ中にクローン化する。このライブラリーは約百万クローンを含む、５ＰＳ ９０及び５ＰＳ７７クローンが、このライブラリーを５ＰＳ６１　（図６）でス クリーニングする間に得られた。これらのクローンの配列は決定すべき５ＰＳ６ １クローンと重複する領域を与えた。５Ｐｓ９０クローンは、到達すべきＳＰＳ の５゛部位を与える。

得られるべき完全なｃＤＮＡ配列を与える異なる配列の構成の照合Ｃ図６）は、 ＰＣＲ技術を用いることにより行なうことが出来た。用いたイニシエーターば５ Ｐｓ３及び５ＰＳ９０クローンに属する。完全な配列により予言される正確なサ イズの７５０塩基対の断片を得ることは、５ＰＳ３及び５ＰＳ９０クローンが同 じＲＮＡメツセンジャーに由来することを断言することを可能にする。

７−　完全なｃＤＮＡのアセンブリー 前に定めた蛋白質のコード部分並びに植物におけるこの蛋白質の発現及び制御に 必要な配列を含むゲノムＤＮＡも又、この発明の主題である。

植物におけるＳＰＳの発現率を改変するための方法も又、この発明の主題である （前記の植物の細胞を前に定めたｃＤＮＡを含む発現ベクターによってトランス ホームすることを特徴とする）。

植物細胞における前記のＳＰＳの発現及び好ましくは超発現（ｓｕｐｅｒｅｘｐ ｒｅｓｓｉｏｎ　）を指示することの出来るプロモーター及びＳＰＳをコードす る遺伝子の発現に対する転写制御信号を含む３゛領域の制御下でＳＰＳ蛋白質を 発現させるベクターも又、この発明の主題である。

更に、この方法の実施により得られる植物も、この発明の主題である。

得られる種子も又、この発明の主題である。

下記の実施例は、この発明を説明するが制限するものではない。

精製中のＳＰＳ活性の監視を２つの方法で行なう　。

ａ）比色定量試験（Ｐ、　Ｓ、　Ｋｅｒｒ等、Ｐｌａｎｔａ　１９８７、１７０ ：　５１５−５１９　）いわゆるレゾルシノール試験による。

サツカロ−スリン酸シンテターゼ又はＵＤＰ−Ｄフルクトース−リン酸グルコシ ルトランスフェラーゼは下記の反応を触媒する： ＩＪＤＰＧ−フルクトース６−Ｐ　＝　サッカロース６−Ｐ　＋　ｆｌＤＰｌｌ ＤＰＧ：　ウリノンノネスネクルコースフルクトース６−Ｐ　即　ち　Ｆ６Ｐ： 　フルクトース６−リン酸サウカロース６−Ｐ：　サッカロース６−リン酸サツ カロ−スローＰは、レゾルシノールと反応して５２０ｎｍでの分光測光（０，Ｄ 、５２０ｎｍ）により定量可能な赤色化合物を与える。

ｂ）或は、下記の方法にてなされる対合酵素系（Ｓ、Ｈａｒｂｒｏｎ等、Ａｎａ ｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、１９ｇ０．　１０７：５６−５９　）による： ＵＤＰＧ　＋　Ｆ６Ｐ　＜＝＞　サッカロース６Ｐ　＋　ＵＤＰＰＳ ＵＤＰ　＋　ＡＴＰ　＜＝＞　ＡＤＰ　＋　ＩＩＴＰヌクレオチドン本ス本〜ナ ーゼ　ＮＰＪＡＤＰ　＋　ＰＥＰ　＜＝＞　ピルビン酸　＋　ＡＴＰピルビン酸 キナーゼ　ＰＫ ピルビン酸　＋　ＮＡＤＨ＜＝＞　ＮＡＤ　＋　乳酸乳酸デヒドロゲナーゼ ＮＡＤＨの消失を３４０ｎｍにて測定し、形成されたＮＡＤの１モル又は消費さ れたＮＡＤＨの１モルが形成されたサッカロース６Ｐの１モルに対応する。

精製のための出発材料を、切り分け、葉脈除去し、液体窒素中で急速冷凍して一 ７０℃に貯蔵した若いトウモロコシの葉（パイオニア３１８４株）により構成す る。

２５０ｇの葉をｌ１ｇのポリビニルピロリドンを加え、窒素を通気して発泡させ 、０℃に冷却した１リツトルの５０ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液、１０　ｍ　Ｍ　Ｍ　 ｇ　Ｃ１，１ｍＭＥＤＴＡ、５ｍＭＤＴＴ、ｐＨ７，５（抽出用緩衝液）中に懸 濁する。

葉を均一な懸濁液が得られるまで破砕する。その結果の生成物を、次いで、１４ ０００ｇで、２０分間、４℃で遠心分離する。

窒素通気による発泡を維持しながら、５０％ポリエチレングリコール（抽出用緩 衝液中の５０％ｐ　／　ｖ　Ｐ　Ｅ　Ｇ３０００″Ｂｒｅｏｘ”）を上清に、６ ％のＰＥＧ終濃度になるまで加える。２０分間、１４０００ｇでの遠心分離の後 、５０％ＰＥＧを上清に１２％のＰＥＧ終濃度になるまで加える。再び遠心分離 した後、上清を除去し、ペレットを６０ｍ１の５０ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液、１０ ｍＭＭｇＣ１ｚ、１ｍＭＥＤＴＡ、５ｍＭＤＴＴ、１０％エチレングリコール（ ＥＧ）、０．０８ＭＫＣｌ、ｐＨ７，５（再懸濁緩衝液）に溶解させる。この溶 液を１０分間、４００００ｇの遠心分離により清澄化する。その上清が最終的抽 出物を構成する。

１．２．２−低圧アニオン交換クロマトグラフィー；ＤＥＡＥセファロース高速 流交換器 最終的抽出物を、再懸濁緩衝液で平衡化したＤＥＡＥセファロース高速流カラム にてクロマトグラフィーにかける。カラムを同緩衝液で洗った後、支持体上に吸 着した蛋白質を５０ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液、１０ｍＭＭｇＣ１２，１ｍＭＥＤＴ Ａ、５ｍＭＤＴＴ、１０％ＥＧ、ｐＨ７，５（緩衝液Ａ）中における０、０８〜 ０．３５ＭＫＣｌの増加するイオン強度の線形勾配により溶出させる。この実験 中に用いる流速は１８０ｍ１／時であり、クロマトグラフィーは４℃で行なう。

ＳＰＳ活性は約０．１７ＭＫｃｌにて溶出される。

１．２．３−ヘパリンセファロース上でのクロマトグラフィＳＰＳ活性を含む画 分を合わせて緩衝液Ａにて１１５に希釈し、次いで、前もって緩衝液Ａにて平衡 化した１２ｉｎｌのヘパリンセファロースに加える。４℃でゆっ（り攪拌しなが ら１時間インキュベートした後、ゲルを約ｌＯ倍容の緩衝液Ａ＋０．０５ＭＫＣ ｌで洗い、次いで、クロマトグラフィーカラム中で元の状態に戻す。

吸着した蛋白質をインクラティク法にて６０ｍ１／時で加えられる１０ｍＭＣＡ ＰＳ緩衝液、１０ｍＭＭｇＣ１ｇ　、１ｍＭＥＤＴＡ、５ｍＭＤＴＴ、１０％Ｅ Ｇ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ８０　、　１　ｍ　ｇ　／　ｍ　１ヘパリン、１％フ ルクトース、０．２５ＭＫＣｌ、ｐＨ１０により溶出する。

ＳＰＳ活性を含む画分を合わせ（ヘパリン画分）、下記の精製段階まで氷上に保 存する。この　にお番る、は１１なくとも１　は　で　る。

下記の精製段階を高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて行ない、 ２８０ｎｍ　（Ａ２８０）の紫外線吸収の測定を可能にするフィルターを取り付 けた検出器によって精製を監視する。この緩衝液及び回収した画分を低温に維持 する。

１．２．４−高性能アニオン交換クロマトグラフィ一二モノＱ ヘパリン画分を２０ｍＭトリエタノールアミン緩衝液、１０ｍＭＭｇＣ１，，１ ｍＭＥＤＴＡ、ｌｏｍＭＤＴＴ、３％ＥＧ、０．３％Ｔｗｅｅｎ８０　、　ｐＨ ７，５（緩衝液Ａ）にて２／３に希釈し、前もってＮａＣ１を加えた（終濃度０ ．１８Ｍ）同緩衝液で平衡化したＨＰＬＣモノＱＨＲＩＯ／１０カラムに載せる 。開始時点を０分として、クロマトグラフィーの支持体に吸着したＡ２８０の蛋 白質を下記のように作成した塩複合勾配により溶出する： 緩衝液Ａ：　上記参照 緩衝液Ｂ：　緩衝液Ａ＋ＩＭＮａＣ１ 時間（分）　Ｂ（％） ４　１、　１　０　０ カラム上で用いた流速は１８０ｍ１／時である。

ｓｐｓ活性は０．２６〜０．３１ＭＮａＣＬで溶出される。活性な画分を集める （上２０画分）。

１．２．５−ヒドロキシアバタイト モ２Ｑ画分を、緩衝液２０　ｍ　Ｍ　Ｋ　Ｈ−Ｐ　Ｏ４／　Ｋ　ｓ　Ｈ２Ｏ２， ３％ＥＧ、０．３％Ｔｗｅｅｎ８０　、５ｍＭＤＴＴ。

ｐＨ７，５で平衡化したヒドロキシアパタイトのＨＰＬＣカラムに載せる。開始 時、屯を０分として、Ａ２８０の吸着蛋白質を下記のリン酸塩勾配により溶出さ せる：緩衝液Ａ：　上記参照 緩衝液Ｂ：　同緩衝液Ａ（但し、５００ｍＭのにリン酸塩を伴う） 時間（分）　Ｂ（％） 用いる流速は６０ｍ１／時である。この段階においてリン酸塩はＳＰＳ活性の部 分的インヒビターであり、それ故、特異的活性並びに精製因子を計算することは 困難であるということを注意すべきである（表１を参照）。

ＳＰＳ活性はこれらの条件においては約６０ｍＭリン酸塩にて溶出される。

活性画分を合わせてＨＡＣ画分を構成する。

１．２．６−　ＤＥＡＥＳ　ＰＷ上でのＨＰＬＣＨＡＣ画分を、前もって２０ｍ Ｍトリエタノールアミン緩衝液、１０ｍＭＭｇＣ１ｇ　、１　ｍＭＥＤＴＡ、３ ％ＥＧ、２．５ｍＭＤＴＴ、２％ベタイン、ｐＨ７，５（緩衝液Ａ）＋０．１５ ＭＮａＣＬにて平衡化したジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ−５ＰＷ）型のアニ オン交換ＨＰＬＣカラム上に載せる。

開始時点な０分として、Ａ２８０の吸着した蛋白質を下記のＮａＣ１勾配によっ て溶出する：緩衝液Ａ：　上記参照 緩衝液Ｂ：　同緩衝液（ＩＭＮａＣｌを伴う）時間（分）　Ｂ（％） 用いる流速は６０ｍ１／時である。

ＳＰＳ活性は約０．３ＭＮａＣ１で溶出する。

１．２．７−最終的標品の獲得、濃縮 最終的標品をモノＱＨＲ５１５交換器（５／５０ｍｍ、ｐｌＩＢｒｍａｃｉａ　 ）上でのＨＰＬＣ（高速溶出）により濃縮する。

ＤＥＡＥＳＰＷ画分（又はＧ２００画分）を緩衝液Ａ（四６）にて２／３に希釈 し、前もって緩衝液Ａ＋０．１８ＭＮａＣ１で平衡化したカラムに載せる。次い で、下記の勾配をカラムに加える： 緩衝液Ａ及びＢ・　（同６） 時間（分）　Ｂ（％） 用いる流速は６０ｍ１／時である。

ＳＰＳ活性は約３０Ｂ　（％）（０，３ＭＮａＣ１）で溶出する。

最終的標品を使用まで一２０℃にて保存する。

表１は精製の異なる段階において得られた結果を要約しである（蛋白質及びＳＰ Ｓ活性の量で示す）。

表１ Ｕンｄ−）　１　１０００　０．０５　０　１００ヘパリン画分０．２＜　＜０ ．４　２５　９　１８０　９０モノＱ　画分　（０，０２）　３０　−ＨＡＣ画 分　（０，０３８− 最終的標品　０．０５　２　２５　５００　５略」しＥ説 Ｐｆ　＝　精製因子 Ｙ＝収率 （）＝近似値 −・　未測定 プロフィル（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）は精製過程を説明しており、最終標品の品質を 図１に与久る。１２０．９５及び３５Ｋｄ　（キロダルトン）の蛋白質の存在は 、ＳＰＳ活性と相互に関係する。

続いて行なう３５及び９５　Ｋ、　ｄ蛋白質の配列の研究は、これらの蛋白質が 恐ら＜１２０Ｋｄの蛋白質の分解産物であることを示すように見える。更に、３ ５及び９５Ｋ（ｉの蛋白質に対する抗体は、メンブレンへのトランスファーの後 の免疫的検出により、１２０Ｋｄの蛋白質をも認識するが、これは、これらの３ 種の蛋白質問の抗原類似性を示す（下記を参照されたい）、シかしながら、精製 の間に緩衝液に加えるプロテアーゼインヒビターが１２０Ｋｄの蛋白質を単独で 獲得することを可能にしなかったことは指摘しなくてはならない。

サツカロ−スリン酸シンテターゼは、それ故、１２０Ｋｄの蛋白質を基礎サブユ ニットとして有する２又は４量体（ホモ２量体又はホモ４量体）であるように思 われる。

区ユ」敷整」し４説 トウモロコシのサツカロ−スリン酸シンテターゼの精製を説明する５ＤＳ−ＰＡ ＧＥのプロフィル２８．５％アクリルアミドゲル、還元条件及び硝酸銀での染色 Ｍ：分子量標１１１Ｂ−ガラクトシダーゼ（１１６Ｋｄ）、ウシアルブミン（６ ８Ｋｄ）、オバルブミン（４５Ｋｄ）、カルボニックアンヒドラーゼ（２９Ｋｄ ） Ｈ：ヘパリン画分（ウェル当り３０マイクログラムの蛋白質） ＦＰ　最終標品（ウェル当り７．５マイクログラムの蛋白質） ＦＥ：最終抽出物（ウェル当９７．５マイクログラムの蛋白） Ｄ　：　ＤＥＡＥ高速流画分（ウェル当９７．５マイクログラムの蛋白） 約１２０Ｋｄ　（１）、９５Ｋｄ　（２）及び３５Ｋｄ（３）にて可視化された 蛋白質バンドは、クロマトグラフィ一段階の過程において、画分中のＳＰＳ活性 の存在と相互に関係する。

２−　サツカロ−スリン　シンテターゼに・するモノクローナル　の　告　゛ ２．１　−　免ＪＬ化 ＢＡＬＢ／Ｃマウスを下記の方法により、（内証及び足への）皮下注射によって 免疫化する２０日目　約５マイクログラムの蛋白質（即ち、マウス当り約０．３ ＵＳＰＳ）の注射：容積対容積でフロイントの完全アジュバント（ＦＣＡ）と乳 化したモノＱブール。

１４日目　約５マイクログラムの蛋白質（即ち、マウス当り約０．３ｔＪＳＰＳ ）の注射：容積対容積でフロイントの不完全アジュバント（ＦＩＡ）と乳化した モノＱプール。

２７日目　１４日目と同じ ０日＋２月目　約２０マイクログラムの蛋白質の注射ＩＦＩＡ中の最終標品 ０日＋３月目　約１２マイクログラムの蛋白質の注射：　ＦＩＡ中の最終標品 ０日＋４．５月目　約２０マイクログラムの蛋白質の尾の静脈経由（ＩＶ）によ る注射：元のままの最終プール 融合をＩＶ免疫化の３日後に行なう。　゛免疫応答を測定するために３４日目、 ６７日目、９８日目及び１５９５９日目清を採取する（スクリーニングを参照さ れたい）。

２、１．１−スクリーニング 免疫のために用いるＳＰＳは完全には均質でないので、この酵素についての特異 的スクリーニングは完璧を期す必要がある。実際、ＥＬ　Ｉ　ＳＡ型試験は免疫 化剤として作用した標品中に存在するＳＰＳに無関係な不純物に対する抗体をも 示す。

２つの抗体検出方法を用いるニ ー　ｓｐｓ活性の抗体インヒビターの検出方法−ｓｐｓに対する抗体の検出方法 （インヒビターであってもな（でも良い）。

ａ）ＳＰＳ活性の抗体インヒビターの検出方法このスクリーニング方法は、抗体 が検出すべきＳＰＳの活性部位又はそれに近い部位のレベルにおいて結合し、そ れ故、基質の接触を阻止することを可能にする。

実際には、適当な方法で希釈した７０ＬＬＬの血清又はハイブリドーマ培養物上 清を７０μｍのＳＰＳ標品（ヘパリン画分）に加える６周囲の温度にて１時間イ ンキュベートした後、残余の活性を酵素結合測定を用いて測定する（Ｉ−１を参 照されたい）、結果を、抗体を伴わずに同じ方法で処理した同じＳＰＳ標品と比 較した阻害のパーセンテージで表す。

ｂ）ｓｐｓに対する抗体の測定方法（インヒビターであってもなくても良い） この方法は、トレーナ−システム（セファロ−スポールと結合した抗１ｇマウス １ｇ：抗マウスヤギセファロース即ちＧＡＭセファロース）を用いる、抗体−８ ＰＳ複合体の沈殿に基づいている。実際には、適当な方法で希釈した６０μｍの 血清又はハイブリドーマ培養物上清を６０μｍのＳＰＳ標品（ヘパリン画分）に 加える。周囲の温度にて２時間インキュベートした後、混合物を、前もって５０ ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液、１０ｍＭＭｇＣ１ａ　、１　ｍＭＥＤＴＡ、１０％ＥＧ 、５ｍＭＤＴＴ、ｐＨ７，５で３回洗った５０マイクロリツトルのＧＡＭ−ＳＥ ＰＨＡＲＯ３Ｅに加える（２５％）、その混合物を、４℃で一晩、振動攪拌しな がらインキュベートする。

３０００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、上清中の残存ＳＰＳ活性を酵素結合測 定法を用いて測定する（１．１を参照されたい）。結果を、抗体を伴わずに同じ 方法で処理した同じＳＰＳ標品と比較した沈降パーセンテージ（沈降の％）とし て表す。

２１．２−区１ １０匹のマウスを上記のプロトコールに従って免疫した。下記の表は１０匹のマ ウスの異種抗血清を用いてＤ１５９にて行なう沈降定量の結果を与える。血清を １／２００に希釈する。

マウス　１　２　３　４　５　６　７　８　９　１０沈降％　４５　２２　３２ 　６４　３６　３０　２２　１６　３９　３７マウス４の血清の更なる希釈は下 記の結果を与える：希釈　沈降（％） マウス１及び４の膵臓を融合に用いる。

２．２−　！ｆｆ１Ｊｌ殿ヱ マウス膵臓細胞をＳＰ２１０−Ａｇ−１４マウスミエローマ細胞と２／１の比で 、４５％のポリエチレングリコール１５００の存在下で融合させる。ハイブリド ーマの選択を、ヒボキサンチン及びアザセリンを培養培地に融合の２４及び４８ 時間後に加えることにより行なう。

ハイブリドーマをクローン化し、限界希釈によりサブクローン化する。

２、２．１−ハイブリッド及びクローンのスクリーニングの結果 ハイブリッド マウス４　（ＳＰＡ融合）　マウス１　（ＳＰＢ融合）ＳＰＡ２　＋３８％沈降 　５ＰＢ３　：１７％沈降５ＰＡ１９：　７％沈降　５ＰＢ５　：６７％沈降５ ＰＢ８　：５３％沈降 ５ＰＢ１３・６８％沈降 ５ＰＢ２５＋１３％沈降 ５ＰＢ３４　：１７％沈降 クローン 融合ＳＰＡ　融合５ＰＢ ＳＰＡ２−２：８５％沈降　５ＰＢ３−２：１９％沈降５ＰＡ１９−７・８％沈 降　５ＰＢ５−１ニア６％沈降５ＰＢ５−２ニア１％沈降 ５ＰＢ５−３＋４５％沈降 ５ＰＢ５−４：２４％沈降 ５ＰＢ１３−１ニア９％沈降 ５Ｐ８１３−２：５３％沈降 サブクローン ＳＰＡ融合　ＳＰＢ融合 Ｓ　Ｐ　Ａ２−２−３　：　６０％沈降　Ｓ　Ｐ　Ｂ　３−２−１９：　２１％ 沈降Ｓ　Ｐ　Ａ　２−２−２２・３３％沈降　Ｓ　Ｐ　Ｂ　５−２−１０：　８ ６％沈降Ｓ　Ｐ　Ａ２−２−２５：　９２％沈降　Ｓ　Ｐ　Ｂ　５−４−２　： 　４Ｂ％沈降Ｓ　Ｐ　Ｂ　１３−１−７：　８７％沈降Ｓ　Ｐ　Ｂ　１３−２− ２：　９３％沈降２、２．２−抗ＳＰＳモノクローナル抗体の製造ハイブリドー マを、前もってブリスタン処理したＢＡＬ　Ｂ　／　ｃ雌マウスに腹腔経由で注 入する。モノクローナル抗体を腹水液から部分精製し、こうして、１８％硫酸ナ トリウムで沈殿させることにより生成する。沈殿した蛋白質を溶解させ、次いで 、ＰＢＳに対して透析する（Ｆ　１８）。

２、２．３−抗ＳＰＳモノクローナル抗体の特性決定ａ）型 ＥＬＩＳＡ試験を用いて、型を決定する。抗ＩｇＧウサギ抗体及び抗ＩｇＧウサ 抗体（ＺＹＭＥＤ　）を９６穴プレートの穴の底に固定させる０周囲の温度で一 装置いた後、非占拠（ｎｏｎ−ｏｃｃｕｐｉｅｄ）部分をＰＢＳ中の３％ウシ血 清アルブミン溶液で満たす、３７℃での１時間のインキュベーション及び数回の 洗浄の後、異なるＦ１８を穴に入れる。インキュベーション及び数回の洗浄の後 、ペルオキシダーゼと結合されたヤギ又はウサギの抗体（マウス免疫グロブリン の抗クラス及び抗サブクラス）を加える、３７℃で１時間経過後、Ｈ，Ｏ，／Ａ ＢＴＳシステムを用いて抗体を見る。

すべての抗ＳＰＳモノクローナル抗体はＩ　ｇ　Ｇ　＋型である。

ｂ）ＳＰＳ活性の阻害 ＳＰＳ活性を阻害する抗体の能力の定量をＦ１８を用いる上述の技術（２，１， １を参照されたい）を用いて行なう。

抗体の濃度　阻害％ 抗体　（ＬＬｇ／ｍ１） Ｓ　Ｐ　Ａ　２−２−３　５０　０ Ｓ　Ｐ　Ａ　２−２−２２　５０　０ Ｓ　Ｐ　Ａ　２−２−２５　５０　０ ＳＰＢ３−２−１．９　５０　０ Ｓ　Ｐ　Ｂ　Ｓ−２−１０５００ Ｓ　Ｐ　Ｂ　５−４−２　５０　０ Ｓ　Ｐ　Ｂ　１３−１−７　５０　５０ＳＰＢＩ３−２−２　５０　６０．　１ ２．５　１４．２ １　８　、７ ｃ）ＳＰＳ活性の免疫沈降 抗体のＳＰＳ活性を免疫沈降させる能力の定量をＦ１８を用いる上述の技術（２ ，１，１ｂを参照されたい）を用いて行なう。

抗体の濃度　沈降％ 抗体　（μｇ／ｍ１） Ｓ　Ｐ　Ａ　２−２−３　５０　９５ ＳＰＡ２−２−２２　５０　９５．７ 抗体 Ｓ　Ｐ’Ａ２−２−２５　５０’　９１　、３２．５　２２．８ １　１２．５ Ｓ　Ｐ　Ｂ　３−２−１９　５０　９５Ｓ　Ｐ　Ｂ　５−２−１０　５０　９５ Ｓ　Ｐ　Ｂ　Ｓ−４−２５０９５ Ｓ　Ｐ　Ｂ　１３−１−７　５０　９５Ｓ　Ｐ　Ｂ　１３−２−２　５０　９５ ２、　５　４３．　５ ３−　サツカロ−スリン　シンテターゼのび　１のためのモノクローナル　の１ ３．１−　トウモロコシのサツカロ−スリン　シンテターゼ悲りユｌ上 この特性決定を、変性条件下での電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）ゲルからニトロ セルロースメンブレンへの蛋白質のトランスファーの後、５ＰＢ３−２−１９及 びＳＰＢ　１３−２−２抗体を用いて免疫検出の技術によって行なう。

１２．５％のアクリルアミドゲル中での泳動（Ｎａｔｕｒｅ　２２７　（１９７ ０）　６８０−６８５　）の後、蛋白質を、トランスファーバットにより、０． ２２ＬＬｍのニトロセルロースゲル（５ｃｈｌｅｉｃｈｅｒと５ｃｈｕｅｌｌ　 ）上へトランスファーする（初期電流は１アンペア）。

用いる緩衝液は標準電気泳動用緩衝液（ＴＲＩＳベース３．０３ｇ／ｌ、グリシ ン１４．４ｇ／ｌ、５Ｄ３０．１％、ｐＨ８，３）に２０％メタノールを加えた ものである。

トランスファーの後、非占拠部位をゲルに由来する蛋白質で満たすために、メン ブレンを浸漬バスに入れる。穏やかに攪拌しながら３７℃で１時間経過した後、 メンブレンを洗浄用緩衝液（０，１％カゼイン、２０．０％ＴｗｅｅｎをＰＢＳ 中に含む）で３〜４回洗い、次いで、試験をするために１０μｇ　／　ｍ　ｌの モノクローナル抗体溶液と共にインキュベートする。メンブレンの１部分を非免 疫抗体と共に並行してインキュベートする（負の対照）０周囲の温度で１時間イ ンキュベートし、続いて９〜１０回洗浄した後、メンブレンを、洗浄用緩衝液に て希釈したヨウ素１２５（メンブレン１　ｃｍ”当り５００００ｃｐｍ）で標識 したマウス抗体の存在下でインキュベートする。

１時間周囲の温度でインキュベートし、続いて９〜１０回洗浄した後、メンブレ ンを乾燥し、次いで、オートラジオグラフィーを行なう（フィルムはＸ−ＯＭＡ Ｔ　ＡＲＫＯＤＡＫで増感剤はＣｒｏｎｅｘ　ＸＴＲＡ　ＬｉｆｅＤＵＰＯＮＴ を使用）。

オートラジオグラムを図２に示す。前の結果と相互に関係する１２０Ｋｄ、９５ Ｋｄ及び３５Ｋｄの蛋白質のバンドのレベル（第１節参照）に強いシグナルが観 られる。

１１立亙ＡＩＩ Ａ：５ＰＢ３−２−１９抗体の存在下でインキュベートしたメンブレン Ｂ：ＳＰＳに対するものではない抗体の存在下でインキュベートしたメンブレン （抗ネオマイシンモノクローナル抗体負の対照） Ｃ：　ＳＰＢ　１３−２−２抗体の存在下でインキュベートしたメンブレン　Ｍ ：　Ｉ　１２５で放射性標識した分子量マーカー（ＮＥＸ−１８８ＮＥＮ　）　 Ｂ−ガラクトシダーゼ（１１６Ｋｄ）、ウシアルブミン（６８Ｋｄ）、カルボニ ックアンヒドラーゼ（２９Ｋｄ）、１−リブシンインヒビター（２０，１Ｋｄ） 、α−ラクトグロブリン（１４，４Ｋｄ）、沈着物当り１５００００ｃｐｍ ＰＡ、モノクローナル抗体ＳＰＢ　１３−２−２を用いるイムノアフィニティー クロマトグラフィー（下記参照）の後に得られた蛋白質の沈着物（沈着物当り約 ４０μｇの蛋白質） Ｈ，ヘパリン画分の沈着物（沈着物当り約４０μｇの蛋白質） ３．２−サツカロ−スリン　シンテターゼのイムノアフニティーによる イムノアフィニティー支持体上でのトウモロコシのサツカロ−スリン酸シンテタ ーゼの精製方法を、精製段階数を減らすことにより回収される蛋白質の量を増し 、それにより、配列決定の研究を可能にするために開示した。

３２．１−免疫吸着の準備 ５ＰＢ１３−１−７抗体又は５ＰＢ１３−２−２抗体に対応するＦ　１８　（２ ，２，２参照）を、ゲル１ｍｌ当り１ｍｇの抗体の割合で、活性化ＣＨ−セファ ロースに加える。２時間周囲の温度でインキュベートした後、抗体によって占め られていない部位を１Ｍエタノールアミン（ｐＨ９）で満たす。支持体を、次い で、選択的に、０．１Ｍ酢酸緩衝液、０．５ＭＮａＣ１，ｐＨ４及び０．１ＭＴ Ｒｌ５緩衝液、０．５ＭＮａＣ１，ｐＨ８で洗う、こうして調製したイムノアフ ィニティー支持体を、４℃で、５０ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液、１０ｍＭＭｇＣ１， ，１ｍＭＥＤＴＡ、１　ｍ　Ｍ　Ｐ　Ｍ　Ｓ　Ｆ、０．０１％窒化ナトリウム（ アジド）、ｐＨ７，５中で保存する。

３、２．２−イムノアン　ニテ　−クロマトグラフ　−８ＰＳの精製に対応する ヘパリン画分に、５０％ＰＥＧを、２０％ＰＥＧの終濃度になるまで加える。３ ０分間、４℃で、低速で攪拌しながらインキュベートした後、混合物を１６００ ｇで３０分間遠心分離する。蛋白質ベレットを出発□緩衝液（５０ｍＭＨＥＰＥ Ｓ、１０ｍＭＭｇｃｌｚ　、１ｍＭＥＤＴＡ、１０％エチレングリコール、ｐＨ ７，５）の容積の半分だけ取る。この段階は、イムノアフィニティークロマトグ ラフィーと相客れない前述の緩衝液の除去及び蛋白質の濃縮を可能とする。ｓｐ ｓ活性の収率は８０〜９０％である。

得られる溶液を、Ｏ，１ｍｌ／分の流速で、ＳＰＳに対するのではない抗体を固 定してカラムに詰めた１ｍｌのイムノアフィニティー支持体（抗ネオマイシン抗 体を固定させた活性化ＣＮＢｒ−５ＥＰＨＡＲＯＳＥ）に加える。この第１段階 は、クロマトグラフィー支持体上で非特異的方法で自分自身を固定する不純物を 除去する。非特異的なカラム流出液を、再び、抗ＳＰＳイムノアフィニティー支 持体（１１Ｘ２０ｍｍのカラム中の２ｍ１）に、０，１ｍ１／分の流速で加λる 。これらの２段階を研究室の１度にて行なう。カラムを１０ｍ１の積載用緩衝液 （ｌｏａｄｉｎｇ　ｂｕｆｆｅｒ）で洗い、次いで、洗浄用緩衝液（０，２５Ｍ ＮａＣ１及び０３％Ｔｗｅｅｎ　２０を含む積載用緩衝液）で、２８０ｎｍでの 紫外線吸収が基底レベルに近づくまで洗った後、支持体上に吸着した蛋白質を５ ０　ｍ　Ｍ　トリエチルアミン（ｐＨ１１）溶液で溶出する。この溶出を４℃で 行ない且つイムノアフィニティーカラムを最良の収率を得るために逆さまにする 。得られる最終標品の５ＤＳＰＡＧＥのプロフィルは欅準的プロトコールによっ て得られるものに対応する（１を参照されたい）。イムノアフィニティー支持体 に吸着した蛋白質の溶出方法はＳＰＳ活性に対して不可逆的に阻害作用を有する が、ＳＰＳ結合蛋白質の回収収率は自然の溶出条件で行なった試験に比較して最 適であるということは注意するべきである。イムノアフィニティーカラム溶出物 を、Ｇ２５カラムを用いて、０．１４％グリセロール、０．０７％Ｂ−メルカプ トエタノール、０．０４％ＳＤＳ、０．９ｍＭＴＲｌ５．ｐＨ６，８の緩衝液（ ７０倍に希釈した還元条件の電気泳動緩衝液）に対して脱塩する。脱塩後、蛋白 質標品な、真空濃縮機を用いて７０倍に濃縮し、ＳＰＳ蛋白質を５ＤＳ−ＰＡＧ Ｅで精製する（下記参照）ＬＬｌＬＬ　：　Ｓ　Ｐ　Ｓをコードする完全なｃＤ ＮＡの構築Ａ）ＳＰＳポリペプチドの 前述のようにして得た精製蛋白質標品の試料をＳＤＳアクリルアミドゲル中で電 気泳動にかける。

電気泳動後、蛋白質のバンドをＢｅｒｇｍａｎとＪｏｅｒｎｖａｌｌ（Ｅｕｒ、 　Ｊｏｕｒ、　Ｂｉｏｃｈｅｗ、　（１９７８１１６９，９−１２）により記載 されたようにして塩化カリウム処理により検出し、分子量９０ｋＤ及び３０ｋＤ に相当すると見られるバンドを切り出す、それらの蛋白質をゲル断片、から、製 造業者（ｌ５ＣＯ；　Ｌｉｎｃｏｌｎ、半１ラスカ）の推薦に従って電気泳動式 濃縮機（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ　Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ）を用い て４ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ８）中で泳動溶出する。泳動溶出の後、回収さ れた蛋白質の量を、既知濃度のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）溶液との比較によ り、クーマシーブルーでの染色によって測定する。およそ３０マイクログラムの ３０ｋＤの蛋白質と７５マイクログラムの９０ｋＤの蛋白質が得られる。

蛋白質をアセトン沈殿により濃縮し、５０ｍＭの炭酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ ８）中に懸濁する。トリプシン消化及びＨＰＬＣ精製をＳｔｕｒｍと（：ｈｒｉ ｓｐｅｅｌｓ　（Ｊｏｕｒ。

Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、（１９８７）　２６２．１３３９２−１３４０３　）に よって記載されたように行なう。手短に言えば、トリプシンを加えて３７℃で２ 時間インキュベートすることにより消化を行なう。次いで、その消化を繰り返す 、蛋白質を凍結乾燥により濃縮し、５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ２ ，２）中に懸濁する。この混合物を、０１８カラムを用いての逆相ＨＰＬＣクロ マトグラフィーにかける。溶出を、アセトニトリルの増加する勾配を用いて行な う。リン酸塩／アセトニトリル勾配の緩衝混合液での溶出を２１４ｎｍにて分光 測光的に監視する。２１４ｎｍの吸収ピークに対応する画分を集め、凍結乾燥し 、０．１％トリフルオロ酢酸中に懸濁し、再びＣＩ８カラムに加え、そしてアセ トニトリル勾配を用いて溶出する。トリフルオロ酢酸／アセトニトリル勾配を用 いて行なう溶出を２１４ｎｍにて分光測光的に監視する。２１４ｎｍでの吸収ピ ークに対応する画分を集め、凍結乾燥し、そして自動蛋白質シーケンサ−（Ａｐ ｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅａｓ；　Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃ１ｔｙ、カリ本ルニ？ ）を用いてエドマン式蛋白質消化にかける。５つのペプチド配列が得られる（図 ３参照）。

Ｂ）　ｌ−ウモロコシの　か　のＲＮＡの全体的に且つ十分に発育した葉を２フ イート（６０゜９６ｃｍ）の高さのＰｉａｎａｅｒ　トウモロコシの雑種３１８ ４植物から採取する。葉を午前中遅くに採取し、液体窒素浴にて急速冷凍し、そ して−７０℃に保存する。全ＲＮＡをＴｕｒｐｅｎとＧｒｉｆｆｉｔｈ　（Ｂｉ ｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　（１９８６１４，１１−１５）の方法によって単離す る。手短に言えば、２５０ｇの材料を４Ｍのグアニジンチオシアネート及び２％ サルコシル中でホモジェナイズする。混合物を、次いで、遠心分離し、透明リゼ イト（Ｌｙｓａｔ　）と呼ばれる上清を５．７ＭＣｓＣ１のベッド上に置き、そ して５０．０００ｒｐｍにて５．５時間遠心分離する。そのＲＮＡペレットを水 に溶かし、フェノール及びクロロホルムで抽出し、エタノールで沈殿させる。そ の結果生じたペレットを水に懸濁する。ＲＮＡ単離の最終的収率なＵ■分光測光 により定量する。セルロース粉末／水の飽和＠濁液をＲＮＡ／水混合物に、総容 量の１０％で加えて残存多糖類を除去する。遠心分離の後、ＲＮＡを含む上清を 、Ｍａｎｉａｔｉｓ等（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　Ａ　Ｌａｂｏ ｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ。

（１９８２）　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　−−ヨーク）によっ て記載されたように、オリゴ（ｄＴ）セルロースカラムに加える。次いで、ポリ （Ａ）ＲＮＡを含む両分を、再び、カラムに加える。ポリ（Ａ）ＲＮＡを含む溶 出画分をフェノールで抽出し、ＲＮＡをエタノールで沈殿させる。

Ｃ）ｃＤＮＡライブラリーの　びスクリーニングｃＤＮＡの合成を製造業者の推 薦（Ｐｒｏｍｅｇａによる５ｙｓｔｅｌｌＩｅ　ｄｅ　５ｙｎｔｈｅｓｅ　Ｒｉ ｂｏＣ１ｏｎｅＴｌ′　ｃＤＮＡ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ウィスコンンン）に従って 、５μｇのポリ（Ａ）ＲＮＡをマトリ・ソクスとして用いて行ない、Ｍ−ＭＬＶ 逆転写酵素（ＢＲＬ　；　Ｂｅｔｈｅｓｄａ、メリーランド）をＡＭＶ逆転写酵 素の代用とする。ＥｃｏＲＩアダプターのオリゴヌクレオチドを遊離末端を有す るｃＤＮＡに付加し、その結果の断片を製造業者の推薦に従って発現ベクター（ Ｌａａ＋ｂｄａＺＡＰ、　Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ；　Ｌａ　Ｊｏｌｌａ、カリ本 ルニ１）中にクローン化する。得られるライブラリーは約１．５Ｘ１０’のトラ ンスホーマントを含む。

段階Ａのペプチドの配列から与えられる情報及びポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ ）を用いて、ＳＰＳのｃＤＮＡに対応する１　２００ｂｐの断片を生成する。ト ウモロコシの葉のＲＮＡから得られる全ｃＤＮＡをマトリックスとして用い、消 化したオリゴヌクレオチド（３０ｋＤ及び９０ｋＤの配列のデータから合成した もの）をイニシエーターとして用いる。これらのイニシエーターシリーズをＣＤ ３及びＣＤ４と呼ぶ（図４）。正しいイニシエーターシリーズ（ＣＤ３）の利用 はＰＣＲ反応によって造られる断片を生じる。他のイニシエーターシリーズ（Ｃ Ｄ４）を用いるＰＣＲ反応は断片の合成を生じない（図５）。ＰＣＲ反応を、３ ０サイクル続く反応及び５０℃で１分間行なう再ハイブリダイゼーション段階を 除いては、製造業者の推薦（ＧｅｎｅＡｌＩｉｐ”　ＤＮＡ　Ａｍｐｌｉｆｉｃ ａｔｔｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔ　Ｋｉｔ及びＤＮＡ　Ｔｈｅｒｍａｌ　Ｃｙｃｌｅ ｒ　ｏｆ　Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｏｌｅｒ　Ｃｅｔｕｓ；　Ｎｏｒｗａｌｋ、　コ ネチカフト）に従って行なう、サザーン分析は、ＰＣＲバンドが、図５に示すよ うに、アーティファクトではないことを確実にする。４に５プローブに対応する 配列が１２００ｂｐの断片に含まれる（この断片がＳＰＳ配列に対応するならば ）と想像されるので、その４に５プローブを用いる。このプローブは、ＣＤ３イ ニシエークーシリーズを用いてＰＣＨによって生成した１２００ｂｐのバンドに ハイブリダイズするが、ＣＤ４イニシエーターシリーズを用いて生成したＰＣＲ 生成物とはハイブリダイズしない（図５）。

ＰＣＨにより生成した１２００ｂｐの断片をＩｍｐ　［１１Ｐ＝放射性の燐］で （ＲａｎｄｏＩＩＰｒｉｅｄ　ＤＮＡ　Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ　Ｋｉｔ、Ｂｏｅｈ ｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、インディアナＩ こよ　って）標識し、約２５０，０００プレートのｃＤＮＡライブラリーをスク リーニングするためのプローブとして用いる。陽性クローンの挿入物をＥｃｏＲ Ｉによる制限分析により分析し、最長の挿入物ＳＰＳ＃３及びＳＰＳ＃１８を有 するクローンを更に徹底的な分析のために選択する（図６）。５ＰＳ３の５゛末 端の工エエｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩ４００ｂｐ断片を単離し、次いで、ランダム標 識（Ｒａｎｄｏｍ　Ｐｒｉｍｅｄ　ＤＮＡ　ＬａｂｅｌｌＬｎｇ　Ｋｉｔ　）に より３２ｐで標識し、そしてライブラリーな再スクリーニングするためのプロー ブとして用いる。ＳＰＳ＃３よりも一贋上流まで達する新しいクローン、ＳＰＳ ＃６１が単離される（区６）。

ＳＰＳ＃３又はＳＰＳ＃６１よりも一層先の５゛領域を含むｃＤＮＡを単離する ために、新たなｃＤＮＡライブラリーを（ＰｒａｍｅｇａによるＳｙｓｔｅｍｅ 　ｄｅ　５ｙｎｔｈｅｓｅ　Ｒｉｂ。

Ｃ１ｏｎｅＴｉｌ　ｃＤＮＡ、Ｍａｃｌｉｓｏｎ、ウイスゴンンンに従って）　 Ｍ−１１／ＩＬＶ逆転写酵素をＡＭＶ逆転写酵素の代りに用いて調製する。しか しながら、オリゴ（ｄＴ）をイニシエーターとして用いる代わりに、ＳＰＳ＃６ １クローンの５°領域力）ら合成される合成イニシエータ−２３Ｂを用いる。こ れは、ＳＰＳ＃６１の５“領域の上流領域のみを含むｃＤＮＡの獲得を生じる。

ライブラリーを”Ｐで標識したＳＰＳ＃６１のＥｃｏＲＩ断片をプローブとして 用５）てスクリーニングし、１６のプレートがハイブリダイゼーションで陽性で ある。最長挿入物ＳＰＳ＃７７及びＳＰＳ＃９０を宵するクローンを更に徹底的 な分析のために選択する。ＳＰＳ＃７７及びＳＰＳ＃９０のＤＮＡ配列の研究は 、ＳＰＳ＃６１との（１００ｂｐより大きいサイズの）重複領域が同一であり、 両方とも５“領域の上流へ伸びていることを示す（図６）。

一本川ｃＤＮＡ（逆転写酵素のために必要な２本鎖イニシェーションをなし遂げ るためのオリゴ（ｄＴ）を用いてのｍＲＮＡ上での逆転写酵素反応によって得ら れる）をマトリックスとして、そしてＳＰＳ＃９０及びＳＰＳ＃３配列から選択 したイニシエーターを用いて行なわれるＰＣＲは、ＳＰＳ＃９０及びＳＰＳ＃３ が同じｍＲＮＡの転写に由来することを確実にする。このＰＣＲ反応から生じる 断片は７５０ｂｐの長さであり、ＤＮＡ配列の研究から予想されるサイズと矛盾 しない。この７５０ｂｐの断片を、影入上工／止エニｄＩＩＩ断片の形態におけ るブルースクリプト（Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ）に由来するベクター中でサブクロ ーン化する。その結果のサブクローンの４つを部分的に配列決定したが、得られ た配列は前に決定したＤＮＡの配列と同一である。

Ｄ）ＳＰＳをコードする配列のアセンブリー＃９０．＃６１及び＃３の２本鎖を Ｓａｎｇｅｒ等の方法（肱昌（１９７７）　７４．５４６３−５４６７　）によ って配列決定する。ペプチド配列の知識によって決定したＳＰＳのり一ディング フェーズは、第１のメチオニンコドンが１１２ｂｐ及び２５０ｂｐの位置にある ことを示す（図７）。

１１２ｂｐ位のコドンは真核生物の翻訳開始のためのコンセンサス配列（Ｋｏｚ ａｋ、　Ｃｅ１ｌ　（１９８６）　４４：　２８３−２９２）に対応し、ＴＡＧ 終止コドン（５８ｂｐ）の５４ｂｐＴ流に位置する。翻訳終止はＳＰＳ＃３クロ ーンにて、１６０３ｂｐの位置に見出される。しかしながら、ｃＤＮＡライブラ リーの初期スクリーニング（実施例２参照）中に得られる他のｃＤＮＡ　（ＳＰ Ｓ＃１８と呼ぶ）は１６０３位に終止コドンを有しない。この事実のため、ＳＰ Ｓ＃１８の１６０３ｂｐ領域を、完全な長さの最終的構築を達成するために用い る（下記を参照）ａＳＰＳをコードする完全な配列は、５２９ｂｐのＳＰＳ　＃ 　９０　Ｂ　ａ　ｍ　ＨＩ　／　Ｈ±ｎｄＩＩＩ断片、７０５ｂｐ＃３土工エｄ 工ＩＩ／旦旦ユＲ１断片を結合することによって調製することが出来る。

５ＰＳ３０ｋＤ−及び５ＰＳ９０ｋＤ−から得られる５つのペプチド配列（段階 Ａ参照）は、ｃＤＮＡのオープンリーディングフェーズの研究から推定された蛋 白質配列中に見出される（図７）。

１五丘ユニ特異的抗血清によるＳＰＳポリペプチドの検出 前述の方法により得られる精製蛋白質標品の試料をＳＤＳアクリルアミド中での 電気泳動にかける。アクリルアミドゲルの蛋白質を固定し、染色により観る。９ ０ｋＤ及び３０ｋＤのポリペプチドに相当するバンドを切り出し、グループにま とめ、そしてウサギに注射する。ウェスタン分析（０ｂｅｒｆｅｌｄｅｒ、　Ｆ ｏｃｕｓ　（１９８９）旦二二二１−５に記載）は、５ＰＳ３０ペプチドを注射 されたウサギの血清から単離した抗体がＳＤＳアクリルアミドゲル中で５ＰＳ３ ０及び５ＰＳ１２０ペプチドに相当するバンドを認識することを示す。５ＰＳ３ ０ペプチドを注射されたウサギの血清から単離した抗体がＳＤＳアクリルアミド ゲル中で５ＰＳ３０及び５ＰＳ１２０ペプチドに相当するバンドを認識する（図 ８）。

トウモロコシ　におしるＳＰＳの　“ ３０日齢のトウモロコシ植物から、午前１１に採取した葉から全蛋白質を抽出し 、それらをＳＤＳ緩衝液中で沸点まで加熱する。蛋白質抽出物を、２つの段階に おいて、ＳＤＳアクリルアミドゲル上に沈殿させる。１つのゲルはクーマシーブ ルーで染色するが、他方は、抗５ＰＳ３０及び抗５ＰＳ９０抗血清の混合物をプ ローブとして用いてウェスタン分析にかける（図９）。クーマシーブルーで染色 されたゲル上に現れた最も密なバンドは、光合成に関与する酵素であるホスホエ ノールピルビン酸カルボキシラーゼ（ＰＥＰＣＡＳＥ　）として同定される。ウ ェスタンプロットはＳＰＳの存在を示す、ｓｐｓ蛋白質の出現プロフィルはＰＥ Ｐカルボキシラーゼ蛋白質の出現プロフィルと非常に類似している（根に存在せ ず、茎に最も近い葉切片に存在せず、非常に若い葉にも存在しない）。このプロ フィルは、光合成に関係する蛋白質の発現に相当し、ＳＰＳについての予想され る図式表示である。

１呈上ユニ発現ベクターの構築 書　のｓｐｓの　み　システムの ＳＰＳ＃９０クローン（図６）を、１エエｄＩＩＩで消化し、ＳＰＳ＃６１の７ ０５ｂｐの止エエｄｌｌＩ断片に結合してＳＰＳコード部分の５′末端領域を含 むプラスミツドを造る。その結果のプラスミツドをＢａｍＨＩで消化し、土±ｎ 　ｄ、　ｒ　Ｉ　Ｉで部分消化して、ＳＰＳの５°末端領域を含むｌ工皿ＨＩ／ Ｈ土工ｄＩＩＩの１３４０ｂｐ断片を生じる。ｓｐｓのコード領域の３”末端領 域を、（終止コドンを除去するために）ＳＰＳ＃３クローンの６８６ｂｐの比土 工ｄＩＩＩ断片（１３４０−２０３６位）　’ｔ　Ｓ　Ｐ　Ｓ　＃　１８　（Ｉ Ｉ）　６４６　ｂ　ｐＯ）　Ｈｉ　ｎ　ｄ　ＩＩＩ断片で置換することによって 得る。次いで、すべての３°末端領域を１旦ｏＲＩ消化及び部分的焦土ｎｄＩＩ ＨＩ！！化によって回収し、１１７２ｂｐの１土ユｄＩＩＩ　／　Ｅ　ｃ　ｏ　 ＲＩ断片を生成する。この３°末端領域を有するＨｉｎｄｌ　Ｉ　Ｉ／ＥｃｏＲ ｒ断片を、ＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩにより消化したｐＵＣに由来するベクター中 に５゛末端領域を有するＢ　ａ　ｍ　ＨＩ　／　Ｅ旦ｏＲＩ断片に結合してＳＰ Ｓのコード領域のすべてを何するもの（３４０６ｂｐ）を造る。

タバコのりブロース−１５−ニリン　カルボキシラーゼのハ千サブユニットプロ モーターカセットの」ニーＬ１ ＳＰＳのコード領域は、タバコの小型サブユニット（ＳＳＵ）プロモーターカセ ットにおけるＢ　ａ　ｍ　ＨＩ　／　Ｅ旦ＲＩ断片（１０６〜３５０６ｂｐ）の 形態において便利な方法でクローン化することが出来る。

例えば、ＳＰＳの発現のためのＳＳＵプロモーターカセットを下記のようにして 謂製することが出来る。ＳＳＵプロモーター領域は、ム互エフ１８／ＳａユＩ断 片の形態のｐＣＧＮ６２７　（後述）に由来し、ム且エフ１８／　Ｓ　ａ　Ｉ　 Ｉにより消化されたプラスミツドｐＣＧＮ　１４３１に結合され（後述）、制限 部位を有するＤＮＡ断片により分離されたＳＳＵプロモーター及び３′末端（ｔ ｍ１３’）領域を含むカセットを生成する。

ＳＳＵ／１ｍ１３°プロモーターカセット中でのＳＰＳコードＤＮＡ断片の結合 の後、Ｓ　Ｓ　Ｕ　／　Ｓ　Ｐ　Ｓ　／　ｔ　ｍ１３“領域をバイナリ−ベクタ ーに結合して、アグロバクテリウムツメファシェンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉ ｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ　）によるトランスホーメーシ３ンによって植物 のゲノムにインチグレートすることが出来る。［”３］ＧＮ６２７ リブロースー１．５−二リン酸カルボキシラーゼの小型サブユニットのプロモー ター領域を含むＴＳＳＵ３−８　（０’Ｎｅａ１等、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ ｓ　Ｒｅｓ　（１９８７）　１５；　１１６６１−８６７７）の３．４ｋｂＥｃ ｏＲＩ断片をＭ　１３　ｍ　ｐ　１８（Ｙａｎｉ３Ｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ等、Ｇｅ ｎｅ　（１９８５）　５３：　１０３−１１９　）　のＥｃｏＲｒ部位にクロー ン化してＭ１３　８Ｂクローンを作成する。このＭ１３　８Ｂフアージの１本！ ３１　Ｄ　Ｎ　Ａをマトリックスとして用いてオリゴヌクレオチド“プローブ１ ”　（その構造は、０°ＮｅａＬの論文（０°Ｎｅａ１等、囲ｅｉｃ　Ａｃ１ｄ ｓ　Ｒｅｓ　（１９８７）　１５；　８６６１−８６７７）において、ＤＮＡポ リメラーゼ■のＫｌｅｎｏｗ断片を用いることにより定められる）のイニシェー ションを延期させる。このポリメラーゼを用いる反応の生成物をヤエナリ（ｍｕ ｎｇ　ｂｅａｎ　）ヌクレアーゼ（Ｍｕｎｇ　Ｂｅａｎ　Ｎｕｃｌｅａｓｅ）で 処理し、次いで、ＨｉｎｄｌＩＩで消化してＳＳＵプロモーター領域を含む１４ ５０ｂｐ断片を作成する。この断片を、ＨｉｎｄＩ　Ｉ　Ｉ−３ｍａＩで消化し たＬ旦立土８　（Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ等、Ｇｅｎｅ　（１９８５）　 ５３：　１０３−１１９　）中でクローン化してｐＣＧＮ６２５を作成する。

ｐＣＧＮ６２５を制限酵素止土工ｄＩｒＩで消化し、末端領域をＤＮＡポリメラ ーゼエのＫｌｅｎｏｖ断片で満たし、こうして得られたプラスミツドを制限酵素 ＥｃｏＲＩで再び消化する。ＳＳＵプロモーター領域を含む満たされたＥ　ｃ　 ｏ　ＲＩ　／　Ｈ上ｎｄＩＩＩ断片をＳ　ｍ　ａ　Ｉ　／　Ｅ　ｃｏＲＩにより 消化されたプラスミツドｐｕｃ　１８に結合してｐＣＧＮ６２７を作成する。

ｐｃＧＮ１４３１は、内部に複数のクローニング部位を有する二重のプロモータ ーＣＡＭＶ３５Ｓ及びｔｍ１３°領域を含む。このプロモーター／ターミネータ −カセットは、アンピシリン耐性遺伝子の代わりにクロラムフェニコール耐性遺 伝子を含むｐＵＣから得られるベクター中に含まれる。このカセットは、使い易 いように、複数の制限部位に隣接している。

Ａ）　ＣＧＮ９８６の ｐＣＧＮ９８６は、複数の制限部位を有するカリフラワーモザイクウィルス（Ｃ ａＭＶ３５）の３５Ｓプロモーター及びＴ−ＤＮＡのｔｍ　ｌ−３”領域を含む 。プラスミツドｐＣＧＮ９８６は、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター及び異なる３° 領域（Ｃａ　Ｍ　Ｖ領域のＶＩ３°末端領域）を含む他のカセットｐｃＧＮ２０ ６から得られる。

ＣａＭＶ３５Ｓのプロモーターを瓦上ユニ断片（７１４４−７７３４ｂ　ｐ）　 （Ｇａｒｄｎｅｒ等、Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　（１９８１）　ｐ： 　２８７１−２８８８）の形態で、Ｍ　１３　ｍ　ｐ　７　（Ｍｅｓｓｉｎｇ等 、Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、（１９８１）　’４：　３０９−３２１） の１土ＩＣＩＩ部位にクローン化してＣ６１４を造る。Ｃ６１４の制限酵素Ｅｃ ｏＲＩによる消化は、ｐｃＧＮ１４７を生成するための、ｐ　Ｕ　Ｃ８（Ｖｉｅ ｉｒａとＭｅｓｓｉｎｇ、　Ｇｅｎｅ　（１９８２）　１９：　２５９−２６８ ）の制限部位にクローン化された３５Ｓプロモーターを含むＥｃｏＲＩ断片を生 成する。

プロそ一ター領域、選択を可能にする標識（２つのＡＴＧを有するカナマイシン ）、及び３°領域を含むｐｃＧＮ１４８ａをプラスミツドｐＣＧＮ５２８のｕＪ ＬユＩ■での消化及びｐ　ＣＧ　Ｎ　１４．７のプロモーター断片、囚」。

ｍ　ＨＩ　−１エユエエの挿入によって調製する。この断片を、１工ユＩＩ部位 がｐＣＧＮ５２８のカナマイシン遺伝子に近いことに注意して、ｐＣＧＮ５２８ のＬＬＬ１１部位にクローン化する。

このｐＣＧＮ５２８の構築のために利用するシャトルベクターは下記のようにし て達成される：　ｐＣＧＮ５３５を、Ｔｎ５（カナマイシン耐性遺伝子を有する ）（Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ等、Ｍｏ１．　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ、　ｆ１９７９） 　１７７：　６５　）を含むプラスミツドの１土工ｄＩＩＩ−Ｂ互ｍＨＩでの消 化及びｐＡＣＹＣ１８４テトラサイクリン耐性遺伝子（Ｃｈａｎｇ　と　Ｃｏｈ ｅｎ、Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　（１９７８）　ｌユ４：　１１４１−１１５ ６）の±１ｎｄＩ　Ｔ　Ｉ−ＢａｍＨＩ部位にカナマイシン耐性遺伝子を含む土 土工ｄＩ　Ｉ　Ｉ−ＢａｍＨＩ断片の挿入により得る。ｐｃＧＮ５２６を、１二 ａｒ部位のレベルにてＸｈｏＩアダプターで改変されたｐＴｉＡ６（Ｔｈｏｍａ ｓｈｏｗ等、江見（１９８０）　１９＋　７２９−７３９　）のＢａｍＨ１１９ 断片のｐＣＧＮ５２５のＢ　ａｍＨｒ部位への挿入によって得る。ｐＣＧＮ５２ ８を、小さいＸｈｏ断片を除去し、続いて新たに結合することにより得る。

プラスミツドｐＣＧＮ　１４９　ａを、ｐｃＧＮ１４８ａることにより得る。ｐ ＭＢＫ、ａｎＸＸＩは、Ｘｈｏ　Ｉ制限部位を有しないが、アグロバクテリウム における有効な選択を可能にするＴｎ９０３のカナマイシン耐性遺伝子を含むｐ ｕｃ４にプラスミツド（ＶｉｅｉｒａとＭｅｓｓｉｎｇ。

ｐｃＧＮ１４９ａを土工ｎｄ工ＩＩ及びＢ　ａｍＨＩで消化し、焦土ｎｄＩＩＩ 及びｌ１皿ＨＩで消化したｐｕＣ８（ＶｉｅｉｒａとＭｅｓｓｉｎｇ、前出）と 結合してｐｃＧＮ１６９を作成する。これはＴｎ９０３のカナマイシン標識を除 去する。ｐＣＧＮ５６５及びｐｃＧＮ１６９を共に旦１ｎｄｒＩＩ及びＰｓｔｌ で消化し、そして再結合してＣａ　Ｍ　Ｖ　３５　Ｓプロモーター及びカナマイ シン耐性遺伝子の５゛末端領域部分（ＰｓｔＩ部位まで）を含むプラスミツドｐ ＣＧＮ２０３を形成する（　Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ等、Ｍｏ１．、Ｇｅｎ、　Ｇｅ ｎｅｔ、（１９７９）　１７７＋　６５）　、　３’制御領域を、ｐ　ＣＧ　Ｎ 　２０４　（ｐＵ　Ｃ１８（Ｃａｒｄｎｅｔ等、Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ−シソ しく１９８１）旦：　２ｇ７ｌ−２８８８）中にクローン化されたＶ工３°末端 領域を含むＣａＭＶ　（４０８−６１，０５ｂｐ）の旦旦ユＲＩ断片）から、辻 エユｄＩＩＩ及び１且ユニで消化して結合することによってｐｃＧＮ２０３に付 加する。その結果生成したカセットｐｃＧＮ２０６は、ｐＣＧＮ９８６の構築の ための基礎プラスミツドであるｐＴ　ｉ　Ａ６Ｔ−ＤＮＡのｔｍ１３”配列を、 Ｔ−ＤＮＡ　（ＴｈｏＩＩｌａｓｈｏｗ等、Ｃｅ１ｌ　（１９８０）　１１７２ ９−７３９　）の１１工ＨＩ　１９断片から、影！皿ＨＩ一旦立ユＲＩ断片（下 記のＢａｒｋｅｒの番号付けによるヌクレオチド９０６２から１２８２３まで） 　（Ｂａｒｋｅｒ等、Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ、　Ｂｉｏｌ、（１９ｇ３）２：　３３ ５−３５０　）の形態で、サブクローンかする。この配列をｐＡＣＹＣ１８４複 製オリジン（旦旦ユＲＩ−ムタマイシン耐性マーカー（Ｂ　ａｍＨＩ−Ｈ上ｎｄ ＩＩ断片）　（Ｄ、　Ｆｉｇｕｒｓｋｉ　）と結合してｐＣＧＮ４１７を作成す る。

ｐ、ｃＧＮ４１７（影立二ＨＩ　１９断片のヌクレオチド１１２０７）の単一の Ｓｍａ１部位をアダプターを用いて５ａｃＩ部位に移し、ＢａｍＨＩ−鉦匹工断 片をｐＣＧＮ５６５中にサブクローン化してｐｃＧＮ９７１を与える。ｐｃＧＮ ９７１のＢ　ａｍＨｒ部位をアダプターを用いてＥｃｏＲ１部位に移してｐｃＧ Ｎ９７１Ｅを作成する。ｐｃＧＮ９７１ＥプラスミツドのＥｃｏＲＩ−ＳａｃＩ 断片（ｔｍ１３°制御領域を含む）を、Ｅｃ。

ＲＩ及び５ａｃＩによる消化の後、ｐ、ＣＧＮ２０６に結合してｐＣＧＮ９７５ を与える。Ｔｎ５カナマイシン耐性遺伝子の小部分をＣａＭＶ３５Ｓプロモータ ーの３゛末端領域から影！ユＩ及びｌエユＩＩでの消化、遊離末端形成及び５ａ ｌＩアダプターの付加により除去する。

最終的発現カセットｐＣＧＮ９８６は、２つのＳ　ａ　］、　Ｉ部位が後ろに続 ＜　Ｃａ　Ｍ　Ｖ　３５　Ｓプロモーター、Ｌ立！■、ＢａｍＨｒ、Ｓｍａｒ、 　瓦二工ｒ部位及びｔｍ１３°領域（Ｔ−ＤＮＡのヌクレオチド１１２０７−９ ０２３）を含む。

Ｂ）ｐｃＧＮ１６４の構築 ＣａＭＶ　（７１４４−７７３５ｂｐ）（Ｇａｒｄｎｅｒ等、Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ ｄｓ　Ｒｅｓ、　（１９８１）　９：　２８７１−２８８８　）の瓦上ｕＩ断片 を瓦工ｕｌでの消化及びＭ　１３　ｍ　ｐ　７　（ＶｉｅｉｒａとＭｅｓｓｉｎ ｇ、　Ｇｅｎｅ　（１９８２）　１９＋　２５９−２６８）の±上ｎｃＩＩ部位 におけるクローニングによって得て０６１４を造る。Ｃ６１４の制限酵素Ｅｃｏ ＲＩによる消化は３５Ｓプロモーターを含む１旦ｏＲＩ断片を生成する。このフ ラグメントをｐ　Ｕ　Ｃ８（ＶｉｅｉｒａとＭｅｓｓｉｎｇ、前出）のＥｃｏＲ ｒ部位にクローン化してｐＣＧＮ　１４６を生成する。プロモーター領域を僅か に減じるために、１工ユＩＩ部位（７６７０ｂｐ）をｌエユＩＩ及び旦−Ｃ１３ １で処理し、次いで、ＬＪＬｉＩＩアダプターをＢａユ３１で処理したＤＮＡに 取付けてｐｃＧＮ１４７を作成する。ｐＣＧＮ　１４７を旦旦ユＲＩ／几上土工 で消化し、その結果の３５８プロモーターを含む旦旦ｏＲＩ−土且上工断片を１ 至ｏＲＩ及びＳ　ｍ　ａ　Ｔ　（ＶｉｅｉｒａとＭｅｓｓｉｎｇ、前出）により 消化したＭ　１３　ｍ　ｐ　８ベクターにトランスファーしてｐＣＧＮ１６４を 造る。

Ｃ）　ＣＧＮ６３８の ＣａＭＶＩＯ（）のＬｘユＩＩでの消化は、ｐｕｃ　１９　（Ｎｏｒｒａｎｄｅ ｒ等、Ｇｅｎｅ　（１９８３）　２６：　１ｏｔ−１０６）の１１３−７６７０ ｂｐ）を含むｌエユＩＩ断片を生成してｐＣＧＮ６３８を造る。

Ｄ）　ＣＧＮ２１１３の ｐＣＧＮ　ｌ　６４をＥｃｏＲＶ及びＢａｍＨＩで２肖化して、３５Ｓプロモ一 タ一部分（７３４０−７４３３）　を含む旦−ｃｏＲＶ−ＢａｍＨｒ断片を遊離 させる。ｐＣＧＮ６３８プラスミツドをｊ（ｉ工ｄＩＩ工及びｉ旦ｏＲＶで消化 して３５Ｓプロモーターの異なる部分（６４９３−７３４０ｂｐ）Ｈ土工ｄＩＩ Ｉ−乱立ｏＲＶ断片を遊ｎｄＩ　Ｉ　Ｉ−ＢａｍＨＩ断片を除去したｐＣＧＮ９ ８６中に結合する；この結合はｐＣＧＮ６３９を生成するが、それは、プラスミ ツドの骨格及びｐＣＧＮ９８６のｔｍｌ−３°領域並びｊ：ｐｃＧＮ１６４及び ｐＣＧＮ６３８の３５Ｓプロモーターの２つの断片を含む。ｐＣＧＮ６３８をＥ ｃｏＲＶ及びＤｄｅ　Ｉで消化して３５Ｓプロモ一ター断片（７０７０−７３４ ０ｂｐ）　を遊離さｆる。このフラグメントをＤＮＡポリメラーゼ■のＫｌｅｎ ｏｗ断片で処理して遊離末端領域を生成し、ｐＣＧＮ６３９のＥｃｏＲＶ部位に 結合して、その断片を適切な向きで有す６ｐＣＧＮ２１１３を生成す６．ｐＣＧ Ｎ２１１３プラスミツドを１９８９年３月２２日に、Ａ　Ｔ　ＣＣ（ＡｍｅｒＬ ｅａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌ七ｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）に、受入れ番号４ ．０５８７で寄託した。

Ｅ）　ＣＧＮ１７６１の ｐＣＧＮ２１１３をＥｃｏＲＩ制限酵素により消化し、そのプラスミツドをＸｂ ａＩ部位及びＢａｍＨＩ部位を含む合成用アダプター（このアダプターは各部位 の粘着性旦ｃｏＲＩ末端を含むが、隣接する塩基は、ｉ立ユＲＩ部位がこの部位 に再構築されないようにする）の存在下で結合してｐＣＧＮ２１１３Ｍを生成す る。９０６次いでＴ４ＤＮＡポリメラーゼで処理して遊離末端を造り、ＥｃｏＲ Ｉアダプターをそのプラスミツド中の遊離末端に結合する。トランスホーメーシ ョンの後、プロモーターと無傷のｔ　ｍ　１−３　’領域の間にＥｃｏＲｒ部位 を有するプラスミツドを有するクローンを選択し、ｐｃＧＮ１７６１と呼ぶ。

Ｆ）　ＣＧＮ１４３１の 完全なプロモーター／複数制限部位−ｔｍ１３°カセットを含むｐＣＧＮ２１１ ３の５−先１１−乱立旦ＲＩ断片を影見ユニ一旦立ユＲＩ消化によって回収し、 互−１」。

Ｉ−ＥｃｏＲＩで消化したプラスミツドｐＣＧＮ５６５にクローン化してｐＣＧ Ｎ２１２０を造る。ｐＣＧＮ５６５プラスミツドはクロラムフェニコール耐性遺 伝子（Ｋ、Ｂｕｃｋｌｅｙ、　Ｐｈ、Ｄ、Ｔｈｅｓｉｓ、　ＩＪｃ　Ｓａｎ　Ｄ ｉｅｇｏ　１９８５　）を有するｐＬＪｃ８−Ｃｍベクターに基づ（クローニン グベクターであるが、ｐ　Ｕ　Ｃ１８（Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ等、Ｇｅ ｎｅ　（１９８５）挫：　１０３−１１９　）の複数制限部位を含む、ｐＣＧＮ ２１２０をＰｓｔＩですっかり消化し、次いで、再び結合する。ｔｍ１３’領域 の８５８　ｂ　ｐ（９２０７−１００６５、Ｂａｒｋｅｒ等、１９８３年、全出 ）のＬ且ユＩ−ＰｓユＩ断片のみを除去したクローンをｐｃＧＮ１４３１と呼ぶ 。

図３　：　ＳＰＳ蛋白質から得られたペプチド配列。すべてえのペプチドはＮか らＣ末端へ向かう。

図４＝ペプチドと関係する、ＣＤ３及びＣＤ４ＰＣＲ反応に用いるオリゴヌクレ オチドの構造（逆方向の配列は肉太で与える）。矢印はオリゴヌクレオチドがポ リメラーゼによる触媒反応を開始する方向を示している。

図５Ａ：アガロースを用いるＣ　Ｄ’３及びＣＤ４ＰＣＲ反応の電気泳動。寸法 はｋｂで与えられる。

図５Ｂ　：　４に５オリゴヌクレオチドプローブを用いて読まれるＣＤ３及びＣ Ｄ４反応のサザーンプロットのオートラジオグラフを示す。

図６：ＳＰＳをコードするｃＤＮＡの制限地図。上部はＳＰＳをコードする全Ｄ ＮＡ断片の制限地図を表す。下部は組合せてこの制限地図を達成するために与え られた異なるクローンの構造を表す。翻訳開始及び翻訳終止コドンは示されてい る。

図７　：　ＳＰＳをコードするｃＤＮＡの配列、５ＰＳ９０．５ＰＳ６１及び５ ＰＳ３クローンの配列を図４に示した点で融合しである。３つのリーディングフ ェーズが翻訳された。ＳＰＳに対応するオーブンリーディングフェーズのみをヌ クレオチド配列の下に示しである。ｓｐｓ（図３のペプチド）の生成及び配列決 定の間に得られたすべてのペプチド配列をこの配列中に示しである。

図８：抗５ＰＳ９０及び抗５ＰＳ３０ウサギ血清のウェスタン技術による特性決 定、ｐＡＳ”＝非免疫血清（ウサギＳ　Ｐ　Ｓ　３０　）　；　Ａ　Ｓ　”＝免 疫化血清（ＳＰＳ３０）、ｐＡＳ＝非免疫血１７１１（ウサギ５ＰＳ９０）；Ａ Ｓ”　＝抗５ＰＳ９０免疫化血清。

分子量マーカーを左端に示す（Ｓ＝ＳＰＳ１２０ｋｄポリペプチド、Ｓ”　＝Ｓ ＰＳ９０ｋｄポリペプチド；Ｓ°。

＝ＳＰＳ３０ｋｄポリペプチド）。

図９Ａ：３０日齢のトウモロコシ植物から単離した全蛋白質のゲル（クーマシー ブルーで染色）。

Ｍ＝サイズマーカー、Ｒ＝根、１−８＝植物の基部から数えた葉の数。葉５は、 葉の先端（５ａ）から葉鞘側の端（５ｅ）まで５つの部分に切り分けた。ＰＥＰ ＝ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ。

図９８　：　３０日齢のトウモロコシ植物から単離された全蛋白質に対する抗５ ＰＳ３０及び抗５ＰＳ９０血清の混合物を用いるウェスタン分析の結果を示す。

ＳＰＳに対応するシグナルが１．２０−１．４０　ｋ　ｄのレベルに現れている 。

Ｍ　ＨＰＦ　ＥＦ　Ｄ　Ｍ Ｆ工ＧＵＲＥ　１ ＡＢ　Ｃ Ｆ工ＧＵＲＥ　２ ＳＰＳ　９０　ｋｄペプチド ＡＢ　ＴｈｒＴｒｐ工１ｅＬｙｓ Ｂｌｌ　ＳｅｒＭｅｔＰｒｏＰｒｏ工１ｅＴｒｐＡｌａＧｌｕＶａ１ＭａヒＡｒ ｇＳＰＳ　：ｌＯｋｄペプチド ４Ｋ　ＬｅｕＡｒｇＰｒｏＡｓｐＧ１ｎＡｓｐＴｙｒＬａｕＭｅｔＨｉｓ工１ｅ ｓｅｒＨｉｓＡｒｇ１２Ｎ　ＴｒｐＳｅｒＨｉｓＡｓｐＧｌｙＡｌａＡｒｇＦ工 ＧσＲＥ３ ＣＤ３　ＣＤ４　Ｍ　ＣＤ３ＣＤ４　）’１２Ｎ ＦＩＧＵＲＥ　７ ３３１３　ＡＴＧＴＧＡＡＴＴＴＧＡＴＧＣＴＴＣＴＴＴＴＡＣＡＴＴＴＴＧＴ Ｃ（Ｔ工丁工（Ｔ丁ＣＡＣＴＧＣＴ＾丁ＡＴＡＡＡＡ丁ＡＡfＴＴＧＴＧＡＡＣ ＡＧ　３３８１ ３３８２　ＴＡＣＣＧＣＧＧＧＴＧＴＧＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＴＧＣＡＧＴＧ ＡＣＡＡＡＴＡＡＡＡＣＡＧＧＡＣＡＣＴＧＣＴＡＡＣＴＡ嘯`ＣＴＧＧＴＧＡ ＡＴ　３４５０ ＦＩＧＵＲε７ ＴＳ　ＴＳ　ＴＳ　ＴＳ　ＴＳ ｌ　２　３４５６　７８９１０ ＣＡＢ　ｐＡＳ”　ＡＳ”　ｏＡｓ’　ＡＳ’ＦＩＧＵＲＥ　８ Ｍ　Ｒ１２３４５ａ５ｂ５ｃ５ｄ５ｅ６　７　８Ｆ工ＧｔｒＲＥ　９ 要　約　書 シュークロースリン酸シンテターゼ（ＳＰＳ）の活性を有し、特に、アミノ酸配 列が下記のようである少なくとも１つのペプチドを含む蛋白質： ＴｈｒＴｒｐｌｌｅＬｙｓ ＴｙｒＶａｌＶａｌＧ１ｕＬｅｕＡｌａＡｒｇＳｅｒＭｅｔＰｒｏＰ’ｒｏｌｌ ｅＴｒｐＡ１ａＧ１ｕＶａ１ＭｅｔＡｒｇＬｅｕＡｒｇＰｒｏＡｓｐＧ１ｎＡｓ ｐＴｙｒＬｅｕＭｅｔＨｉｓＩｌｅＳｅｒＨｉｓＡ（ｇＴｒｐＳｅｒＨｉｓＡｓ ｐＧｌｙＡｌａＡｒｇ　。

これらを調製する方法、 それらから得られる細胞系統、 前記の蛋白質に特異的なモノクローナル抗体、前記の蛋白質のｃＤＮＡ、 前記のｃＤＮＡの、植物中での前記の蛋白質の発現と制御を改変するための利用 、 前記のｃＤＮＡを含む発現ベクター及び前記の発現ベクターによって得られる植 物及び種子を記載する。

国際調査報告 １、ｍｌｌ＋１゜、、「＾−に＋ｌｉ。１゜ＰＣＴ／ＦＲ９＋７０００５９３１ ｌｌｌｕう、４．。＋１１Ａ、。１．。１．。＋喝　ＰＣＴ／ＦＲ９１１００５ ９３

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）サッカロースリン酸シンテターゼ（ＳＰＳ）の活性を有する蛋白質。 ２）請求項１において定めた蛋白質としてのサッカロースリン酸シンテターゼ。 ３）請求項２において定めた蛋白質としての植物サッカロースリン酸シンテター ゼ。 ４）トウモロコシサッカロースリン酸シンテターゼ。 ５）単量体、２量体又は４量体の形態で存在し、それらの誘導体がアミノ酸配列 が下記のようである少なくとも１つのペプチドを有する１１０〜１３０ｋＤのオ ーダーの分子量の前記の請求項の何れか１つに記載の蛋白質：【配列があります 】 ６）図７に記載のアミノ酸配列を有する、請求項５に記載の蛋白質。 ７）遺伝子工学技術により改変され、ＳＰＳの活性を与える、請求項１〜６に記 載の蛋白質の誘導体。 ８）請求項１〜７の何れかに記載の蛋白質の製造方法であって、下記により特徴 付けられる製造方法：ａ）低温にて関係する植物の部分から、破砕、遠心分離及 び濾過によって抽出物を作成し、 ｂ）得られた抽出物を、適当な溶媒中での沈殿、得られた沈殿物の緩衝溶液中で の遠心分離及び可溶化によりＳＰＳ蛋白質を豊富にさせ、 ｃ）こうして得られた活性な蛋白質をクロマトグラフィーによって精製し、且つ 所望であれば、ｄ）上記のａ）、ｂ）及びｃ）段落にて得られた標品の１つから 得られる抗原溶液からモノクローナルなハイブリドーマ及び抗体を製造し、 ｅ）そのハイブリドーマをスクリーニングし、ＳＰＳに特異的なモノクローナル 抗体を選択し、ｆ）得られたＳＰＳを、こうして製造した抗体を用いて精製する 。 ９）請求項８に記載のトウモロコシＳＰＳの製造方法であって、下記により特徴 付けられる製造方法：ａ）低温に保存したトウモロコシ植物の部分から、破砕、 遠心分離及び濾過によって抽出物を作成し、ｂ）得られた抽出物を、ポリエチレ ングリコール中での沈殿、得られた沈殿物の緩衝溶液中での遠心分離及び可溶化 により蛋白質を豊富にさせ、 ｃ）こうして得られたＳＰＳ蛋白質を低圧アニオン交換クロマトグラフィーによ り、次いでヘパリンセファロース上でのクロマトグラフィーにより、次いで高圧 アニオン交換クロマトグラフィーにより精製し、ｄ）活性画分を２つの高圧クロ マトグラフィーカラムを通すことにより精製し、且つ所望であれば、ｅ）製法ａ ）、ｂ）、ｃ）から得られた抗原溶液からモノクローナルなハイブリドーマ及び 抗体を製造し、ｆ）そのハイブリドーマをスクリーニングし、ＳＰＳに特異的な 抗体を選択し、 ｇ）前に得られたＳＰＳを、こうして製造した抗体を用いて精製する。 １０）請求項８又は９に記載の方法によって得られたハイブリドーマの細胞系統 。 １１）下記のように呼ばれる、請求項１０に記載のハイブリドーマの細胞系統： ＳＰＡ２−２−３ＳＰＢ３−２−１９ ＳＰＡ２−２−２２ＳＰＢ５−２−１０ＳＰＡ２−２−２５ＳＰＢ５−４−２ ＳＰＢ１３−１−７ ＳＰＢ１３−２−２ １２）請求項１〜７の何れか１つによって定められた蛋白質に特異的なモノクロ ーナル抗体。 １３）トウモロコシＳＰＳに特異的な、請求項１２に記載の抗体。 １４）請求項１〜７の何れか１つに記載の蛋白質の製造方法であって、前記の蛋 白質を含む標品を前記の蛋白質に特異的な請求項１２又は１３に記載のモノクロ ーナル抗体を含むクロマトグラフィーカラムを通し、こうして、所望の蛋白質を 得ることにより特徴付けられる前記の蛋白質の製造方法。 １５）請求項１〜７の蛋白質をコードしているｃＤＮＡ。 １６）トウモロコシＳＰＳをコードしている、請求項１５に記載のｃＤＮＡ。 １７）図７に記載のヌクレオチド配列を有する、請求項１６に記載のｃＤＮＡ。 １８）前に定めた蛋白質のコード部分及びこの蛋白質の植物中での発現及び制御 に必要な配列を含むゲノムＤＮＡ。 １９）請求項１６及び１７で定めたｃＤＮＡを含む発現ベクターを用いて植物の 細胞をトランスホームすることにより特徴付けられる植物におけるＳＰＳの発現 率を改変する方法。 ２０）植物細胞においてＳＰＳの発現及び好ましくは超発現を指示することの出 来るプロモーター及びＳＰＳをコードする遺伝子の発現のための転写制御信号を 含む３′領域の制御下においてＳＰＳ蛋白質の発現を可能にするベクター。 ２１）改変された炭素分配の図式を有する、請求項１９の方法によって得られる 植物。 ２２）請求項２１に記載の植物の種子。