JPH05500357A - イオンチャンネル調節剤としてのポリアミンの使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 イオンチャンネル調節剤としてのポリアミンの使用本出頴は、（ａ）１９８８年 ２月１０日出原の米国特許出原第１５４．８４５号（現在放棄されている）の一 部継続出願である１９８８年７月１４日出原の米国特許出願第２１９，１０５号 （現在許可されている）、（ｂ）１９８９年２月１０日出願のＰＣＴ出願ＰＣＴ ／ＵＳ８９１００５５８　（ＷＯ８９１０７６０８として公開）（現在、１９８ ９年１０月１０日出願の米国特許出願第４３５，４８８号）及び（ｃ）１９８９ 年７月３日出原の米国特許出願第３７５，７７６号の一部継続出顆である。

米国政府は国立神経連絡不全脳溢血研究所からの第ＮＳ−１３７４２号及び国立 保健研究所、米国公共サービス、国立眼科研究所からＮＩＨＥＹ−０８００２に よって本発明において権利を有する。

の 本発明は、概して細胞膜におけるイオン伝導調節剤としてのポリアミン化合物の 使用に関する。更に詳細には１本発明のある特徴は、神経細胞膜におけるカルシ ウム（並びに他のカチオン性）チャンネルのブロック、調節あるいは活性化及び かようなチャンネルが存在するいかなる細胞膜においても特定タイプのカルシウ ムチャンネルのブロック、調節あるいは活性化における一定のポリアミンの使用 に関する。

の 細胞膜の厚みを通しての電界における増加変化に応答して、チャンネル蛋白質（ 「電圧過敏」あるいは「電圧依存」カルシウムチャンネルと呼ばれるものを含む ）は細胞膜を通しての帯電粒子の受動輸送を媒介する（及び相当部分にわたり調 節する）。

本議論においては、単離されたチャンネルは単独の蛋白質でなければならないと 信じられているけれども、チャンネルが必然的に単独の蛋白質から成らなければ ならないことを含意せずにｒチャンネル」及びｒチャンネル蛋白質」の語を互換 的に用いる。

はとんどのチャンネル蛋白質は、他のイオン種の輸送よりも実質的に高い特異性 で、一つのイオン種の輸送を媒介する。特異であるイオンの名を採って、種々の チャンネルを名付けることが一般的であり、故にナトリウムチャンネル、カリウ ムチャンネル及びカルシウムチャンネル等がある。

次に、一つのカチオンの輸送に特異なイオンチャンネルは、電気的及び／又は化 学的（薬理学的）刺激に応答して相互に作用し合う方法に基づいて、更に種々の サブカテゴリーあるいはチャンネルタイプに分類することができる。特に、ニュ ーロンを含む多くの異なる細胞タイプが確認されているカルシウムチャンネルは 、形態、性質及び／又は機能において、相違点（並びに類似点）を有することが 明らかである。これらの相違点のいくつかは、かようなチャンネルが現存する細 胞の形態及び機能に帰因する０例えば、神経カルシウムチャンネルはすべての３ 局面において断熱複雑である。ミラー、アール、ジｘ　＋、（Ｍｉｌｌｅｒ、Ｒ ，Ｊ、、）参照。他の相違点は細胞タイプに直接的に関与していない、事実、カ ルシウムチャンネルの異なるタイプが同じ細胞においても通常に存在する０例え ば、神経細胞は４つの活動的にカルシウム伝導性の性質が異なるタイプを示す、 故に、神経カルシウムチャンネルの４ｒタイプ」がある（しかしながら、神経カ ルシウムチャンネルの各タイプの性質のいくつかは、他の組織におけるカルシウ ムチャンネルにより分担されることは明らかである。）。

歴史的に、神経カルシウム伝導性は、高スレッシュホールド（閾値）カルシウム 伝導性（ＨＴＣＣ）及び低スレジシュホールド（閾値）カルシウム伝導性（ＬＴ ＣＣ＞を活性化させる推進力に基づいて、最初２つのカテゴリーに分割された。

中枢神経においては、ＨＴＣＣは樹状突起においてより顕著であり、ＬＴＣＣは 体幹すなわち細胞体においてより顕著である。後に、神経カルシウムチャンネル は３つのカテゴリー、すなわちＬＴＣＣの原因と信じられているＴ−チャンネル 、ＨＴＣＣに対して不完全な符合性を示すＮ−チャンネル、及び中枢神経におい ては通常現れないが、伝導性質がＨＴＣＣに対する符合性を示すＬ−チャンネル に分類された。

これらの３つのカテゴリーは、更に薬理学的性質によって識別することができる 。Ｌ−チャンネルは、ジヒドロピリジン感受性、すなわち、ニフェジピン、ニド レンジベン等のジヒドロピリジンによって有効にブロックされるのに対して、Ｔ −チャンネル及びＮ−チャンネルはジヒドロピリジン耐性である。大部分におい て、Ｔ−チャンネルはカドミウムイオンによる妨害を阻止する。さらに重要なこ とには、Ｔ−チャンネルは１０−’Ｍ以下の濃度のアルコール（特にオクタツー ル）により特異的にブロックされる。最終的には、Ｎ−及びＬ−チャンネルのい ずれもが、Ｔ−チャンネルが耐性的である海洋性巻貝コーヌスゲオグラフイ表丞 のベノム（毒液）より単離された毒素、オメガ−コノトキシンによりブロックさ れるといわれている。ミラー、アール、ジエー、　（Ｍｘｌｌｓｒ。

Ｒ，Ｊ、）、サイエンス（Ｓｃｉａｎｃａ）、１９８７．２３５：　４６−５２ ゜しかしながら、プルキンエ細胞におけるＨＴＣＣ（ＨＴＣＣのカルシウム依存 安定電位成分及び樹状スパイク成分）の原因であるカルシウムチャンネルは一５ ０ｍＶで活性化され、かつ、ジヒドロビリジン不感性であり、オメガ−コノトキ シン耐性でもあるにれらのチャンネルは、ジョウゴグモのベノムより単離された 低分子量ブロック剤により特異的にブロックされる。ライナスら（Ｌｌｉｎａｓ 　ｅｔ　ａｌ、）　、　Ｐ　ＮＡ　Ｓ、１９８９．８６：　１６８９−１６９３ （特異性は、このブロック剤は、カリウムチャンネルの伝導性がカルシウムによ り調節された点を除いては、Ｔ−チャンネル、ナトリウムチャンネル、ジヒドロ ピリジン感性チャンネル、コノトキシン感性チャンネルあるいはカリウムチャン ネルに起因するいかなる伝導性をもブロックしないという事実により確認された 。）、さらに、前記ジヒドロピリジン−及びコノトキシン−耐性カルシウムチャ ンネルは、下位オリーブ状視床神経には存在しないことが明らかである。これら のカルシウムチャンネルは、最初にプルキンエ細胞において記述されたので、Ｐ −チャンネルと呼ばれている。ライナス、アール、アール、ら（Ｌｌｉｎａｓ、 　Ｒ，Ｒ，ａｔ　ａｌ、）、　Ａｎｎ、　Ｎ。

ｈ紅１Ｌ録ｉ、、　１９８９，４遼：’１０３−１１１．　Ｐ−タイプチャンネ ルがイカ大型シナプス及びイカ視葉にも存在することも示されている。

ナトリウム及びカリウムチャンネルも種々のタイプがある。ヒル、ビー（Ｈｉｌ ｌｅ、　Ｂ、）を概観されたい［［興奮性膜のイオンチャンネルＪ　５ｉｎａｕ ｅｒ　Ａｓ５ｏｃ、　Ｉｎｃ、、Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄｗ　Ｍａｓｓ、１９８４ ］　。

ナトリウムチャンネルの２つの主タイプが中枢神経等の電気的興奮性細胞におい て発見される。いわゆる敏速ナトリウム伝導性の原因であるチャンネルの１タイ プは、バッファーフィッシュ（脹れる魚）から単離された毒であるテトロドトキ シン（ＴＴＸ）により特異的にブロックされる。緩慢なナトリウム電流の原因で あるナトリウムチャンネルの第２のタイプは、リドカイン等の局部麻酔剤により ブロックされる。明らかに異なるナトリウムチャンネルは、上皮等の非電気的興 奮性組織に位置し、かつ、ＴＴＸ又は局部麻酔剤によってはブロックされないが 、アミロライド利尿剤によってはブロックされる。

対比において、多くのタイプのカリウムチャンネルが存在すると考えられる。カ リウムチャンネルの２．３のタイプは神経に特異的に位置する一方で、多くは全 身いたる所に散在する。公知のに＋チャンネルのブロッカ−、テトラエチルアン モニウム（ＴＦＡ）、アミノピリジン及びキニーネは、いかなる特定のカリウム チャンネルに対しても特異性をほとんど示さない。

高親和性及び特異性でカルシウムチャンネルをブロックする薬剤並びにカルシウ ムチャンネルを活性化する薬剤は電気生理学的研究において試薬として有用であ る。かような薬剤の入手は、カルシウムチャンネル性質及び機能を理解するため に基本的なことである。かような薬剤は、プロトタイプドラッグ設計及びドラッ グスクリーニングにおいて特に有用である。

例えば、Ｐ−チャンネルに特異的なブロック剤は、Ｐ−チャンネルカルシウム伝 導性からの干渉なしに、他のチャンネル（種々のインビトロ又はインビボ実験に おいてＰ−チャンネルと共存する）の伝導性の研究を可能にする。加えて、かよ うなブロック剤は、例えば、細胞膜を通してのカルシウム輸送を調節することが できるプロトタイプドラッグとして役立つことができる０次に、かようなドラッ グは、虚血又は他の無酸素性脳障害による。あるいはエージング等のカルシウム 輸送の調節を分裂させる他のファクターによる細胞死防止に潜在的な適用性を有 する。かようなドラッグは、てんかん、記憶及び学習疾患の治療において潜在的 な適用性をも有する。

従来のカルシウム−チャンネルブロック剤は、一つ以上の以下の理由により、こ の必要性に十分ではない。

（ａ）　のカルシウムチャンネル　の 特にＰ−チャンネルは、天然毒、オメガコノトキシン、デヒドロピリジン及びそ の誘導体、及びアルコールに対し抵抗性である。

（ｂ）豊五作夏欠乏 あるチャンネルをブロックする物質を開発する際、特異性は第一に重要な事項で ある。

（ｃ）　コス　での ジョウゴグモベノムから誘導されたＰ−チャンネルブロック剤の化学構造、並び にその活性誘導体及び類似物、並びに便利に低コストで合成できた他の特異的な Ｐ−チャンネルブロック剤を、識別することが望ましい。

（ｄ）ブローク　の　の 特異的Ｐ−チャンネルブロック剤の入手は、ブロック活性部位の識別、及び反対 の性質、開放カルシウムチャンネルを有する改良された代替物又は同等の化合物 の設計を可能にする。

カルシウム−チャンネル活性化剤（即ち、これらのチャンネルを通じてカルシウ ム流入を増加する薬剤）は、カルシウム−チャンネルブロック剤よりも更に一層 欠乏している。公知のＬ−チャンネル特異的活性体は、商品名ペイ−Ｋ　８６４ ４　（Ｂａｙ−に８６４４）で一般に入手可能である。しかしながら、Ｎ−１Ｔ −１又はＰ−チャンネルの活性体は従来技術にはなかった。故に、特異的、高効 能及び／又は安価で入手可能なカルシウムチャンネル活性体が、カルシウムブロ ック剤よりも更に一層緊急に必要である。

特異的カルシウムチャンネル活性体は有用な試験試薬として役立つことができ、 ブロック剤と異なり活性体は例えば、細胞内に流入す−るカルシウムを許すＰ− チャンネル容量の限度等の異なるチャンネル性質のテストに用いられる。活性体 は、シナプス伝達解除及び、例えば推進力、すなわちシナプス前部の内部カルシ ウム電流を増幅することにより、より密接に他の伝達性の側面の研究にも用いる ことができる。

本発明のＣａチャンネル活性体は、鎮痙性（例えば、抗てんがん性）、不安緩解 性、精神安定化性、抗アルツハイマー症性及び／又は記憶増進性を示すプロトタ イプドラッグとして潜在的な使用をも有する。さらに一般的な活性体は、病理学 すなわちＣ＋＋流入を許す細胞（特に神経）の不十分な能力に起因する行動変化 ににおけるプロトタイプドラッグとして潜在的に有用である。

類似物は、ナトリウム又はカリウムチャンネル等の他のイオン性チャンネルのイ オン輸送性質を変化させる物質の存在を必要とする。かような物質は下記の治療 上の使用にも見出させる。

Ｎａ＋チャンネルの機能の変化は、筋肉痙拳、斜傾、振せん。

学習疾患、及びアルツハイマー症治療のため、治療上有用でもある。ナトリウム チャンネルを緩やかにブロックするポリアミンは、局部麻酔剤として追加の有用 性を有する。上皮のＮａチャンネルにおいて作用する薬剤は、嚢包性繊維症及び 喘息治療において。

かつ抗高血圧症剤として、有用な補助剤である。

Ｋ＋チャンネルの活性を調節する薬剤は、無酸素性及び虚血性疾患、及び高血圧 症の有害な効果に対する保護剤として有用であり、マラリャ及び鎌状細胞疾患に おける損傷に対し赤血球細胞を守るために作用する。

個々に用いられたカルシウム活性体及びカルシウムブロック剤（並びに他のタイ プのカルシウム調節剤）は、細胞死がどのように生じるかについて情報を与える ことが予想される０例えば、細胞内カルシウムの放出の初期及び速度において、 カルシウム輸送のための細胞膜の増長された能力が影響するかどうか、更に重要 なことには、この遅れて現れる細胞死の発現を逆転できるかどうかの情報を引き だすことにより、細胞外媒体におけるカルシウム活性体の存在の影響を観察され るジトリルカルシウム「流れ」の初期及び進行の割合において測定することがで きる。

チデッケル、イー、ダブり二一ら（Ｃｈｉｄｅｅｋｌ、Ｅ、１．、）　ｒＢｒ、 Ｊ。

Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、　１９８６．８９：　２７−３３Ｊは、「ポリアミン」へ の瞬間的な暴露は、細胞外でのカリウムイオンのその後の暴露に応じて、モルモ ット気道平滑筋（気管筋）の弛緩を引き起こすことを報告する。これは、ポリア ミン（又はニフェヂピン、バラパミル、ジルチアゼム又はカルシウムイオン欠乏 溶液等の他のカルシウム−イオン侵入ブロック剤）の不存在下において現れる本 筋肉の正常な収縮性応答に反する。著者らは、とりわけスペルミジンはＣａ”拮 抗機能を有すること及びスペルミジン及び特定の他のポリアミンは公知の上述し たＣａ”＋侵入ブロック剤と「おそらく」同様なカルシウムチャンネルブロック 活性を有することを仮説として取り上げた。

膜Ｃａ”＋異常流出及び細胞Ｃａ”＋取扱に関する他のポリアミンの作用が以下 の他の文献から引用されているけれども、スペルミジンは、この論文において記 述された実験において試された唯一のポリアミンであった。：プトレッシンは、 細胞外Ｃａ”＋流入及び同時に起こるミトコンドリアからのＣａ”＋放出の増加 のいずれにも起因する心臓及び腎臓スライスにおけるシトツルＣａ”＋濃度にお いての増加を引き起こすといわれている。；スペルミンは、細胞外Ｃａ”＋濃度 の増加により妨げることができるよりも、子宮筋の任意の収縮を抑制するといわ れている。

スペルミン及びスペルミジンは、腸、子宮、気道及び脈管構造の平滑筋において 弛緩性作用を有するといわれている。

著者らは、気管筋に（又は言及された他の組織において）存在するといわれてい るカルシウムチャンネルのタイプに言及していない。気管筋に関する限りでは、 ジヒドロピリジン感応性はＬ−タイプチャンネルが影響を与えるかもしれないこ とを示す、言及された他の組織に関する限りでは、カルシウムチャンネルが含ま れること（多くの他のファクター又は工程が、シトソールにおけるカルシウム濃 度に影響することができる）は、この論文において何ら主張されていない、事実 、この論文において報告された結果のいくつかは、カルシウムチャンネルの妨害 と相反し、カリウムチャンネル上の作用を含み、又は直接的に平滑筋（パバベリ ン様作用）に作用するかもしれない多くの他のファクター故に（この論文の開示 に基づいて）カルシウムチャンネルの活性化に帰することかできない。

ヒルッシュ、ニス、アール、ら（Ｈｉｒｓｈ、　Ｓ、Ｒ，）ｒＰｓ　ｃｈａ　ｈ ａｒｍａｃｏｌｏ　−１９８７，８３：　１０１−１０４Ｊは、腹腔内に５〜４ ｏ醜ｇ／ｋｇの投与量でラットに投与された２種のポリアミン、スペルミン及び スペルミジンが、無意識によじ登ること及び車回転疾走行動の投与量依存抑制を 引き起こしたことを報告し、著者らは仮説的に、これらの辺縁系ドーパミン機能 のポリアミンによる調節に帰因するとした。

大脳内に注入された（線条において）これらの化合物は、非対称行動を誘発しな かった。一方、これらの化合物は、行動過多（倒産核内に注入した際に）に拮抗 し、該行動過多はドーパミン受容体妨害物ではなく、ドーパミン機能の調節と一 致すると考えられた。イオン性（又は特にカルシウム）伝導性における何らの効 果も開示され又は示唆されていない。

バラーデ、ビー、　（Ｐａｌａｄｅ、　Ｐ、）　ｒＪ、Ｂｉｏｌ、ｃｈｅｍ、　 １９８７．２６２：６１４９−６１５４Ｊは２種々の開放−誘導物質（カフェイ ン及びチモールを含む）の添加で通常観察されたＣ　ａ　１　＋　（筋小胞体の 単離された副分画内に前負荷された）の放出は、ルテニウムレッド、特定の有機 ポリアミン（スペルミン、スペルミジン及びトリエチレンテトラミン）、特定の 抗生物質（ネオマイシン、カナマイシン、トブラマイシン、ゲンタマイシン、ス テルブトマイシン及びクリンダマイシン）及び特定のポリペプチド（ポリリジン 、ポリアルギニン、いくつかのヒストン及びプロタミン）によりブロックされた ことを報告する。著者らは、これらの薬剤はただ一つの特徴：数種のアミノ基の 存在を共通に有することを観察した。カルシウムポンプ機能に影響するポリアミ ンの無能性に基づいて、著者らはルテニウムレッド、スペルミン、ネオマイシン 及びポリリジン（全く異なった構造を有する）の作用は、Ｃａ”＋ポンプの影響 のためではなく、筋小胞体カルシウムチャンネルの妨害のためと結論を下した。

これらの薬剤の多くは、カルシウム放出を（概略）ナノモル濃度にてブロックす ることが明らかとなった。著者らはまた、抗生物質はモル濃度基準において更に 効能があることが明らかとなったという事実に基づいて、カルシウム放出抑制効 能は、化合物中に存在するアミン基の数と関係があることが明らかとなったと述 べた。該論文は、これらの薬剤が活性的である小濃度が［小胞体カルシウムチャ ンネルのプローブとして可能性のある有用性を示唆する」と述べているけれども 、これらの薬剤の小胞体（ＳＲ）カルシウムチャンネル（他のＳＲ輸送成分及び ／又は受容体に比較して）に対する特異性において何ら結論を開示していない、 しかしながら、著者らはルテニウムレッドもスペルミンも特異的なものではない ことを認める。更に、カルシウム放出の妨害のみをこの論文において報告した実 験では測定したので、カルシウムチャンネルの関連を積極的に確立しなかった。

報告された結果は、大伝導性（おそらく他の公知のカルシウムチャンネルよりも 規模が大きいオーダーで）を有する小胞体におけるＣａ−チャンネルに制限され 、著者らにより述べられたところでは、小胞体におけるＣａ”＋チャンネルの１ タイプに更に制限されるかもしれない、著者らはこれらの化合物は、三リン酸イ ノシトールに感知しないＳＲチャンネルにおいて活性的であることが明らかとな ったことを明白に述べる。

論文のシリーズで、メルチオレ、シー、ら（Ｍｅｌｃｈｉｏｒｒｅ、Ｃ，、）は 、式 ここで、Ａｒは芳香族基、Ｒ，Ｒ’は水素又はメチル、ｍ、ｎは５〜１４の範囲 で組み合わせられる種々の整数である。の特定のポリメチレンテトラミンがモル モット心房及び回腸においてＭ−２ムス力リン受容体ブロック活性を有すること を報告する。これらの化合物の数種は１回腸受容体よりも相当に高い親和性にて 、心房のムスカリン受容体を選択的にブロックするといわれており、故に２つの 受容体間を識別するのに多分役立つことができる。カルシウムチャンネルについ ては、何等開示されていないけれども、開示されたポリアミンの非アロマティッ ク（芳香族）部位の一般的な合成の概要が提供さ゛れた：　「ム五引ム旦１１ヨ ー１９８９，３２：　７９−８４　；ムＪ見ち旦回見、１９８５．川：　１６４ ３−１１５４７　；及び５１工Ｔ、Ｐ）墜飢がよ、１９８０゜鋒：　１４７７− １４８３４ 灸−一度且首 本発明は以下の目的を有する： イオン性チャンネル（カルシウム、ナトリウム及びカリウムチャンネルを含む） 、特にカルシウムチャンネル及び更に特にＰ−タイプカルシウムチャンネルを調 節（例えば、ブロック、調節又は活性化）するための新規な薬剤及び方法を発明 すること。

伝達開放又はシナプス伝達を調節するための新規な薬剤及び方法を発明すること 。

上述された公知のブロック剤に関連する欠点の１つ以上を克服する１つ以上の前 記のチャンネルをブロックするための追加の薬剤及び方法を発明すること。

カルシウム、ナトリウム及び／又はカリウムチャンネルをブロック、調節又は活 性化するプロトタイプドラッグ（特に中枢神経のチャンネルをブロック又は活性 化するドラッグに重点をおいて）を設計するためにかような調節剤及び方法を使 用すること、及びイオン性チャンネル構造、性質及び機能の理解を増すこと。

かような薬剤及び／又はドラッグのための更に活性的、低コスト化及び／又は他 の改良された代替物を設計すること。

活性又は妨害とは違った機能を調節するカルシウム、ナトリウム及び／又はカリ ウムチャンネルを有する薬剤を設計すること。

例えば、細胞膜においてＧ−プロティンに作用する薬剤は、イオン性チャンネル の活性を間接的に変更する。

本発明の他の目的は、本明細書、特許請求の範囲及び図面を参照すれば当業者に とって明らかとされるであろう。

ｎ督塁朋− 図ＩＡは、全てのブロック剤の不存在下にて直流スクエア電流パルス（０，３ｎ Ａ、６２ｍ５ｅｃ）の適用で、ラットのブルキシエ細胞において観察された自発 的な刺激活性のトレースである（対照）。

図ＩＢは、スペルミジン添加後、０．４５ｎＡ直流スクエア電流パルスでのプル キシエ細胞の応答のトレースである：カルシウム伝導性はブロックされる。

図ＩＣ上方トレースは、（ｉ）Ｐ−チャンネルがスペルミジンでブロックされた （１１）カリウム伝導性がＴＥＡでブロックされた（ｉｉｉ）ナトリウム伝導性 がＴＴＸでブロックされた後、０゜４５ｎＡ直流スクエア電流パルスでのブルキ シエ細胞の応答のトレースである。残存スパイクは、ジヒドロピリジン感応性タ イプのカルシウムチャンネルのためである。Ｌ−チャンネルもまたジヒドロピリ ジンによりブロックされる図ＩＣ下方トレースにおいて、又はＬ−チャンネルが ストレプトマイシンによりブロックされる図ＬＤ（下方トレース）において、こ れは実証される（ＩＤの上方トレースはＩＣと同じタイプである。）。

図２は、この効果の投与量依存性を示す電圧−クランプ実験において種々の量の ニー、アベルタ（Ａ、ａｐｅｒｔａ）ベノム添加後観察されたイカシナプスにお けるシナプス前部カルシウム電流のグラフである。

図３は、種々の量の部分的に精製したイカシナプスでのニー。

アペルタ（Ａ、ａｐｅｒｔａ）ベノムからのＰ−チャンネルブロックファクター の添加後残存する（１として得た対照にて）興奮性シナプス後部ポテンシャル（ ＥＰＳＰ）の分画を示すグラフである。結果は、ＥＰＳＰのファクターによる効 果の投与量依存性を示す。

図４は、シナプス前部末端の直接刺激によるイカシナプスシナプス後部作用ポテ ンシャルを示す、トレースＡは、浴内の化合物Ｅの添加（実施例２の調製物の０ ．１５ｍ１）に先だち記録された。

トレースＢは、化合物Ｅの添加４分後に記録され、トレースＣは、化合物Ｅの添 加６分後に記録された。

図５上方トレースは、浴内（既にＴＴＸ及び３−アミノピリジンを含んでいる） でのスペルミジンの適用（Ａ）前及び（Ｂ）後の電圧クランプ実験でのイカシナ プスにおけるシナプス後部ポテンシャル（Ｅ　Ｐ　Ｓ　Ｐ）応答である。中間の トレースは、浴内でのスペルミジンの適用（Ａ）前及び（Ｂ）後のシナプス前部 カルシウム電流である。下方のトレースは、適用された電圧ステップ（２８ｍＶ 、５．５ｍ５ｅｃ）である。

図６は、ＴＴＸ及び３−アミノピリジンの存在下での電圧クランプ実験にて、３ ８　、２ｍＶ／　１０＋ｍ５ｅｃ電圧ステツプの適用後の更にイカシナプスにお けるシナプス後部ポテンシャルのトレースである。

図７Ａ及びＢは、カルシウムブロック剤の不存在下（上方トレース）又は存在下 （下方トレース）にてのイカシナプスでのシナプス前部及びシナプス後部ポテン シャルのトレースである。

図８は、３５　ｍＶ／　１　ｉ＋ｓｅｃ電圧が適用された（トレースＶ）シナプ ス前部細胞の内部カルシウムチャンネル（トレースＩ−１からｌ−４）及びＴＴ Ｘ及びＴＥＡ、及びリジンエチルエステルとスペルミジンとの反応により製造さ れた化合物であるカルシウムチャンネル活性剤の存在下における対応するＥＰＳ Ｐ　（）−レースＰ−１からＰ−４）のトレースの重ね合わせである。

丑」し乞！１〜 本発明の１つの特徴は、特定タイプのイオンチャンネルを所有する細胞膜を該チ ャンネルに特異的に影響する非アロマティックポリアミン化合物に暴露すること を含むカチオンチャンネルを所有する細胞膜を横切るのカチオン輸送調節方法に 対する。前記非アロマティックポリアミン化合物は、下記式を有する。

Ｒ−（ＣＨ，）ｘ−ＮＨ−（ＣＨ，）、−ＮＨ。

ここで、ｙは１〜１５の整数、ＸはＯ〜１５の整数、Ｒはアミノ、イミノ、アミ ド、イミド及び／又は−ＣＸ、−０−ＮＨ−（ここでＸはＨ又はＸの１つがＮＨ ，でもよい）を介して上記式の残余に追加されてもよいものの少なくとも１つを 含む有機非アロマティック基、ただし該ポリアミンの分子についてメチレン基又 は窒素原子の少なくとも１つの配位が非対称であり、かつ該化合物が少なくとも ３つの窒素原子を含む：該ポリアミンはこのチャンネルに起因する伝導性のブロ ック、活性化又は他の調節をするものに効果的な量で存在する。。

加えて、本発明は前記式の化合物に向けられる。

本発明の他の特徴は、カルシウムチャンネルをブロックする（又は場合によって は活性化してもよい）方法及び上述された化合物の１つ以上及び／又はジョウゴ グモゲノムから単離されたポリアミンＰ−チャンネルブロック剤を用いて、シナ プス伝達開放をブロックする（又は高める）方法に向けられる。

本発明の他の特徴は、イオン性チャンネル、電圧又はグルタミン活性化チャンネ ル等のりガントゲート（配位子ゲート）のいずれかを、本発明に従って化合物、 該化合物は特定のカルシウム−。

ナトリウム−又はカリウムブロック剤、活性化剤又は関節剤である、を選択する ことにより、及びこの化合物の存在下にて細胞を暴露し、所望の特異的調節結果 をターゲットチャンネル上にもたらすことにより調節するための方法を含む。

葺Ｊしい　の　な 論文及び特許出頭書類を含むいかなる及び全ての引例書類の記載は、引用により 完全に組み込まれている。

本明細書「イオン性チャンネル調節剤」が、直接的に又は関節的にチャンネルに 作用することにより（例えば、イオン性チャンネルの機能に順次影響する他の物 質又は細胞構造に作用することにより）、カチオン流れを調節する化合物及び組 成物を意味するものであることが理解される。

共に係属中で共に譲渡された１９８８年７月１４日出願の米国特許出頴第２１９ ，１０５号は、セファデックスＧ−１５（Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−１５）　（フ ァルマシア（Ｐｈａｒ＋＊ａｃｉａ））サイズ−エクスクル−ジョン　クロマト グラフィー上にて、２００−４００ダルトンの見かけの分子量を有するクロマト グラフィー技術によりジョウゴグモゲノムから単層された耐煮沸活性ファクター が、上述のＰ−タイプのカルシウムチャンネルを高特異性かつ高親和性にてブロ ックする性質を有することを開示する。これらのファクターは更に以下の性質に よって特徴付けられる。

（ａ）酸の存在下に不活性 （ｂ）ジチオスレイトール還元抵抗 （Ｃ）エーテル結合セファロース４Ｂ（ファルマシア、ビスカットウェイ、ニュ ーシャーシー州）　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｐｉｓｃａｔａｖａｙ、Ｎ、Ｊ、） との結合能 本発明による構造分析において、このカルシウムチャンネルブロック剤は、より 詳細には、蛋白除去（煮沸）、引き続いて遠心分離による沈殿物除去及び上澄液 を約０．８Ｍ　ＮａＣ１で溶出する活性画分（ベノム０．５鳳ｌから得られる） でカチオン−交換カラム、例えば、ファルマシア　エルケービー　バイオテクノ ロジー社（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　ＬＫＢ　ＢｉｏｔｓｃｈｎｏｌｏｇｙＪｎｃ、 、　Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、　Ｎ、Ｊ、）製Ｍｏｎｏ−８（５Ｘ５０ｔｗ）を用 いて、Ｏ〜Ｏ，ＬＭ　ＮａＣ１、ＰＨ７，５、流速１ｍｌ／ｗｉｎの条件下に０ 行なわれるＦＰＬＣ（高圧液体クロマトグラフィー−ファルマシア（Ｐｈａｒｍ ａｃｉａ）　）により紅吐扛租りモベノムから単離されたカルシウムチャンネル ブロック剤の調製は、以下の結果を与えた。

（ａ）ＵＶ分光測定法（ミルトン−ロイ　スペクトロニック（Ｎｉｌｔｏｎ−Ｒ ａｙ　５ｐｓｃｔｒｏｎｉｃ）、モデル１００１　（Ｍｏｄｅｌ　１００１）　 Ｕ　Ｖ分光測定器を用いる）において、精製された紅吐肛田ファクターは２６０ 〜２８０ｎｉｉで吸光を示さず、螢光を発しなかったことにより、アロマティッ ク環が存在しないことを示唆する。吸収波長は試料の酸性化より強くシフトした が、高いｐＨに対し比較的不感性のままだった。この挙動はアミン基の存在と一 致する。

（ｂ）ＦＴ−ＩＲ（フーリエ変換赤外分光）において、試料はヌジュールマル及 びＫＢｒペレットとして分析された。得られたスペクトルは、比較的シンプルで 、アミノ基並びにメチレン基の形跡を示した。

（ｃ）元素分析において、試料は約２９　：１４　：１４のＣ：Ｎ：Ｈの相対的 な割合を示した。

この実験から得られた結論は、紅吐肛垣Ｐ−チャンネルブロック剤（以後時々ｒ ＦＴＸ］として参照する）は非アロマティックポリアミン構造を含むということ である。

本発明によれば、直鎖又は分枝鎖非アロマティックポリアミンは、Ｐ−タイプカ ルシウムチャンネル（即ち、プルキシエ細胞において最初に識別されたＰ−チャ ンネルに関連した上述の１以上の特性を示すチャンネル）をブロックする又は高 める能力を有する。

ここで用いられたように、「ポリアミン」は少なくとも３つの−ＮＨ，及び／又 は−ＮＨ−基を有する化合物として参照される。

好ましくは、非対称メチレン及び／又は窒素原子配位を有する非アロマティック ポリアミン、より好ましくは、重炭素原子又は隣接炭素原子上に２つ又は複数の アミン基を支える部分を有する非アロマティックポリアミンである。非対称メチ レン及び／又は窒素原子配位は、化合物の２つの部分が同じではないことを意味 する１例えば、スペルミン（この発明の範囲内にはない）は、窒素原子が各サイ ドで４つのメチレン基により分離された対称的配位を有する。他方、下記化合物 Ｐは、左部位にＮ原子のより多い数（炭素原子数当り）がある非対称窒素原子配 位を有する。化合物Ｈは非対称メチレン基配位を有する。

イオン性チャンネル調節剤として有用なポリアミンの実例は以下の化合物である ： （弱いカリウムチャンネルブロック剤−Ｐ−チャンネルに活性無し）（Ｐ−チャ ンネルブロック剤、即ち、精製されたジゴウゴグモベノムファクターと同様なカ ルシウム−箇り （Ｐ−チャンネルにおいて不活性なカルシウム−チャンネルブロックａ（潜在的 なカリウムーチャンネ／Ｌａυ（Ｐ−チャンネルブロック剤 （潜在的なＣａ−チャンネルブロック剤、Ｐ−チャンネルにおいて不粕汁υ（Ｇ ）虱−■馬）、−Ｍ←（ＣＯＺ）−■。

（弱いＰ−チャンネルブロック剤 （Ｈ）虱−（偽）、−訃（へ）□−Ｍ←に几）、−虱（Ｐ−チャンネルにおいて 活性でない）（ト）４℃唸なＣａブロック寿Ｄ α宍℃吟なカルシウムブロックｍ （Ｋ）虱−（島）、−Ｍト（αい、−Ｎｌト（偽）、−１（潜在的なカルシウム ブロック船 （潜在的なＰ−チャンネルブロック剤 （潜在的なカリウム−活ｌ 曙４η勺なカリウム−活十り （潜在的なナトリウムブロック却 （潜在的なナトリムブロック斉Ｄ （Ｐ−チャンネルブロック剤、即ち、精製されたクモベノムファクターＦＴＸと 同様なカルシウム−活十〇 （Ｐ−チャンネルブロック剤、即ち、精製されたクモペノムファクターＦＴＸと 同様なカルシウム−活十〇 （Ｐ−チャンネルブロック剤、即ち、精製されたクモベノムファクターＦＴＸと 同様なカルシウム−活十υ （Ｐ−チャンネルブロック剤−ＦＴＸ（資）（Ｐ−チャンネルブロック剤−ＦＴ Ｘｔｌ（Ｐ−チャンネルブロック剤−ＦＴＸ様）（Ｐ−チャンネルブロック剤− ＦＴＸ様）イオン性チャンネルブロック及び／又は活性化活性を有する化合物の 例は、例えば、脱水酸又は脱カルボキシル化されたリジン部位を有する化合物Ａ −Ｗの誘導体又は類似物を含む、加えて、上記の化合物の多く及びその類似物は ナトリウム又はカリウムチャンネルに活性である。

かようなチャンネル調節剤として有用なポリアミンの実例は以下の化合物である ： （弱いカリウムチャンネルブロック却 （Ｐ−チャンネノ吋馴生イＵ叩 （Ｐ−チャンネルをブロックせず、潜在的なＰ−チャンネ）Ｌｍｌｌ’ｒＪｆ） （潜在的なカリウム話中υ （潜在的なカルシウム括十冒誹Ｄ （ＦＦ）　ＨｚＮ−（ＣＨｉ）ｃＯ←】、−Ｎ）１−（Ｑ（ｉ）ｉ−ＮＨ−（Ｃ Ｉ（ｚ）ａ−Ｎ＋←（＞１）３−Ｒ虱 （潜在的なカルシウム括刊撰」０ （潜在的なカルシウム活七（イ）」す （潜在的なカリウム話中〇 （潜在的なカリウム括士り （潜在的なカリウム話中υ （Ｐ−チャンネノ蹄對ぢ―Ｄ （Ｐ−チャンネノ吋斤姓イジ０ （Ｐ−チャンネノ圀欝餌Ｕ叩 （Ｐ−チャンネノオ畠館Ｕ０ （Ｐ−チャンネノｌ討餌Ｕ叩 （Ｐ−チャンネノ吋斤比什済０ （Ｐ−チャンネノオ計せ圃 一般に、本発明において有用なイオンチャンネルブロック、調節又は活性化ポリ アミンは、式 ％式％） に包含されるとみなしてもよい、ここで、ｙは１〜１５の整数、好ましくは１〜 ６；ｘは０〜１５の整数、好ましくは０〜６；及びＲは少なくとも１つのアミン （アミノ、イミノ、アミド又はイミド、アミノアルキル、アミドアルキル、イミ ドアルキル等を含むがこれに制限されない；Ｒは前記基の２以上を組み合わせて もよい）含む有機非アロマティック基又は−ＣＸ２−０−ＮＨ−基を介して式の 残余に追加されてもよい有機非アロマティック基であり、ここでＸは水素又はＸ の１つがＮＨ２である。ただし、（ｉ）本発明のポリアミン分子は、メチレン及 びＮ−含有基の配位において対称でない、及び（ｉｉ）少なくとも３つの窒素原 子を有する。

本発明のポリアミンは、好ましくは分子量８００未満を有し、更に好ましくは、 ２００〜４００の間である。

この条件で、以下の記述は当然いくつかの例外を有する通則を構成するものと理 解して、Ｘが０であり、Ｒがメチレン又はメチレン鎖（例えば、Ｒ自身は−Ｎ− Ｃ，，，−Ｎ−Ｃ−、、、Ｎ−配置形態を補助しない）を介して左のＮＨ基と結 合するものではない上記式の化合物は、好ましくはｙは６より大きく、更に好ま しくは同時にアルギニン（リジンに対立するものとして）部位であるＲを有する カリウムチャンネルブロック剤であろうということができる。故に、例えば、　 Ａ　ｒ　ｇ　ＮＨ−（ＣＨＩ）　ｇｏ−ＮＨｚがカリウムチャンネルブロック剤 であるのと同様に、Ａ　ｒ　ｇ＝ＮＨ−（ＣＨ□）ｚｚ　ＮＨｚもカリウムチャ ンネルブロック剤である。左にリジン部位を有する対応する化合物もまた活性は 少ないが同じカリウム−ブロック活性を示す。

Ｒがアルファーアミノメチレン基（−ＣＯ−１−０−又は−ＣＨ，−基が介在す る又は介在しない）を介してポリアミン鎖にリンク（結合）し、Ｘとｙの聞方が 上記定義の範囲内の正の整数である前記化合物はカルシウムチャンネル活性を有 する。Ｐ−チャンネルにおいて、もし左手側の部位がアルギニン系であるならば 、この活性はブロック活性であり、もし左手側の部位がリジン系であるならば、 カルシウム活性化活性であろう０例えば、化合物Ｂはカルシウム（Ｐ−チャンネ ル）ブロック剤である。：一方、化合物ＢＢはカルシウム（Ｐ−チャンネル）活 性化剤である。

アルファーアミノエチレン基を有せず、かつ、Ｘ及びｙの両方が０より大きい− ＮＨ−（ＣＨ，）ｘ−ＮＨ−（ＣＨ，）　ｙ−ＮＨ。

配置で直鎖ポリアミン部を有する化合物は、Ｒ部位においてメチレン基の数に「 逆比例」して現出するナトリウムチャンネルに特異的なナトリウムブロック活性 を有するであろう、故に、Ｘ−ｙが例えば、３．４；３．３；４．３；又は４， ４であるＨ、　Ｎ−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ−（ＣＨ，）、−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ，） ｘ−Ｎ）Ｉ−（ＣＨａ　）ｙ−Ｎ）Ｉ、は、Ｐ−チャンネルにおいてカルシウム をブロックしない代わりに弱いナトリウムチャンネルブロック剤である。メチレ ン直鎖の数が４から３に減少するにつれ、２つ又は少数のメチレンのみがある場 合には特異性が減少し、最終的にナトリウム及びカルシウムの両方が同時にブロ ックされるまで、ナトリウムブロック活性は増加する。

本発明に用いられるポリアミン化合物は、公知の及び市販の出発材料及び公知技 術の合成機構を用いて合成することができる。

なお、本発明の範囲内のポリアミン化合物は市販源より得てもよ＆’ｍ 例えば、脱カルボキシル化アルギニン（アグマタイン）又はアルギニンエチルエ ステル、脱カルボキシル化リジン又はリジンメチル又はエチルエステルをミズー リ州セントルイスのシグマケミカル社（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、 、　Ｓｔ、Ｌｏｕｉｓ、　ＭＯ）から購入することができる。スペルミン、スペ ルミジン、１，６ジアミノヘキサン、プトレッシン、カダベリン等の他の公知の ポリアミンもまたシグマ又は他の市販源から得ることができる。自身は活性では ない（例えば、スペルミン）ものを以下のように活性化合物合成に用いることが できる。

原案では、水溶液中にてアミノエステルを用い、ジアミン又は他のポリアミンを 水溶液中（又は液体形態）適当な（通常等モルの）量で塩基性条件下にて反応さ せることを含む。

マーチ、ジｘ　−（Ｍａｒｃｈ、Ｊ、、）ｒＡｄｖａｎｃｅｄ　Ｏｒｇａｎｉｃ 　ＣｈｅｍｉｓｔｒｙＪ、３ｄ、Ｅｄ、、１９８５．　Ｖｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎ 、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、概要参照。

本発明の範囲内の化合物の他の合成概要は、エルデフラウイ、ニー、チー、ら（ Ｅｌｄｅｆｒａｗｉ、Ａ、Ｔ、）、　ｒＰＮＡＳＪ　−１９８８，８５：４９１ ０−４９１３；、ハシモト、ワイら（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ、Ｙ、、）、ｒ　Ｔａ ｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔｅｒｓＪ　、　１９８７．２８：３５１１−３５１ ４；及びヤマモト、エイチら（Ｙａｍａｍｏｔｏ、Ｈ，、）、　ｒＪ、Ａｍ、ｃ ｈｓｍ、ｓｏｃ、　Ｊ　、１９８１．１０３：６１３３−６１３５に開示され、 これらの全ては、仮りにあったとしても、当業者にとって容易に明らかとなるよ うに、単なる修正で用いることができる。追加の合成概要は、１９８９年８月１ ０日公開された国際出願ＷＯ３９１０７０９８に基づき考えられるであろう。

本化合物に適用できる別の有用な合成概要は、メルチオーレら（Ｍｅｌｃｈｉｏ ｒｒｅ、）、１９８９、同上において開示され、これによればポリアミンの長さ の増加するようジカルボン酸の使用する（ＨＣＩ及びエタノールの添加とＣＨ， Ｃ：Ｈ，０ＣＯＣＩ、トリエチルアミン及びジオキサン存在下にて、引次いでホ ウ化水素、硫化ジメチル及びジグリン存在下に還元）。

本発明の範囲内の脱カルボキシル化アルギニン部位（例えば、Ｈ，Ｎ−（ＣＨ， ）、−ＣＨ（ＮＨ，）−ＣＨ，−ＮＨ−（ｃＨｚ）３−ＮＨ−（ＣＨ，）、−Ｎ Ｈ，又はＨ，Ｎ−（ＣＨ，）。

−ＣＨ（ＮＨ，）−ＣＨ，−ＮＨ−（ＣＨ，）、−ＮＨ−（ＣＨ，）□−ＮＨ， ）を含む化合物の１つの好ましい合成概要は、適当に保護されたアミンエステル 、例えば、ＴＨＦ　（−７８℃）の存在下におけるＺ−ＮＨ−（ＣＨ，）、−Ｃ Ｈ（ＮＨ−Ｚ）−Ｇ。

−０Ｅｔ　（＝＝でＺはＰｈ−ＣＨ，−０−Ｃｏ−等の適当な保護基であり、こ こでｐｈはフェニルである）及びジ−イソブチルアルミニウムハイドライドを対 応するアルデヒドへ還元し、ナトリウムシアノボロヒドライドの存在下にてこの 生成物をアミノ化することを含み、所望のポリアミンを製造する１次いで、該ポ リアミンは、公知の方法により、保護解除され、精製することができる。

なお、保護されたアミノ酸（例えば、上記参照されたエチルエステルに対応する 遊離酸）は、例えば＋　Ｅ　ｔ　−０−Ｇｏ−Ｃ１（エトキシカルボニルクロラ イド）及びＴＥＡ　（トリエチルアミン）及びＴＨＦ　（テトラヒドロフラン） とを−２０℃にて反応させることにより、対応する混合無水物に最初に転換する ことができる。次いで、前記無水物は、ナトリウムボロノ１イドライドの存在下 にて、アルコール、例えば、メタノールと一１０℃にて反応し、アルコールに対 応する混合無水物に転換することができる。

次いで、前記アルコールは、公知のハロゲン化技術によって対応　。

するハライドに転換できる。前記ハライドは、適当なアミンで濃縮しくＫ、Ｃｏ 、又はジメチルフォルムアミド等の酸スカベンチャー存在下にて）、ターゲット 保護化合物を得ることができる。該ターゲット保護化合物は、例えば、ハイドロ ジエノリシス（Ｈｘパラジウム／カーボン　］、００％により、すなわち、保護 基力ｔＢＯＣである部位にて、真のターゲット化合物を得るためにトリフルオロ 酢酸で保護解除されることができる。

Ｒが−Ｎ−Ｃ＋、、Ｎ鎖のＮＨ基と−〇−結合を介して結合している発明の化合 物は、公知の技術により合成できる。例えば。

適当なアミノ酸（例えば、アルギニン）は好ましくは、還流で適当な直鎖ポリア ミン、例えば、スペルミン又はＨ，Ｎ−（ＣＨ，）、−ＮＨ−（ＣＨ，）、−Ｎ Ｈ２又はＨ，Ｎ−（ＣＨ，）、−ＮＨ−（ＣＨ，）、−ＮＨ，と、酸（例えば、 酢酸）及びペルオキシド（過酸化水素等）の存在下にて反応させ、発明に従って 所望の化合物を得ることができる（実施例において、この化合物は、式 ％式％ ここで、Ｔ　−ＣＸ、　−０−はＸがＨである（又は２つのＸの１つがＮＨ，で ある）変性アルギニン部位である。により表わされる。

Ｒが一〇Ｈ基又はそれらの同位体に付加されたアルファアミノ基を有しない式１ の化合物（例えば、 ＮＨ＝Ｃ（ＮＨ，）−Ｎｌ（−（ｃＨｗ　）４−ＮＨ−（ＣＨ，）４−ＮＨ−（ ＣＨ，）３−ＮＨｌ　）は、適当なポリアミン（例えば、Ｈ□Ｎ−（ＣＨ，）、 −ＮＨ−（ＣＨ，）、−ＮＨ−（ＣＨ，）、　−ＮＨ，）から、エタノール還流 下で、硝酸３，５−ジメチル−１−グアニルピラゾール等のグアニル化剤を用い て合成できる。前記ターゲット化合物は硝酸塩として単離できる。

本発明の化合物を実験試薬として用いる際、ナノモルから特に上限なく広範囲に て使用することができる。各側において用いられるべき必要である量は、特定の 化α物の活性（化合物が有力なブロック剤、活性剤または調節剤のいずれでも） 、この化合物が活性（チャンネル性質はたやすく変性できても）である特定のチ ャンネルの感応性、特定の化合物（化合物が１つのタイプのチャンネルに排他的 に作用しても）の活性の特異性及び最適化を目的とすべき技術においてよく認知 されている他のファクターに依存することは評価されるだろう。

薬理学的に許容できる塩を含む本発明の化合物が医薬目的に用いられる際（例え ば、上記、背景項目にて参照した行動変化を引き起こすため、又は行動代替を処 理するため）、本化合物の１以上を含む経口、腸溶性の、局所用の、貯恵、又は 非経口投与形態にて、医薬品調製に慣習的に用いられているように、例えば、錠 剤、連続放出調合剤、ゼラチンカプセル、注射溶液、座薬又は薬物付与系等と結 合した１以上の薬理学的に許容される賦形剤、増量剤、塩、被覆剤、キャリアー 又は稀釈液と結合して医薬化合物に組み込まれてもよい、活性成分投与範囲は以 下の好ましい範囲を含むであろう：ネズミには特定の化合物１０〜１００■ｇ／ ｋｇ及びヒトには０．０５．５０ｍｇ／ｋｇ、もちろん、できるだけ副作用を避 けるために、所望の効果を果たす最小量を用いることは好ましいであろう、更に 、複数の投与形態が組合せにおける効果的な量をなすために投与されてもよいの で、各投与形態の単位容量は、それ自身効果的な量の活性成分を構成する必要が ない、加えて、用いられる量及び処置持続時間も適正化すべきであり、かつ処置 されるべき条件、年齢１体重及び患者の身体的条件の厳格性かつ応答性により異 なり、またしばしば投与経路によっても異なるであろう。

本発明は更に、本範囲に制限されずに描くことを意図する特定の実施例を参照し ながら以下に詳述する。

去１−例１：Ｐ−チＪＬンネルブジＬ先１１分丘Ａ、プルキンエ細胞系 成熟バートリーモルモット（Ｈａｒｔｌｅｙ　ｇｕｉｎｅａ　ｐｉｇｓ）　（４ ００〜６００ｇ、二二−ジジャージー州、ウニインのカムリサーチ研究所産（Ｃ ａｍｍ　Ｒｅａｓｅａｒｃｈ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ、　Ｗａｙｎｅ、Ｎｅｗ　Ｊ ｅｒｓｅｙ）　）をエーテル又はナトリウムベンドパルビタール（イリノイ州シ カゴのアボット７フルマシユチ力ル社（Ａｂｂｏｔｔ　Ｐｈａｒ＋＊ａｃｅｕｔ ｉｃａｌｓ、　Ｉｎｃ、、　Ｎ。

Ｃｈｉｃａｇｏ、ｌ１ｌ）、４０ｍｇ／ｋｇ　ｉ、ｐ、　（腹腔内））麻酔注下 にて、小動物ギロチンで首切りした。敏速な開頭が行なわれ、小脳核を含む総量 小脳塊を全翼スパチュラで迅速に引き剥がすべく、後頭骨のウロコ状部分を除去 した。次いで、前記組織をＮ　ａ　Ｃ１１２４ｍＭ、　ＫＣｌ５５ｍＭ、　ＫＨ ，ＰＯ４１，２＋ｍＭ、　Ｃａ　ＣＬ　２−４ｍＭ、Ｍｇ５０．１．３＋Ｍ、Ｎ 　ａ　ＨＣＯ、（２６ｍＭ）及びグルコース１０ｍＭを含む電気クレーブスリン ガー液にすばやく浸した。この溶液を６℃に冷蔵保持した。次いで、前記小脳塊 を矢状縫合的に処理し、約２１厚の単細胞スライスを主部から又は半球の１つか ら単離した。前記スライスをシアノアクリレートと共に、プレキシグラス力ッテ ングチャンバーの基部に貼付し、スライスの周囲に寒天ブロックを用いて側部サ ポートを準備した。一旦固定し、前記組織は６℃でクレーブスリンガ−溶液に浸 され、更にオックスフォードＧ５０１バイブラトーン（Ｏｘｆｏｒｄ　Ｇ５ＱＩ 　Ｖｉｂｒａｔｏｍｅ）　（テッドペラ社、タラツイン、カルフォルニア（Ｔａ ｄ　Ｐθｌｌａ、　Ｉｎｃ、。

Ｔｕｓｔｉｎ、　ＣＡ）で更に分画し、与えられたロスドロ尾部平面並びに中枢 白質及び小脳核細胞において全ての小脳回の条状縫合区画を含む約６つの２００ （又は３００）ミクロン厚の小脳スライスを得た。この過程に引き続き、前記ス ライスを酸素化した（９５％０２：５％ＣＯ）クレーブスリンガ−溶液中にて３ ７℃で約１時間培養した。

培養後、スライスをライナスら（Ｌｌｉｎａｓ、Ｒ，ｅｔ　ａｌ）、　ｒム薊■ 諌Ｌ−，３０５：　１７１１９８０４に記載されたような記録皿に移した。前記 小脳スライスをシリガードプレート（コーニング　グラス、コーニング、ニュー ヨーク（Ｃｏｒｎｉｎｇ　Ｇｌａｓｓ、Ｃｏｒｎｉｎｇ＋Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）） に記録チャンバー基部で配置し、前記白質上に軽く押し付けなから双極の刺激電 極で固定した。該実験は、周囲温度制御水浴により維持された３７℃のチャンバ ー温度で行なった。継続潅流のために用いた食塩水（リンガ−）も３７℃に保持 した。

研究下の伝導性をブロックするために又は特定の実験を妨げるイオン性伝導性を ブロックするために５種々のチャンネルブロック剤を用いた。：テトロドトキシ ン（ｒＴＴｘＪ　１０−＠Ｍをナトリウム伝導性をブロックするために用いた； トリエチルアミンモニウムクロライド（ｒＴＥＡＪ　、３０ｍＭ）をカリウム伝 導性をブロックするために用いた；ニトレンジピン（１０〜５〜１０””Ｍ）を Ｌ−チャンネルをブロックするために用いた。

Ｐ−チャンネルブロック活性を試験すべき種々の化合物の製剤を前記浴に導入し 、流れを種々の時間で止めた。これらの製剤を試験すべき各物質の特定のモル濃 度を含む溶液から２０〜４０マイクロリツトルの等分にて加えた。細胞外浴の容 積は４ｃｃであった。

プルキンエ細胞をホフマン七改良顕微鏡法（Ｈｏｆｆｍａｎｍｏｄｕｌａｔｉｏ ｎ　ｍ１ｃｒｏｓｃｏｐｙ）　（ホフマン、アール、　（Ｈｏｆｆ＋ｍａｎ、Ｒ ，、ｒ、Ｔ。

Ｍｉｃｒｏｓｃ、　１１０：２０５−２２２，１９７７）Ｊを用いて記録マイフ ロピペラトチ直視下に突き刺した。細胞内記録を３Ｍ酢酸カリウム又は１Ｍテト ラエチルアンモニウムクロライド（Ｔ　Ｆ　Ａ）で満たされ、平均６０〜８０メ ガオームの直流電流抵抗を有するマイクロピペットで得た。細胞のシナプス活性 化は、研究された前記小脳回基部の白質上に位置された双極の刺激電極で行った 。プルキンエ細胞の直接刺激は、高入力インピーダンス（１０１２オーム）ブリ ッジアンプで与えられた。

この実験のシリーズで、試験された種々の化合物濃度は以下に詳述するように用 いたニブロックを行う活性化合物が少量であれば小量であるほど、カルシウムチ ャンネルのための活性ポリアミンの親和性はそれだけ高くなる。以下に記載され た実験の典型的な結果を図１に示す。

ポリアミン又は他のチャンネルブロック剤化合物の浴内への導入の前に一外部（ 復極）電流パルスの注入で、Ｐ−チャンネルブロック剤（図ＩＡ）不存在下にお けるプルキンエ細胞の正常な電気応答に従って、神経はナトリウム依存及びカル シウム依存スパイクの両方を有する刺激に応答した。前記細胞応答も、記録チャ ンバー媒体内でポリアミン化合物の導入後数時間の間隔で測定された。Ｐ−チャ ンネルブロック剤の存在下では、典型的に小復極電流（約０．３又は０　、４５ 　ｎ　Ａ、　６２ｍ５ｅｃ）がポテンシャルスパイク及びプラトーポテンシャル のバーストを生じ、後者は非−不活性化（「不変の」）ナトリウム伝導性のため ；カルシラ１１スパイクを実質的に減少又は消失し、プラトーポテンシャルにカ ルシウム依存成分はない（図ＩＢ）。図ＩＢは最終濃度Ｑ、８ｍＭのスペルミジ ンの添加後に記録された。

図ＩＢにおけるナトリウム依存性の敏速なスパイク（これは第１番目のかような スパイクに引き続くと予測されたが）の明らかな欠乏は、細胞の抵抗の実質的な 増加のためである（ナトリウム依存性プラトーポテンシャルにより示された）、 カルシウムチャンネルの妨害は、細胞への侵入からカルシウムイオンを排除し、 故にカリウムイオンの細胞からの退去を活性化しない０図ＩＢでの結果は、ジョ ウゴグモベノム、例えば、米国特許願第２１９゜９０５号にて開示されるように ７から単離されたＰ−チャンネルブロック剤の添加に匹敵する。

図ＩＣ（上方トレース）では、前記浴（既にＴＴＸ及びスペルミジンを含んでい る）に添加されたＴＥＡでカリウム伝導性がブロックされた。残存しているカル シウムスパイクは、プルキンエ細胞におけるカルシウムチャンネルの別のタイプ の存在のためである（Ｐ−チャンネルは、図ＩＢの実験におけるようにスペルミ ジンによりブロックされている）０図ＩＣのスパイクは、ポリアミン抵抗（及び ジ目つゴグモベノム抵抗）であるカルシウム伝導性のためであり、故にＰ−チャ ンネルのためではない。この残存するカルシウム伝導性は、ジヒドロピリジンの 添加によりブロックされ（図ＩＣ１下方トレース）、ストレプトマイシン等の抗 生物質の添加（ＩＤ上方トレース、同一調整物に対し）によってもブロックされ る（図ＩＤ、下方トレース）。

活性剤である本発明内の化合物を用いて、同じ実験をなすことができる。もちろ ん、この場合には、結果は１図１で生じたように、実験において記録できたカル シウムスパイクの上昇割合の増加となるであろう（ブロック剤が添加されないこ とを除いて）。

Ｂ、イカ　での電 イカシナプス電圧クランプ及び電流クランプ実験において、以下の観察がなされ た。

活性ポテンシャルは、イカ星状神経節において巨大シナプスの神経束シナプス前 部の直流電気刺激により引き起こされた。かようにして引き起こされたシナプス 後部の活動ポテンシャルを前記浴内でのいかなるカルシウムチャンネルブロック 剤をも不存在下にて＠４に示す（トレースＡ）、３ｃｃ浴内への化合物Ｅの製剤 ０゜１５■ｌ添加後（以下に詳述した）、シナプス後部活動ポテンシャルは、か ような添加後４分で有為に減少しくトレースＢ）、６分で完全に消失した。

シナプス後部活動ポテンシャルの減少及び結果としての消失は。

シナプス前部カルシウムチャンネルのＰ−チャンネルブロックファクター（ここ で化合物Ｅ）により妨害されることに起因する。

該カルシウムチャンネルは、電圧クランプ実験の他のタイプにて示されたものも 含む（図６）、ここでイカシナプスにおけるシナプス後部ポテンシャル（テトラ トドキシン及び３−アミノピリジンを含む製剤において）は、Ｐ−チャンネルブ ロック剤化合物Ｂの１ｍＭ溶液の０゜４ｍｌの３ｃｃ浴内への添加後、時間をか けて減少する６図６において、−６０＋＊Ｖの休止ポテンシャルからの３８゜２ 鳳Ｖ、１０＋ｓｅｃの電圧クランプにより引き起こされたイカシナプス後部活動 ポテンシャルは、Ｐ−ポテンシャルブロック剤の添加後１，６．１ｏ、及び１３ 分に記録された。ポテンシャルは減少し、結果として消失した。イカシナプスは 、プルキンエ細胞よりも試薬による影響を少なく受けることに留意すべきである 。従って、観察されるべき特定の効果のために、ブロック剤の多くの量及び／又 は長い待ち時間が必要とされる。

図５は、また別の電圧クランプ実験を示す、ここで、２８冨Ｖ１５．５ｍ５ｅｃ 電圧ステツプをイカシナプス製剤においてシナプス前部末端に適用しくト１ノー スＣ）、ナトリム伝導性はＴＴＸでブロックされ、かつカリウム伝導性は３−ア ミノピリジンでブロックされた。該適用ステップ電圧は、他の伝導性がブロック されるため。

カルシウムに単独に起因するシナプス前部細胞におけるあるべき補償内部イオン 性電流を生じる（トレースＢ）。シナプス後部細胞では、Ｐ−チャンネルブロッ ク剤（ここで化合物Ｂ）の不存在下にて正常な応答（上方曲線、トレースＡ）で あるシナプス後部ポテンシャル（ＥＰＳＰ）が引き起こされる。同時に、化合物 Ｂの存在にて、シナプス前部イオン性電流もまた減少する（トレースＢ、上方曲 線、即ち、小さい増幅の曲線）。

これは、シナプス後部応答へのシナプス前部カルシウム侵入の図５での時間相関 関係が一定に残るため、かつ、シナプス後部応答の増幅がシナプス前部カルシウ ム電流の減少と直接的な相関関係で減少するため、Ｐ−チャンネルブロック剤が シナプス前部カルシウムチャンネル上に作用することを示す、これはＰ−チャン ネルブロック剤が、シナプス前部カルシウムチャンネルをブロックし、カルシウ ム流入を妨げ、従って予想された伝達放出が起こらないことを意味する。減少し た伝達放出は、順次、減少したシナプス後部応答を引き起こす。

イカシナプスを用いた電流クランプ実験において、固定された振幅復極電流（４ ００ｎ　Ａ、　８　、４ｍ５ｅｃ）が、シナプス前部末端に適用された。ＴＴＸ 及び３−アミノピリジンの存在下にて、シナプス前部ポテンシャル（カルシウム スパイク）は、図７Ａ、上方トレースに描かれている様である。

対応するシナプス後部ポテンシャル（ＥＰＳＰ）は１図７Ｂ（上方トレース）に 描かれる。Ｐ−チャンネルブロック剤（ここで化合物Ｂ）添加７分後、シナプス 前部カルシウムスノ（イクは減少しく７Ａ、下方トレース）−ＥＰＳＰも同様で あった（７Ｂ、下方トレース）、妨害後、シナプス前部カルシウムスパイクは単 に振幅において変化する。引き起こされたシナプス後部ポテンシャルも振幅にて 変化する。更に、妨害後、ＥＰＳＰの時間推移はブロック剤の不存在下において と同様である。これは、ポリアミンＰ−チャンネルブロック剤がシナプス前部に 作用し、シナプス後部効果を有していないことを示す：もしシナプス後部妨害が 存在したなら、ＥＰＳＰの時間推移は異なったものとなるべきである（それ自身 の振幅が低いことに加えて）。

図２及び図３は、シナプス前部カルシウム電流及びシナプス後部ポテンシャルに 対するＰ−チャンネルブロック剤の効果が投与量依存性であることを示す：Ｐ− チャンネルブロック剤の量的増加に伴う振幅の減少両方を細胞外培養にて用いた （図２では、ベノムを用い１図３では部分的に精製された７　Ｐ−チャンネルブ ロック剤を用いた）、前記部分的に精製された製剤はベノムから脱蛋白化（煮沸 ）し、遠心分離し、ペレットを除去し、水を加えてもとの容量とした後、ブタノ ール２０容量で２回ブタノール抽出を行うことにより製造された。該水層を用い た。

ここで詳述された結果は、特定のＰ−チャンネルポリアミンブロック剤を用いた にもかかわらず、質的に同じである。ただＪ、つの相違点は、特定のブロック剤 の効能である。化合物Ａ及びＢ。

及び特に化合物Ｅは、スペルミジンよりも最も効能的なことが明らかで、この理 由によりこれらの化合物が好ましい、また、好ましくは、ジョウゴグモから、上 記したように脱蛋白化に引き続いてカチオン交換クロマトグラフィーにより精製 されたＰ−チャンネルブロックファクターである。

図８は、イカ（図５に示したと同様だが、バックグランドを除去した）における 電圧クランプ実験からトレースした重ね合わせである。ここで、３５購Ｖ／１ｍ ５ｅｃ電圧ステップ（トレースＶ）が上記されたタイプのイカシナプス製剤のシ ナプス前部末端に適用され、ナトリウム伝導性はＴＴＸでブロックされ、カリウ ム伝導性はＴＥＡでブロックされた。この特定の製剤において、４つのシナプス 前部イオン性電流測定が、リジンエステル及び実施例２からのスペルミジン反応 産物を浴当り約１履ｇ／ｃｃにての適用前（トレースｌ−１）、１．２及び５分 後１時間をかけて同じ電圧ステップの適用後なされた（トレースＩ−２から１− ４）、細胞は結局死ぬので、この産物なしで、イオン性電流の振幅は段々に減少 する。しかしながら、化合物ＢＢの適用後、テール電流が生じる（他の伝導性が ブロックされるため、単独にカルシウムによる）、該カルシウム電流最大振幅は 最初徐々に減少しくｌ−２）、次いで徐々増加しくＩ−３，ｌ−４）、徐々に大 きいピークを示す（Ｉ−２で１８０ｎＡから始まる）、これは活性化剤の影響下 で、カルシウムチャンネル開放の蓋然性が増加し、シナプス前部細胞が細胞外培 養液からより多くのカルシウムを受け取ることを意味する。シナプス前部カルシ ウム電流における小さな変化が。

正常に（すなわち、カルシウムブロック剤又は活性化剤なしの新鮮細胞製剤にお いて）ＥＰＳＰ内にて大きい変化を生じる。このシナプス後部細胞でのＥＰＳＰ 測定は事実、ＥＰＳＰのために徐々に高い振幅を示した（トレースＰ−１からＰ −４に対応するＥＰＳＰ参照）、この実験もまた。ＥＰＳＰ内の変化が直接的に シナプス前部細胞内変化に関係するので、リジン−スペルミジン共役がカルシウ ムチャンネルを活性化し、シナプス前部に作用することを示す、この化合物によ り活性化された前記チャンネルはＰ−タイプ特異性であり、活性化効果は他のカ ルシウムチャンネルタイプのブロック剤の添加によって落ちこまないことが予想 されるゆさらに、実験において、リジンエチルエステルとスペルミジンとの反応 産物（実施例２参照）は前記浴内に配置され、上記のように精製された７ベノム からの精製されたカルシウムチャンネルブロックファクターの浴内での引き続く 二次導入後、カルシウムチャンネルブロック剤はなくなった。

失凰五ｌ　プロ・り　又は　化　として　いたポリアミン以下の化合物が購入さ れ又は合成され、Ｐ−チャンネルブロック活性及びかような活性の特異性が試験 された：シグマ（Ｓｉｇｉ＋ａ）から以下のものが得られたニスペルミジン　Ｎ ）１．＝（ＣＨ，）４−ＮＨ−（ＣＨ，）３−ＮＨ□１．６ジアミノヘキサン　 ＮＨｌ　−（ＣＨ，）、　−Ｎｌ（。

スペルミン　ＮＨ，−（ＣＨ，）、　−ＮＨ−（ＣＨ２）　、−ＮＨ−（ＣＨ， ）、　−ＮＨ。

古註えて、シグマ（Ｓｉｇ履ａ）からのＬ−アルギニンエチルエステルもまた、 上記化合物Ｂ及びＡを合成するために用いられた．簡単には、化合物Ｂの合成は 、ＩＮ　ＮａＯＨ　５ｍｌに溶解されたＬ−アルギニンエチルエステエル３ＸＩ Ｏ−”モルを使用した。スペルミジンの等モル量を滴下し、反応は２５℃．ｐＨ １４で撹拌しながら、行なった．生成物を５Ｎ　ＭＣＩの添加によりｐＨ７．４ とした．化合物Ｂの該製剤４０マイクロリットル等分を実施例１の分析システム で実験に用いた。

化合物Ａは、ＩＮ　ＮａＯＨ中にアルギニンエステルを加える前に水の最小容量 中にＮＨ．　−　（ＣＨ．　）、−Ｎ８２等モルを最初に溶解した点を除いて同 じ方法で合成された。

化合物Ｅ及びその同位体は上記されたように合成された。

加えて、ポリアミン部位を含むいくつかの抗生物質が市販品より得られ，試験さ れた。これらは： ゲンタマイシン（エルキンスーシン社，チェリーヒル、ニュージャー・ジー（Ｅ ｌｋｉｎｓ−Ｓｉｎｎ＋Ｉｎｃ，、Ｃｈｅｒｒｙ　Ｈｉｌｌ，Ｎ．Ｊ．））スト レプトマイシン（（Ｐｆｉｐｈａｒｍｅｃｓ，ａ　ｄｉｖｉｓｉｏｎ　ｏｆ　Ｐ ｆｉｚｅｒ。

Ｉｎｃ．、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，　Ｎ．Ｙ．））バンコマイシン（エリ　リリー 　インダストリー社、キャロライナ、プエルトリコ（Ｅｌｉ　Ｌｊ．１１ｙ　Ｉ ｎｄｕｓｔｒｉｓｓ．Ｉｎｃ．、Ｃａｒｏｌｉｎａ。

Ｐｕｅｒｔｏ　Ｒｉｃｏ）） カナマシン等のアミン基を含む他の抗生物質は，同じ活性を有し、種よりも級に よるいくつかの相違点を有するであろうことが予想される．いくつかのかような 抗生物質は市販されている。

上記にリストされ、試験された３つの抗生物質のそれぞれは。

０、１、０．４及び０．８曹阿の量で水中に溶解した．バンコマイシン１鳳にを 用いた。

最後に、ウィスコンシン州ミルウォーキーのアルドリッヒケミカル（Ａｌｄｒｉ ｃｈ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，ｖｉｓｅ．、）からの化合物４−（３−・アミノプ ロピル）モルフォリン及びにエルデフラウィら（Ｅｌｄｅｆｒａｗｉ　ａｔａｌ ．、１９８８同上）（イナゴ足筋肉のグルタミン酸受容体拮抗薬と信じられてい る）に記載された化合物ＰＨＴＸ４３３　（ｒ’ＰＴＸ４　３　３Ｊ　）　モ試 験すレタ。

モルフォリン誘導体の１．０■Ｎまでの量及びＰＴＸ４３３の更により多い量を Ｐ−チャンネルブロック活性の電気生理学的評価のために用いた。

Ｐ−カルシウムチャンネル活性剤化合物及び が、水可溶性カルボジイミドすなわち、スルホン酸Ｎ−シクロヘキシル−Ｎ’　 −　［　（２−モルフオリニル）−エチルゴーカルボシイミゾ−メチル−ｐ−ト ルエン（アルドリッヒケミカル社（Ａｌｄｒｉｃｈ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ． ）の等モル量の存在下にて．ＰＨ４．７で等モルのリジン及びスペルミジンの混 合物を水中で反応することにより合成された．反応混合物は２０時間、室温にて 撹拌されながら放置された．生成物混合物を酢酸エチルで３回（総計約１０容量 ）抽出し，水層を口取し、ｐＨ７．２とした．該水層をＦＰＬＣ　（高性能液体 クロマトグラフィー、ファルマシア）により、Ｏ〜１．Ｏ　ＮａＣｌグラディエ ンド、ｐＨ７．５、流速１ｍｌ／ｗｉｎで、ファルマシアのＭｏｎｏ−Ｓ　（　 ５　Ｘ　５　０　ａｍ）等のカチオン交換カラムを用いて更に精製した．なお、 他の既知の精製方法を更に用いることもできる．しかしながら、上記最後の酢酸 エチル抽出から結果的に得られる水層をそのまま用いることができる。

上述の合成方法は２つの化合物（ＢＢ）及び（ＢＢ’　）間に相違がなく、多分 これらの化合物の混合物を生ずるけれども、抽出物のカルシウムチャンネル活性 効能（実施例１参照）は多分両方が活性であることを示す。

上述の技術は、他の式Ｉのリジン系ポリアミンを合成するために用いることがで きる。

化合物（ＢＢ）’だけを得るために用いることができる他の合成技術は、リジン と１，３ジアミノプロパンとを、例えば上記カルボジイミド方法を用いて最初に 反応させ、次いで、反応生成物を（好ましくは）精製後、１，４ジアミンブタン と上記式１の化合物のための方法の１つを用いて反応させる。ジアミンの使用の 順序は（ＢＢ）産物合成において逆転させることができる。

３：　カルシウム　の　なる リジン−スペルミジン反応物を用いてはいるが、ＰＣＴ出願ＰＣＴＵＳ８９１０ ０５５８にて上記したように行われた単一チャンネル研究において、前記のカル シウムチャンネル活性体はカルシウムチャンネルのオープン確率は増加したが、 個々のチャンネルの伝導性を変化することは明らかにならなかった。

ニー、アペルタ（紅吐肛田）ペノム又は化合物Ｂ又はＥから単離されたカルシウ ムチャンネルブロックファクターは、５０〜１００マイクロリツトルの投与量で 投与されると、ラットに致死的である。精製された化合物ＢＢの同量はこれらの 動物を殺さなかった。観察上、ラットは落ち着いているが、可視行動不全を示さ ず、つまみ上げたときラットの四肢は延びない、化合物ＢＢ（及び／又はＢＢ’ 　）は筋肉弛緩はあまりないがトランキライザー効果と同様に鎮静効果を有する ことが明らかであった。

４：カルシウム　の　ラバ１ング アルギニンは、ｐＨ９，５のホウ酸ナトリウムバッファにフルオレセインの等モ ル量で混合することにより、及び１晩かけて暗所にて撹拌しながら混合物を反応 させることによりラベリングされた。過剰フルオレセインを洗浄当り酢酸エチル １０容量で３回洗浄することにより抽出した。かようにしてラベリングされたア ルギニンを式１の化合物を合成するために用いることができる。

リジンエチルエステルは同様にラベリングすることができる。故に、ラベリング された式１の化合物（ブロック剤及び活性剤の両方）を公知技術の方法を用いる 螢光実験に用いることができる。

５：　なる電　生理学研　の結果 Ｐ−チャンネル活性を実施例２にてリストされた化合物の種々の量の不存在下及 び存在下にて実施例１の系にて記録した。

Ｐ−チャンネルに対する結果は以下の通りであった：スペルミン及び１，６ジア ミノヘキサンは、試験された濃度（約１ｍＭまで）ではＰ−チャンネルをブロッ クしなかった。Ｐ−チャンネルに起因するカルシウム伝導性もこれらの化合物の 不存在下及び存在下にて同じであった。対照してみると、スペルミジンはＰ−チ ャンネルを選択的にブロックしたが、高効能ではなかった（クモゲノムの効能又 はベノムから精製されたＰ−チャンネルブロック剤と比較して）。

スペルミジンは８００マイクロモルの濃度までＬ−チャンネルに効果を有しない 、４−　（３−７ミノプロビル）モルフォリンは。

１■Ｎの濃度までＰ−チャンネルをブロックしなかった。

ＰＨＴＸ４３３は、プルキシエ細胞内にて１０ＩＩＭの濃度までＰ−チャンネル をブロックしなかったが、イカにおいてシナプス後部応答をブロックした（約３ ００マイクロモル）。

対照してみると、化合物Ａ、Ｂ及びＥは、０．５ｍＭ未満の濃度で完全なＰ−チ ャンネル妨害をなす効能があるＰ−チャンネルブロック剤であった。試験された 濃度で（十分に１■により低く）、いずれもジヒドロピリジン感応性Ｌ−チャン ネルをブロックしなかった。他のチャンネル（ナトリウム、カリウム）は影響さ れなかった。本発明のＰ−チャンネルブロック剤の効果的な最小濃度は、マイク ロモル以下である；このことは、これらの薬剤の連続的な稀釈を用いる通常の実 験より結論することができる。好ましくは１ｍＭまでの濃度であるが、技術上公 知のように、各薬剤の濃度の選択は最適とすること及び部分的又は全Ｐ−チャン ネルブロックを望むか否かによることを評価すべきである。

抗生物質は、１１未満の濃度でナトリウムチャンネル並びにＬ−チャンネルの両 方をブロックする。浴内に導入された等分の濃度が１０ｍＭよりも高い場合に、 Ｐ−チャンネルブロック（並びにＬ−及びナトリウムチャンネルブロック）は見 られたけれども、試験した抗生物質のいずれも、１ｍＭ未満の濃度でＰ−チャン ネルブロックしなかった。いずれの場合にも、ストレプトマイシン中のアルギニ ン及び他の抗生物質中の種々のアミン基により所有されるＮＨ＝Ｃ（ＮＨ，）− ＮＨ一部位の存在にもかかわらず、効能のある又は特異性の、全ての抗生物質分 子におけるアロマティック環の存在に合致する抗生物質によるＰ−チャンネル妨 害は存在しなかった。

これらの結果は、本発明の非アロマティックブロックポリアミンが、Ｐ−タイプ カルシウムチャンネルを特異的に（すなわち。

ナトリウム、カリウム又はＬ−タイプカルシウムチャンネルに影響なしに）ブロ ックすることを示す、特に、これらの薬剤は、シナプス前部カルシウムチャンネ ルをブロックし、これによりシナプス前部からシナプス後部神経への伝達放出を 調節する。本発明の活性剤について類似物の特異性が予想される。

種々の他の化合物を上記のように得ること及び／又は試験することができる。該 結果が以下の観点の一般への適用性を示すことが予想されるニ ーアロマティック環の存在（ヘテロ環を含む）が、ポリアミン化合物のＰ−チャ ンネル調節能を抑制し、かつ特異的に抑制する。

−３つのアミノ基の存在が活性のために必須である。ただし、ポリアミンはメチ レン／アミン基配置内で対称でないことを条件する。

ポリアミン（全てが同等である）の窒素含有増加につれて、活性は増加する。

本発明のＰ−チャンネル活性化化合物は、アルギニン系ブロック剤と、単にアル ギニンがリジンにより置換されている点で異なる。従って、ポリアミンはＲ基の 構造によってＰ−タイプチャンネルに異なる効果、事実相反する効果を有するこ とができることが判る。事実、いくつかのカルシウムチャンネル活性剤（又はブ ロック剤）は、特定の動物種細胞からのＰ−チャンネルに特異的であり、従って 追加のＰ−チャンネルのサブタイプの特性識別マーカーとすることができるとい うことが予期される。

去１１」」− 化合物ＢＢは５０〜１００ｍｇ／ｋＨの範囲の量でラットに投与された。該ラッ トに、正常に全身麻酔を引き起こす投与量であり。

かつ多くの場合、死に至るナトリウムフェノバルビタール（ネンブタール（ＮＥ ＭＢ（ＩＴＡＬ））　４０鳳ｇ／ｋｇを引き続いて注射した。対照してみれば、 ＢＢ−注入ラットは、注入により意識不明にならなかった。該ラットを麻酔する ために、ネンブタールの２つの追加の投与量を要した。１匹には先の実験で投与 したと同量で、他の１匹には２倍の投与量で、２匹のラットに化合物ＢＢを注入 した点を除いて、該実験を繰り返した。注入後まもなく、最初のラットは正常で あり、第２のラットは観察上、活性の減少を示した。各ネンブタール４０ｍｇ／ ｋｇ注人後、最初のラットは、何等効果を示さなかったが、−第２のラットは起 き上がった。その後のネンブタール４０ｍｇ／ｋｇずつの注入は、最初のラット に総投与量１６０ｍｇ／ｋｇで麻酔を引き起こしたが、！２のラットは麻酔され る前に２００ｍｇ／ｋＨの総量を受容し、死ぬ前に２４０■ｇ／ｋｇを受容した 。

ラットにおけるネンブタールの正常なＬＤ−５０は約６０ｍｇ／ｋｇである。従 って、比較すれば、この投与量は異常に多い、暗黙的意味は、カルシウム−チャ ンネル活性剤である化合物ＢＢがバルビタール活動に対する抵抗性を引き起こす ということである。更に、該化合物は動物にトランキナイズなしに安静を引き起 こし、筋肉弛緩を大幅には引き起こさず、不安緩衝のためのプロトタイプドラッ グとしての潜在的な有用性を有する。

図１Ｃ図１Ｄ ベノム　投与量 図６ 補正書の翻訳文提出書（特許法１８４条の８）平成　３年１２月２７日

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ジヒドロピリジン抵抗性、コノトキシン抵抗性及びオクタノール抵抗性カル シウムチャンネルを有する細胞膜を横切るカルシウムイオン輸送を調節する方法 であって、式（Ｉ）の非アロマティックポリアミン化合物に該チャンネルを有す る細胞膜を暴露し： Ｒ−（ＣＨ２）ｘ−ＮＨ−（ＣＨ２）ｙ−ＮＨ２ここで、ｙは１〜１５の整数； ｘは０〜１５の整数；Ｒはアミノ、イミノ、アミド、イミド及び／又は−ＣＸ２ −Ｏ−ＮＨ−基を介して前記式の残余に付加されてもよいものの少なくとも１つ を含む有機非アロマティック基であり、ここでｘは水素又はｘの１つがＮＨ２で ある、ただし、該ポリアミンの分子についてメチレン基又は窒素原子の少なくと も１つの配位が非対称であり、かつ前記化合物が少なくとも３つの窒素原子を含 む；該ポリアミンは該チャンネルに起因する伝導性を調節するに効果的な量にて 存在することからなる調節方法。 ２．前記ポリアミン化合物がｘが１〜６であり、ｙが１〜６である式Ｉを有する 請求項１の方法。 ３．前記チャンネルがＰ−チャンネルである請求項１の方法。 ４．前記チャンネルがＰ−チャンネルであり、かつ前記細胞が哺乳網中枢神経で ある請求項２の方法。 ５．前記ポリアミンが下記式を有する請求項１の方法。 ▲数式、化学式、表等があります▼ ６．前記ポリアミンが下記式を有する請求項１の方法。 ▲数式、化学式、表等があります▼ ７．前記ポリアミンが下記式を有する請求項１の方法。 ▲数式、化学式、表等があります▼ ８．前記ポリアミンが下記式を有する請求項１の方法。 ▲数式、化学式、表等があります▼９．前記ポリアミンが下記式を有する請求項 １の方法。 ▲数式、化学式、表等があります▼ １０．前記ポリアミンが下記式を有する請求項１の方法。 ▲数式、化学式、表等があります▼ １１．前記ポリアミンが下記式を有する請求項１の方法。 ＮＨ２−（ＣＨ２）４−ＮＨ−（ＣＨ２）２−ＮＨ２１２．前記ポリアミンが下 記式を有する請求項１の方法。 ＮＨ２−（ＣＨ２）３−ＮＨ−（ＣＨ２）３−ＮＨ−（ＣＨ２）４−ＮＨ２１３ ．前記ポリアミンが下記式を有する請求項１の方法。 ▲数式、化学式、表等があります▼ １４．前記ポリアミンが下記式を有する請求項１の方法。 ▲数式、化学式、表等があります▼ １５．前記ポリアミンが下記式を有する請求項１の方法。 ＨＮ２−（ＣＨ２）３−ＮＨ−（ＣＨ２）４−ＮＨ−（ＣＨ２）２−ＮＨ２１６ ．前記ポリアミンが下記式を有する請求項１の方法。 ▲数式、化学式、表等があります▼ １７．前記ポリアミンが下記式を有する請求項１の方法。 ▲数式、化学式、表等があります▼ １８．前記ポリアミンが下記式を有する請求項１の方法。 ▲数式、化学式、表等があります▼ １９．前記ポリアミンが下記式を有する請求項１の方法。 ▲数式、化学式、表等があります▼ ２０．前記ポリアミンが下記式を有する請求項１の方法。 ▲数式、化学式、表等があります▼ ２１．前記ポリアミンが下記式を有する請求項１の方法。 ▲数式、化学式、表等があります▼ ２２．前記ポリアミンが下記式を有する請求項１の方法。 ▲数式、化学式、表等があります▼ ２３．前記ポリアミンが下記式を有する請求項１の方法。 ▲数式、化学式、表等があります▼ ２４．前記ポリアミンが下記式を有する請求項１の方法。 ▲数式、化学式、表等があります▼ ２５．前記ポリアミンが下記式を有する請求項１の方法。 ▲数式、化学式、表等があります▼ ２６．前記ポリアミンが下記式を有する請求項１の方法。 ▲数式、化学式、表等があります▼ ２７．前記ポリアミンが下記式を有する請求項１の方法。 ▲数式、化学式、表等があります▼ ２８．前記ポリアミンが下記式を有する請求項１の方法。 ▲数式、化学式、表等があります▼２９．前記ポリアミンが下記式を有する請求 項１の方法。 ▲数式、化学式、表等があります▼ ３０．前記ポリアミンが下記式を有する請求項１の方法。 ▲数式、化学式、表等があります▼ ３１．前記ポリアミンが下記式を有する請求項１の方法。 ▲数式、化学式、表等があります▼ ３２．前記ポリアミンが下記式を有する請求項１の方法。 ▲数式、化学式、表等があります▼ ３３．ジヒドロオキシピリジン、アルコール及びコノトキシンによるカルシウム チャンネル妨害抵抗性をブロックする方法であって、式（Ｉ）の非アロマティッ クポリアミンカルシウムーチャンネルブロッキング化合物に該チャンネルを有す る細胞膜を暴露し： Ｒ−（ＣＨ２）ｘ−ＮＨ−（ＣＨ２）ｙ−ＮＨ２ここで、ｙは１〜１５の整数； ｘは０〜１５の整数；Ｒはアミノ、イミノ、アミド、イミド及び／又は−ＣＸ２ −Ｏ−ＮＨ−基を介して前記式の残余に付加されてもよいものの少なくとも１つ を含む有機非アロマティック基であり、ここでｘは水素又はｘの１つがＮＨ２で ある、ただし、該ポリアミンの分子についてメチレン基又は窒素原子の少なくと も１つの配位が非対称であり、かつ前記化合物が少なくとも３つの窒素原子を含 む；該ポリアミンは該チャンネルに起因するカルシウム伝導性をブロックするに 効果的な量にて存在することからなる方法。 ３４．シナプスにおける神経カルシウムチャンネルの活性化からの結果として生 ずる伝達放出の程度の出現又は減少を阻止する方法であって、前記チャンネルは 前記ジヒドロピリジン抵抗性、アルコール抵抗性及びコノトキシン抵抗性であり 、該方法は式（Ｉ）の非アロマティックポリアミンカルシウムチャンネルブロッ キング化合物に前記シナプスを暴露することからなり：Ｒ−（ＣＨ２）ｘ−ＮＨ −（ＣＨ２）ｙ−ＮＨ２ここで、ｙは１〜１５の整数；ｘは０〜１５の整数；Ｒ はアミノ、イミノ、アミド、イミド及び／又は−ＣＸ２−Ｏ−ＮＨ−基を介して 前記式の残余に付加されてもよいものの少なくとも１つを含む有機非アロマティ ック基であり、ここでｘは水素又はｘの１つがＮＨ２である、ただし、該ポリア ミンの分子についてメチレン基又は窒素原子の少なくとも１つの配位が非対称で あり、かつ前記化合物が少なくとも３つの窒素原子を含む；該ポリアミンは該チ ャンネルに起因するカルシウム伝導性をブロックするに効果的な量にて存在する ことからなる方法。 ３５．ジヒドロピリジン、アルコール及びコノトキシンによるカルシウムチャン ネル妨害抵抗性を活性化する方法であって、前記チャンネルを有する細胞膜を式 （Ｉ）の非アロマティックポリアミンカルシウムーチャンネル活性化化合物に暴 露し：Ｒ−（ＣＨ２）ｘ−ＮＨ−（ＣＨ２）ｙ−ＮＨ２ここで、ｙは１〜１５の 整数；ｘは０〜１５の整数；Ｒはアミノ、イミノ、アミド、イミド及び／又は− ＣＸ２−Ｏ−ＮＨ−基を介して前記式の残余に付加されてもよいものの少なくと も１つを含む有機非アロマティック基であり、ここでｘは水素又はｘの１つがＮ Ｈ２である、ただし、該ポリアミンの分子についてメチレン基又は窒素原子の少 なくとも１つの配位が非対称であり、かつ前記化合物が少なくとも３つの窒素原 子を含む；該ポリアミンは該チャンネルに起因するカルシウム伝導性を増加する に効果的な量にて存在することからなる方法。 ３６． シナプスにおける神経カルシウムチャンネルの活性化から結果として生じる伝達 放出の程度において伝達放出を高める方法であって、前記チャンネルがジヒドロ ピリジン抵抗性、アルコール抵抗性及びコノトキシン抵抗性であり、該方法は前 記シナプスを式（Ｉ）の非アロマティックポリアミンカルシウムーチャンネル活 性化化合物に暴露し： Ｒ−（ＣＨ２）ｘ−ＮＨ−（ＣＨ２）ｙ−ＮＨ２ここで、ｙは１〜１５の整数； ｘは０〜１５の整数；Ｒはアミノ、イミノ、アミド、イミド及び／又は−ＣＸ２ −Ｏ−ＮＨ−基を介して前記式の残余に付加されてもよいものの少なくとも１つ を含む有機非アロマティック基であり、ここでｘは水素又はｘの１つがＮＨ２で ある、ただし、該ポリアミンの分子についてメチレン基又は窒素原子の少なくと も１つの配位が非対称であり、かつ前記化合物が少なくとも３つの窒素原子を含 む；該ポリアミンは該チャンネルに起因するカルシウム伝導性を増加するに効果 的な量にて存在することからなる方法。 ３７． 式（Ｉ）の非アロマティックポリアミン化合物：Ｒ−（ＣＨ２）ｘ−ＮＨ−（Ｃ Ｈ２）ｙ−ＮＨ２ここで、ｙは１〜１５の整数；ｘは０〜１５の整数；Ｒはアミ ノ、イミノ、アミド、イミド及び／又は−ＣＸ２−Ｏ−ＮＨ−基を介して前記式 の残余に付加されてもよいものの少なくとも１つを含む有機非アロマティック基 であり、ここでｘは水素又はｘの１つがＮＨ２である、ただし、該ポリアミンの 分子についてメチレン基又は窒素原子の少なくとも１つの配位が非対称であり、 かつ前記化合物が少なくとも３つの窒素原子を含む；及び前記化合物が Ｈ２Ｎ−（ＣＨ２）ｗ−ＮＨ−（ＣＨ２）ｘ−ＮＨ−（ＣＨ２）ｙ−ＮＨ２ここ でｗは１〜６の整数である、ではない。 ３８． ▲数式、化学式、表等があります▼ ここでｘ及びｙのそれぞれが３又は４の整数である化合物。 ３９． ▲数式、化学式、表等があります▼ ここでｘ及びｙのそれぞれが３又は４の整数である化合物。 ４０． ▲数式、化学式、表等があります▼ ここでｘ及びｙのそれそれが３又は４の整数である化合物。 ４１． ▲数式、化学式、表等があります▼ ここでｘ及びｙのそれぞれが３又は４の整数である化合物。 ４２． ▲数式、化学式、表等があります▼ ここでｘ及びｙのそれぞれが３又は４の整数である化合物。 ４３． ▲数式、化学式、表等があります▼ ここでｘ及びｙのそれそれが３又は４の整数である化合物。 ４４． Ａｒｇ−ＮＨ−（ＣＨ２）１０−ＮＨ２ここで、Ａｒｇがアルギニン残基又は脱 カルポオキシル化アルギニン残基である化合物。 ４５． Ａｒｇ−ＮＨ−（ＣＨ２）１２−ＮＨ２ここで、Ａｒｇがアルギニン残基又は脱 カルポオキシル化アルギニン残基である化合物。