JPH05336993A - 微生物の迅速検出方法 - Google Patents
微生物の迅速検出方法Info
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- JPH05336993A JPH05336993A JP15190892A JP15190892A JPH05336993A JP H05336993 A JPH05336993 A JP H05336993A JP 15190892 A JP15190892 A JP 15190892A JP 15190892 A JP15190892 A JP 15190892A JP H05336993 A JPH05336993 A JP H05336993A
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 検体又は検体の懸濁液を、検出しようとする
微生物が産生する酵素の作用により蛍光物質を遊離する
蛍光基質と培地とを乾燥固定化してなるプレートのウエ
ル、陽性対照となるウエル及び陰性対照となるウエルに
それぞれ添加し、当該プレート上で静置培養後各ウエル
の遊離蛍光物質量を測定し、陽性対照及び陰性対照と対
比することを特徴とする検体中の微生物の検出方法。 【効果】 本発明によれば肉等の濁度の高い検体を用い
た場合でもブランク値を設定したり、遠心分離操作等の
煩雑な操作をすることなく、また用時培地を調製する等
の操作をすることなく簡便で、迅速かつ高感度で検体中
の微生物を検出することができる。特に食品中の大腸菌
群の検出のための日常検査法として有用である。
微生物が産生する酵素の作用により蛍光物質を遊離する
蛍光基質と培地とを乾燥固定化してなるプレートのウエ
ル、陽性対照となるウエル及び陰性対照となるウエルに
それぞれ添加し、当該プレート上で静置培養後各ウエル
の遊離蛍光物質量を測定し、陽性対照及び陰性対照と対
比することを特徴とする検体中の微生物の検出方法。 【効果】 本発明によれば肉等の濁度の高い検体を用い
た場合でもブランク値を設定したり、遠心分離操作等の
煩雑な操作をすることなく、また用時培地を調製する等
の操作をすることなく簡便で、迅速かつ高感度で検体中
の微生物を検出することができる。特に食品中の大腸菌
群の検出のための日常検査法として有用である。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は食品等の検体中に微生物
が存在するか否かを迅速、簡便かつ高感度で判定するこ
とができる検査方法に関する。
が存在するか否かを迅速、簡便かつ高感度で判定するこ
とができる検査方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】食品、薬品等に代表されるヒトが摂取す
るものの安全性については厳しい管理がなされており、
特に微生物の有無の判定は重要である。このうち、食品
中の大腸菌群の有無の判定は日常検査として特に重要で
ある。
るものの安全性については厳しい管理がなされており、
特に微生物の有無の判定は重要である。このうち、食品
中の大腸菌群の有無の判定は日常検査として特に重要で
ある。
【０００３】食品中の大腸菌群の検出法としては、従
来、食品サンプルを滅菌生理食塩水等に懸濁してストマ
ッキングし、得られた懸濁液を段階希釈して培地に添加
して、２４〜４８時間静置培養し、次いで当該培養物上
に発生するコロニーを計測又はガスの発生を確認する方
法が一般的に行われている。しかしながら、この方法で
は、培養時間が２４〜４８時間程度必要であることから
判定に１日以上を要すること、コロニーの計測は煩雑で
あり、その操作には熟練を要すること、また検体を段階
希釈したり、培地を用時調製することから操作が煩雑で
ある等の問題があった。
来、食品サンプルを滅菌生理食塩水等に懸濁してストマ
ッキングし、得られた懸濁液を段階希釈して培地に添加
して、２４〜４８時間静置培養し、次いで当該培養物上
に発生するコロニーを計測又はガスの発生を確認する方
法が一般的に行われている。しかしながら、この方法で
は、培養時間が２４〜４８時間程度必要であることから
判定に１日以上を要すること、コロニーの計測は煩雑で
あり、その操作には熟練を要すること、また検体を段階
希釈したり、培地を用時調製することから操作が煩雑で
ある等の問題があった。
【０００４】一方、最近蛍光基質を利用した蛍光法が開
発され、より迅速な微生物の検出が行われている。その
操作は、食品を培地に添加して振とう培養した後、培養
液を遠心分離又はフィルター処理し、これに蛍光基質を
加えて反応させ、微生物が産生する酵素により蛍光基質
から蛍光物質を遊離させ、反応液にアルカリを添加した
後、再度遠心分離又はフィルター処理を行い、上澄液の
蛍光を測定するというものである。しかしながら、この
方法においては、遠心分離又はフィルター処理操作を行
うなど操作が煩雑であるという問題があった。
発され、より迅速な微生物の検出が行われている。その
操作は、食品を培地に添加して振とう培養した後、培養
液を遠心分離又はフィルター処理し、これに蛍光基質を
加えて反応させ、微生物が産生する酵素により蛍光基質
から蛍光物質を遊離させ、反応液にアルカリを添加した
後、再度遠心分離又はフィルター処理を行い、上澄液の
蛍光を測定するというものである。しかしながら、この
方法においては、遠心分離又はフィルター処理操作を行
うなど操作が煩雑であるという問題があった。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
は簡便な操作で、迅速かつ高感度で食品等の検体中の微
生物の有無を判定する方法を提供することにある。
は簡便な操作で、迅速かつ高感度で食品等の検体中の微
生物の有無を判定する方法を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】そこで、本発明者らは上
記課題を解決すべく種々検討した結果、蛍光法において
培地を予め乾燥固定化したプレートを用いれば、培地を
用時調製する必要がないため操作が簡便になり、陽性対
照と陰性対照の２点を対照とし、これらと検体との蛍光
量対比を行えば遠心分離又はフィルター操作をすること
なく容易かつ迅速に食品等の検体中の微生物の有無が判
定できることを見出し、本発明を完成するに至った。
記課題を解決すべく種々検討した結果、蛍光法において
培地を予め乾燥固定化したプレートを用いれば、培地を
用時調製する必要がないため操作が簡便になり、陽性対
照と陰性対照の２点を対照とし、これらと検体との蛍光
量対比を行えば遠心分離又はフィルター操作をすること
なく容易かつ迅速に食品等の検体中の微生物の有無が判
定できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】すなわち、本発明は検体又は検体の懸濁液
を、検出しようとする微生物が産生する酵素の作用によ
り蛍光物質を遊離する蛍光基質と培地とを乾燥固定化し
てなるプレートのウエル３ケ所Ａ、Ｂ及びＣに添加し、
そのうちウエルＢ及びウエルＣにアルカリ液を添加した
後、当該プレート上で静置培養後、ウエルＢに蛍光物質
を添加し、ウエルＡにアルカリ液を添加した後、各ウエ
ルの蛍光物質量を測定し、ウエルＡの蛍光物質量をウエ
ルＢ及びウエルＣのそれと対比することを特徴とする検
体中の微生物の検出方法を提供するものである。
を、検出しようとする微生物が産生する酵素の作用によ
り蛍光物質を遊離する蛍光基質と培地とを乾燥固定化し
てなるプレートのウエル３ケ所Ａ、Ｂ及びＣに添加し、
そのうちウエルＢ及びウエルＣにアルカリ液を添加した
後、当該プレート上で静置培養後、ウエルＢに蛍光物質
を添加し、ウエルＡにアルカリ液を添加した後、各ウエ
ルの蛍光物質量を測定し、ウエルＡの蛍光物質量をウエ
ルＢ及びウエルＣのそれと対比することを特徴とする検
体中の微生物の検出方法を提供するものである。
【０００８】また、本発明は検体又は検体の懸濁液を、
検出しようとする微生物が産生する酵素の作用により蛍
光物質を遊離する蛍光基質と培地とを乾燥固定化してな
るプレートのウエルＡ及びウエルＣ、培地、当該蛍光基
質及び蛍光物質を乾燥固定化してなるウエルＢにそれぞ
れ添加し、そのうちウエルＢ及びウエルＣにアルカリ液
を添加した後、当該プレート上で静置培養後、ウエルＡ
にアルカリ液を添加した後、各ウエルの蛍光物質量を測
定し、ウエルＡの蛍光物質量をウエルＢ及びウエルＣの
それと対比することを特徴とする検体中の微生物の検出
方法を提供するものである。
検出しようとする微生物が産生する酵素の作用により蛍
光物質を遊離する蛍光基質と培地とを乾燥固定化してな
るプレートのウエルＡ及びウエルＣ、培地、当該蛍光基
質及び蛍光物質を乾燥固定化してなるウエルＢにそれぞ
れ添加し、そのうちウエルＢ及びウエルＣにアルカリ液
を添加した後、当該プレート上で静置培養後、ウエルＡ
にアルカリ液を添加した後、各ウエルの蛍光物質量を測
定し、ウエルＡの蛍光物質量をウエルＢ及びウエルＣの
それと対比することを特徴とする検体中の微生物の検出
方法を提供するものである。
【０００９】本発明方法に用いられる検体としては、食
品、医薬、農薬、化粧品、飲料水、尿等微生物混入の有
無を検出する必要のあるものが用いられるが、肉類、魚
介類、野菜類、果物類等の生鮮食料品を用いるのが好ま
しい。液体の検体はよく振って混合して、固形検体は無
菌的に一定量秤量し滅菌生理食塩水等の希釈液を加えて
ストマッカー等にかけて均一な懸濁液として用いられ
る。
品、医薬、農薬、化粧品、飲料水、尿等微生物混入の有
無を検出する必要のあるものが用いられるが、肉類、魚
介類、野菜類、果物類等の生鮮食料品を用いるのが好ま
しい。液体の検体はよく振って混合して、固形検体は無
菌的に一定量秤量し滅菌生理食塩水等の希釈液を加えて
ストマッカー等にかけて均一な懸濁液として用いられ
る。
【００１０】本発明方法の検出対象である微生物として
は、種々の細菌、真菌等が挙げられるが、食品を検体と
した場合には大腸菌群が重要である。ここで大腸菌群と
は、ラクトース分解酵素を産生する能力を有する一群の
微生物で、エシェリシア属、サイトロバクター属、クレ
ブシエラ属、エンテロバクター属等に属するものであ
る。
は、種々の細菌、真菌等が挙げられるが、食品を検体と
した場合には大腸菌群が重要である。ここで大腸菌群と
は、ラクトース分解酵素を産生する能力を有する一群の
微生物で、エシェリシア属、サイトロバクター属、クレ
ブシエラ属、エンテロバクター属等に属するものであ
る。
【００１１】本発明においては、検出しようとする微生
物が産生する酵素の作用により蛍光物質を遊離する蛍光
基質と培地とを乾燥固定化してなる少なくとも３つのウ
エルを有するプレートを準備する必要がある。また、少
なくとも２つのウエルに当該蛍光基質と培地が乾燥固定
され、少なくとも１つのウエルに当該蛍光基質、蛍光物
質及び培地が乾燥固定化されたプレートも用いることが
できる。
物が産生する酵素の作用により蛍光物質を遊離する蛍光
基質と培地とを乾燥固定化してなる少なくとも３つのウ
エルを有するプレートを準備する必要がある。また、少
なくとも２つのウエルに当該蛍光基質と培地が乾燥固定
され、少なくとも１つのウエルに当該蛍光基質、蛍光物
質及び培地が乾燥固定化されたプレートも用いることが
できる。
【００１２】ここで、プレートに固定化される蛍光基質
としては、例えば検出しようとする微生物が大腸菌群で
ある場合には、４−メチル−ウンベリフェリル−β−Ｄ
−ガラクトシド（以下、４−ＭＵＧａｌと略す）が好ま
しく、検出しようとする微生物がＥ．ｃｏｌｉの場合に
は４−メチル−ウンベリフェリル−β−Ｄ−グルクロニ
ド（以下、４−ＭＵＧｌｕと略す）が好ましい。大腸菌
群は前記のようにラクトース分解酵素を産生するので、
大腸菌群が存在すれば４−ＭＵＧａｌは分解され、蛍光
物質４−メチル−ウンベリフェロン（４−ＭＵ）を遊離
する。また、Ｅ．ｃｏｌｉはグルクロニダーゼを産生す
るので、Ｅ．ｃｏｌｉが存在すれば４−ＭＵＧｌｕは分
解され、蛍光物質４−ＭＵを遊離する。
としては、例えば検出しようとする微生物が大腸菌群で
ある場合には、４−メチル−ウンベリフェリル−β−Ｄ
−ガラクトシド（以下、４−ＭＵＧａｌと略す）が好ま
しく、検出しようとする微生物がＥ．ｃｏｌｉの場合に
は４−メチル−ウンベリフェリル−β−Ｄ−グルクロニ
ド（以下、４−ＭＵＧｌｕと略す）が好ましい。大腸菌
群は前記のようにラクトース分解酵素を産生するので、
大腸菌群が存在すれば４−ＭＵＧａｌは分解され、蛍光
物質４−メチル−ウンベリフェロン（４−ＭＵ）を遊離
する。また、Ｅ．ｃｏｌｉはグルクロニダーゼを産生す
るので、Ｅ．ｃｏｌｉが存在すれば４−ＭＵＧｌｕは分
解され、蛍光物質４−ＭＵを遊離する。
【００１３】固定化される蛍光基質の量は、検体中の微
生物量よりも過剰であれば特に制限されず、例えば培地
に対し１×１０-2〜１×１０-4Ｍが好ましい。
生物量よりも過剰であれば特に制限されず、例えば培地
に対し１×１０-2〜１×１０-4Ｍが好ましい。
【００１４】一方、プレートに固定化される培地として
は、検出しようとする微生物が生育できる培地であれば
特に制限されないが、大腸菌群やＥ．ｃｏｌｉを対象と
する場合は、本発明者らが先に報告した特開平４−５１
８９０号公報記載の大腸菌群増殖用培地、後記のＫＳ培
地、ブレインハートインフュージョン培地、ハートイン
フュージョン培地、トリプトソーヤ培地、乾燥ブイヨン
培地、ブリリアントグリーン乳糖ブイヨン培地（ＢＧＬ
Ｂと略す）、乳糖ブイヨン培地（ＬＢと略す）、ＥＣ培
地（ＥＣと略す）等が挙げられるが、ＫＳ培地が特に好
ましい。
は、検出しようとする微生物が生育できる培地であれば
特に制限されないが、大腸菌群やＥ．ｃｏｌｉを対象と
する場合は、本発明者らが先に報告した特開平４−５１
８９０号公報記載の大腸菌群増殖用培地、後記のＫＳ培
地、ブレインハートインフュージョン培地、ハートイン
フュージョン培地、トリプトソーヤ培地、乾燥ブイヨン
培地、ブリリアントグリーン乳糖ブイヨン培地（ＢＧＬ
Ｂと略す）、乳糖ブイヨン培地（ＬＢと略す）、ＥＣ培
地（ＥＣと略す）等が挙げられるが、ＫＳ培地が特に好
ましい。
【００１５】固定化される培地の量は、特に制限されな
いが、通常０．１〜２ml／２４穴プレート、特に１．０
ml／２４穴プレートが好ましい。
いが、通常０．１〜２ml／２４穴プレート、特に１．０
ml／２４穴プレートが好ましい。
【００１６】また、プレートに固定化されることのある
蛍光物質としては、前記４−ＭＵ等が挙げられる。固定
化される蛍光物質の量は、特に制限されないが、通常１
×１０-8〜１×１０-3mol ／プレートウエル、特に５×
１０-5mol ／プレートウエルが好ましい。
蛍光物質としては、前記４−ＭＵ等が挙げられる。固定
化される蛍光物質の量は、特に制限されないが、通常１
×１０-8〜１×１０-3mol ／プレートウエル、特に５×
１０-5mol ／プレートウエルが好ましい。
【００１７】これらの培地等を乾燥固定化するためのプ
レートとしては、例えばプラスチック製の多穴プレート
である９６穴プレート、２４穴プレート等が挙げられ
る。
レートとしては、例えばプラスチック製の多穴プレート
である９６穴プレート、２４穴プレート等が挙げられ
る。
【００１８】これらのプレートへの培地、蛍光基質、蛍
光物質等の乾燥固定化は、プレートにこれらの物質の懸
濁液を添加した後、減圧乾燥することにより行うのが好
ましい。
光物質等の乾燥固定化は、プレートにこれらの物質の懸
濁液を添加した後、減圧乾燥することにより行うのが好
ましい。
【００１９】本発明に用いられるアルカリ液としては、
大腸菌群等の微生物の発育が停止するpHを有するもので
あれば特に制限されないが、pH１０〜１１の緩衝液、例
えば０．５〜１．０Ｍグリシン緩衝液を用いるのが好ま
しい。かかるアルカリ液の添加量は０．５〜１．０ml／
プレートウエルが好ましい。
大腸菌群等の微生物の発育が停止するpHを有するもので
あれば特に制限されないが、pH１０〜１１の緩衝液、例
えば０．５〜１．０Ｍグリシン緩衝液を用いるのが好ま
しい。かかるアルカリ液の添加量は０．５〜１．０ml／
プレートウエルが好ましい。
【００２０】本発明方法を実施するには、まずプレート
のウエル３ケ所Ａ、Ｂ及びＣに検体又は検体の懸濁液を
添加し、そのうち、対照となるウエルＢ及びウエルＣに
アルカリ液を添加して微生物の発育を停止させた後、当
該プレート上で静置培養する。検体等の添加量は、例え
ば２４穴プレートを用いる場合０．５〜２．０ml程度で
十分である。培養は、検出しようとする微生物、培地等
によって異なるが、大腸菌群検出の場合、通常３５〜３
７℃、４〜８時間行うのが好ましい。静置培養後、ウエ
ルＡにもアルカリ液を添加する。
のウエル３ケ所Ａ、Ｂ及びＣに検体又は検体の懸濁液を
添加し、そのうち、対照となるウエルＢ及びウエルＣに
アルカリ液を添加して微生物の発育を停止させた後、当
該プレート上で静置培養する。検体等の添加量は、例え
ば２４穴プレートを用いる場合０．５〜２．０ml程度で
十分である。培養は、検出しようとする微生物、培地等
によって異なるが、大腸菌群検出の場合、通常３５〜３
７℃、４〜８時間行うのが好ましい。静置培養後、ウエ
ルＡにもアルカリ液を添加する。
【００２１】なお、陽性対照となるウエルＢに蛍光物質
が予め固定化されていない場合には、培養後に蛍光物質
を所定量添加する。
が予め固定化されていない場合には、培養後に蛍光物質
を所定量添加する。
【００２２】次いで、ウエルＡ、ウエルＢ及びウエルＣ
の蛍光を、目視、蛍光リーダー等により測定する。蛍光
物質が４−ＭＵの場合には、３６５nmの波長で励起さ
せ、４５０nmの蛍光を測定すればよい。この場合、ウエ
ルＢを陽性対照（蛍光量１００％）、ウエルＣを陰性対
照（蛍光量０％）として、これらのプレートの蛍光量を
比較し、検体中の微生物量を判定する。このように、対
照を２点設けることにより、肉等の濁度の高い検体を用
いた場合でも、遠心分離操作を行うことなく微生物によ
る蛍光量を正確に判定することが可能となる。
の蛍光を、目視、蛍光リーダー等により測定する。蛍光
物質が４−ＭＵの場合には、３６５nmの波長で励起さ
せ、４５０nmの蛍光を測定すればよい。この場合、ウエ
ルＢを陽性対照（蛍光量１００％）、ウエルＣを陰性対
照（蛍光量０％）として、これらのプレートの蛍光量を
比較し、検体中の微生物量を判定する。このように、対
照を２点設けることにより、肉等の濁度の高い検体を用
いた場合でも、遠心分離操作を行うことなく微生物によ
る蛍光量を正確に判定することが可能となる。
【００２３】
【発明の効果】本発明によれば肉等の濁度の高い検体を
用いた場合でも、遠心分離操作等の煩雑な操作をするこ
となく、また用時培地を調製する等の操作をすることな
く簡便で、迅速かつ高感度で検体中の微生物を検出する
ことができる。特に食品中の大腸菌群の検出のための日
常検査法として有用である。
用いた場合でも、遠心分離操作等の煩雑な操作をするこ
となく、また用時培地を調製する等の操作をすることな
く簡便で、迅速かつ高感度で検体中の微生物を検出する
ことができる。特に食品中の大腸菌群の検出のための日
常検査法として有用である。
【００２４】
【実施例】次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明する
が、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
が、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００２５】実施例１ （１）２４穴プレートの各ウエルに、ＫＳ培地を１．０
ml添加し、減圧乾燥プレートを調製した。
ml添加し、減圧乾燥プレートを調製した。
【００２６】
【表１】
【００２７】（２）表２記載の食品１０ｇに９０mlの滅
菌生理食塩水を加え均一になるようにストマッキング
し、その１mlずつ減圧乾燥プレートウエルに注加した。
更に４−ＭＵを０〜５×１０-5mol ／ｌになるように注
加した後、各プレートを蛍光リーダー（コロナ社製，Ｍ
ＴＰ−３２）を用いて３６５nmの光を照射し４５０nmの
蛍光を測定した。 （３）得られた結果を表２に示す。
菌生理食塩水を加え均一になるようにストマッキング
し、その１mlずつ減圧乾燥プレートウエルに注加した。
更に４−ＭＵを０〜５×１０-5mol ／ｌになるように注
加した後、各プレートを蛍光リーダー（コロナ社製，Ｍ
ＴＰ−３２）を用いて３６５nmの光を照射し４５０nmの
蛍光を測定した。 （３）得られた結果を表２に示す。
【００２８】
【表２】
【００２９】表２の結果から、食品の種類によって同一
４−ＭＵ添加量であっても蛍光強度が異なることが認め
られた。そこで食品により異なるばらつきを抑えるため
に４−ＭＵ無添加の蛍光強度の値を基準値０とした０点
補正を行い表３に示した。
４−ＭＵ添加量であっても蛍光強度が異なることが認め
られた。そこで食品により異なるばらつきを抑えるため
に４−ＭＵ無添加の蛍光強度の値を基準値０とした０点
補正を行い表３に示した。
【００３０】
【表３】
【００３１】表３の結果から各種食品間の蛍光強度を比
較したところ、やはり各種食品により蛍光強度のばらつ
きがみられ、４−ＭＵ添加による蛍光強度変化がわかり
ずらいことが認められた。そこで４−ＭＵ無添加の蛍光
強度を０％とし、更に４−ＭＵ５×１０-5mol ／ｌの場
合の蛍光強度を１００％として各４−ＭＵ添加の蛍光強
度の比率を比較した結果を表４に示した。
較したところ、やはり各種食品により蛍光強度のばらつ
きがみられ、４−ＭＵ添加による蛍光強度変化がわかり
ずらいことが認められた。そこで４−ＭＵ無添加の蛍光
強度を０％とし、更に４−ＭＵ５×１０-5mol ／ｌの場
合の蛍光強度を１００％として各４−ＭＵ添加の蛍光強
度の比率を比較した結果を表４に示した。
【００３２】
【表４】
【００３３】表４の結果から各種食品とも食品ごとに４
−ＭＵ無添加と添加の２点の対照をとることによりほぼ
同一の蛍光強度の変化がみられることが認められた。
−ＭＵ無添加と添加の２点の対照をとることによりほぼ
同一の蛍光強度の変化がみられることが認められた。
【００３４】実施例２ （１）２４穴プレートの各ウエルに、４−ＭＵＧａｌ
１．０×１０-3mol 含有ＫＳ培地を１．０ml添加し、減
圧乾燥固定してプレートを調製した。 （２）表５〜１０記載の食品１０ｇに１０〜１０2ＣＦ
Ｕ／mlになるように大腸菌群を接種した後、９０ml滅菌
生理食塩水を加え均一になるようにストマッキングし、
その１mlずつを減圧乾燥プレートウエル３ケ所に注加し
た。そのうち対照となる２ケ所のウエルに０．５Ｍグリ
シン緩衝液を１ml注加した後、このプレートを３５℃で
３〜８時間静置培養した。培養後、検査ウエルに０．５
Ｍグリシン緩衝液を１ml注加し更に対照となるウエルの
一方に４−ＭＵを５×１０-5mol ／ｌになるように注加
（陽性対照、４−ＭＵ無添加を陰性対照と仮称）した
後、各プレートを蛍光リーダー（コロナ社製，ＭＴＰ−
３２）を用いて３６５nmの光を照射し４５０nmの蛍光を
測定した。 （３）得られた実測値の結果及び各食品ごとに陰性対照
（０％）陽性対照（１００％）を基準とした場合の実測
値の蛍光強度の比率を比較した結果を表５〜表１０に示
した。
１．０×１０-3mol 含有ＫＳ培地を１．０ml添加し、減
圧乾燥固定してプレートを調製した。 （２）表５〜１０記載の食品１０ｇに１０〜１０2ＣＦ
Ｕ／mlになるように大腸菌群を接種した後、９０ml滅菌
生理食塩水を加え均一になるようにストマッキングし、
その１mlずつを減圧乾燥プレートウエル３ケ所に注加し
た。そのうち対照となる２ケ所のウエルに０．５Ｍグリ
シン緩衝液を１ml注加した後、このプレートを３５℃で
３〜８時間静置培養した。培養後、検査ウエルに０．５
Ｍグリシン緩衝液を１ml注加し更に対照となるウエルの
一方に４−ＭＵを５×１０-5mol ／ｌになるように注加
（陽性対照、４−ＭＵ無添加を陰性対照と仮称）した
後、各プレートを蛍光リーダー（コロナ社製，ＭＴＰ−
３２）を用いて３６５nmの光を照射し４５０nmの蛍光を
測定した。 （３）得られた実測値の結果及び各食品ごとに陰性対照
（０％）陽性対照（１００％）を基準とした場合の実測
値の蛍光強度の比率を比較した結果を表５〜表１０に示
した。
【００３５】
【表５】
【００３６】
【表６】
【００３７】
【表７】
【００３８】
【表８】
【００３９】
【表９】
【００４０】
【表１０】
【００４１】表５〜表１０の結果から、本発明方法によ
れば、蛍光測定をいずれの食品において行った場合にお
いても２点の対照との比率をみることにより蛍光強度の
変化が明瞭にしかも６〜８時間の培養でみられることが
認められた。
れば、蛍光測定をいずれの食品において行った場合にお
いても２点の対照との比率をみることにより蛍光強度の
変化が明瞭にしかも６〜８時間の培養でみられることが
認められた。
【００４２】実施例３ （１）２４穴プレートの各ウエルに、４−ＭＵＧｌｕ
１．０×１０-3mol 含有ＫＳ培地を１．０ml添加し、減
圧乾燥固定してプレートを調製した。 （２）食品１０ｇに１０ＣＦＵ／mlになるように大腸菌
を接種した後、実施例２と同様に試料の調製を行い、培
養後各ウエルの蛍光測定を行った。 （３）得られた実測値の結果及び各食品ごとに陰性対照
（０％）陽性対照（１００％）を基準とした場合の実測
値の蛍光強度の比率を比較した結果を表１１〜表１２に
示した。
１．０×１０-3mol 含有ＫＳ培地を１．０ml添加し、減
圧乾燥固定してプレートを調製した。 （２）食品１０ｇに１０ＣＦＵ／mlになるように大腸菌
を接種した後、実施例２と同様に試料の調製を行い、培
養後各ウエルの蛍光測定を行った。 （３）得られた実測値の結果及び各食品ごとに陰性対照
（０％）陽性対照（１００％）を基準とした場合の実測
値の蛍光強度の比率を比較した結果を表１１〜表１２に
示した。
【００４３】
【表１１】
【００４４】
【表１２】
【００４５】表１１〜表１２の結果から、本発明方法に
よれば、蛍光測定をいずれの食品において行った場合に
おいても２点の対照との比率をみることにより蛍光強度
の変化が明瞭にしかも６時間の培養でみられることが認
められた。
よれば、蛍光測定をいずれの食品において行った場合に
おいても２点の対照との比率をみることにより蛍光強度
の変化が明瞭にしかも６時間の培養でみられることが認
められた。
Claims (3)
- 【請求項１】 検体又は検体の懸濁液を、検出しようと
する微生物が産生する酵素の作用により蛍光物質を遊離
する蛍光基質と培地とを乾燥固定化してなるプレートの
ウエル３ケ所Ａ、Ｂ及びＣに添加し、そのうちウエルＢ
及びウエルＣにアルカリ液を添加した後、当該プレート
上で静置培養後、ウエルＢに蛍光物質を添加し、ウエル
Ａにアルカリ液を添加した後、各ウエルの蛍光物質量を
測定し、ウエルＡの蛍光物質量をウエルＢ及びウエルＣ
のそれと対比することを特徴とする検体中の微生物の検
出方法。 - 【請求項２】 検体又は検体の懸濁液を、検出しようと
する微生物が産生する酵素の作用により蛍光物質を遊離
する蛍光基質と培地とを乾燥固定化してなるプレートの
ウエルＡ及びウエルＣ、培地、当該蛍光基質及び蛍光物
質を乾燥固定化してなるウエルＢにそれぞれ添加し、そ
のうちウエルＢ及びウエルＣにアルカリ液を添加した
後、当該プレート上で静置培養後、ウエルＡにアルカリ
液を添加した後、各ウエルの蛍光物質量を測定し、ウエ
ルＡの蛍光物質量をウエルＢ及びウエルＣのそれと対比
することを特徴とする検体中の微生物の検出方法。 - 【請求項３】 蛍光基質が４−メチル−ウンベリフェリ
ル−β−Ｄ−ガラクトシド又は４−メチル−ウンベリフ
ェリル−β−Ｄ−グルクロニドであり、蛍光物質が４−
メチル−ウンベリフェロンであり、検出しようとする微
生物が大腸菌群又はＥ．ｃｏｌｉである請求項１又は２
記載の検出方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP04151908A JP3142953B2 (ja) | 1992-06-11 | 1992-06-11 | 微生物の迅速検出方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP04151908A JP3142953B2 (ja) | 1992-06-11 | 1992-06-11 | 微生物の迅速検出方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05336993A true JPH05336993A (ja) | 1993-12-21 |
| JP3142953B2 JP3142953B2 (ja) | 2001-03-07 |
Family
ID=15528826
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP04151908A Expired - Lifetime JP3142953B2 (ja) | 1992-06-11 | 1992-06-11 | 微生物の迅速検出方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3142953B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB2386946A (en) * | 2002-03-27 | 2003-10-01 | Danisco | Detecting microorganisms |
-
1992
- 1992-06-11 JP JP04151908A patent/JP3142953B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB2386946A (en) * | 2002-03-27 | 2003-10-01 | Danisco | Detecting microorganisms |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3142953B2 (ja) | 2001-03-07 |
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