JPH05301043A - 低比重リポ蛋白吸着材 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 血液を直接潅流することによって血液の凝
固、血球成分の破壊、減少等の弊害を及ぼすことのない
血液適合性を有し、血中の低比重リポタンパクおよび
（または）極低比重リポタンパクを選択的、簡便、かつ
効果的に吸着することのできる吸着能、吸着特性を備え
た低比重リポタンパク吸着材を提供する。 【構成】 水不溶性固体表面に、Ｎ−スルホキトサンを
スルホン酸含量が５０μｅｑ／ｍｌから２．０ｍｅｑ／
ｍｌ（湿潤状態）となるよう固定し、これによって血中
の低比重リポタンパクおよび（または）極低比重リポタ
ンパクを除去することを特徴とする低比重リポタンパク
吸着材。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は動脈硬化、高脂血症の病
因物質である低比重リポ蛋白（以下ＬＤＬと略記する）
および（または）極低比重リポ蛋白（以下ＶＬＤＬと略
記する）を吸着除去し、疾病を治療することを目的と
し、血液もしくは血液成分を接触させることによって血
中のＬＤＬおよび（または）ＶＬＤＬを吸着する低比重
リポ蛋白吸着材に関するものである。本発明において、
Ｎ−スルホキトサンとは、下記化１の要部構造を有する
化合物を指す。

【０００２】

【化１】

【０００３】また、本発明において、−ＮＨＳＯ₃Ｈも
しくはこの塩をいずれもスルファミノ基と呼ぶ。

【０００４】

【従来の技術】動脈硬化の原因となる高脂血症の治療に
は各種薬剤の使用が行われているが、一般に副作用の危
険性があり、使用量、使用期間などに細心の注意を払う
必要がある。また、正常値の数倍のＬＤＬおよび（また
は）ＶＬＤＬ値を示し、最も重篤な症状を招く危険性の
ある家族性高脂血症（ＦＨ）では薬剤の効果が充分に期
待できない場合も多い。

【０００５】他の治療方法としては血漿交換法が有効と
され、広く行われている。しかしながら、この療法では
血漿をすべて交換するため、（１）不要成分のみなら
ず、必要な成分までも除去されてしまうこと、（２）除
去した血漿に替えて体内に補充される血漿、あるいは血
漿製剤が不足しているため、大量かつ持続的な入手が困
難であること、（３）血清肝炎やアレルギー、さらには
ＡＩＤＳ（後天性免疫不全症候群）感染の危険性がある
こと、など血漿交換法が内含する問題は多い。

【０００６】このような問題を解決できる治療法として
は、自己の血液を浄化した後に再輪注する方法、すなわ
ち、体外循環血液浄化法が望ましいとされる。この方法
を採るにあたり、副作用がなく、自己の血液から病因物
質を充分且つ選択的に除去することのできる浄化材及び
血液浄化療法が望まれていた。

【０００７】こういった状況を背景として、近年、ＬＤ
Ｌおよび（または）ＶＬＤＬの吸着除去による療法が一
般的になってきた。このような方法は例えば、アガロー
スゲルにヘパリンを固定した吸着材（Ｓ．Ｍｏｏｒｊａ
ｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ．，
７７（１９７７）２１−３０）などが知られているが、
この材料は吸着能力が充分でなく、機械的強度について
も充分とは言い難い。また、抗体等を固定した免疫吸着
体を利用してＬＤＬおよび（または）ＶＬＤＬの吸着除
去を行う試みがなされているが、吸着選択性、吸着能力
の面では満足できるものの、抗体の入手が困難で高価で
あるという欠点がある。

【０００８】このような問題点を改善する目的で供せら
れた吸着材には、有害成分と親和性をもつ素材（シリカ
など）を多孔化したもの（特開昭５９−１３９９３５，
特開昭６３−１６０６６９など）、有害成分と親和性を
有する化合物（リガンド：スルホン酸基，カルボキシル
基など）を固定したものがある。後者はいわゆるアフィ
ニティー吸着材と呼ばれるもので、さらに次のふたつに
大別できる。 （１）不溶性担体にリガンドとしてポリアニオンを固定
したもの（特公昭６２−５９９７５，特開平１−１４５
０７１，リガンドをデキストラン硫酸に限定：特公平３
−５８２２，リガンドをヘパリンに限定：特開昭５９−
１３９９３７など） （２）不溶性担体にリガンドとしてスルホン酸基および
（または）カルボキシル基をもつ単量体を固定したもの
（特公平２−５１３４６，特開昭５８−２７５５９な
ど）

【０００９】アフィニティー吸着材に用いられるリガン
ドは比較的安価で、選択性、吸着能力も比較的満足でき
るレベルにあるが、これらの吸着材は血液適合性に乏し
いため、多量のヘパリンの添加が必要となり、出血傾向
等の副作用が生じる可能性を残している。このような点
から、さらに高い効率及び特異性で病因物質を除去する
ことができ、また体液に対する悪影響の少ない浄化材が
望まれている。

【００１０】ＬＤＬおよび（または）ＶＬＤＬ以外の物
質を吸着する吸着材に目を向けてみると、例えば、特開
平１−１５８９７０という特許にはこのような概念に基
づいて開発された血液浄化材について開示されている。
この特許によって開示されている血液浄化材は、重合度
１〜９０のエチレンオキサイド骨格を有する親水性スペ
ーサーを介して、リガンドとなる低分子有機化合物を水
不溶性多孔質固体表面に固定し、これに直接血液を潅流
して免疫グロブリンを吸着することを特徴としている。

【００１１】親水性スペーサーの持つ意義は大きく二つ
に分けることができる。第一に、血液中の血球成分や、
被吸着物質でないタンパクの付着を防止することであ
る。親水性スペーサーはその周辺に水を吸着している。
このため吸着材表面は水の層に覆われ、この水の層が血
球成分の付着を防いでいる（排除体積効果）。また、水
の層を形成するスペーサーが運動することにより、さら
に血球成分の付着は困難になり、付着した血球成分は脱
離しやすくなる。また、凝固因子や補体の活性化が抑制
されるといった利点を有する。

【００１２】第二に、リガンドの運動性を上昇させるこ
とによって吸着能の向上が期待できるということであ
る。特に被吸着物質が巨大分子である場合、リガンドを
担体表面に直接固定しただけでは被吸着物質とリガンド
の接近が困難であり、また一部で結合したとしても結合
サイトの数が充分ではなく、容易に脱着してしまう可能
性が大きい。親水性スペーサーを介在させることによっ
て被吸着物質とリガンドとの接近が促進され、またリガ
ンドの動きに融通性があるため周囲のリガンドが被吸着
物質との結合に参与しやすく、このため結合サイトの多
い強固な結合を生成することができる。

【００１３】特開平１−１５８９７０では、重合度１〜
９０のエチレンオキサイド骨格を有する親水性スペーサ
ーを介在させているが、重合度が９０までのエチレンオ
キサイド骨格を有する親水性スペーサーを導入しただけ
では、充分な血液適合性を実現するのは困難であり、特
開平１−１５８９７０においても血液適合性向上のため
アクリル酸誘導体のコーティングを行っている。このよ
うな操作は煩雑であるばかりでなく、毒性をもった物質
の溶出を招く可能性も存在する。

【００１４】

【発明が解決しようとする課題】本発明は上記従来技術
の欠点を解決し、リガンドの効果を充分に引き出して、
良好な吸着能、吸着特性を有し、コーティング等の煩雑
な操作を省略してなお充分な血液適合性を持った血液浄
化吸着材を提供することにより、副作用がなく、自己の
血液からＬＤＬおよび（または）ＶＬＤＬを充分且つ選
択的に除去することのできる効果的な吸着材を提供しよ
うとしたものである。

【００１５】

【課題を解決するための手段】本発明の低比重リポタン
パク吸着材は、水不溶性固体に親水性スペーサーを介し
てＮ−スルホキトサンを、スルファミノ基由来の酸含量
が５０μｅｑ／ｍｌ（湿潤状態）〜２．０ｍｅｑ／ｍｌ
（湿潤状態）となるよう固定し、これによって血中のＬ
ＤＬおよび（または）ＶＬＤＬ除去することを特徴とす
るものである。本発明の低比重リポタンパク吸着材に用
いられる親水性スペーサーは」、炭素数１〜４の繰り返
し単位から成り、重合度が５〜４００のポリアルキレン
オキサイド骨格を有することを特徴とする。このような
親水性スペーサーとしては、例えばポリエチレングリコ
ール、ポリプロピレングリコール、ポリテトレメチレン
グリコールなどの骨格を有する化合物が挙げられる。本
発明に用いられる親水性スペーサーはここに例示した化
合物のように非イオン性であることが好ましい。

【００１６】本発明の低比重リポタンパク吸着材は、水
不溶性固体がポリスチレン、架橋ポリビニルアルコー
ル、ポリメタクリル酸およびその誘導体或いはこれらの
共重合体などの合成有機高分子化合物、セルロース、キ
チン、キトサン等の天然有機高分子化合物、またはアシ
ルセルロース、アシルキチン等の改質天然有機高分子化
合物であることが好ましい。これらの高分子化合物のう
ち、機械的強度、リガンド導入の容易さを考慮すると、
適度に架橋したポリスチレン、ポリメタクリル酸および
その誘導体或いはこれらの共重合体、セルロースが望ま
しく、さらに好ましくはセルロースが望ましい。

【００１７】本発明に用いられるＮ−スルホキトサンは
ゲルパーミエイションクロマトグラフィー（以下ＧＰＣ
と略記する）によるポリエチレングリコール（以下ＰＥ
Ｇと略記する）換算で分子量１０００〜２００００が望
ましく、好ましくは２０００〜１００００、さらに好ま
しくは２５００〜６０００が望ましい。これよりも分子
量が小さいと血液適合性、吸着性能とも充分に得られ
ず、これよりも大きいと導入率が低下する傾向にあり、
性能の向上は望めない。

【００１８】本発明でのＮ−スルホキトサン導入は、キ
トサンを水不溶性固体に導入した後アミノ基をスルホン
化する方法、あらかじめアミノ基をスルホン化したキト
サンを水不溶性固体に導入する方法、いずれも用いられ
得る。前者を採用する場合、Ｎ−スルホキトサンに含ま
れるアミノ基のスルホン化率は３０％以上、好ましくは
５０％以上、さらに好ましくは７０％以上が望ましい。
後者を採用する場合、Ｎ−スルホキトサンのスルホン化
率は３０％以上、好ましくは５０％以上、さらに好まし
くは７０％以上が望ましいが、キトサンのアミノ基が全
てスルホン化されてしまうと（スルホン化率１００
％）、残存のアミノ基を利用して［水不溶性固体］−
［親水性スペーサー］に化学結合で導入することが不可
能になるので好ましくない。しかしながら、残存アミノ
基が大量に存在するとＬＤＬ吸着に好ましくない影響を
与える可能性があるので、水不溶性固体への固定が終了
した時点での残存アミノ基が全体の１０％以下であるこ
とが望ましい。これを超える量の残存アミノ基が存在す
る場合、無水酢酸、無水コハク酸、１，３−プロパンス
ルトンなどによってブロックすることが推奨される。本
発明でのキトサンのＮ−スルホン化にはクロロスルホン
酸、濃硫酸、発煙硫酸、三酸化硫黄／ジメチルホルムア
ミド錯体、三酸化硫黄／ピリジン錯体などが用いられ得
るが、このなかで、三酸化硫黄／ピリジン錯体が好まし
い。他の試薬を用いた場合、水酸基までもスルホン化さ
れてしまう。なお、上記スルホン化率は、スルホン化前
後のキトサンに含まれるアミノ基を滴定する方法、もし
くは元素分析で窒素と硫黄の含量を定量することによっ
て測定することができる。

【００１９】本発明のＮ−スルホキトサンはＬＤＬおよ
び（または）ＶＬＤＬとの親和性によってこれを吸着除
去するリガンドとしてだけではなく、上記の特開平１−
１５８９７０で開示されている親水性スペーサーとして
の働きをも有している。水不溶性固体表面の比較的近傍
のＮ−スルホキトサン鎖は主に親水性スペーサーとして
血液適合性の向上およびリガンドの運動性向上に貢献
し、水不溶性固体表面から遠距離にあるＮ−スルホキト
サンはリガンドとしてＬＤＬおよび（または）ＶＬＤＬ
の吸着除去の役割を有する。しかしながら、親水性スペ
ーサーとしてのＮ−スルホキトサン鎖の効果は充分であ
るとは言い難く、より良好な吸着性能、血液適合性を実
現するには非イオン性の親水性スペーサーを介在させる
必要がある。

【００２０】さらに、水不溶性固体に直接ポリアニオン
を導入した場合においては導入法のいかんに関わらず、
ポリアニオンが水不溶性固体に多数の結合点で固定され
る可能性が大きく、ＬＤＬおよび（または）ＶＬＤＬ吸
着の際にポリアニオンの効果が充分に発揮されないとい
う欠点を有する。このようなことから、より良好な吸着
性能、血液適合性を実現するには非イオン性の親水性ス
ペーサーを介在させる必要がある。

【００２１】また、Ｎ−スルホキトサンは抗凝血剤とし
てよく知られているヘパリンの機能を示す類似物（ヘパ
リノイド）としての働きも有する。ヘパリンの基本骨格
はＤ−グルコサミンとＤ−グルクロン酸であり、このア
ミノ基と一部の水酸基がスルホン化された構造を持って
いる。ヘパリノイドとしては現在までにセルロース、ア
ミロース、デキストランなどの基本骨格にスルホン酸基
を導入したものが報告されているが、キトサンはこれら
の多糖類とは異なり、Ｄ−グルコサミンを基本骨格とし
ているので、そのＮ−スルホン化物はヘパリノイドとし
てより大きな効果が期待できる。したがって、特開平１
−１５８９７０ではいまだ不十分であった血液適合性の
実現が可能となる。

【００２２】このようなヘパリノイドの抗凝血性を議論
する際に忘れてならないのが、毒性であるが、本発明に
おいてはＮ−スルホキトサンを水不溶性固体表面に固定
しているため、抗凝血剤として直接投与する場合に比べ
てその危険性は極端に減少する。また、毒性はＮ−スル
ホキトサンの鎖長、分子量にも大きく影響を受ける。前
に記載したような範囲の分子量のＮ−スルホキトサンを
水不溶性固体表面上に固定した場合、万一Ｎ−スルホキ
トサンが脱離して血中に遊離しても、重篤な副作用を招
く恐れは小さい。

【００２３】本発明に使用される水不溶性固体の形状
は、粒子状、繊維状、膜状等いずれの公知の形状も用い
られ得るが、通液性、表面積確保、吸着材調製時の取扱
いの容易さなどの点から、粒子状もしくは繊維状が望ま
しい。粒子状担体の平均粒径は１０μｍから５ｍｍの範
囲にあることが望ましいが、粒径が小さくなると血球の
流通抵抗が大きくなり、粒径が大きくなると担体充填量
の減少、ひいては有効表面積の減少を招くので、平均粒
径３０μｍから１ｍｍの範囲にあることが望ましい。さ
らに好ましくは平均粒径５０μｍから５００μｍが望ま
しい。粒子形状については、細胞に損傷を与えにくいこ
とや、物理的外力に対する強度、さらに調製の容易さか
ら、球状であることが望ましい。同じ理由から、繊維状
担体の繊維直径は０．１μｍから５０μｍ、好ましくは
０．３μｍから２５μｍが望ましく、さらに好ましくは
０．５μｍから１５μｍが望ましい。

【００２４】担体表面には有効表面積を拡大するため微
小孔が存在することが好ましい。その平均孔径は粒子状
担体の場合、２０Åから２００００Å、好ましくは１０
０Åから１５０００Å、更に好ましくは１０００Åから
１２０００Å、繊維状担体の場合２０Åから３０００
Å、好ましくは１００Åから２０００Åである。これよ
り平均孔径が小さいと被吸着物質が微小孔内部まで到達
できず、これより大きいと有効表面積を拡大する効果が
不十分であり、また担体の強度低下を招く恐れがある。

【００２５】本発明に使用される水不溶性固体への親水
性スペーサー、およびＮ−スルホキトサンの導入の方法
は共有結合、電子線照射によるグラフト化など、特に制
限されないが、［セルロース］−［親水性スペーサー］
−［Ｎ−スルホキトサン］を得る場合、以下のような方
法が利用され得る。 セルロースに親水性スペーサーを介してキトサンを導
入した後、このキトサンのアミノ基をスルホン化する方
法 （１）セルロースの改質 過沃素酸ナトリウムを０．１規定から５．０規定好まし
くは０．５規定から１．５規定の硫酸に溶解した溶液
に、平均粒径２０μｍから２００μｍ、好ましくは３０
μｍから７０μｍ、平均孔径５００Åから１００００
Å、好ましくは１０００Åから８０００Åの粒状多孔質
セルロースを添加し、１０℃から５０℃、好ましくは２
０℃から３０℃で、５時間から３０時間、好ましくは１
０時間から２４時間反応させる。上記過沃素酸ナトリウ
ム−硫酸溶液の過沃素酸ナトリウム濃度は０．５重量％
から１５重量％、好ましくは１．０重量％から１０重量
％である。また、上記粒状多孔質セルロースの過沃素酸
ナトリウム溶液への浴比は１０容量％から５０容量％、
好ましくは１５容量％から３５容量％である。この反応
混合物を濾過して生成物を回収し、充分に水洗して、膨
潤状態でアルデヒド含量０．０１０ｍｅｑ／ｍｌから
２．００ｍｅｑ／ｍｌ、好ましくは０．０５０ｍｅｑ／
ｍｌから１．５０ｍｅｑ／ｍｌのアルデヒドセルロース
を得る。このアルデヒドセルロースは下記化２にその要
部構造を示すように、一部のグルコースユニットが開環
した構造をしている。

【００２６】

【化２】

【００２７】（２）親水性スペーサーの導入 分子量３００〜８０００、好ましくは４００〜７００
０、さらに好ましくは１０００〜６５００の両末端にア
ミノ基を有するポリエチレングリコール（以下ＰＥＯア
ミンと略記する）をｐＨ９．５の緩衝液に溶解させてお
き、これに上記（１）で得たアルデヒドセルロースを
添加して撹拌しながら１０℃から５０℃好ましくは２０
℃から３０℃で、５時間から３０時間、好ましくは１０
時間から２４時間反応させる。上記ＰＥＯアミン緩衝液
の濃度は５重量％から６０重量％、好ましくは１０重量
％から４０重量％、この溶液へのアルデヒドセルロース
の浴比は１容量％から２０容量％、好ましくは３容量％
から１５容量％である。この反応混合物を濾過して生成
物を回収、水洗し、これをｐＨ９．０の緩衝液に分散さ
せ、水素化ホウ素ナトリウムを添加して１０℃から５０
℃好ましくは２０℃から３０℃で、５時間から３０時
間、好ましくは１０時間から２４時間反応させてシッフ
塩基の水素添加を行う。含シッフ塩基［セルロース］−
［ＰＥＯアミン］の緩衝液への浴比は１容量％から２０
容量％、好ましくは３容量％から１５容量％、含シッフ
塩基［セルロース］−［ＰＥＯアミン］と水素化ホウ素
ナトリウムの仕込比は２０／１から３／２、好ましくは
１５／１から３／１（いずれも容量／重量比）である。
こうしてアミノ基含量０．０１０から２．５０ｍｅｑ／
ｍｌ、好ましくは０．０５０から１．５０ｍｅｑ／ｍｌ
の［セルロース］−［ＰＥＯアミン］を得る。ここで用
いたＰＥＯアミンとは下記化３の構造を有する

【００２８】

【化３】 化３においてはｎが５−４００のものである。

【００２９】（３）キトサンの導入 上記（２）で得た［セルロース］−［ＰＥＯアミン］
をｐＨ９．５の緩衝液に分散させておき、これにグルタ
ルアルデヒドを添加して撹拌しながら１０℃から５０℃
好ましくは２０℃から３０℃で、５時間から３０時間、
好ましくは１０時間から２４時間反応させる。上記緩衝
液への［セルロース］−［ＰＥＯアミン］の浴比は３容
量％から２０容量％、好ましくは５容量％から１５容量
％、グルタルアルデヒドの添加量は濃度が０．０５重量
％から５．０重量％、好ましくは０．１重量％から３．
０重量％となることが望ましく、［セルロース］−［Ｐ
ＥＯアミン］由来のアミノ基に対して過剰量が加えられ
ることが必要である。こうして［セルロース］−［ＰＥ
Ｏアミン］−［グルタルアルデヒド］を得る。この反応
混合物を濾過して生成物を回収、水洗し、これをｐＨ
９．５の緩衝液に分散させ、ＧＰＣでＰＥＧ換算の分子
量１０００〜２００００、好ましくは２０００〜１００
００、さらに好ましくは２５００〜６０００のキトサン
を加えてｐＨを調整した後、１０℃から５０℃好ましく
は２０℃から３０℃で、５時間から３０時間、好ましく
は１０時間から２４時間反応させる。上記緩衝液への
［セルロース］−［ＰＥＯアミン］−［グルタルアルデ
ヒド］の浴比は３容量％から２０容量％、好ましくは５
容量％から１５容量％、キトサンの添加量は濃度が１．
５重量％から６０重量％、好ましくは１０重量％から４
０重量％となることが望ましく、［セルロース］−［Ｐ
ＥＯアミン］−［グルタルアルデヒド］由来のアルデヒ
ド基に対して過剰量が加えられることが必要である。こ
の反応混合物を濾過して生成物を回収、水洗し、これを
ｐＨ９．０の緩衝液に分散させ、水素化ホウ素ナトリウ
ムを添加して１０℃から５０℃好ましくは２０℃から３
０℃で、５時間から３０時間、好ましくは１０時間から
２４時間反応させてシッフ塩基の水素添加を行う。含シ
ッフ塩基［セルロース］−［ＰＥＯアミン］−［キトサ
ン］の緩衝液への浴比は３容量％から２０容量％、好ま
しくは５容量％から１５容量％、含シッフ塩基［セルロ
ース］−［ＰＥＯアミン］−［キトサン］と水素化ホウ
素ナトリウムの仕込比は２０／１から３／２、好ましく
は１５／１から３／１（いずれも容量／重量比）であ
る。こうしてアミノ基含量０．０１０から２．５０ｍｅ
ｑ／ｍｌ、好ましくは０．０５０から２．００ｍｅｑ／
ｍｌの［セルロース］−［ＰＥＯアミン］−［キトサ
ン］を得る。

【００３０】（４）キトサンのＮ−スルホン化 上記（２）で得た［セルロース］−［ＰＥＯアミン］−
［キトサン］にｐＨ９．５の緩衝液を１／３から１／１
２好ましくは１／５から１／１０の容量比となるよう加
えて分散させ、三酸化硫黄／ピリジン錯体を少量ずつ加
えてゆき、濃度が１０重量％から５０重量％、好ましく
は２０重量％から４０重量％の水酸化ナトリウム水溶液
を加えて反応溶液のｐＨを９〜１０に保つよう調整しな
がら、１０℃から５０℃好ましくは２０℃から３０℃
で、０．５時間から１２時間、好ましくは１時間から８
時間反応させる。反応混合物から生成物を回収、洗浄水
がｐＨ７．０になるまで充分に洗浄して［セルロース］
−［ＰＥＯアミン］−［Ｎ−スルホキトサン］を得る。
［セルロース］−［ＰＥＯアミン］−［キトサン］／緩
衝液懸濁液と、三酸化硫黄／ピリジン錯体の仕込比は５
／１から３０／１、好ましくは１０／１から２５／１
（いずれも容量／重量比）である。

【００３１】あらかじめアミノ基をスルホン化したキ
トサンを水不溶性固体表面に導入する方法 （１）キトサンのＮ−スルホン化 ＧＰＣによるＰＥＧ換算で分子量１０００〜２０００
０、好ましくは２０００〜１００００、さらに好ましく
は２５００〜６０００のキトサンにｐＨ９．５の炭酸緩
衝液を１／３から１／１２好ましくは１／５から１／１
０の容量比となるよう加えて溶解させ、三酸化硫黄／ピ
リジン錯体を少量ずつ加えてゆき、濃度が１０重量％か
ら５０重量％、好ましくは２０重量％から４０重量％の
水酸化ナトリウム水溶液を加えて反応溶液のｐＨを９〜
１０に保つよう調整しながら、１０℃から５０℃好まし
くは２０℃から３０℃で、０．５時間から１２時間、好
ましくは１時間から８時間反応させる。こうして得られ
たＮ-スルホキトサンのスルホン化率３０％から９９
％、好ましくは５０％から９５％、さらに好ましくは７
０％から９５％である。この反応混合物はそのまま［セ
ルロース］−［ＰＥＯアミン］への導入反応に使用でき
るが、充分な精製を要する場合は、反応混合物を約１／
３の容量に濃縮した後、セルロース半透膜に入れて蒸留
水で透析することにより低分子量の不純物を除去し、こ
れを濃縮乾固させればよい。キトサンと三酸化硫黄／ピ
リジン錯体の仕込比は１／３から１０／１、好ましくは
２／３から５／１（いずれも重量比）である。

【００３２】（２）Ｎ−スルホキトサンの導入 上記（１）で得たＮ−スルホキトサンを、上記
（２）の方法で得た［セルロース］−［ＰＥＯアミン］
に、上記（３）と同様の方法で固定することによって
［セルロース］−［ＰＥＯアミン］−［Ｎ−スルホＰＥ
Ｉ］を得る。

【００３３】例えば上記の様な方法で、粒子状もしくは
繊維状の［水不溶性固体］−［親水性スペーサー］−
［Ｎ−スルホキトサン］を得た後、これを適当な容器に
充填することによって本発明の血液浄化吸着材が得られ
る。容器の材質はガラス、ステンレス、ポリエチレン、
ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポ
リメチルメタクリレート等、特に制限されないが、滅菌
等の取扱いを考慮すると、ポリプロピレンやポリカーボ
ネートが好ましい。容器の形態についても特に制限され
ないが、粒子状担体の場合は両端を血液流入部、血液流
出部とした円筒のカラム型、繊維状担体の場合は粒子状
担体の場合と同様のカラム型、或いはシート状に成形し
た後、これを挟み込むような形態にしたものが適当であ
ろう。

【００３４】

【実施例】以下、実施例を用いて本発明を説明する。実
施例中の部は、特に注釈を加えない場合は重量部を意味
する。 〈実施例１〉粒状多孔質セルロース（平均粒径５０μ
ｍ、平均孔径５０００Å）１０００部（容量）を、過沃
素酸ナトリウム１２５部を１規定−硫酸４０００部に溶
解した溶液に添加し、２５℃で１８時間反応させた後、
濾別、水洗し、アルデヒド含量１．０２ｍｅｑ／ｍｌの
アルデヒドセルロース（ＣＡ−１）を得た。アルデヒド
の定量はオキシム法によって行った。すなわち、ＣＡ−
１約１．０ｍｌを正確に秤量し（この量をＶ₁ｍｌとす
る）、これに０．５規定塩酸ヒドロキシルアミン溶液
（塩酸ヒドロキシルアミン３５ｇを水１６０ｍｌに溶か
し、９５％エタノールで希釈して１ｌとしたもの）１０
ｍｌ、ピリジンブロムフェノールブルー溶液（４％ブロ
ムフェノールブルー０．２５ｍｌとピリジン２０ｍｌの
混合液を９５％エタノールに希釈して１ｌとしたもの）
３５ｍｌを加えた。この懸濁液（以下サンプルと呼ぶ）
を、ＣＡ−１を入れずに０．５規定塩酸ヒドロキシルア
ミン溶液１０ｍｌとピリジンブロムフェノールブルー溶
液３５ｍｌを加えたもの（以下ブランクと呼ぶ）と併せ
て超音波洗浄器内に１５分間放置した。サンプルとブラ
ンクを取り出し、サンプルの呈する色がブランクと同じ
になるまで０．１規定水酸化ナトリウム−メタノール溶
液を滴下した。この際滴下した水酸化ナトリウム量をＷ
₁ｍｌ、力価をＦ₁とすると、アルデヒド含量ｘ₁ｍｅｑ
／ｇは次式によって得られる。 ｘ₁＝（０．１×Ｆ₁×Ｗ₁）／Ｖ₁

【００３５】分子量４５００のＰＥＯアミンを４００部
取ってｐＨ９．５の炭酸緩衝液１２００部（容量）に溶
解し、これに上記で得たＣＡ−１を１００部（容量）加
え、２５℃で１８時間撹拌して反応させた。この反応混
合物を濾過して生成物を回収、水洗し、アミノ基含量
０．９７ｍｅｑ／ｇの［セルロース］−［ＰＥＯアミ
ン］（ＣＰＥＡ−１）を得た。アミノ基の定量は以下の
方法によって行った。ＣＰＥＡ−１約０．１ｍｌを正確
に秤量し（この量をＶ₂ｇとする）、０．１規定塩酸水
溶液１０ｍｌ（力価をＦ₂とする）を加え、この懸濁液
をジオキサンで希釈して全量で４０ｍｌにする（この懸
濁液を以下サンプルと呼ぶ）。サンプルを約３０分撹拌
した後、自動滴定装置（平沼産業製ＣＯＭＴＩＴＥ１０
１）を用いて０．１規定水酸化ナトリウム水溶液（力価
をＦ₂'とする）で滴定を行う。サンプルを中和するまで
に要した０．１規定水酸化ナトリウム水溶液の量をＷ₂
ｍｌとすると、ＣＣ−１のアミノ基含量ｘ₂ｍｅｑ／ｇ
は次式によって得られる。 Ｖ₂×ｘ₂＋０．１×Ｆ₂’×Ｗ₂＝０．１×Ｆ₂×１０

【００３６】上記で得たＣＰＥＡ−１を１００部（容
量）取ってｐＨ９．５の炭酸緩衝液１２００部（容量）
に懸濁させておき、これにグルタルアルデヒド６０％水
溶液１００部を添加して、２５℃で１８時間撹拌して反
応させた。濾過によって回収、水洗した生成物をｐＨ
９．５炭酸緩衝液２０００部（容量）に懸濁させ、これ
に、ＧＰＣ（島津製作所製Ｃ−Ｒ４Ａ）によるＰＥＧ換
算で分子量約５０００のキトサン３０部を添加して撹拌
しながら２５℃で、１８時間反応させた。この反応混合
物を濾過して生成物を回収、水洗し、これをｐＨ９．０
の炭酸緩衝液１５００部（容量）に分散させ、水素化ホ
ウ素ナトリウム３０部を添加して２５℃で、１８時間反
応させてシッフ塩基の水素添加を行った。こうしてキト
サン由来のアミノ基含量０．９４ｍｅｑ／ｍｌの［セル
ロース］−［ＰＥＯアミン］−［キトサン］（ＣＰＥＡ
Ｃ−１）を得た。アミノ基の定量は上記と同様の方法に
よって行った。

【００３７】上記で得たＣＰＥＡＣ−１を１００部（容
量）取ってｐＨ９．５の炭酸緩衝液８５０部（容量）に
分散させ、３０重量％水酸化ナトリウム水溶液を少量ず
つ添加し、ｐＨを９〜１０に調整しながら三酸化硫黄／
ピリジン錯体５０部を２５℃で、少量ずつ４時間かけて
加えてゆき、２５℃でさらに１時間撹拌した。ここで要
した水酸化ナトリウム水溶液は３４部（容量）であっ
た。反応混合物を回収、洗浄水がｐＨ７．０になるまで
充分にイオン交換水で洗浄して［セルロース］−［ＰＥ
Ｏアミン］−［Ｎ−スルホキトサン］（ＣＰＥＡＳＣ−
１）を得た。このＣＰＥＡＳＣ−１は、Ｎ−スルホキト
サンのスルファミノ基由来の酸含量が０．９２ｍｅｑ／
ｍｌであった。酸含量の定量は以下の方法によって行っ
た。ＣＰＥＡＳＣ−１をＮ／１０過塩素酸水溶液で洗浄
した後、イオン交換水で洗浄水がｐＨ７．０になるまで
充分に洗浄し、これを上記でＣＰＥＡ−１を定量したの
と同様の方法で、０．１規定塩酸水溶液を０．１規定水
酸化ナトリウム水溶液に、０．１規定水酸化ナトリウム
水溶液を０．１規定過塩素酸−ジオキサン溶液にそれぞ
れ替えて測定することによって定量した。

【００３８】上記で得たＣＰＥＡＳＣ-１を１００ｍｌ
のカラムに充填し、１００Ｕ／ｍｌのヘパリンを含む生
理食塩液１００ｍｌ、続いて１Ｕ／ｍｌのヘパリンを含
む生理食塩液１００ｍｌでカラム内、および血液回路内
を洗浄した。一方、クエン酸加豚血１ｌをビーカーにと
り、カラムを通して再びこのビーカーに戻すよう血液回
路を組んだ。この装置を用いて血液流量５０ｍｌ／ｍｉ
ｎで潅流実験を３時間連続して行い、カラム前後の血中
ＬＤＬの量を測定した。また、潅流開始前後の全血液中
のアルブミン量、総蛋白量、血小板量を測定した。ＬＤ
Ｌの定量は和光純薬製β−リポ蛋白Ｃ−テストワコーを
用いてヘパリン沈澱・比色法によって行った。アルブミ
ン量はブロムクレゾールグリーン法、総蛋白量はビウレ
ット法、血小板量は自動血球算定装置を用いて定量し
た。結果は表１、表２に示した。なお、ＬＤＬの量は実
際の測定値、アルブミン、総蛋白、血小板については残
存率で表示した。単位は（ｍｇ／ｄｌ）であるが、血小
板については（個／ｄｌ）を用いた。

【００３９】

【表１】

【００４０】

【表２】

【００４１】〈実施例２〉ＧＰＣ（島津製作所製Ｃ−Ｒ
４Ａ）によるＰＥＧ換算で分子量約５０００のキトサン
１００部をｐＨ９．５の炭酸緩衝液９００部（容量）に
溶解させておき、これに３０重量％の水酸化ナトリウム
水溶液を少量ずつ添加してｐＨを９〜１０に調整しなが
ら、三酸化硫黄／ピリジン錯体９０部を２５℃で少量ず
つ５時間かけて加えてゆき、２５℃でさらに１時間撹拌
した。ここで要した水酸化ナトリウム水溶液は９１部
（容量）であった。反応溶液を炭酸ナトリウムと炭酸水
素ナトリウムでｐＨを９．５に調整し、Ｎ−スルホキト
サン（ＳＣ−２）溶液を得た。

【００４２】実施例１で得たＣＰＥＡ−１を１００部
（容量）取ってｐＨ９．５の炭酸緩衝液１５００部（容
量）に懸濁させておき、これにグルタルアルデヒド６０
％水溶液１００部を添加して、２５℃で１８時間撹拌し
て反応させた。濾過によって回収、水洗した生成物をｐ
Ｈ９．５炭酸緩衝液１８４０部（容量）に懸濁させ、こ
れに、上記で得たＳＣ−を１６０部（容量）添加して撹
拌しながら２５℃で、１８時間反応させた。この反応混
合物を濾過して生成物を回収、水洗し、これをｐＨ９．
０の炭酸緩衝液１５００部（容量）に分散させ、水素化
ホウ素ナトリウム３０部を添加して２５℃で、１８時間
反応させてシッフ塩基の水素添加を行った。こうしてＮ
−スルホキトサンに含まれるスルファミノ基由来の酸含
量０．９０ｍｅｑ／ｍｌの［セルロース］−［ＰＥＯア
ミン］−［Ｎ−スルホキトサン］（ＣＰＥＡＳＣ−２）
を得た。酸含量の定量は実施例１と同様の方法で行っ
た。

【００４３】上記［セルロース］−［ＰＥＯアミン］−
［Ｎ−スルホキトサン］（ＣＰＥＡＳＣ−２）を用いて
実施例１と同様に血液潅流実験を行い、カラム前後の血
中ＬＤＬ量、潅流開始前後の全血液中のアルブミン量、
総蛋白量、血小板量を測定した。結果は表１、表２に示
す。

【００４４】〈比較例１〉分子量４０００のポリアクリ
ル酸６００部をｐＨ４．５のクエン酸緩衝液２５００部
（容量）に溶解させ、Ｎ−シクロヘキシル−Ｎ'-（２−
モルホリノエチル）カルボジイミド−メト−ｐ−トルエ
ンスルホン酸塩（以下ＣＭＥＣと略記する）６３部を添
加し、０℃で２０分撹拌した。これに実施例１で得たＣ
ＰＥＡ−１を１００部（容量）加えて、０℃から徐々に
反応温度を室温まで上昇させ、１８時間撹拌して反応さ
せた。生成物を濾過によって回収し、３％水酸化ナトリ
ウム水溶液、続いてイオン交換水で充分に洗浄し、ポリ
アクリル酸のカルボキシル基由来の酸含量１．２４ｍｅ
ｑ／ｍｌの［セルロース］−［ＰＥＯアミン］−［ポリ
アクリル酸］ （ＣＰＥＡＰＡ−３）を得た。酸含量は実施例と同様の
方法で定量した。

【００４５】上記［セルロース］−［ＰＥＯアミン］−
［ポリアクリル酸］（ＣＰＥＡＰＡ−３）を用いて実施
例１と同様に血液潅流実験を行い、カラム前後の血中Ｌ
ＤＬ量、潅流開始前後の全血液中のアルブミン量、総蛋
白量、血小板量を測定した。結果は表１、表２に示す。

【００４６】〈比較例２〉実施例１で得たＣＰＥＡ−１
を１００部（容量）取ってｐＨ９．５の炭酸緩衝液１５
００部（容量）に懸濁させておき、これにグルタルアル
デヒド６０％水溶液１００部を添加して、２５℃で１８
時間撹拌して反応させた。濾過によって回収、水洗した
生成物をｐＨ９．５炭酸緩衝液１５００部（容量）に懸
濁させ、これに、タウリン２５部を添加して撹拌しなが
ら２５℃で、１８時間反応させた。この反応混合物を濾
過して生成物を回収、水洗し、これをｐＨ９．０の炭酸
緩衝液１５００部（容量）に分散させ、水素化ホウ素ナ
トリウム３０部を添加して２５℃で、１８時間反応させ
てシッフ塩基の水素添加を行った。こうしてタウリン由
来のスルホン酸含量０．８８ｍｅｑ／ｍｌの［セルロー
ス］−［ＰＥＯアミン］−［タウリン］（ＣＰＥＡＴ−
４）を得た。酸含量は実施例と同様の方法で定量した。

【００４７】上記［セルロース］−［ＰＥＯアミン］−
［タウリン］（ＣＰＥＡＴ−４）を用いて実施例１と同
様に血液潅流実験を行い、カラム前後の血中ＬＤＬ量、
潅流開始前後の全血液中のアルブミン量、総蛋白量、血
小板量を測定した。結果は表１、表２に示す。

【００４８】〈比較例３〉実施例１で得たＣＡ−１を１
００部（容量）取ってｐＨ９．５の炭酸緩衝液２０００
部（容量）に分散させておき、これにタウリン２６部を
添加して撹拌し、２５℃で１８時間反応させた。生成物
を濾過によって回収し、イオン交換水で洗浄した後ｐＨ
９．０の炭酸緩衝液２０００部（容量）に分散させ、水
素化ホウ素ナトリウム３０部を加えて撹拌し、２５℃で
１８時間反応させてシッフ塩基の水素添加を行った。生
成物を回収、イオン交換水で充分に洗浄して［セルロー
ス］−［タウリン］（ＣＴ−５）を得た。実施例と同様
の方法で測定したところ、ＣＴ−５のタウリン由来スル
ホン酸の含量は、０．９５ｍｅｑ／ｍｌであった。

【００４９】上記［セルロース］−［タウリン］（ＣＴ
−５）を用いて実施例１と同様に血液潅流実験を行い、
カラム前後の血中ＬＤＬ量、潅流開始前後の全血液中の
アルブミン量、総蛋白量、血小板量を測定した。結果は
表１、表２に示す。

【００５０】〈比較例４〉粒状多孔質セルロース（平均
粒径５０μｍ、平均孔径５０００Å）１００部（容
量）、２０重量％水酸化ナトリウム水溶液４０部（容
量）、ヘプタン１２０部（容量）、ゼラチン８部の混合
懸濁液を４０℃で２時間撹拌した後、エピクロルヒドリ
ン５０部を加えて４０℃でさらに２時間撹拌した。この
反応混合物から生成物を回収し、充分に洗浄してエポキ
シ化セルロース（ＣＥ−６）を得た。極限粘度０．０８
３ｄｌ／ｇ、平均重合度１４０、硫黄含量１９．２％重
量のデキストラン硫酸ナトリウム５部を水２０部（容
量）に溶解させておき、これに上記ＣＥ−６を２０部
（容量）を加えてｐＨを１２に調整して４０℃で１８時
間反応させた。未反応のグリシジル基をモノエタノール
アミンでブロックした後、生成物を回収し充分洗浄して
スルホン酸含量０．３０ｍｅｑ／ｍｌ［セルロース］−
［デキストラン硫酸ナトリウム］（ＣＤＳ−６）を得
た。

【００５１】上記［セルロース］−［デキストラン硫酸
ナトリウム］（ＣＤＳ−６）を用いて実施例１と同様に
血液潅流実験を行い、カラム前後の血中ＬＤＬ量、潅流
開始前後の全血液中のアルブミン量、総蛋白量、血小板
量を測定した。結果は表１、表２に示す。

【００５２】上記の例から明らかなように、本発明の定
比重リポタンパク吸着材は血中のＬＤＬを選択的かつ簡
便に除去できた。吸着能だけに注目した場合はデキスト
ラン硫酸を固定した吸着材も本発明の吸着材と同レベル
であったが、アルブミン、血小板といったたの血中成分
に及ぼす影響を考えた場合、本発明の吸着材は極めて優
れていることがわかった。この理由は以下の通りであ
る。水不溶性固体表面上に固定した親水性スペーサーが
有効に働き、排除体積効果によって良好な血液適合性が
実現される。また、Ｎ−スルホキトサンのヘパリノイド
としての効果も現れ、これも血液適合性の向上に貢献し
ているものと考えられる。リガンドとして働くスルファ
ミノ基は、親水性スペーサーによって固体表面から離れ
て固定されており、固体表面近傍の親水性スペーサーの
流動性によってそのモービリティーを増し、吸着能の向
上が図られている。

【００５３】

【発明の効果】本発明の低比重リポタンパク吸着材は、
親水性スペーサー導入による排除体積効果に加えて、リ
ガンドとして導入したＮ−スルホキトサンの一部がヘパ
リノイドとしての効果も発揮するために、良好な吸着能
と血液適合性を両立することができ、あらかじめ血液か
ら血漿成分を分離して潅流するという煩雑な方法をとら
ず直接血液を潅流することによって充分な効果を期待す
ることができる。このため、簡便な操作で低比重リポタ
ンパクの除去による症状の改善、治療に利用され得る。

─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【提出日】平成４年５月２６日

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正内容】

【書類名】 明細書

【発明の名称】 低比重リポ蛋白吸着材

【特許請求の範囲】

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は動脈硬化、高脂血症の病
因物質である低比重リポ蛋白（以下ＬＤＬと略記する）
および（または）極低比重リポ蛋白（以下ＶＬＤＬと略
記する）を吸着除去し、疾病を治療することを目的と
し、血液もしくは血液成分を接触させることによって血
中のＬＤＬおよび（または）ＶＬＤＬを吸着する低比重
リポ蛋白吸着材に関するものである。本発明において、
Ｎ−スルホキトサンとは、下記化１の要部構造を有する
化合物を指す。

【０００２】

【化１】 化１におけるＸは、Ｈ、またはＮａ等のアルカリ金属、
またはＣａ等のアルカリ土類金属、または第４級アミノ
基の塩形成基である。

【０００３】また、本発明において、−ＮＨＳＯ₃Ｈも
しくはこの塩をいずれもスルファミノ基と呼ぶ。

【０００４】

【従来の技術】動脈硬化の原因となる高脂血症の治療に
は各種薬剤の使用が行われているが、一般に副作用の危
険性があり、使用量、使用期間などに細心の注意を払う
必要がある。また、正常値の数倍のＬＤＬおよび（また
は）ＶＬＤＬ値を示し、最も重篤な症状を招く危険性の
ある家族性高脂血症（ＦＨ）では薬剤の効果が充分に期
待できない場合も多い。

【０００５】他の治療方法としては血漿交換法が有効と
され、広く行われている。しかしながら、この療法では
血漿をすべて交換するため、（１）不要成分のみなら
ず、必要な成分までも除去されてしまうこと、（２）除
去した血漿に替えて体内に補充される血漿、あるいは血
漿製剤が不足しているため、大量かつ持続的な入手が困
難であること、（３）血清肝炎やアレルギー、さらには
ＡＩＤＳ（後天性免疫不全症候群）感染の危険性がある
こと、など血漿交換法が内含する問題は多い。

【０００６】このような問題を解決できる治療法として
は、自己の血液を浄化した後に再輪注する方法、すなわ
ち、体外循環血液浄化法が望ましいとされる。この方法
を採るにあたり、副作用がなく、自己の血液から病因物
質を充分且つ選択的に除去することのできる浄化材及び
血液浄化療法が望まれていた。

【０００７】こういった状況を背景として、近年、ＬＤ
Ｌおよび（または）ＶＬＤＬの吸着除去による療法が一
般的になってきた。このような方法は例えば、アガロー
スゲルにヘパリンを固定した吸着材（Ｓ．Ｍｏｏｒｊａ
ｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ．，
７７（１９７７）２１−３０）などが知られているが、
この材料は吸着能力が充分でなく、機械的強度について
も充分とは言い難い。また、抗体等を固定した免疫吸着
体を利用してＬＤＬおよび（または）ＶＬＤＬの吸着除
去を行う試みがなされているが、吸着選択性、吸着能力
の面では満足できるものの、抗体の入手が困難で高価で
あるという欠点がある。

【０００８】このような問題点を改善する目的で供せら
れた吸着材には、有害成分と親和性をもつ素材（シリカ
など）を多孔化したもの（特開昭５９−１３９９３５，
特開昭６３−１６０６６９など）、有害成分と親和性を
有する化合物（リガンド：スルホン酸基，カルボキシル
基など）を固定したものがある。後者はいわゆるアフィ
ニティー吸着材と呼ばれるもので、さらに次のふたつに
大別できる。 （１）不溶性担体にリガンドとしてポリアニオンを固定
したもの（特公昭６２−５９９７５，特開平１−１４５
０７１，リガンドをデキストラン硫酸に限定：特公平３
−５８２２，リガンドをヘパリンに限定：特開昭５９−
１３９９３７など） （２）不溶性担体にリガンドとしてスルホン酸基および
（または）カルボキシル基をもつ単量体を固定したもの
（特公平２−５１３４６，特開昭５８−２７５５９な
ど）

【０００９】アフィニティー吸着材に用いられるリガン
ドは比較的安価で、選択性、吸着能力も比較的満足でき
るレベルにあるが、これらの吸着材は血液適合性に乏し
いため、多量のヘパリンの添加が必要となり、出血傾向
等の副作用が生じる可能性を残している。このような点
から、さらに高い効率及び特異性で病因物質を除去する
ことができ、また体液に対する悪影響の少ない浄化材が
望まれている。

【００１０】ＬＤＬおよび（または）ＶＬＤＬ以外の物
質を吸着する吸着材に目を向けてみると、例えば、特開
平１−１５８９７０という特許にはこのような概念に基
づいて開発された血液浄化材について開示されている。
この特許によって開示されている血液浄化材は、重合度
１〜９０のエチレンオキサイド骨格を有する親水性スペ
ーサーを介して、リガンドとなる低分子有機化合物を水
不溶性多孔質固体表面に固定し、これに直接血液を潅流
して免疫グロブリンを吸着することを特徴としている。

【００１１】親水性スペーサーの持つ意義は大きく二つ
に分けることができる。第一に、血液中の血球成分や、
被吸着物質でないタンパクの付着を防止することであ
る。親水性スペーサーはその周辺に水を吸着している。
このため吸着材表面は水の層に覆われ、この水の層が血
球成分の付着を防いでいる（排除体積効果）。また、水
の層を形成するスペーサーが運動することにより、さら
に血球成分の付着は困難になり、付着した血球成分は脱
離しやすくなる。また、凝固因子や補体の活性化が抑制
されるといった利点を有する。

【００１２】第二に、リガンドの運動性を上昇させるこ
とによって吸着能の向上が期待できるということであ
る。特に被吸着物質が巨大分子である場合、リガンドを
担体表面に直接固定しただけでは被吸着物質とリガンド
の接近が困難であり、また一部で結合したとしても結合
サイトの数が充分ではなく、容易に脱着してしまう可能
性が大きい。親水性スペーサーを介在させることによっ
て被吸着物質とリガンドとの接近が促進され、またリガ
ンドの動きに融通性があるため周囲のリガンドが被吸着
物質との結合に参与しやすく、このため結合サイトの多
い強固な結合を生成することができる。

【００１３】特開平１−１５８９７０では、重合度１〜
９０のエチレンオキサイド骨格を有する親水性スペーサ
ーを介在させているが、重合度が９０までのエチレンオ
キサイド骨格を有する親水性スペーサーを導入しただけ
では、充分な血液適合性を実現するのは困難であり、特
開平１−１５８９７０においても血液適合性向上のため
アクリル酸誘導体のコーティングを行っている。このよ
うな操作は煩雑であるばかりでなく、毒性をもった物質
の溶出を招く可能性も存在する。

【００１４】

【発明が解決しようとする課題】本発明は上記従来技術
の欠点を解決し、リガンドの効果を充分に引き出して、
良好な吸着能、吸着特性を有し、コーティング等の煩雑
な操作を省略してなお充分な血液適合性を持った血液浄
化吸着材を提供することにより、副作用がなく、自己の
血液からＬＤＬおよび（または）ＶＬＤＬを充分且つ選
択的に除去することのできる効果的な吸着材を提供しよ
うとしたものである。

【００１５】

【課題を解決するための手段】本発明の低比重リポタン
パク吸着材は、水不溶性固体に親水性スペーサーを介し
てＮ−スルホキトサンを、スルファミノ基由来の酸含量
が５０μｅｑ／ｍｌ（湿潤状態）〜２．０ｍｅｑ／ｍｌ
（湿潤状態）となるよう固定し、これによって血中のＬ
ＤＬおよび（または）ＶＬＤＬを除去することを特徴と
するものである。本発明の低比重リポ蛋白吸着材に用い
られる親水性スペーサーは」、炭素数１〜４の繰り返し
単位から成り、重合度が５〜４００のポリアルキレンオ
キサイド骨格を有することを特徴とする。このような親
水性スペーサーとしては、例えばポリエチレングリコー
ル、ポリプロピレングリコール、ポリテトラメチレング
リコールなどの骨格を有する化合物が挙げられる。本発
明に用いられる親水性スペーサーはここに例示した化合
物のように非イオン性であることが好ましい。

【００１６】本発明の低比重リポ蛋白吸着材は、水不溶
性固体がポリスチレン、架橋ポリビニルアルコール、ポ
リメタクリル酸およびその誘導体或いはこれらの共重合
体などの合成有機高分子化合物、セルロース、キチン、
キトサン等の天然有機高分子化合物、またはアシルセル
ロース、アシルキチン等の改質天然有機高分子化合物で
あることが好ましい。これらの高分子化合物のうち、機
械的強度、リガンド導入の容易さを考慮すると、適度に
架橋したポリスチレン、ポリメタクリル酸およびその誘
導体或いはこれらの共重合体、セルロースが望ましく、
さらに好ましくはセルロースが望ましい。

【００１７】本発明に用いられるＮ−スルホキトサンは
ゲルパーミエイションクロマトグラフィー（以下ＧＰＣ
と略記する）によるポリエチレングリコール（以下ＰＥ
Ｇと略記する）換算で分子量１０００〜２００００が望
ましく、好ましくは２０００〜１００００、さらに好ま
しくは２５００〜６０００が望ましい。これよりも分子
量が小さいと血液適合性、吸着性能とも充分に得られ
ず、これよりも大きいと導入率が低下する傾向にあり、
性能の向上は望めない。

【００１８】本発明でのＮ−スルホキトサン導入は、キ
トサンを水不溶性固体に導入した後アミノ基をスルホン
化する方法、あらかじめアミノ基をスルホン化したキト
サンを水不溶性固体に導入する方法、いずれも用いられ
得る。前者を採用する場合、Ｎ−スルホキトサンに含ま
れるアミノ基のスルホン化率は３０％以上、好ましくは
５０％以上、さらに好ましくは７０％以上が望ましい。
後者を採用する場合、Ｎ−スルホキトサンのスルホン化
率は３０％以上、好ましくは５０％以上、さらに好まし
くは７０％以上が望ましいが、キトサンのアミノ基が全
てスルホン化されてしまうと（スルホン化率１００
％）、残存のアミノ基を利用して［水不溶性固体］−
［親水性スペーサー］に化学結合で導入することが不可
能になるので好ましくない。しかしながら、残存アミノ
基が大量に存在するとＬＤＬ吸着に好ましくない影響を
与える可能性があるので、水不溶性固体への固定が終了
した時点での残存アミノ基が全体の１０％以下であるこ
とが望ましい。これを超える量の残存アミノ基が存在す
る場合、無水酢酸、無水コハク酸、１，３−プロパンス
ルトンなどによってブロックすることが推奨される。本
発明でのキトサンのＮ−スルホン化にはクロロスルホン
酸、濃硫酸、発煙硫酸、三酸化硫黄／ジメチルホルムア
ミド錯体、三酸化硫黄／ピリジン錯体などが用いられ得
るが、このなかで、三酸化硫黄／ピリジン錯体が好まし
い。他の試薬を用いた場合、水酸基までもスルホン化さ
れてしまう。なお、上記スルホン化率は、スルホン化前
後のキトサンに含まれるアミノ基を滴定する方法、もし
くは元素分析で窒素と硫黄の含量を定量することによっ
て測定することができる。

【００１９】本発明のＮ−スルホキトサンはＬＤＬおよ
び（または）ＶＬＤＬとの親和性によってこれを吸着除
去するリガンドとしてだけではなく、上記の特開平１−
１５８９７０で開示されている親水性スペーサーとして
の働きをも有している。水不溶性固体表面の比較的近傍
のＮ−スルホキトサン鎖は主に親水性スペーサーとして
血液適合性の向上およびリガンドの運動性向上に貢献
し、水不溶性固体表面から遠距離にあるＮ−スルホキト
サンはリガンドとしてＬＤＬおよび（または）ＶＬＤＬ
の吸着除去の役割を有する。しかしながら、親水性スペ
ーサーとしてのＮ−スルホキトサン鎖の効果は充分であ
るとは言い難く、より良好な吸着性能、血液適合性を実
現するには非イオン性の親水性スペーサーを介在させる
必要がある。

【００２０】さらに、水不溶性固体に直接ポリアニオン
を導入した場合においては導入法のいかんに関わらず、
ポリアニオンが水不溶性固体に多数の結合点で固定され
る可能性が大きく、水不溶性固体表面からポリアニオン
の分子鎖が長く伸びるのが困難になりＬＤＬおよび（ま
たは）ＶＬＤＬ吸着の際にポリアニオンの効果が充分に
発揮されないという欠点を有する。このようなことか
ら、より良好な吸着性能、血液適合性を実現するには非
イオン性の親水性スペーサーを介在させる必要がある。

【００２１】また、Ｎ−スルホキトサンは抗凝血剤とし
てよく知られているヘパリンの機能を示す類似物（ヘパ
リノイド）としての働きも有する。ヘパリンの基本骨格
はＤ−グルコサミンとＤ−グルクロン酸であり、このア
ミノ基と一部の水酸基がスルホン化された構造を持って
いる。ヘパリノイドとしては現在までにセルロース、ア
ミロース、デキストランなどの基本骨格にスルホン酸基
を導入したものが報告されているが、キトサンはこれら
の多糖類とは異なり、Ｄ−グルコサミンを基本骨格とし
ているので、そのＮ−スルホン化物はヘパリノイドとし
てより大きな効果が期待できる。したがって、特開平１
−１５８９７０ではいまだ不十分であった血液適合性の
実現が可能となる。

【００２２】このようなヘパリノイドの抗凝血性を議論
する際に忘れてならないのが、毒性であるが、本発明に
おいてはＮ−スルホキトサンを水不溶性固体表面に固定
しているため、抗凝血剤として直接投与する場合に比べ
てその危険性は極端に減少する。また、毒性はＮ−スル
ホキトサンの鎖長、分子量にも大きく影響を受ける。前
に記載したような範囲の分子量のＮ−スルホキトサンを
水不溶性固体表面上に固定した場合、万一Ｎ−スルホキ
トサンが脱離して血中に遊離しても、重篤な副作用を招
く恐れは小さい。

【００２３】本発明に使用される水不溶性固体の形状
は、粒子状、繊維状、膜状等いずれの公知の形状も用い
られ得るが、通液性、表面積確保、吸着材調製時の取扱
いの容易さなどの点から、粒子状もしくは繊維状が望ま
しい。粒子状担体の平均粒径は１０μｍから５ｍｍの範
囲にあることが望ましいが、粒径が小さくなると血球の
流通抵抗が大きくなり、粒径が大きくなると担体充填量
の減少、ひいては有効表面積の減少を招くので、平均粒
径３０μｍから１ｍｍの範囲にあることが望ましい。さ
らに好ましくは平均粒径５０μｍから５００μｍが望ま
しい。粒子形状については、細胞に損傷を与えにくいこ
とや、物理的外力に対する強度、さらに調製の容易さか
ら、球状であることが望ましい。同じ理由から、繊維状
担体の繊維直径は０．１μｍから５０μｍ、好ましくは
０．３μｍから２５μｍが望ましく、さらに好ましくは
０．５μｍから１５μｍが望ましい。

【００２４】担体表面には有効表面積を拡大するため微
小孔が存在することが好ましい。その平均孔径は粒子状
担体の場合、２０Åから２００００Å、好ましくは１０
０Åから１５０００Å、更に好ましくは１０００Åから
１２０００Å、繊維状担体の場合２０Åから３０００
Å、好ましくは１００Åから２０００Åである。これよ
り平均孔径が小さいと被吸着物質が微小孔内部まで到達
できず、これより大きいと有効表面積を拡大する効果が
不十分であり、また担体の強度低下を招く恐れがある。

【００２５】本発明に使用される水不溶性固体への親水
性スペーサー、およびＮ−スルホキトサンの導入の方法
は共有結合、電子線照射によるグラフト化など、特に制
限されないが、［セルロース］−［親水性スペーサー］
−［Ｎ−スルホキトサン］を得る場合、以下のような方
法が利用され得る。 セルロースに親水性スペーサーを介してキトサンを導
入した後、このキトサンのアミノ基をスルホン化する方
法 （１）セルロースの改質 過沃素酸ナトリウムを０．１規定から５．０規定好まし
くは０．５規定から１．５規定の硫酸に溶解した溶液
に、平均粒径２０μｍから２００μｍ、好ましくは３０
μｍから７０μｍ、平均孔径５００Åから１００００
Å、好ましくは１０００Åから８０００Åの粒状多孔質
セルロースを添加し、１０℃から５０℃、好ましくは２
０℃から３０℃で、５時間から３０時間、好ましくは１
０時間から２４時間反応させる。上記過沃素酸ナトリウ
ム−硫酸溶液の過沃素酸ナトリウム濃度は０．５重量％
から１５重量％、好ましくは１．０重量％から１０重量
％である。また、上記粒状多孔質セルロースの過沃素酸
ナトリウム溶液への浴比は１０容量％から５０容量％、
好ましくは１５容量％から３５容量％である。この反応
混合物を濾過して生成物を回収し、充分に水洗して、膨
潤状態でアルデヒド含量０．０１０ｍｅｑ／ｍｌから
２．００ｍｅｑ／ｍｌ、好ましくは０．０５０ｍｅｑ／
ｍｌから１．５０ｍｅｑ／ｍｌのアルデヒドセルロース
を得る。このアルデヒドセルロースは下記化２にその要
部構造を示すように、一部のグルコースユニットが開環
した構造をしている。

【００２６】

【化２】

【００２７】（２）親水性スペーサーの導入 分子量３００〜８０００、好ましくは４００〜７００
０、さらに好ましくは１０００〜６５００の両末端にア
ミノ基を有するポリエチレングリコール（以下ＰＥＯア
ミンと略記する）をｐＨ９．５の緩衝液に溶解させてお
き、これに上記（１）で得たアルデヒドセルロースを
添加して撹拌しながら１０℃から５０℃好ましくは２０
℃から３０℃で、５時間から３０時間、好ましくは１０
時間から２４時間反応させる。上記ＰＥＯアミン緩衝液
の濃度は５重量％から６０重量％、好ましくは１０重量
％から４０重量％、この溶液へのアルデヒドセルロース
の浴比は１容量％から２０容量％、好ましくは３容量％
から１５容量％である。この反応混合物を濾過して生成
物を回収、水洗し、これをｐＨ９．０の緩衝液に分散さ
せ、水素化ホウ素ナトリウムを添加して１０℃から５０
℃好ましくは２０℃から３０℃で、５時間から３０時
間、好ましくは１０時間から２４時間反応させてシッフ
塩基の水素添加を行う。含シッフ塩基［セルロース］−
［ＰＥＯアミン］の緩衝液への浴比は１容量％から２０
容量％、好ましくは３容量％から１５容量％、含シッフ
塩基［セルロース］−［ＰＥＯアミン］と水素化ホウ素
ナトリウムの仕込比は２０／１から３／２、好ましくは
１５／１から３／１（いずれも容量／重量比）である。
こうしてアミノ基含量０．０１０から２．５０ｍｅｑ／
ｍｌ、好ましくは０．０５０から１．５０ｍｅｑ／ｍｌ
の［セルロース］−［ＰＥＯアミン］を得る。ここで用
いたＰＥＯアミンとは下記化３の構造を有する

【００２８】

【化３】 化３においてはｎは５から４００のものである。

【００２９】（３）キトサンの導入 上記（２）で得た［セルロース］−［ＰＥＯアミン］
をｐＨ９．５の緩衝液に分散させておき、これにグルタ
ルアルデヒドを添加して撹拌しながら１０℃から５０℃
好ましくは２０℃から３０℃で、５時間から３０時間、
好ましくは１０時間から２４時間反応させる。上記緩衝
液への［セルロース］−［ＰＥＯアミン］の浴比は３容
量％から２０容量％、好ましくは５容量％から１５容量
％、グルタルアルデヒドの添加量は濃度が０．０５重量
％から５．０重量％、好ましくは０．１重量％から３．
０重量％となることが望ましく、［セルロース］−［Ｐ
ＥＯアミン］由来のアミノ基に対して過剰量が加えられ
ることが必要である。こうして［セルロース］−［ＰＥ
Ｏアミン］−［グルタルアルデヒド］を得る。この反応
混合物を濾過して生成物を回収、水洗し、これをｐＨ
９．５の緩衝液に分散させ、ＧＰＣでＰＥＧ換算の分子
量１０００〜２００００、好ましくは２０００〜１００
００、さらに好ましくは２５００〜６０００のキトサン
を加えてｐＨを調整した後、１０℃から５０℃好ましく
は２０℃から３０℃で、５時間から３０時間、好ましく
は１０時間から２４時間反応させる。上記緩衝液への
［セルロース］−［ＰＥＯアミン］−［グルタルアルデ
ヒド］の浴比は３容量％から２０容量％、好ましくは５
容量％から１５容量％、キトサンの添加量は濃度が１．
５重量％から６０重量％、好ましくは１０重量％から４
０重量％となることが望ましく、［セルロース］−［Ｐ
ＥＯアミン］−［グルタルアルデヒド］由来のアルデヒ
ド基に対して過剰量が加えられることが必要である。こ
の反応混合物を濾過して生成物を回収、水洗し、これを
ｐＨ９．０の緩衝液に分散させ、水素化ホウ素ナトリウ
ムを添加して１０℃から５０℃好ましくは２０℃から３
０℃で、５時間から３０時間、好ましくは１０時間から
２４時間反応させてシッフ塩基の水素添加を行う。含シ
ッフ塩基［セルロース］−［ＰＥＯアミン］−［キトサ
ン］の緩衝液への浴比は３容量％から２０容量％、好ま
しくは５容量％から１５容量％、含シッフ塩基［セルロ
ース］−［ＰＥＯアミン］−［キトサン］と水素化ホウ
素ナトリウムの仕込比は２０／１から３／２、好ましく
は１５／１から３／１（いずれも容量／重量比）であ
る。こうしてアミノ基含量０．０１０から２．５０ｍｅ
ｑ／ｍｌ、好ましくは０．０５０から２．００ｍｅｑ／
ｍｌの［セルロース］−［ＰＥＯアミン］−［キトサ
ン］を得る。

【００３０】（４）キトサンのＮ−スルホン化 上記（２）で得た［セルロース］−［ＰＥＯアミン］−
［キトサン］にｐＨ９．５の緩衝液を１／３から１／１
２好ましくは１／５から１／１０の容量比となるよう加
えて分散させ、三酸化硫黄／ピリジン錯体を少量ずつ加
えてゆき、濃度が１０重量％から５０重量％、好ましく
は２０重量％から４０重量％の水酸化ナトリウム水溶液
を加えて反応溶液のｐＨを９〜１０に保つよう調整しな
がら、１０℃から５０℃好ましくは２０℃から３０℃
で、０．５時間から１２時間、好ましくは１時間から８
時間反応させる。反応混合物から生成物を回収、洗浄水
がｐＨ７．０になるまで充分に洗浄して［セルロース］
−［ＰＥＯアミン］−［Ｎ−スルホキトサン］を得る。
［セルロース］−［ＰＥＯアミン］−［キトサン］／緩
衝液懸濁液と、三酸化硫黄／ピリジン錯体の仕込比は５
／１から３０／１、好ましくは１０／１から２５／１
（いずれも容量／重量比）である。

【００３１】あらかじめアミノ基をスルホン化したキ
トサンを水不溶性固体表面に導入する方法 （１）キトサンのＮ−スルホン化 ＧＰＣによるＰＥＧ換算で分子量１０００〜２０００
０、好ましくは２０００〜１００００、さらに好ましく
は２５００〜６０００のキトサンにｐＨ９．５の炭酸緩
衝液を１／３から１／１２好ましくは１／５から１／１
０の容量比となるよう加えて溶解させ、三酸化硫黄／ピ
リジン錯体を少量ずつ加えてゆき、濃度が１０重量％か
ら５０重量％、好ましくは２０重量％から４０重量％の
水酸化ナトリウム水溶液を加えて反応溶液のｐＨを９〜
１０に保つよう調整しながら、１０℃から５０℃好まし
くは２０℃から３０℃で、０．５時間から１２時間、好
ましくは１時間から８時間反応させる。こうして得られ
たＮ-スルホキトサンのスルホン化率は３０％から９９
％、好ましくは５０％から９５％、さらに好ましくは７
０％から９５％である。この反応混合物はそのまま［セ
ルロース］−［ＰＥＯアミン］への導入反応に使用でき
るが、充分な精製を要する場合は、反応混合物を約１／
３の容量に濃縮した後、セルロース半透膜に入れて蒸留
水で透析することにより低分子量の不純物を除去し、こ
れを濃縮乾固させればよい。キトサンと三酸化硫黄／ピ
リジン錯体の仕込比は１／３から１０／１、好ましくは
２／３から５／１（いずれも重量比）である。

【００３２】（２）Ｎ−スルホキトサンの導入 上記（１）で得たＮ−スルホキトサンを、上記
（２）の方法で得た［セルロース］−［ＰＥＯアミン］
に、上記（３）と同様の方法で固定することによって
［セルロース］−［ＰＥＯアミン］−［Ｎ−スルホＰＥ
Ｉ］を得る。

【００３３】例えば上記の様な方法で、粒子状もしくは
繊維状の［水不溶性固体］−［親水性スペーサー］−
［Ｎ−スルホキトサン］を得た後、これを適当な容器に
充填することによって本発明の血液浄化吸着材が得られ
る。容器の材質はガラス、ステンレス、ポリエチレン、
ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポ
リメチルメタクリレート等、特に制限されないが、滅菌
等の取扱いを考慮すると、ポリプロピレンやポリカーボ
ネートが好ましい。容器の形態についても特に制限され
ないが、粒子状担体の場合は両端を血液流入部、血液流
出部とした円筒のカラム型、繊維状担体の場合は粒子状
担体の場合と同様のカラム型、或いはシート状に成形し
た後、これを挟み込むような形態にしたものが適当であ
ろう。

【００３４】

【実施例】以下、実施例を用いて本発明を説明する。実
施例中の部は、特に注釈を加えない場合は重量部を意味
する。 〈実施例１〉粒状多孔質セルロース（平均粒径５０μ
ｍ、平均孔径５０００Å）１０００部（容量）を、過沃
素酸ナトリウム１２５部を１規定−硫酸４０００部に溶
解した溶液に添加し、２５℃で１８時間反応させた後、
濾別、水洗し、アルデヒド含量１．０２ｍｅｑ／ｍｌの
アルデヒドセルロース（ＣＡ−１）を得た。アルデヒド
の定量はオキシム法によって行った。すなわち、ＣＡ−
１約１．０ｍｌを正確に秤量し（この量をＶ₁ｍｌとす
る）、これに０．５規定塩酸ヒドロキシルアミン溶液
（塩酸ヒドロキシルアミン３５ｇを水１６０ｍｌに溶か
し、９５％エタノールで希釈して１ｌとしたもの）１０
ｍｌ、ピリジンブロムフェノールブルー溶液（４％ブロ
ムフェノールブルー０．２５ｍｌとピリジン２０ｍｌの
混合液を９５％エタノールに希釈して１ｌとしたもの）
３５ｍｌを加えた。この懸濁液（以下サンプルと呼ぶ）
を、ＣＡ−１を入れずに０．５規定塩酸ヒドロキシルア
ミン溶液１０ｍｌとピリジンブロムフェノールブルー溶
液３５ｍｌを加えたもの（以下ブランクと呼ぶ）と併せ
て超音波洗浄器内に１５分間放置した。サンプルとブラ
ンクを取り出し、サンプルの呈する色がブランクと同じ
になるまで０．１規定水酸化ナトリウム−メタノール溶
液を滴下した。この際滴下した水酸化ナトリウム量をＷ
₁ｍｌ、力価をＦ₁とすると、アルデヒド含量ｘ₁ｍｅｑ
／ｍｌは次式によって得られる。 ｘ₁＝（０．１×Ｆ₁×Ｗ₁）／Ｖ₁

【００３５】分子量４５００のＰＥＯアミンを４００部
取ってｐＨ９．５の炭酸緩衝液１２００部（容量）に溶
解し、これに上記で得たＣＡ−１を１００部（容量）加
え、２５℃で１８時間撹拌して反応させた。この反応混
合物を濾過して生成物を回収、水洗し、アミノ基含量
０．９７ｍｅｑ／ｍｌの［セルロース］−［ＰＥＯアミ
ン］（ＣＰＥＡ−１）を得た。アミノ基の定量は以下の
方法によって行った。ＣＰＥＡ−１約０．１ｍｌを正確
に秤量し（この量をＶ₂ｍｌとする）、０．１規定塩酸
水溶液１０ｍｌ（力価をＦ₂とする）を加え、この懸濁
液をジオキサンで希釈して全量で４０ｍｌにする（この
懸濁液を以下サンプルと呼ぶ）。サンプルを約３０分撹
拌した後、自動滴定装置（平沼産業製ＣＯＭＴＩＴＥ１
０１）を用いて０．１規定水酸化ナトリウム水溶液（力
価をＦ₂'とする）で滴定を行う。サンプルを中和するま
でに要した０．１規定水酸化ナトリウム水溶液の量をＷ
₂ｍｌとすると、ＣＣ−１のアミノ基含量ｘ₂ｍｅｑ／ｍ
ｌは次式によって得られる。 Ｖ₂×ｘ₂＋０．１×Ｆ₂’×Ｗ₂＝０．１×Ｆ₂×１０

【００３６】上記で得たＣＰＥＡ−１を１００部（容
量）取ってｐＨ９．５の炭酸緩衝液１２００部（容量）
に懸濁させておき、これにグルタルアルデヒド６０％水
溶液１００部を添加して、２５℃で１８時間撹拌して反
応させた。濾過によって回収、水洗した生成物をｐＨ
９．５炭酸緩衝液２０００部（容量）に懸濁させ、これ
に、ＧＰＣ（島津製作所製Ｃ−Ｒ４Ａ）によるＰＥＧ換
算で分子量約５０００のキトサン３０部を添加して撹拌
しながら２５℃で、１８時間反応させた。この反応混合
物を濾過して生成物を回収、水洗し、これをｐＨ９．０
の炭酸緩衝液１５００部（容量）に分散させ、水素化ホ
ウ素ナトリウム３０部を添加して２５℃で、１８時間反
応させてシッフ塩基の水素添加を行った。こうしてキト
サン由来のアミノ基含量０．９４ｍｅｑ／ｍｌの［セル
ロース］−［ＰＥＯアミン］−［キトサン］（ＣＰＥＡ
Ｃ−１）を得た。アミノ基の定量は上記と同様の方法に
よって行った。

【００３７】上記で得たＣＰＥＡＣ−１を１００部（容
量）取ってｐＨ９．５の炭酸緩衝液８５０部（容量）に
分散させ、３０重量％水酸化ナトリウム水溶液を少量ず
つ添加し、ｐＨを９〜１０に調整しながら三酸化硫黄／
ピリジン錯体５０部を２５℃で、少量ずつ４時間かけて
加えてゆき、２５℃でさらに１時間撹拌した。ここで要
した水酸化ナトリウム水溶液は３４部（容量）であっ
た。反応混合物を回収、洗浄水がｐＨ７．０になるまで
充分にイオン交換水で洗浄して［セルロース］−［ＰＥ
Ｏアミン］−［Ｎ−スルホキトサン］（ＣＰＥＡＳＣ−
１）を得た。このＣＰＥＡＳＣ−１は、Ｎ−スルホキト
サンのスルファミノ基由来の酸含量が０．９２ｍｅｑ／
ｍｌであった。酸含量の定量は以下の方法によって行っ
た。ＣＰＥＡＳＣ−１をＮ／１０過塩素酸水溶液で洗浄
した後、イオン交換水で洗浄水がｐＨ７．０になるまで
充分に洗浄し、これを上記でＣＰＥＡ−１を定量したの
と同様の方法で、０．１規定塩酸水溶液を０．１規定水
酸化ナトリウム水溶液に、０．１規定水酸化ナトリウム
水溶液を０．１規定過塩素酸−ジオキサン溶液にそれぞ
れ替えて測定することによって定量した。

【００３８】上記で得たＣＰＥＡＳＣ-１を１００ｍｌ
のカラムに充填し、１００Ｕ／ｍｌのヘパリンを含む生
理食塩液１００ｍｌ、続いて１Ｕ／ｍｌのヘパリンを含
む生理食塩液１００ｍｌでカラム内、および血液回路内
を洗浄した。一方、クエン酸加豚血１ｌをビーカーにと
り、カラムを通して再びこのビーカーに戻すよう血液回
路を組んだ。この装置を用いて血液流量５０ｍｌ／ｍｉ
ｎで潅流実験を３時間連続して行い、カラム前後の血中
ＬＤＬの量を測定した。また、潅流開始前後の全血液中
のアルブミン量、総蛋白量、血小板量を測定した。ＬＤ
Ｌの定量は和光純薬製β−リポ蛋白Ｃ−テストワコーを
用いてヘパリン沈澱・比色法によって行った。アルブミ
ン量はブロムクレゾールグリーン法、総蛋白量はビウレ
ット法、血小板量は自動血球算定装置を用いて定量し
た。結果は表１、表２に示した。なお、ＬＤＬの量は実
際の測定値、アルブミン、総蛋白、血小板については残
存率で表示した。単位は（ｍｇ／ｄｌ）であるが、血小
板については（個／ｄｌ）を用いた。

【００３９】

【表１】

【００４０】

【表２】

【００４１】〈実施例２〉ＧＰＣ（島津製作所製Ｃ−Ｒ
４Ａ）によるＰＥＧ換算で分子量約５０００のキトサン
１００部をｐＨ９．５の炭酸緩衝液９００部（容量）に
溶解させておき、これに３０重量％の水酸化ナトリウム
水溶液を少量ずつ添加してｐＨを９〜１０に調整しなが
ら、三酸化硫黄／ピリジン錯体９０部を２５℃で少量ず
つ５時間かけて加えてゆき、２５℃でさらに１時間撹拌
した。ここで要した水酸化ナトリウム水溶液は９１部
（容量）であった。反応溶液を炭酸ナトリウムと炭酸水
素ナトリウムでｐＨを９．５に調整し、Ｎ−スルホキト
サン（ＳＣ−２）溶液を得た。

【００４２】実施例１で得たＣＰＥＡ−１を１００部
（容量）取ってｐＨ９．５の炭酸緩衝液１５００部（容
量）に懸濁させておき、これにグルタルアルデヒド６０
％水溶液１００部を添加して、２５℃で１８時間撹拌し
て反応させた。濾過によって回収、水洗した生成物をｐ
Ｈ９．５炭酸緩衝液１８４０部（容量）に懸濁させ、こ
れに、上記で得たＳＣ−を１６０部（容量）添加して撹
拌しながら２５℃で、１８時間反応させた。この反応混
合物を濾過して生成物を回収、水洗し、これをｐＨ９．
０の炭酸緩衝液１５００部（容量）に分散させ、水素化
ホウ素ナトリウム３０部を添加して２５℃で、１８時間
反応させてシッフ塩基の水素添加を行った。こうしてＮ
−スルホキトサンに含まれるスルファミノ基由来の酸含
量０．９０ｍｅｑ／ｍｌの［セルロース］−［ＰＥＯア
ミン］−［Ｎ−スルホキトサン］（ＣＰＥＡＳＣ−２）
を得た。酸含量の定量は実施例１と同様の方法で行っ
た。

【００４３】上記［セルロース］−［ＰＥＯアミン］−
［Ｎ−スルホキトサン］（ＣＰＥＡＳＣ−２）を用いて
実施例１と同様に血液潅流実験を行い、カラム前後の血
中ＬＤＬ量、潅流開始前後の全血液中のアルブミン量、
総蛋白量、血小板量を測定した。結果は表１、表２に示
す。

【００４４】〈比較例１〉分子量４０００のポリアクリ
ル酸６００部をｐＨ４．５のクエン酸緩衝液２５００部
（容量）に溶解させ、Ｎ−シクロヘキシル−Ｎ'-（２−
モルホリノエチル）カルボジイミド−メト−ｐ−トルエ
ンスルホン酸塩（以下ＣＭＥＣと略記する）６３部を添
加し、０℃で２０分撹拌した。これに実施例１で得たＣ
ＰＥＡ−１を１００部（容量）加えて、０℃から徐々に
反応温度を室温まで上昇させ、１８時間撹拌して反応さ
せた。生成物を濾過によって回収し、３％水酸化ナトリ
ウム水溶液、続いてイオン交換水で充分に洗浄し、ポリ
アクリル酸のカルボキシル基由来の酸含量１．２４ｍｅ
ｑ／ｍｌの［セルロース］−［ＰＥＯアミン］−［ポリ
アクリル酸］ （ＣＰＥＡＰＡ−３）を得た。酸含量は実施例と同様の
方法で定量した。

【００４５】上記［セルロース］−［ＰＥＯアミン］−
［ポリアクリル酸］（ＣＰＥＡＰＡ−３）を用いて実施
例１と同様に血液潅流実験を行い、カラム前後の血中Ｌ
ＤＬ量、潅流開始前後の全血液中のアルブミン量、総蛋
白量、血小板量を測定した。結果は表１、表２に示す。

【００４６】〈比較例２〉実施例１で得たＣＰＥＡ−１
を１００部（容量）取ってｐＨ９．５の炭酸緩衝液１５
００部（容量）に懸濁させておき、これにグルタルアル
デヒド６０％水溶液１００部を添加して、２５℃で１８
時間撹拌して反応させた。濾過によって回収、水洗した
生成物をｐＨ９．５炭酸緩衝液１５００部（容量）に懸
濁させ、これに、タウリン２５部を添加して撹拌しなが
ら２５℃で、１８時間反応させた。この反応混合物を濾
過して生成物を回収、水洗し、これをｐＨ９．０の炭酸
緩衝液１５００部（容量）に分散させ、水素化ホウ素ナ
トリウム３０部を添加して２５℃で、１８時間反応させ
てシッフ塩基の水素添加を行った。こうしてタウリン由
来のスルホン酸含量０．８８ｍｅｑ／ｍｌの［セルロー
ス］−［ＰＥＯアミン］−［タウリン］（ＣＰＥＡＴ−
４）を得た。酸含量は実施例と同様の方法で定量した。

【００４７】上記［セルロース］−［ＰＥＯアミン］−
［タウリン］（ＣＰＥＡＴ−４）を用いて実施例１と同
様に血液潅流実験を行い、カラム前後の血中ＬＤＬ量、
潅流開始前後の全血液中のアルブミン量、総蛋白量、血
小板量を測定した。結果は表１、表２に示す。

【００４８】〈比較例３〉実施例１で得たＣＡ−１を１
００部（容量）取ってｐＨ９．５の炭酸緩衝液２０００
部（容量）に分散させておき、これにタウリン２６部を
添加して撹拌し、２５℃で１８時間反応させた。生成物
を濾過によって回収し、イオン交換水で洗浄した後ｐＨ
９．０の炭酸緩衝液２０００部（容量）に分散させ、水
素化ホウ素ナトリウム３０部を加えて撹拌し、２５℃で
１８時間反応させてシッフ塩基の水素添加を行った。生
成物を回収、イオン交換水で充分に洗浄して［セルロー
ス］−［タウリン］（ＣＴ−５）を得た。実施例と同様
の方法で測定したところ、ＣＴ−５のタウリン由来スル
ホン酸の含量は、０．９５ｍｅｑ／ｍｌであった。

【００４９】上記［セルロース］−［タウリン］（ＣＴ
−５）を用いて実施例１と同様に血液潅流実験を行い、
カラム前後の血中ＬＤＬ量、潅流開始前後の全血液中の
アルブミン量、総蛋白量、血小板量を測定した。結果は
表１、表２に示す。

【００５０】〈比較例４〉粒状多孔質セルロース（平均
粒径５０μｍ、平均孔径５０００Å）１００部（容
量）、２０重量％水酸化ナトリウム水溶液４０部（容
量）、ヘプタン１２０部（容量）、ゼラチン８部の混合
懸濁液を４０℃で２時間撹拌した後、エピクロルヒドリ
ン５０部を加えて４０℃でさらに２時間撹拌した。この
反応混合物から生成物を回収し、充分に洗浄してエポキ
シ化セルロース（ＣＥ−６）を得た。極限粘度０．０８
３ｄｌ／ｇ、平均重合度１４０、硫黄含量１９．２％重
量のデキストラン硫酸ナトリウム５部を水２０部（容
量）に溶解させておき、これに上記ＣＥ−６を２０部
（容量）を加えてｐＨを１２に調整して４０℃で１８時
間反応させた。未反応のグリシジル基をモノエタノール
アミンでブロックした後、生成物を回収し充分洗浄して
スルホン酸含量０．３０ｍｅｑ／ｍｌ［セルロース］−
［デキストラン硫酸ナトリウム］（ＣＤＳ−６）を得
た。

【００５１】上記［セルロース］−［デキストラン硫酸
ナトリウム］（ＣＤＳ−６）を用いて実施例１と同様に
血液潅流実験を行い、カラム前後の血中ＬＤＬ量、潅流
開始前後の全血液中のアルブミン量、総蛋白量、血小板
量を測定した。結果は表１、表２に示す。

【００５２】上記の例から明らかなように、本発明の定
比重リポ蛋白吸着材は血中のＬＤＬを選択的かつ簡便に
除去できた。吸着能だけに注目した場合はデキストラン
硫酸を固定した吸着材も本発明の吸着材と同レベルであ
ったが、アルブミン、血小板といったたの血中成分に及
ぼす影響を考えた場合、本発明の吸着材は極めて優れて
いることがわかった。この理由は以下の通りである。水
不溶性固体表面上に固定した親水性スペーサーが有効に
働き、排除体積効果によって良好な血液適合性が実現さ
れる。また、Ｎ−スルホキトサンのヘパリノイドとして
の効果も現れ、これも血液適合性の向上に貢献している
ものと考えられる。リガンドとして働くスルファミノ基
は、親水性スペーサーによって固体表面から離れて固定
されており、固体表面近傍の親水性スペーサーの流動性
によってそのモービリティーを増し、吸着能の向上が図
られている。

【００５３】

【発明の効果】本発明の低比重リポ蛋白吸着材は、親水
性スペーサー導入による排除体積効果に加えて、リガン
ドとして導入したＮ−スルホキトサンの一部がヘパリノ
イドとしての効果も発揮するために、良好な吸着能と血
液適合性を両立することができ、あらかじめ血液から血
漿成分を分離して潅流するという煩雑な方法をとらず直
接血液を潅流することによって充分な効果を期待するこ
とができる。このため、簡便な操作で低比重リポ蛋白の
除去による症状の改善、治療に利用され得る。

フロントページの続き (72)発明者 田中 昌和 滋賀県大津市堅田二丁目１番１号 東洋紡 績株式会社総合研究所内

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 水不溶性固体に親水性スペーサーを介し
   てＮ−スルホキトサンを、−ＮＨＳＯ₃ Ｈもしくはこの
   塩という構造を有する官能基由来の酸含量が５０μｅｑ
   ／ｍｌ（湿潤状態）〜２．０ｍｅｑ／ｍｌ（湿潤状態）
   となるよう固定したことを特徴とする低比重リポ蛋白吸
   着材。
2. 【請求項２】 親水性スペーサーが、炭素数１〜４の繰
   り返し単位から成り、重合度が５〜４００のポリアルキ
   レンオキサイド骨格を有することを特徴とする請求項１
   記載の低比重リポ蛋白吸着材。