JPH05292966A - ウイルスを検出する方法 - Google Patents
ウイルスを検出する方法Info
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- JPH05292966A JPH05292966A JP4101189A JP10118992A JPH05292966A JP H05292966 A JPH05292966 A JP H05292966A JP 4101189 A JP4101189 A JP 4101189A JP 10118992 A JP10118992 A JP 10118992A JP H05292966 A JPH05292966 A JP H05292966A
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- group
- viruses
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- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56983—Viruses
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 本発明は、液体試料中のウイルス又は関連グ
ループのウイルス群を検出する方法を提供することを目
的とする。 【構成】 本発明は、下記工程を有する、液体試料中の
ウイルス又は関連グループのウイルス群を検出する方
法；(a) 液体試料とともに、検出対象のウイルスに対す
る固定化一次レセプターをインキュベートし、第１不溶
性複合体を形成する工程；(b) 第１不溶性複合体ととも
に、検出対象のウイルスに対するラベル化可溶性一次レ
セプターをインキュベートし、第２不溶性複合体を形成
する工程；(c) 形成された第２不溶性複合体を分離する
工程；(d) 固定化一次レセプターと結合したラベルの量
又は未反応ラベルの量のいずれかを測定する工程；及び
(e) 工程の測定値と、対照試料の測定値を比較すること
により、ウイルスの存在を確認する工程。
ループのウイルス群を検出する方法を提供することを目
的とする。 【構成】 本発明は、下記工程を有する、液体試料中の
ウイルス又は関連グループのウイルス群を検出する方
法；(a) 液体試料とともに、検出対象のウイルスに対す
る固定化一次レセプターをインキュベートし、第１不溶
性複合体を形成する工程；(b) 第１不溶性複合体ととも
に、検出対象のウイルスに対するラベル化可溶性一次レ
セプターをインキュベートし、第２不溶性複合体を形成
する工程；(c) 形成された第２不溶性複合体を分離する
工程；(d) 固定化一次レセプターと結合したラベルの量
又は未反応ラベルの量のいずれかを測定する工程；及び
(e) 工程の測定値と、対照試料の測定値を比較すること
により、ウイルスの存在を確認する工程。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ウイルスに対する１種
以上の一次細胞表面レセプターを使用して、液体試料中
のウイルス又は関連グループのウイルス群を検出する方
法に関するものである。さらに詳細に述べると、本発明
は、ウイルス又は関連グループのウイルス群に対する固
定化一次細胞表面レセプター、及びウイルス又は関連ウ
イルス群に対するラベル化可溶性一次細胞表面レセプタ
ーを使用して、液体試料中のウイルス又は関連グループ
のウイルス群の存在を検出するサンドイッチアッセイ法
に関するものである。
以上の一次細胞表面レセプターを使用して、液体試料中
のウイルス又は関連グループのウイルス群を検出する方
法に関するものである。さらに詳細に述べると、本発明
は、ウイルス又は関連グループのウイルス群に対する固
定化一次細胞表面レセプター、及びウイルス又は関連ウ
イルス群に対するラベル化可溶性一次細胞表面レセプタ
ーを使用して、液体試料中のウイルス又は関連グループ
のウイルス群の存在を検出するサンドイッチアッセイ法
に関するものである。
【０００２】
【従来技術】ウイルスは様々な病気の主要な原因となる
病原体である。しかし、細菌感染に対する抗生物質を用
いた治療と異なり、ウイルス感染症に対する一般的な合
理的治療法は、開発されていない。一般に、ワクチン及
び単一のウイルスに対する治療的処置は、他のウイルス
に対する広い適用性がなく、時には同種ウイルスの他の
菌株に対してでさえ適用できない。したがって、患者が
特定のウイルス又は関連グループのウイルス群に感染し
たか、否かを確認することは、予防及び治療的な処置を
どのように行うか決めるうえで望ましい。ウイルス感染
においては、ウイルスは最初に標的細胞表面に付着しな
ければならない。細胞表面にあるレセプターは、この付
着を促進する。この分野において、２種のレセプターが
報告されている。第１のタイプのレセプター（以下、一
次レセプターという。）は、ホスト細胞に対するウイル
スの付着を媒介する。一次レセプターは、特定種のウイ
ルスに感染し易い特定タイプの細胞上に存在し、かつ一
般に、特定種のウイルスだけと結合する（参照：T. Len
tz, J. of Gen. Virol. 71 : 751 (1990) 及び T. Lent
z, TIPS 9 : 247 (July 1988))。第２に報告されたウイ
ルスに対するレセプター（以下、二次レセプターとい
う。）は、特定種のウイルスに特異的なものではない。
この二次レセプターは、多くの細胞上にに存在し、一次
レセプターに付着した後に、ウイルスがホスト細胞内に
進入する場合に関連するものである（参照：米国特許第
4,859,769号）。
病原体である。しかし、細菌感染に対する抗生物質を用
いた治療と異なり、ウイルス感染症に対する一般的な合
理的治療法は、開発されていない。一般に、ワクチン及
び単一のウイルスに対する治療的処置は、他のウイルス
に対する広い適用性がなく、時には同種ウイルスの他の
菌株に対してでさえ適用できない。したがって、患者が
特定のウイルス又は関連グループのウイルス群に感染し
たか、否かを確認することは、予防及び治療的な処置を
どのように行うか決めるうえで望ましい。ウイルス感染
においては、ウイルスは最初に標的細胞表面に付着しな
ければならない。細胞表面にあるレセプターは、この付
着を促進する。この分野において、２種のレセプターが
報告されている。第１のタイプのレセプター（以下、一
次レセプターという。）は、ホスト細胞に対するウイル
スの付着を媒介する。一次レセプターは、特定種のウイ
ルスに感染し易い特定タイプの細胞上に存在し、かつ一
般に、特定種のウイルスだけと結合する（参照：T. Len
tz, J. of Gen. Virol. 71 : 751 (1990) 及び T. Lent
z, TIPS 9 : 247 (July 1988))。第２に報告されたウイ
ルスに対するレセプター（以下、二次レセプターとい
う。）は、特定種のウイルスに特異的なものではない。
この二次レセプターは、多くの細胞上にに存在し、一次
レセプターに付着した後に、ウイルスがホスト細胞内に
進入する場合に関連するものである（参照：米国特許第
4,859,769号）。
【０００３】この分野において、数種のウイルスに対す
る一次レセプターが報告されている。例えば、HIV に対
する一次レセプターである CD 4 を報告したFisherらの
論文(Nature 331: 76 (1988)) 、インフルエンザウイル
スに対する一次レセプター、ヘマグルチニンがシアル酸
であることを報告した Weissらの論文(Nature 333: 426
(1988))、及びポリオウイルスに対する一次レセプター
を論じたMendelsohnらの論文(Cell 56 : 855 (1989))が
ある。最近になって見出されたことに、主要サブグルー
プのライノウイルスに対する一次レセプターの可溶性形
態である、可溶性細胞間付着分子-1 (sICAM-1)が、主要
サブグループのライノウイルス群による結合及びそれに
続く標的細胞の感染を阻害できるということがある（参
照：Marlinらの論文、Nature 344: 70 (1990)( 以下、M
arlinらの論文という。）なお、この論文の記載を、本
願明細書の内容として引用する。）。この主要サブグル
ープのライノウイルスは、通常の感冒感染の約45〜50％
を引き起こすものであるから、 sICAM-1及びその誘導体
の使用は、その予防及び治療にとって有益である。主要
サブグループのライノウイルスを検出する方法を得るこ
とは、有益なことである。ウイルス検出のアッセイ法及
び抗生物質及び cDNA プローブを使用したウイルス感染
の診断方法は、公知である（参照：Al-Nakibらの論文、
J. of Med. Virol. 20: 289 (1986)及びJ. of Med. Vir
ol. 29: 268 (1986)) 。しかし、これらのアッセイ法
は、その特異性又は使用方法のいずれかに欠点があり、
日常的な診断に適していないことが多い。米国特許第
4,376,110号及び第4,486,530 号は、モノクローナル抗
体を使用し、液体中に抗原性物質の存在を測定する" 二
部位 "又は" サンドイッチ "免疫定量アッセイ法を開示
する。
る一次レセプターが報告されている。例えば、HIV に対
する一次レセプターである CD 4 を報告したFisherらの
論文(Nature 331: 76 (1988)) 、インフルエンザウイル
スに対する一次レセプター、ヘマグルチニンがシアル酸
であることを報告した Weissらの論文(Nature 333: 426
(1988))、及びポリオウイルスに対する一次レセプター
を論じたMendelsohnらの論文(Cell 56 : 855 (1989))が
ある。最近になって見出されたことに、主要サブグルー
プのライノウイルスに対する一次レセプターの可溶性形
態である、可溶性細胞間付着分子-1 (sICAM-1)が、主要
サブグループのライノウイルス群による結合及びそれに
続く標的細胞の感染を阻害できるということがある（参
照：Marlinらの論文、Nature 344: 70 (1990)( 以下、M
arlinらの論文という。）なお、この論文の記載を、本
願明細書の内容として引用する。）。この主要サブグル
ープのライノウイルスは、通常の感冒感染の約45〜50％
を引き起こすものであるから、 sICAM-1及びその誘導体
の使用は、その予防及び治療にとって有益である。主要
サブグループのライノウイルスを検出する方法を得るこ
とは、有益なことである。ウイルス検出のアッセイ法及
び抗生物質及び cDNA プローブを使用したウイルス感染
の診断方法は、公知である（参照：Al-Nakibらの論文、
J. of Med. Virol. 20: 289 (1986)及びJ. of Med. Vir
ol. 29: 268 (1986)) 。しかし、これらのアッセイ法
は、その特異性又は使用方法のいずれかに欠点があり、
日常的な診断に適していないことが多い。米国特許第
4,376,110号及び第4,486,530 号は、モノクローナル抗
体を使用し、液体中に抗原性物質の存在を測定する" 二
部位 "又は" サンドイッチ "免疫定量アッセイ法を開示
する。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、液体
中のウイルスの存在の検出、例えば、主要サブグループ
のライノウイルスの存在の検出を、一次レセプターを使
用して" サンドイッチ "形態で行う、迅速、かつ再現可
能な方法を提供することである。
中のウイルスの存在の検出、例えば、主要サブグループ
のライノウイルスの存在の検出を、一次レセプターを使
用して" サンドイッチ "形態で行う、迅速、かつ再現可
能な方法を提供することである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明は、液体試料中の
ウイルス又は関連グループのウイルス群の存在を検出す
る方法であって、下記工程を有する方法である： (a) 液体試料を、その液体試料に不溶性である、ウイル
ス又は関連グループのウイルス群に対する固定化一次レ
セプターとインキュベートし、ウイルス又は１種以上の
関連グループのウイルスと固定化一次レセプターとの第
１不溶性複合体を形成する工程； (b) 第１不溶性複合体を、ウイルス又は関連グループの
ウイルス群に対するラベル化可溶性一次レセプターとイ
ンキュベートし、ラベル化可溶性レセプター、ウイルス
又は１種以上の関連グループのウイルス、及び固定化一
次レセプターの第２不溶性複合体を形成する工程； (c) 液体試料及び未反応ラベル化可溶性一次レセプター
から、第２不溶性複合体を分離する工程； (d) 固定化一次レセプターと結合したラベルの量又は未
反応ラベルの量のいずれかを測定する工程；及び (e) (d) 工程の測定値と、ウイルス又は関連グループの
ウイルス群を含まない対照試料の測定値を比較すること
により、液体試料中のウイルス又は関連グループのウイ
ルス群の存在を確認する工程である。
ウイルス又は関連グループのウイルス群の存在を検出す
る方法であって、下記工程を有する方法である： (a) 液体試料を、その液体試料に不溶性である、ウイル
ス又は関連グループのウイルス群に対する固定化一次レ
セプターとインキュベートし、ウイルス又は１種以上の
関連グループのウイルスと固定化一次レセプターとの第
１不溶性複合体を形成する工程； (b) 第１不溶性複合体を、ウイルス又は関連グループの
ウイルス群に対するラベル化可溶性一次レセプターとイ
ンキュベートし、ラベル化可溶性レセプター、ウイルス
又は１種以上の関連グループのウイルス、及び固定化一
次レセプターの第２不溶性複合体を形成する工程； (c) 液体試料及び未反応ラベル化可溶性一次レセプター
から、第２不溶性複合体を分離する工程； (d) 固定化一次レセプターと結合したラベルの量又は未
反応ラベルの量のいずれかを測定する工程；及び (e) (d) 工程の測定値と、ウイルス又は関連グループの
ウイルス群を含まない対照試料の測定値を比較すること
により、液体試料中のウイルス又は関連グループのウイ
ルス群の存在を確認する工程である。
【０００６】さらに、本発明は、液体試料中のウイルス
又は関連グループのウイルス群の存在を検出する方法で
あって、下記工程を有する方法である： (a) 液体試料を、ウイルス又は関連グループのウイルス
群に対するラベル化可溶性一次レセプターとインキュベ
ートし、ウイルス又は１種以上の関連グループのウイル
スと、ラベル化可溶性レセプターとの可溶性複合体を形
成する工程； (b) (a) の可溶性複合体を、液体試料に不溶性である、
ウイルス又は関連グループのウイルス群に対する固定化
一次レセプターとインキュベートし、ラベル化可溶性レ
セプター、ウイルス又は１種以上の関連グループのウイ
ルス、及び固定化一次レセプターの第２不溶性複合体を
形成する工程； (c) 液体試料及び未反応ラベル化可溶性レセプターか
ら、第２不溶性複合体を分離する工程； (d) 固定化一次レセプターと結合したラベルの量又は未
反応ラベルの量のいずれかを測定する工程；及び (e) (d) 工程の測定値と、ウイルス又は関連グループの
ウイルス群を含まない対照試料の測定値を比較すること
により、液体試料中のウイルス又は関連グループのウイ
ルス群の存在を確認する工程である。
又は関連グループのウイルス群の存在を検出する方法で
あって、下記工程を有する方法である： (a) 液体試料を、ウイルス又は関連グループのウイルス
群に対するラベル化可溶性一次レセプターとインキュベ
ートし、ウイルス又は１種以上の関連グループのウイル
スと、ラベル化可溶性レセプターとの可溶性複合体を形
成する工程； (b) (a) の可溶性複合体を、液体試料に不溶性である、
ウイルス又は関連グループのウイルス群に対する固定化
一次レセプターとインキュベートし、ラベル化可溶性レ
セプター、ウイルス又は１種以上の関連グループのウイ
ルス、及び固定化一次レセプターの第２不溶性複合体を
形成する工程； (c) 液体試料及び未反応ラベル化可溶性レセプターか
ら、第２不溶性複合体を分離する工程； (d) 固定化一次レセプターと結合したラベルの量又は未
反応ラベルの量のいずれかを測定する工程；及び (e) (d) 工程の測定値と、ウイルス又は関連グループの
ウイルス群を含まない対照試料の測定値を比較すること
により、液体試料中のウイルス又は関連グループのウイ
ルス群の存在を確認する工程である。
【０００７】さらに、本発明は、液体試料中のウイルス
又は関連グループのウイルス群を検出する方法であっ
て、下記工程を有する方法である： (a) 液体試料を、(i) その液体試料に不溶性である、ウ
イルス又は関連グループのウイルス群に対する固定化一
次レセプター；及び(ii)ウイルス又は関連グループのウ
イルス群に対するラベル化可溶性一次レセプターとイン
キュベートし、ラベル化可溶性レセプター、ウイルス又
は１種以上の関連グループのウイルス、及び固定化一次
レセプターの第２不溶性複合体を形成する工程； (b) 液体試料及び未反応ラベル化可溶性一次レセプター
から、第２不溶性複合体を分離する工程； (c) 固定化一次レセプターと結合したラベルの量又は未
反応ラベルの量のいずれかを測定する工程；及び (d) (c) 工程の測定値と、ウイルス又は関連グループの
ウイルス群を含まない対照試料の測定値を比較すること
により、液体試料中のウイルス又は関連グループのウイ
ルス群の存在を確認する工程である。
又は関連グループのウイルス群を検出する方法であっ
て、下記工程を有する方法である： (a) 液体試料を、(i) その液体試料に不溶性である、ウ
イルス又は関連グループのウイルス群に対する固定化一
次レセプター；及び(ii)ウイルス又は関連グループのウ
イルス群に対するラベル化可溶性一次レセプターとイン
キュベートし、ラベル化可溶性レセプター、ウイルス又
は１種以上の関連グループのウイルス、及び固定化一次
レセプターの第２不溶性複合体を形成する工程； (b) 液体試料及び未反応ラベル化可溶性一次レセプター
から、第２不溶性複合体を分離する工程； (c) 固定化一次レセプターと結合したラベルの量又は未
反応ラベルの量のいずれかを測定する工程；及び (d) (c) 工程の測定値と、ウイルス又は関連グループの
ウイルス群を含まない対照試料の測定値を比較すること
により、液体試料中のウイルス又は関連グループのウイ
ルス群の存在を確認する工程である。
【０００８】本願明細書中の用語" 一次レセプター "
は、ウイルス又は関連グループのウイルス群の初期細胞
付着を促進する、特定の細胞表面認識構造を意味する。
本願明細書中の用語" 主要グループのライノウイルス "
及び" 主要サブグループのライノウイルス "は、一次レ
セプターとして細胞間付着分子-1(ICAM-1)を用いるヒト
ライノウイルスを意味する。Rothleinらの論文において
ICAM-1分子の一般的議論がなされている(J.Immunol 13
7:1270(1986);なお、この論文の記載を、本明細書の内
容として引用する。）。本願明細書中の用語" 副次的グ
ループのライノウイルス "及び" 副次的サブグループの
ライノウイルス "とは、ICAM-1以外の一次レセプターを
用いるヒトライノウイルスを意味する。本願明細書中の
用語" 関連グループのウイルス群 "とは、少なくとも１
種の共通する一次レセプターを有するグループのウイル
ス群をいう。固定化一次レセプターは、固体の支持体上
に固定されるのが好ましく、固体の支持体上に固定する
前は、可溶性の形態であるのが好ましい。ラベル化可溶
性一次レセプターは、ラベル化される前は、可溶性の形
態であるのが好ましい。可溶性一次レセプターは、細胞
表面から化学的又は酵素的に解離するか、又は組み換え
DNA技術を介してトランケーション (truncation) する
（Marlinらの論文参照）。
は、ウイルス又は関連グループのウイルス群の初期細胞
付着を促進する、特定の細胞表面認識構造を意味する。
本願明細書中の用語" 主要グループのライノウイルス "
及び" 主要サブグループのライノウイルス "は、一次レ
セプターとして細胞間付着分子-1(ICAM-1)を用いるヒト
ライノウイルスを意味する。Rothleinらの論文において
ICAM-1分子の一般的議論がなされている(J.Immunol 13
7:1270(1986);なお、この論文の記載を、本明細書の内
容として引用する。）。本願明細書中の用語" 副次的グ
ループのライノウイルス "及び" 副次的サブグループの
ライノウイルス "とは、ICAM-1以外の一次レセプターを
用いるヒトライノウイルスを意味する。本願明細書中の
用語" 関連グループのウイルス群 "とは、少なくとも１
種の共通する一次レセプターを有するグループのウイル
ス群をいう。固定化一次レセプターは、固体の支持体上
に固定されるのが好ましく、固体の支持体上に固定する
前は、可溶性の形態であるのが好ましい。ラベル化可溶
性一次レセプターは、ラベル化される前は、可溶性の形
態であるのが好ましい。可溶性一次レセプターは、細胞
表面から化学的又は酵素的に解離するか、又は組み換え
DNA技術を介してトランケーション (truncation) する
（Marlinらの論文参照）。
【０００９】固体の支持体は、従前のアッセイ法で有用
な公知の支持体材料のどれでもよく、例えば、セルロー
ス、セファロース、ポリスチレン、ナイロン、ポリアク
リルアミド、ラテックス、ガラス、磁化できる粒子、ナ
イロンセルロースなどである。固体の支持体として、こ
のうちポリスチレンが好ましい。一次レセプターは、標
的ウイルスが結合できる固定化一次レセプターを製造す
る方法により、固体の支持体上に固定することができ
る。例えば、一次レセプターをマイクロタイターウェル
において吸収することができ（後述する実施例１及びEr
lichらの論文(Methods in Emzymology 68: 443 (1979)
に記載）、又は二官能試薬を使用して、固体の支持体上
に固定することができる（Kagedal らの論文、Clinica
Chimica Acta 78: 103 (1977) ）。本発明の方法で使用
される固定化一次レセプターの量は、検出可能な量の標
的ウイルスを結合できるものでなければならない。この
量は、標的ウイルス、一次レセプター、使用するラベル
などにより変化し、実験的に決めなければならない。一
般的に、液体試料50μl に対し、固体の支持体上に固定
される一次レセプターは約10μg/ml〜約20μg/mlである
ことが好ましい。
な公知の支持体材料のどれでもよく、例えば、セルロー
ス、セファロース、ポリスチレン、ナイロン、ポリアク
リルアミド、ラテックス、ガラス、磁化できる粒子、ナ
イロンセルロースなどである。固体の支持体として、こ
のうちポリスチレンが好ましい。一次レセプターは、標
的ウイルスが結合できる固定化一次レセプターを製造す
る方法により、固体の支持体上に固定することができ
る。例えば、一次レセプターをマイクロタイターウェル
において吸収することができ（後述する実施例１及びEr
lichらの論文(Methods in Emzymology 68: 443 (1979)
に記載）、又は二官能試薬を使用して、固体の支持体上
に固定することができる（Kagedal らの論文、Clinica
Chimica Acta 78: 103 (1977) ）。本発明の方法で使用
される固定化一次レセプターの量は、検出可能な量の標
的ウイルスを結合できるものでなければならない。この
量は、標的ウイルス、一次レセプター、使用するラベル
などにより変化し、実験的に決めなければならない。一
般的に、液体試料50μl に対し、固体の支持体上に固定
される一次レセプターは約10μg/ml〜約20μg/mlである
ことが好ましい。
【００１０】一次レセプターは、公知の手段、例えば、
酵素的、蛍光性、放射性、生物発光性、化学発光性又は
着色性ラベル、あるいはマーカーでラベルすることがで
きる。ただし、標的ウイルスが一次レセプターに結合す
るのに有害な効果を有するものは除く。例えば、実施例
１記載の方法を、本発明の目的を達成するために、一次
レセプターをビオチニル化する場合に使用することがで
き、あるいは woodhead らの論文(Clinical Chemistry
29(8): 1474 (1983)に記載されている方法を、本発明の
目的を達成するために、一次レセプターをラベル化する
場合に使用することができる。本発明の方法で使用する
ラベル化可溶性レセプターの量は、ラベル化可溶性レセ
プターに結合するウイルスの検出を可能にするのに充分
な量でなければならない。この量は、主に使用するラベ
ルのタイプによって変わってくるものであり、実験的に
決めなければならない。この一次レセプターは、実施例
１記載の方法を使用してビオチニル化するのが好まし
い。結合されたビオチニル化一次レセプターは、次い
で、ストレプトアビジン(streptavidin)−酵素複合体、
例えば、ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ複合体
により検出する。
酵素的、蛍光性、放射性、生物発光性、化学発光性又は
着色性ラベル、あるいはマーカーでラベルすることがで
きる。ただし、標的ウイルスが一次レセプターに結合す
るのに有害な効果を有するものは除く。例えば、実施例
１記載の方法を、本発明の目的を達成するために、一次
レセプターをビオチニル化する場合に使用することがで
き、あるいは woodhead らの論文(Clinical Chemistry
29(8): 1474 (1983)に記載されている方法を、本発明の
目的を達成するために、一次レセプターをラベル化する
場合に使用することができる。本発明の方法で使用する
ラベル化可溶性レセプターの量は、ラベル化可溶性レセ
プターに結合するウイルスの検出を可能にするのに充分
な量でなければならない。この量は、主に使用するラベ
ルのタイプによって変わってくるものであり、実験的に
決めなければならない。この一次レセプターは、実施例
１記載の方法を使用してビオチニル化するのが好まし
い。結合されたビオチニル化一次レセプターは、次い
で、ストレプトアビジン(streptavidin)−酵素複合体、
例えば、ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ複合体
により検出する。
【００１１】ラベル化可溶性レセプター、ウイルス、及
び固体の支持体と結合した固定化レセプターからなる第
２不溶性複合体（最終的な不溶性複合体）を、３種のア
ッセイ法により形成することができる。この３種のアッ
セイ法を、それぞれフォワードアッセイ法、リバースア
ッセイ法及び同時アッセイ法という。フォワードアッセ
イ法においては、最初に液体試料を固定化レセプターと
ともに適当な時間インキュベートして第１不溶性複合体
を形成し、次いでその第１不溶性複合体を、ラベル化可
溶性レセプターとともに適当な時間インキュベートして
第２不溶性複合体を形成する。このフォワードアッセイ
法では、固定化レセプター及びラベル化可溶性レセプタ
ーを、同じ一次レセプター、あるいは同じ標的ウイルス
又は関連グループのウイルス群に対する２種の異なる一
次レセプターとすることができ、このレセプターは、標
的ウイルス又は関連グループのウイルス群に対するそれ
ぞれの結合をお互いに干渉しないものである。リバース
アッセイ法においては、最初に液体試料をラベル化可溶
性レセプターとともに適当な時間インキュベートしてラ
ベル化可溶性レセプター及びウイルスの可溶性複合体を
形成する。次いでその可溶性複合体を、固定化レセプタ
ーとともに適当な時間インキュベートして第２不溶性複
合体を形成する。このリバースアッセイ法では、固定化
レセプター及びラベル化可溶性レセプターは、同じ標的
ウイルス又は関連グループのウイルス群に対する２種の
一次レセプターであって、標的ウイルス又は関連グルー
プのウイルス群に対するそれぞれの結合をお互いに干渉
しないものでなければばらない。
び固体の支持体と結合した固定化レセプターからなる第
２不溶性複合体（最終的な不溶性複合体）を、３種のア
ッセイ法により形成することができる。この３種のアッ
セイ法を、それぞれフォワードアッセイ法、リバースア
ッセイ法及び同時アッセイ法という。フォワードアッセ
イ法においては、最初に液体試料を固定化レセプターと
ともに適当な時間インキュベートして第１不溶性複合体
を形成し、次いでその第１不溶性複合体を、ラベル化可
溶性レセプターとともに適当な時間インキュベートして
第２不溶性複合体を形成する。このフォワードアッセイ
法では、固定化レセプター及びラベル化可溶性レセプタ
ーを、同じ一次レセプター、あるいは同じ標的ウイルス
又は関連グループのウイルス群に対する２種の異なる一
次レセプターとすることができ、このレセプターは、標
的ウイルス又は関連グループのウイルス群に対するそれ
ぞれの結合をお互いに干渉しないものである。リバース
アッセイ法においては、最初に液体試料をラベル化可溶
性レセプターとともに適当な時間インキュベートしてラ
ベル化可溶性レセプター及びウイルスの可溶性複合体を
形成する。次いでその可溶性複合体を、固定化レセプタ
ーとともに適当な時間インキュベートして第２不溶性複
合体を形成する。このリバースアッセイ法では、固定化
レセプター及びラベル化可溶性レセプターは、同じ標的
ウイルス又は関連グループのウイルス群に対する２種の
一次レセプターであって、標的ウイルス又は関連グルー
プのウイルス群に対するそれぞれの結合をお互いに干渉
しないものでなければばらない。
【００１２】同時アッセイ法においては、液体試料を、
ラベル化可溶性レセプター及び固定化レセプターととも
に同時にインキュベートし、第２不溶性複合体を形成す
る。この同時アッセイ法では、固定化レセプター及びラ
ベル化可溶性レセプターは、同じ標的ウイルス又は関連
グループのウイルス群に対する２種の一次レセプターで
あって、標的ウイルス又は関連グループのウイルス群に
対するそれぞれの結合をお互いに干渉しないものでなけ
ればばらない。これらフォワードアッセイ法、リバース
アッセイ法及び同時アッセイ法の各工程におけるインキ
ュベート条件は、時間、温度及び最終的なインキュベー
ト容量によって変化するが、各インキュベート工程は、
室温で、少なくとも15分間、好ましくは30分間以上行う
べきである。インキュベート後、第２不溶性複合体を、
インキュベート培地（すなわち、液体試料、未結合ラベ
ル化可溶性レセプターなどを含む。）から分離する。第
２不溶性複合体は、インキュベート培地に不溶性である
から、従来の手段でインキュベート培地から分離するこ
とができる。ラベル化可溶性レセプターの取り込みは、
複合体に結合している標的ウイルスの存在と直接関連す
る。最終的な不溶性複合体と結合したラベルの量は、少
なくとも２種の方法で測定することができる。その方法
は、(1) 第２不溶性複合体と結合したラベルを直接定量
するか、又は(2) 分離後、インキュベート培地中に残っ
ているラベルを間接的に定量し、次いで使用した総ラベ
ル量から先に測定したラベルの量を引くことである。適
当な定量法は、使用したラベルに大きく依存して決ま
る。
ラベル化可溶性レセプター及び固定化レセプターととも
に同時にインキュベートし、第２不溶性複合体を形成す
る。この同時アッセイ法では、固定化レセプター及びラ
ベル化可溶性レセプターは、同じ標的ウイルス又は関連
グループのウイルス群に対する２種の一次レセプターで
あって、標的ウイルス又は関連グループのウイルス群に
対するそれぞれの結合をお互いに干渉しないものでなけ
ればばらない。これらフォワードアッセイ法、リバース
アッセイ法及び同時アッセイ法の各工程におけるインキ
ュベート条件は、時間、温度及び最終的なインキュベー
ト容量によって変化するが、各インキュベート工程は、
室温で、少なくとも15分間、好ましくは30分間以上行う
べきである。インキュベート後、第２不溶性複合体を、
インキュベート培地（すなわち、液体試料、未結合ラベ
ル化可溶性レセプターなどを含む。）から分離する。第
２不溶性複合体は、インキュベート培地に不溶性である
から、従来の手段でインキュベート培地から分離するこ
とができる。ラベル化可溶性レセプターの取り込みは、
複合体に結合している標的ウイルスの存在と直接関連す
る。最終的な不溶性複合体と結合したラベルの量は、少
なくとも２種の方法で測定することができる。その方法
は、(1) 第２不溶性複合体と結合したラベルを直接定量
するか、又は(2) 分離後、インキュベート培地中に残っ
ているラベルを間接的に定量し、次いで使用した総ラベ
ル量から先に測定したラベルの量を引くことである。適
当な定量法は、使用したラベルに大きく依存して決ま
る。
【００１３】次に、本発明の方法では、第２不溶性複合
体と結合して、測定されたラベルの量を、参考試料の第
２不溶性複合体と結合して、測定されたラベルの量と比
較する。このラベルの量は、液体試料からシグナルを得
るために用いたのと同じラベル、方法及び反応条件で参
考試料を測定したものであり、この参考試料は、標的ウ
イルス又は如何なる種類の標的グループの関連ウイルス
群をも含んでいないものであり、参考試料から検出され
るラベルは、バックグラウンドシグナルと考えられるも
のである。参考試料のバックグラウンドシグナルを越え
て液体試料で検出されるシグナルは、液体試料中に標的
ウイルス又は標的グループの関連ウイルス群が存在する
ことを示している。本発明の方法の好ましい態様におい
ては、標的グループの関連ウイルス群が、主要グループ
のライノウイルスであり、固定化一次レセプターが、
ポリスチレンに固定されたsICAM-1 であり、ラベル化可
溶性一次レセプターが、ビオチニル化 sICAM-1であり、
かつ使用するアッセイ法がフォワードアッセイ法であ
る。次の実施例は、主要グループのライノウイルスを検
出する、本発明の方法を説明したものである。
体と結合して、測定されたラベルの量を、参考試料の第
２不溶性複合体と結合して、測定されたラベルの量と比
較する。このラベルの量は、液体試料からシグナルを得
るために用いたのと同じラベル、方法及び反応条件で参
考試料を測定したものであり、この参考試料は、標的ウ
イルス又は如何なる種類の標的グループの関連ウイルス
群をも含んでいないものであり、参考試料から検出され
るラベルは、バックグラウンドシグナルと考えられるも
のである。参考試料のバックグラウンドシグナルを越え
て液体試料で検出されるシグナルは、液体試料中に標的
ウイルス又は標的グループの関連ウイルス群が存在する
ことを示している。本発明の方法の好ましい態様におい
ては、標的グループの関連ウイルス群が、主要グループ
のライノウイルスであり、固定化一次レセプターが、
ポリスチレンに固定されたsICAM-1 であり、ラベル化可
溶性一次レセプターが、ビオチニル化 sICAM-1であり、
かつ使用するアッセイ法がフォワードアッセイ法であ
る。次の実施例は、主要グループのライノウイルスを検
出する、本発明の方法を説明したものである。
【００１４】
【実施例】実施例１ sICAMを使用する主要グループのライノウイ
ルスの検出 Ａ．セルライン アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ATC
C）（ロックビル，ＭＤ）からヒーラー細胞（頸部ヒト
癌腫；CCL2F6333 ）を得た。該細胞を、ゲンタマイシン
50μg/ml、L ‐グルタミン 1 mM （GIBCO ，グランドア
イランド，ＮＹ）及びマイコプラズマを特異的にスクリ
ーニングし、熱インキュベート(56 ℃、30分) したウシ
胎児血清（FCS)10％及びウイルス（ホワイタッカー(Whi
ttaker),M.A.バイオプロダクツ，ウォーカーズビル，Ｍ
Ｄ）を補充したRPMI-1640 培養培地に維持した。複数の
75cm2 組織培養フラスコ（コーニング社製）中に該細胞
を接種し、90％が合流(confluent）した時点で該単一層
を0.25％トリプシンと0.1 mMEDTA （GIBCO ）で37℃で
５分間インキュベートすることによって、該細胞を採取
した。トリプシン化後、該細胞を遠心分離（500 × g）
で１回洗浄し、96ウェル平底マイクロタイタープレート
〔リンブロ（Linbro）No.76-003-05〕に培養ウェル当た
り20,500個を敷いた。24時間後に該細胞は80〜90％が合
流し、以下に記載した力価測定前のウイルスで抗原投与
した。 Ｂ．ウイルスストック 使用したウイルスを以下の表１に掲げた。
ルスの検出 Ａ．セルライン アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ATC
C）（ロックビル，ＭＤ）からヒーラー細胞（頸部ヒト
癌腫；CCL2F6333 ）を得た。該細胞を、ゲンタマイシン
50μg/ml、L ‐グルタミン 1 mM （GIBCO ，グランドア
イランド，ＮＹ）及びマイコプラズマを特異的にスクリ
ーニングし、熱インキュベート(56 ℃、30分) したウシ
胎児血清（FCS)10％及びウイルス（ホワイタッカー(Whi
ttaker),M.A.バイオプロダクツ，ウォーカーズビル，Ｍ
Ｄ）を補充したRPMI-1640 培養培地に維持した。複数の
75cm2 組織培養フラスコ（コーニング社製）中に該細胞
を接種し、90％が合流(confluent）した時点で該単一層
を0.25％トリプシンと0.1 mMEDTA （GIBCO ）で37℃で
５分間インキュベートすることによって、該細胞を採取
した。トリプシン化後、該細胞を遠心分離（500 × g）
で１回洗浄し、96ウェル平底マイクロタイタープレート
〔リンブロ（Linbro）No.76-003-05〕に培養ウェル当た
り20,500個を敷いた。24時間後に該細胞は80〜90％が合
流し、以下に記載した力価測定前のウイルスで抗原投与
した。 Ｂ．ウイルスストック 使用したウイルスを以下の表１に掲げた。
【００１５】
【表１】 表 １ ウイルスストックのまとめ ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ ウイルス 科 出 処 HRV-レセプターa ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ コクサッキーＡ１３ ピコルナウイルス ATCC VR-1019 主要 ライノウイルス１Ｂ ピコルナウイルス ATCC VR-481 副次的 ライノウイルス ２ ピコルナウイルス ATCC VR-482 副次的 ライノウイルス３４ ピコルナウイルス ATCC VR-1144 主要 ライノウイルス４９ ピコルナウイルス ATCC VR-516 副次的 ライノウイルス５４ ピコルナウイルス ATCC VR-521 主要 ライノウイルス８９ ピコルナウイルス ATCC VR-1199 主要 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━a 主要：ＩＣＡＭ‐１ 副次的：非ＩＣＡＭ‐１レセプター
【００１６】５％ FCSを補充したRPMI-1640 培地中で該
ヒーラー細胞を該ウイルスに感染させることによって、
Ａで調製したヒーラー細胞中にウイルスストックを増幅
及び膨張させ、次いで、−80℃で該感染した細胞を凍結
した。ライノウイルスについては、培地に更にMgCl2 20
mMを補充した。Abraham らの論文( J. of Virol.54, 40
9 (1984)) に記載された方法の改良法を用いて、コクサ
ッキーＡ１３を除く全てのウイルスストックを濃縮し
た。即ち、１％ウシ胎児血清を含有するRPMI-1640 培地
中で４〜６時間、個々のライノウイルスでヒーラー細胞
を感染した後、２％ウシ胎児血清を含有する培地中でイ
ンキュベートした。次いで、普遍細胞変性効果を観察
（18〜48時間）した後、このようにして調製した培養培
地を−80℃で凍結し、そして、33℃で解かした。次い
で、ポリエチレングリコールでウイルス上清液を析出さ
せ、30％ショ糖クッション（ベックマンSW41ローターで
２時間；34,900 rpm）に通してペレットにした。次い
で、下層の0.5 mlを渦巻かせ、プールし、−80℃で等分
して保存した。
ヒーラー細胞を該ウイルスに感染させることによって、
Ａで調製したヒーラー細胞中にウイルスストックを増幅
及び膨張させ、次いで、−80℃で該感染した細胞を凍結
した。ライノウイルスについては、培地に更にMgCl2 20
mMを補充した。Abraham らの論文( J. of Virol.54, 40
9 (1984)) に記載された方法の改良法を用いて、コクサ
ッキーＡ１３を除く全てのウイルスストックを濃縮し
た。即ち、１％ウシ胎児血清を含有するRPMI-1640 培地
中で４〜６時間、個々のライノウイルスでヒーラー細胞
を感染した後、２％ウシ胎児血清を含有する培地中でイ
ンキュベートした。次いで、普遍細胞変性効果を観察
（18〜48時間）した後、このようにして調製した培養培
地を−80℃で凍結し、そして、33℃で解かした。次い
で、ポリエチレングリコールでウイルス上清液を析出さ
せ、30％ショ糖クッション（ベックマンSW41ローターで
２時間；34,900 rpm）に通してペレットにした。次い
で、下層の0.5 mlを渦巻かせ、プールし、−80℃で等分
して保存した。
【００１７】Ｃ．細胞変性効果（ＣＰＥ）のアッセイ 全ウイルスについて、培養ウェル当たり20,500個の割合
でヒーラー細胞を敷いた。24時間後に培地を除き、Ｂで
調製した、膨張したヒーラ−ウイルスストックの希釈液
を含有する培養培地（５％ FCSを補充したRPMI-1640 ；
ライノウイルス培地に更にMgCl2 20mMを補充した）と置
換した。５％ CO2の湿った空気中で37℃（コクサッキ
ー）または33℃（ライノウイルス）で該プレートをイン
キュベートし96時間静置した。倒立顕微鏡を使用して観
察したところ24〜72時間でＣＰＥが見られた。定性的方
法でこれらの点でＣＰＥを肉眼で勘定した。以下の方法
での直接ウイルス抗原投与のあと、96時間で定量的読み
取り法で測定した。即ち、培地を吸引除去し、20％メタ
ノールを溶媒とする0.5 ％クリスタルバイオレット溶液
45μl を５分間各培地ウェルに添加し、次いで、該プレ
ートを水で激しく洗浄し、空気で乾燥し、570 nmでマイ
クロプレートリーダー（ダイナテックMR600 ）上で読み
取った。各培養ウェルに残った成育可能な細胞の数を測
定するのに細胞数対光学密度（ＯＤ）の標準曲線プロッ
トを使用した。ＣＰＥのパーセント減少率は以下のよう
にして決定した：
でヒーラー細胞を敷いた。24時間後に培地を除き、Ｂで
調製した、膨張したヒーラ−ウイルスストックの希釈液
を含有する培養培地（５％ FCSを補充したRPMI-1640 ；
ライノウイルス培地に更にMgCl2 20mMを補充した）と置
換した。５％ CO2の湿った空気中で37℃（コクサッキ
ー）または33℃（ライノウイルス）で該プレートをイン
キュベートし96時間静置した。倒立顕微鏡を使用して観
察したところ24〜72時間でＣＰＥが見られた。定性的方
法でこれらの点でＣＰＥを肉眼で勘定した。以下の方法
での直接ウイルス抗原投与のあと、96時間で定量的読み
取り法で測定した。即ち、培地を吸引除去し、20％メタ
ノールを溶媒とする0.5 ％クリスタルバイオレット溶液
45μl を５分間各培地ウェルに添加し、次いで、該プレ
ートを水で激しく洗浄し、空気で乾燥し、570 nmでマイ
クロプレートリーダー（ダイナテックMR600 ）上で読み
取った。各培養ウェルに残った成育可能な細胞の数を測
定するのに細胞数対光学密度（ＯＤ）の標準曲線プロッ
トを使用した。ＣＰＥのパーセント減少率は以下のよう
にして決定した：
【００１８】
【数１】
【００１９】線状回帰法によって決定したときに50％Ｃ
ＰＥをもたらすウイルス供与量を決定することによっ
て、ウイルスストックの力価を96時間で測定した。特に
特定しない限り、50％ＣＰＥ（100 TCID50）をもたらす
組織培養感染供与量の 100倍量を使用した。
ＰＥをもたらすウイルス供与量を決定することによっ
て、ウイルスストックの力価を96時間で測定した。特に
特定しない限り、50％ＣＰＥ（100 TCID50）をもたらす
組織培養感染供与量の 100倍量を使用した。
【００２０】 Ｄ．ビオチニル化 sICAM-1を使用したＣＰＥアッセイ法 Marlinらの論文に記載されている方法で sICAM-1を調製
した。sICAM-1 を以下の方法でビオチニル化した。即
ち、4200μｇの sICAM-1を2.8 mlの 100mM酢酸ナトリウ
ム緩衝液（pH5.5 ）に溶解し、４℃で一夜透析した。該
透析した sICAM-1溶液を回収して測定し、次いで、５mM
最終過ヨウ素酸ナトリウム溶液で０℃で30分間インキュ
ベートした。得られた sICAM-1／過ヨウ素酸塩溶液を４
℃で一夜透析した。該透析した sICAM-1溶液を回収して
測定し、次いで、１mM最終ビオチン‐ＬＣ‐ヒドラジン
（Pierce＃21340)で室温で５時間インキュベートした。
このようにして調製したビオチニル化 sICAM-1を４℃で
ＰＢＳを介して一晩透析した。該透析したビオチニル化
sICAM-1を回収して測定し、等分し、次いで、−80℃で
保存した。25μｇ／mlの sICAM-1と共に又は sICAM-1な
しに、100 TCID50で様々な副次的または主要なライノウ
イルスを使用して、上記Ｃに記載した操作を使用するウ
イルスＣＰＥアッセイ法でビオチニル化 sICAM-1を試験
した。この試験の結果を下記の表２に掲げた。
した。sICAM-1 を以下の方法でビオチニル化した。即
ち、4200μｇの sICAM-1を2.8 mlの 100mM酢酸ナトリウ
ム緩衝液（pH5.5 ）に溶解し、４℃で一夜透析した。該
透析した sICAM-1溶液を回収して測定し、次いで、５mM
最終過ヨウ素酸ナトリウム溶液で０℃で30分間インキュ
ベートした。得られた sICAM-1／過ヨウ素酸塩溶液を４
℃で一夜透析した。該透析した sICAM-1溶液を回収して
測定し、次いで、１mM最終ビオチン‐ＬＣ‐ヒドラジン
（Pierce＃21340)で室温で５時間インキュベートした。
このようにして調製したビオチニル化 sICAM-1を４℃で
ＰＢＳを介して一晩透析した。該透析したビオチニル化
sICAM-1を回収して測定し、等分し、次いで、−80℃で
保存した。25μｇ／mlの sICAM-1と共に又は sICAM-1な
しに、100 TCID50で様々な副次的または主要なライノウ
イルスを使用して、上記Ｃに記載した操作を使用するウ
イルスＣＰＥアッセイ法でビオチニル化 sICAM-1を試験
した。この試験の結果を下記の表２に掲げた。
【００２１】
【表２】 表 ２ ピコルナウイルス細胞変性の阻害に関 するビオチニル化 sICAM-1の効果 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ ウイルス株 レセプターグループ ％阻害 ＣＰＥa ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ ライノウイルス５４ 主要 ９２ ライノウイルス３４ 主要 １００ ライノウイルス８９ 主要 ５６ コクサッキーＡ１３ 主要 １００ ライノウイルス ２ 副次的 ０ ライノウイルス１Ｂ 副次的 ０ ライノウイルス４９ 副次的 ０ ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━a 全ウイルス株の100 TCID50で、ヒーラー細胞単一層に
ついて測定したＣＰＥ；ビオチニル化 sICAM-1 50 μg
／ml これらの結果は、ビオチニル化 sICAM-1は主要なグルー
プのライノウイルスの阻害に活性であるが、副次的グル
ープのウイルスに対しては活性がないことを証明してい
る。
ついて測定したＣＰＥ；ビオチニル化 sICAM-1 50 μg
／ml これらの結果は、ビオチニル化 sICAM-1は主要なグルー
プのライノウイルスの阻害に活性であるが、副次的グル
ープのウイルスに対しては活性がないことを証明してい
る。
【００２２】Ｅ．フォワードアッセイ法を使用したライ
ノウイルスの検出 sICAM-1を下記方法で固定した。即ち、50μl の sICAM-
1溶液（ PBS中に20μg ／mlで溶解した）をNUNCマキシ
ソープ（maxisorp）96ウェルの各ボトムにピペットで注
入し、37℃で60分間インキュベートした。次いで、各ウ
ェルを 200μlのリン酸塩で緩衝化したpH 7.5の食塩水
（PBS ）で洗浄した。 ｉ）以下の方法でフォワードアッセイ法を行った：固定
化した sICAM-1を入れたNUNCマキシソープ96ウェルの各
々に 200μl の２％ウシ血清アルブミン／リン酸塩緩衝
化食塩水（ BSA‐PBS ）を添加し、37℃で60分間インキ
ュベートした。これはブロッキング工程を構成する。上
記のＢで調製したウイルスを希釈して適当な希釈度に
し、該ウェルに添加し、４℃または室温(RT)で２〜５時
間インキュベートした。次いで、 200μl のPBS で該ウ
ェルを５回洗浄した。次いで、各ウェルに上記で調製し
たビオチニル化 sICAM-1の50μl を添加し、室温で30分
間インキュベートした。各ウェルに50μl のストレプト
アビダンペルオキシダーゼ複合体（SA‐HRP ）（1:4000
と示唆された作業在庫品）〔Zymed ＃43‐4323〕を添加
し、室温で30分間インキュベートした。次いで、200 μ
l のPBS 中で該ウェルを洗浄した。次いで、各ウェルに
200 μl の基質、即ち、2,2-アジノ‐ジ（3-エチルベン
ズチアゾリン）スルホン酸（ABTS）（メーカーの溶液）
（Zymed ＃00‐240 ）を添加し、室温で10〜240 分間イ
ンキュベートした。次いで、それぞれのウェルの光学密
度をダイナテックMR600 プレートリーダーを使用して 4
10nmで測定した。この分析の結果を下記の表３に掲げ
た。
ノウイルスの検出 sICAM-1を下記方法で固定した。即ち、50μl の sICAM-
1溶液（ PBS中に20μg ／mlで溶解した）をNUNCマキシ
ソープ（maxisorp）96ウェルの各ボトムにピペットで注
入し、37℃で60分間インキュベートした。次いで、各ウ
ェルを 200μlのリン酸塩で緩衝化したpH 7.5の食塩水
（PBS ）で洗浄した。 ｉ）以下の方法でフォワードアッセイ法を行った：固定
化した sICAM-1を入れたNUNCマキシソープ96ウェルの各
々に 200μl の２％ウシ血清アルブミン／リン酸塩緩衝
化食塩水（ BSA‐PBS ）を添加し、37℃で60分間インキ
ュベートした。これはブロッキング工程を構成する。上
記のＢで調製したウイルスを希釈して適当な希釈度に
し、該ウェルに添加し、４℃または室温(RT)で２〜５時
間インキュベートした。次いで、 200μl のPBS で該ウ
ェルを５回洗浄した。次いで、各ウェルに上記で調製し
たビオチニル化 sICAM-1の50μl を添加し、室温で30分
間インキュベートした。各ウェルに50μl のストレプト
アビダンペルオキシダーゼ複合体（SA‐HRP ）（1:4000
と示唆された作業在庫品）〔Zymed ＃43‐4323〕を添加
し、室温で30分間インキュベートした。次いで、200 μ
l のPBS 中で該ウェルを洗浄した。次いで、各ウェルに
200 μl の基質、即ち、2,2-アジノ‐ジ（3-エチルベン
ズチアゾリン）スルホン酸（ABTS）（メーカーの溶液）
（Zymed ＃00‐240 ）を添加し、室温で10〜240 分間イ
ンキュベートした。次いで、それぞれのウェルの光学密
度をダイナテックMR600 プレートリーダーを使用して 4
10nmで測定した。この分析の結果を下記の表３に掲げ
た。
【００２３】
【表３】 表 ３ ビオチニル化 sICAM-1による主要グループのライノ ウイルスの検出（副次的ライノウイルスではない） ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ ウイルス株 レセプターグループ 光学密度a ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ 平均値±ＳＤ ライノウイルス５４ 主要 ０．５８６±０．０４３ ライノウイルス３４ 主要 １．０１４±０．１３２ ライノウイルス８９ 主要 ０．１２０±０．０１４ ライノウイルス１Ｂ 副次的 ＜０．０５０ ライノウイルス ２ 副次的 ＜０．０５０ ライノウイルス４９ 副次的 ＜０．０５０ ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━a 10,000 TCID50 でウイルスを一夜インキュベートし、
上記の如くして100 μｇ／mlでビオチニル化 sICAM-1で
検出した。光学密度は３連で培養したものの平均値±Ｓ
Ｄとして表示した。
上記の如くして100 μｇ／mlでビオチニル化 sICAM-1で
検出した。光学密度は３連で培養したものの平均値±Ｓ
Ｄとして表示した。
【００２４】このデータは、３種の主要なグループのラ
イノウイルス（３４、５４及び８９）を検出できるが、
３種の副次的なグループのライノウイルス（１Ｂ、２及
び４９）はいかなる顕著な発色もしないことを示してい
る。 ii）上記のフォワードアッセイ法 操作の変法を使用し
た。ここで、ABC ペルオキシダーゼキット（Pierce＃32
052 ）をSA‐HRP の代わりに使用した。１％ BSA‐PBS
で希釈した以外は、メーカーの説明書に従って該キット
を使用した。この分析の結果を下記の表４に掲げた。
イノウイルス（３４、５４及び８９）を検出できるが、
３種の副次的なグループのライノウイルス（１Ｂ、２及
び４９）はいかなる顕著な発色もしないことを示してい
る。 ii）上記のフォワードアッセイ法 操作の変法を使用し
た。ここで、ABC ペルオキシダーゼキット（Pierce＃32
052 ）をSA‐HRP の代わりに使用した。１％ BSA‐PBS
で希釈した以外は、メーカーの説明書に従って該キット
を使用した。この分析の結果を下記の表４に掲げた。
【００２５】
【表４】 表 ４ ABC ペルオキシダーゼキットを用いたライノウイルス３４の検出の向上 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ ウイルスインキュベーション 光学密度b 光学密度b 時間a SA‐HRP SA‐ビオチン‐HRP ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ １．５時間 ０．１１０ ０．３７２ ３．０時間 ０．２４３ ０．７６２ ６．０時間 ０．４３１ １．４２０ ２４．０時間 ０．５０４ １．６９２ ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━a 100 TCID50でライノウイルス３４を、及びビオチニル
化 sICAM-1 75μg ／mlb SA‐HRP ＝ストレプアビジンホースラディッシュペル
オキシダーゼ；SA‐ビオチン‐HRP ＝ストレプアビジン
ビオチニル化ホースラディッシュペルオキシダーゼ（AB
C キット）。
化 sICAM-1 75μg ／mlb SA‐HRP ＝ストレプアビジンホースラディッシュペル
オキシダーゼ；SA‐ビオチン‐HRP ＝ストレプアビジン
ビオチニル化ホースラディッシュペルオキシダーゼ（AB
C キット）。
【００２６】ABC ペルオキシダーゼ試薬（SA‐ビオチン
‐HRP ）は、全ウイルストッラッピングインキュベーシ
ョン時間でシグナルを増幅し、最短インキュベーション
時間で応答を向上させた。その結果、より高いシグナル
をより速く得ることを可能にした。 iii)上記のＥ（ｉ）及びＥ（ii）に記載した操作を使用
して、３時間ウイルス（ライノウイルス３４）インキュ
ベーション時間で、但しウイルス濃度を変化させてアッ
セイを行った。この分析の結果を図４に示した。 iv）固定した sICAM-1によって、一夜インキュベートし
たあと２種の異なる濃度でＨＲＶ５４をトラップし、そ
して、上記のＥ（ｉ）に記載した操作を使用して、ビオ
チニル化 sICAM-1、SA-HRP及び基質を添加することによ
って検出した。この分析の結果を図１に示した。該デー
タは、この結果がウイルスの濃度に依存していることを
示した。 ｖ）上記のＥ（ｉ）に記載した操作を使用して、 sICAM
-1でトラップしたあと僅か１時間の時点でライノウイル
ス５４が検出された。この分析の結果を図２に示した。 vi）僅か1000TCID50の濃度でライノウイルス５４が検出
され、ライノウイルス２はいかなる試験濃度においても
検出されなかった。ライノウイルス５４及びライノウイ
ルス２の両方を、上記のＥ（ｉ）に記載した操作を使用
して、 sICAM-1と３時間インキュベートしたあとトラッ
プした。このアッセイの結果を図３に示した。
‐HRP ）は、全ウイルストッラッピングインキュベーシ
ョン時間でシグナルを増幅し、最短インキュベーション
時間で応答を向上させた。その結果、より高いシグナル
をより速く得ることを可能にした。 iii)上記のＥ（ｉ）及びＥ（ii）に記載した操作を使用
して、３時間ウイルス（ライノウイルス３４）インキュ
ベーション時間で、但しウイルス濃度を変化させてアッ
セイを行った。この分析の結果を図４に示した。 iv）固定した sICAM-1によって、一夜インキュベートし
たあと２種の異なる濃度でＨＲＶ５４をトラップし、そ
して、上記のＥ（ｉ）に記載した操作を使用して、ビオ
チニル化 sICAM-1、SA-HRP及び基質を添加することによ
って検出した。この分析の結果を図１に示した。該デー
タは、この結果がウイルスの濃度に依存していることを
示した。 ｖ）上記のＥ（ｉ）に記載した操作を使用して、 sICAM
-1でトラップしたあと僅か１時間の時点でライノウイル
ス５４が検出された。この分析の結果を図２に示した。 vi）僅か1000TCID50の濃度でライノウイルス５４が検出
され、ライノウイルス２はいかなる試験濃度においても
検出されなかった。ライノウイルス５４及びライノウイ
ルス２の両方を、上記のＥ（ｉ）に記載した操作を使用
して、 sICAM-1と３時間インキュベートしたあとトラッ
プした。このアッセイの結果を図３に示した。
【図１】図１は、ビオチニル化 sICAM-1を、数種の投与
濃度で用いた場合における、主要なライノウイルス 54
を検出する能力を示す。〔●〕は、30,000 TCID50 でウ
イルスを一晩インキュベートした結果を、〔▲〕は、1
0,000 TCID50 でウイルスを一晩インキュベートした結
果を示している。これらの結果は、３連で行った培養の
平均±SDである。
濃度で用いた場合における、主要なライノウイルス 54
を検出する能力を示す。〔●〕は、30,000 TCID50 でウ
イルスを一晩インキュベートした結果を、〔▲〕は、1
0,000 TCID50 でウイルスを一晩インキュベートした結
果を示している。これらの結果は、３連で行った培養の
平均±SDである。
【図２】図２は、ELISA におけるライノウイルス54を検
出する sICAM-1(100μg/ml) の能力におけるウイルスイ
ンキュベート時間の影響を示している。 6,000 TCID50
力価のライノウイルス54を、グラフに示したすべてのイ
ンキュベート時間において使用した。これらの結果は、
３連で行った培養の平均±SDである。
出する sICAM-1(100μg/ml) の能力におけるウイルスイ
ンキュベート時間の影響を示している。 6,000 TCID50
力価のライノウイルス54を、グラフに示したすべてのイ
ンキュベート時間において使用した。これらの結果は、
３連で行った培養の平均±SDである。
【図３】図３は、ライノウイルス54〔▲〕及びライノウ
イルス 2〔●〕の検出におけるウイルス濃度の影響を示
している。ビオチニル化 sICAM-1を 100μg/mlとした。
これらの結果は、３連で行った培養の平均±SDである。
イルス 2〔●〕の検出におけるウイルス濃度の影響を示
している。ビオチニル化 sICAM-1を 100μg/mlとした。
これらの結果は、３連で行った培養の平均±SDである。
【図４】図４は、ライノウイルス34の検出を増感する A
BCペルオキシダーゼキットを使用した結果を示してい
る。ビオチニル化 sICAM-1を 100μg/mlとした。SA-HRP
単独を〔○〕で、ビオチニル化セイヨウワサビペルオキ
シダーゼを使用するABC ペルオキシダーゼキットの場合
を、〔●〕で示した。これらの結果は、３連で行った培
養の平均±SDである。
BCペルオキシダーゼキットを使用した結果を示してい
る。ビオチニル化 sICAM-1を 100μg/mlとした。SA-HRP
単独を〔○〕で、ビオチニル化セイヨウワサビペルオキ
シダーゼを使用するABC ペルオキシダーゼキットの場合
を、〔●〕で示した。これらの結果は、３連で行った培
養の平均±SDである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ヴィンセント ジェイ マールッジー アメリカ合衆国 ニューヨーク州 12531 ホームズ アールアール １ ボックス 395 (72)発明者 ロナルド ファーネス アメリカ合衆国 ニューヨーク州 10576 パウンド リッジ ピーオーボックス 326 (72)発明者 スティーヴン ディー マーリン アメリカ合衆国 コネチカット州 06810 ダンバリー テラ ホウト ロード 18
Claims (10)
- 【請求項１】 液体試料中のウイルス又は関連グループ
のウイルス群の存在を検出する方法であって、下記工程
を有することを特徴とする方法： (a) 液体試料を、その液体試料に不溶性である、ウイル
ス又は関連グループのウイルス群に対する固定化一次レ
セプターとインキュベートし、ウイルス又は１種以上の
関連グループのウイルスと固定化一次レセプターとの第
１不溶性複合体を形成する工程； (b) 第１不溶性複合体を、ウイルス又は関連グループの
ウイルス群に対するラベル化可溶性一次レセプターとイ
ンキュベートし、ラベル化可溶性レセプター、ウイルス
又は１種以上の関連グループのウイルス、及び固定化一
次レセプターの第２不溶性複合体を形成する工程； (c) 液体試料及び未反応ラベル化可溶性レセプターか
ら、第２不溶性複合体を分離する工程； (d) 固定化一次レセプターと結合したラベルの量又は未
反応ラベルの量のいずれかを測定する工程；及び (e) (d) 工程の測定値と、ウイルス又は関連グループの
ウイルス群を含まない対照試料の測定値を比較すること
により、液体試料中のウイルス又は関連グループのウイ
ルス群の存在を決定する工程。 - 【請求項２】 固定化一次レセプターが、固体の支持体
に固定されている請求項１記載の方法。 - 【請求項３】 関連グループのウイルス群が、主要サブ
グループのライノウイルスである請求項２記載の方法。 - 【請求項４】 固定化一次レセプターが、固定化sICAM-
1 である請求項３記載の方法。 - 【請求項５】 ラベル化可溶性一次レセプターが、ラベ
ル化 sICAM-1である請求項３記載の方法。 - 【請求項６】 ラベル化 sICAM-1が、ビオチニル化 sIC
AM-1である請求項５記載の方法。 - 【請求項７】 液体試料中のウイルス又は関連グループ
のウイルス群の存在を検出する方法であって、下記工程
を有することを特徴とする方法： (a) 液体試料を、ウイルス又は関連グループのウイルス
群に対するラベル化可溶性一次レセプターとインキュベ
ートし、ウイルス又は１種以上の関連グループのウイル
スと、ラベル化可溶性レセプターとの可溶性複合体を形
成する工程； (b) (a) の可溶性複合体を、液体試料に不溶性である、
ウイルス又は関連グループのウイルス群に対する固定化
一次レセプターとインキュベートし、ラベル化可溶性レ
セプター、ウイルス又は１種以上の関連グループのウイ
ルス、及び固定化一次レセプターの第２不溶性複合体を
形成する工程； (c) 液体試料及び未反応ラベル化可溶性レセプターか
ら、第２不溶性複合体を分離する工程； (d) 固定化一次レセプターと結合したラベルの量又は未
反応ラベルの量のいずれかを測定する工程；及び (e) (d) 工程の測定値と、ウイルス又は関連グループの
ウイルス群を含まない対照試料の測定値を比較すること
により、液体試料中のウイルス又は関連グループのウイ
ルス群の存在を決定する工程。 - 【請求項８】 固定化一次レセプターが、固体の支持体
に固定されている請求項７記載の方法。 - 【請求項９】 液体試料中のウイルス又は関連グループ
のウイルス群の存在を検出する方法であって、下記工程
を有することを特徴とする方法： (a) 液体試料を、(i) その液体試料に不溶性である、ウ
イルス又は関連グループのウイルス群に対する固定化一
次レセプター；及び(ii)ウイルス又は関連グループのウ
イルス群に対するラベル化可溶性一次レセプターとイン
キュベートし、ラベル化可溶性レセプター、ウイルス又
は１種以上の関連グループのウイルス、及び固定化一次
レセプターの第２不溶性複合体を形成する工程； (b) 液体試料及び未反応ラベル化可溶性レセプターか
ら、第２不溶性複合体を分離する工程； (c) 固定化一次レセプターと結合したラベルの量又は未
反応ラベルの量のいずれかを測定する工程；及び (d) (c) 工程の測定値と、ウイルス又は関連グループの
ウイルス群を含まない対照試料の測定値を比較すること
により、液体試料中のウイルス又は関連グループのウイ
ルス群の存在を決定する工程。 - 【請求項10】 固定化一次レセプターが、固体の支持体
に固定されている請求項９記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US68940791A | 1991-04-22 | 1991-04-22 | |
| US07/689407 | 1991-04-22 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05292966A true JPH05292966A (ja) | 1993-11-09 |
Family
ID=24768318
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4101189A Withdrawn JPH05292966A (ja) | 1991-04-22 | 1992-04-21 | ウイルスを検出する方法 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0510483A1 (ja) |
| JP (1) | JPH05292966A (ja) |
| AU (1) | AU650964B2 (ja) |
| CA (1) | CA2066288A1 (ja) |
| NZ (1) | NZ242450A (ja) |
| ZA (1) | ZA922868B (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2012500797A (ja) * | 2008-08-20 | 2012-01-12 | バクスター・インターナショナル・インコーポレイテッド | 多相分散系を処理する方法 |
Families Citing this family (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6143298A (en) * | 1988-09-01 | 2000-11-07 | Bayer Corporation | Soluble truncated forms of ICAM-1 |
| US6051231A (en) * | 1988-09-01 | 2000-04-18 | Bayer Corporation | Antiviral methods and prepations |
| ES2141076T3 (es) | 1988-09-01 | 2000-03-16 | Bayer Ag | Proteina del receptor de rinovirus humano que inhibe la infectividad del virus. |
| US6514936B1 (en) | 1988-09-01 | 2003-02-04 | Bayer Corporation | Antiviral methods using human rhinovirus receptor (ICAM-1) |
| US6107461A (en) * | 1990-07-20 | 2000-08-22 | Bayer Corporation | Multimeric forms of human rhinovirus receptor and fragments thereof, and method of use |
| DE69131564T2 (de) * | 1990-07-20 | 2000-01-13 | Bayer Ag | Multimere Formen des menschlichen Rhinovirus-Rezeptorproteins |
| US6130202A (en) * | 1990-07-20 | 2000-10-10 | Bayer Corporation | Antiviral methods |
| US5610148A (en) * | 1991-01-18 | 1997-03-11 | University College London | Macroscopically oriented cell adhesion protein for wound treatment |
| US5629287A (en) * | 1991-01-18 | 1997-05-13 | University College London | Depot formulations |
| DE4438833A1 (de) * | 1994-10-31 | 1996-05-02 | Bayer Ag | Verfahren zur analytischen Trennung von Viren |
| US11066712B1 (en) * | 2020-05-18 | 2021-07-20 | Bret T. Barnhizer | Rapid viral assay |
| EP3926342A1 (en) | 2020-06-16 | 2021-12-22 | Viravaxx AG | Rhinovirus assay |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IL75020A (en) * | 1984-05-10 | 1988-10-31 | Abbott Lab | Biotin-antibiotin immunoassay for the detection of ligands |
| IL87902A0 (en) * | 1987-10-08 | 1989-03-31 | Dana Farber Cancer Inst Inc | Soluble human cd4 fragments and applications thereof |
| CA1341055C (en) * | 1987-12-08 | 2000-07-18 | Alan Mcclelland | Transfectant cell lines which express the major human rhinovirus receptor |
| DE3829245A1 (de) * | 1988-08-29 | 1990-03-01 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zur bestimmung einer spezifisch bindefaehigen substanz |
| CA2011633C (en) * | 1989-03-09 | 2007-05-15 | Timothy A. Springer | Intercellular adhesion molecule - 2 and its binding ligands |
| ATE146968T1 (de) * | 1989-03-16 | 1997-01-15 | Blood Res Center | Verwendung von funkionellen derivaten des interzellulär-adhäsions-moleküls icam-1 in einer antivirus-therapie |
-
1992
- 1992-04-14 EP EP92106374A patent/EP0510483A1/en not_active Withdrawn
- 1992-04-16 CA CA002066288A patent/CA2066288A1/en not_active Abandoned
- 1992-04-21 ZA ZA922868A patent/ZA922868B/xx unknown
- 1992-04-21 JP JP4101189A patent/JPH05292966A/ja not_active Withdrawn
- 1992-04-22 AU AU15029/92A patent/AU650964B2/en not_active Ceased
- 1992-04-22 NZ NZ242450A patent/NZ242450A/xx unknown
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2012500797A (ja) * | 2008-08-20 | 2012-01-12 | バクスター・インターナショナル・インコーポレイテッド | 多相分散系を処理する方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0510483A1 (en) | 1992-10-28 |
| NZ242450A (en) | 1993-05-26 |
| AU650964B2 (en) | 1994-07-07 |
| ZA922868B (en) | 1993-10-21 |
| CA2066288A1 (en) | 1992-10-23 |
| AU1502992A (en) | 1992-10-29 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |