JPH05260995A - 酵素的測定法 - Google Patents
酵素的測定法Info
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- JPH05260995A JPH05260995A JP6074392A JP6074392A JPH05260995A JP H05260995 A JPH05260995 A JP H05260995A JP 6074392 A JP6074392 A JP 6074392A JP 6074392 A JP6074392 A JP 6074392A JP H05260995 A JPH05260995 A JP H05260995A
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（Ｎ
ＡＤ）またはその環元型（ＮＡＤＨ）の酵素的サイクリ
ングを用いたシグナル増幅系において、酵素的サイクリ
ングの触媒としてザイモモナス属由来のアルコール脱水
素酵素（ＡＤＨ）を用いることを特徴とする。 【効果】 酵素的サイクリングを促進するＡＤＨ活性が
経時的に低下することがなく、シグナル増幅反応が長時
間持続するため、ＡＤＨ少量で従来方法と同等のＮＡＤ
またはＮＡＤＨ検出感度が得られる。また、ＡＤＨ量が
同量の場合は、従来方法に比べはるかに優れた検出感度
が得られる。
ＡＤ）またはその環元型（ＮＡＤＨ）の酵素的サイクリ
ングを用いたシグナル増幅系において、酵素的サイクリ
ングの触媒としてザイモモナス属由来のアルコール脱水
素酵素（ＡＤＨ）を用いることを特徴とする。 【効果】 酵素的サイクリングを促進するＡＤＨ活性が
経時的に低下することがなく、シグナル増幅反応が長時
間持続するため、ＡＤＨ少量で従来方法と同等のＮＡＤ
またはＮＡＤＨ検出感度が得られる。また、ＡＤＨ量が
同量の場合は、従来方法に比べはるかに優れた検出感度
が得られる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】この発明は、生体成分や各種食品
成分等の分析に有用な酵素的測定法に関するものであ
る。さらに詳しくは、この発明は、ニコチンアミドアデ
ニンジヌクレオチド（以下、ＮＡＤと略記する）または
その環元型（以下、ＮＡＤＨと略記する）の酸化還元サ
イクリングに伴うシグナル増幅系を用いた酵素的測定法
に関するものである。
成分等の分析に有用な酵素的測定法に関するものであ
る。さらに詳しくは、この発明は、ニコチンアミドアデ
ニンジヌクレオチド（以下、ＮＡＤと略記する）または
その環元型（以下、ＮＡＤＨと略記する）の酸化還元サ
イクリングに伴うシグナル増幅系を用いた酵素的測定法
に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】ＮＡＤおよびその環元型であるＮＡＤＨ
は生体含量の最も多い補酵素であり、水素原子の授受を
介して可逆的に変化することにより多くの脱水素酵素の
酸化還元反応に関与している。これらのＮＡＤおよびＮ
ＡＤＨは、それぞれ２６０ｎｍおよび３４０ｎｍ付近に
吸収極大を有するため、従来より、その吸光度変化が種
々の酵素活性の測定に応用されてきているが、これとは
別に、ＮＡＤまたはＮＡＤＨを高感度に検出する測定法
として、酵素的サイクリングによるシグナル増幅系が知
られている(C.Bernofsky他、Analytical Biochemistry
、第５２巻、第４５２〜４５８頁、１９７３年：C.H.S
elf他、Clinical Acta 、第１４８巻、第１１９〜１２
４頁、１９８５年）。
は生体含量の最も多い補酵素であり、水素原子の授受を
介して可逆的に変化することにより多くの脱水素酵素の
酸化還元反応に関与している。これらのＮＡＤおよびＮ
ＡＤＨは、それぞれ２６０ｎｍおよび３４０ｎｍ付近に
吸収極大を有するため、従来より、その吸光度変化が種
々の酵素活性の測定に応用されてきているが、これとは
別に、ＮＡＤまたはＮＡＤＨを高感度に検出する測定法
として、酵素的サイクリングによるシグナル増幅系が知
られている(C.Bernofsky他、Analytical Biochemistry
、第５２巻、第４５２〜４５８頁、１９７３年：C.H.S
elf他、Clinical Acta 、第１４８巻、第１１９〜１２
４頁、１９８５年）。
【０００３】この測定法は、ＮＡＤまたはＮＡＤＨの酸
化環元反応に伴って発色するシグナルを、その反応の繰
り返し（酵素的サイクリング）によって増幅させ、ＮＡ
ＤまたはＮＡＤＨの存在を高感度に検出するというもの
である。すなわち、以下にその反応式を示したように、
ＮＡＤは、アルコール脱水素酵素（以下、ＡＤＨと略記
する）とその基質であるエタノール存在下で、ＡＤＨに
よるエタノールからアセトアルデヒドへの酸化反応に補
酵素として作用し、その際にＮＡＤＨへと還元する。さ
らにこのＮＡＤＨは、テトラゾリウム系色素とその環元
酵素ジアホラーゼ存在下で再びＮＡＤへと酸化するが、
同時にテトラゾリウム系色素が環元されてホルマザンが
生じ、発色シグナルが得られる。ＮＡＤは、このような
条件下で酸化還元を繰り返すため、シグナル強度は徐々
に大きくなる。ＮＡＤＨが検体中に存在する場合も同じ
原理で発色し、その強度を増幅させる。
化環元反応に伴って発色するシグナルを、その反応の繰
り返し（酵素的サイクリング）によって増幅させ、ＮＡ
ＤまたはＮＡＤＨの存在を高感度に検出するというもの
である。すなわち、以下にその反応式を示したように、
ＮＡＤは、アルコール脱水素酵素（以下、ＡＤＨと略記
する）とその基質であるエタノール存在下で、ＡＤＨに
よるエタノールからアセトアルデヒドへの酸化反応に補
酵素として作用し、その際にＮＡＤＨへと還元する。さ
らにこのＮＡＤＨは、テトラゾリウム系色素とその環元
酵素ジアホラーゼ存在下で再びＮＡＤへと酸化するが、
同時にテトラゾリウム系色素が環元されてホルマザンが
生じ、発色シグナルが得られる。ＮＡＤは、このような
条件下で酸化還元を繰り返すため、シグナル強度は徐々
に大きくなる。ＮＡＤＨが検体中に存在する場合も同じ
原理で発色し、その強度を増幅させる。
【０００４】
【化１】
【０００５】このような系によるＮＡＤまたはＮＡＤＨ
の検出は、ホスファターゼの活性測定（C.H.Self他、前
記文献）およびＮＡＤシンセターゼの活性測定（美崎英
夫、BIO INDUSTRY、第７巻、第７７５−７８７頁、１９
９０年）等に応用されており、特にアルカリホスファタ
ーゼの測定では、比色法にもかかわらず蛍光法や発色法
と同等の検出感度が得られることから、免疫測定法の分
野において、非常にすぐれた方法として位置づけられて
いる（石川他編、“免疫測定法 第３版”第５８−６０
頁、医学書院刊）。
の検出は、ホスファターゼの活性測定（C.H.Self他、前
記文献）およびＮＡＤシンセターゼの活性測定（美崎英
夫、BIO INDUSTRY、第７巻、第７７５−７８７頁、１９
９０年）等に応用されており、特にアルカリホスファタ
ーゼの測定では、比色法にもかかわらず蛍光法や発色法
と同等の検出感度が得られることから、免疫測定法の分
野において、非常にすぐれた方法として位置づけられて
いる（石川他編、“免疫測定法 第３版”第５８−６０
頁、医学書院刊）。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】従来、このような酵素
的サイクリングを用いた測定系においては、ＡＤＨとし
て、パン酵母由来のものが用いられてきた。しかしなが
ら、このパン酵母由来ＡＤＨは、その活性持続時間が短
いために、ＮＡＤまたはＮＡＤＨを繰り返し酸化環元し
て十分な発色シグナルを得るには多量のＡＤＨを測定試
薬中に添加しなければならなかった。
的サイクリングを用いた測定系においては、ＡＤＨとし
て、パン酵母由来のものが用いられてきた。しかしなが
ら、このパン酵母由来ＡＤＨは、その活性持続時間が短
いために、ＮＡＤまたはＮＡＤＨを繰り返し酸化環元し
て十分な発色シグナルを得るには多量のＡＤＨを測定試
薬中に添加しなければならなかった。
【０００７】この発明は、以上の通りの事情に鑑みてな
されたものであり、従来の測定方法の欠点を解消し、Ｎ
ＡＤまたはＮＡＤＨをさらに高感度に検出することので
きる新しい酵素的測定法を提供することを目的としてい
る。
されたものであり、従来の測定方法の欠点を解消し、Ｎ
ＡＤまたはＮＡＤＨをさらに高感度に検出することので
きる新しい酵素的測定法を提供することを目的としてい
る。
【０００８】
【課題を解決するための手段】この発明は、上記の課題
を解決するたものとして、ニコチンアミドアデニンジヌ
クレオチドまたはその還元型の酵素的サイクリングを用
いたシグナル増幅系において、酵素的サイクリングの触
媒としてザイモモナス属由来アルコール脱水素酵素を用
いることを特徴とする酵素的測定法を提供する。
を解決するたものとして、ニコチンアミドアデニンジヌ
クレオチドまたはその還元型の酵素的サイクリングを用
いたシグナル増幅系において、酵素的サイクリングの触
媒としてザイモモナス属由来アルコール脱水素酵素を用
いることを特徴とする酵素的測定法を提供する。
【０００９】以下、この発明の構成および好ましい態様
についてさらに詳しく説明する。この発明の酵素的測定
法におけるＮＡＤおよびＮＡＤＨの検出は、これらのい
ずれか一方を含有する検体と、ＡＤＨ、ジアホラーゼ、
アルコール、テトラゾリウム系色素、界面活性剤、緩衝
液等を混合して測定溶液とし、テトラゾリウム系色素の
環元によって生じるホルマザンの吸光度変化を測定すれ
ばよい。
についてさらに詳しく説明する。この発明の酵素的測定
法におけるＮＡＤおよびＮＡＤＨの検出は、これらのい
ずれか一方を含有する検体と、ＡＤＨ、ジアホラーゼ、
アルコール、テトラゾリウム系色素、界面活性剤、緩衝
液等を混合して測定溶液とし、テトラゾリウム系色素の
環元によって生じるホルマザンの吸光度変化を測定すれ
ばよい。
【００１０】この発明において測定溶液中に添加するＡ
ＤＨはザイモモナス属由来のものを使用するが、なかで
もザイモモナスモビリス由来のＡＤＨが特に好ましい。
微生物であるザイモモナスは（財）醗酵研究所やアメリ
カンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）などか
ら入手できる。入手したザイモモナスを培養してＡＤＨ
を精製することによりＡＤＨを得ることができる。ザイ
モモナスの培養は一般のバクテリアと同様の方法で、ま
た精製は、一般的なタンパク質と同様の方法で行うこと
ができるが、好ましくはヨーロピアンジャーナル オブ
バイオケミストリー １５４巻１１９〜１２４頁（１
９８６年）記載の方法で行う。またＡＤＨの精製につつ
いても同文献記載の方法で行えばよい。測定中のＡＤＨ
濃度は、０．０１〜１０００単位／ｍｌ、より好ましく
は０．１〜１００単位／ｍｌである。なおＡＤＨの活性
１単位とはｐＨ８，３０°Ｃで１分間当たりエタノール
を１μｍｏｌ酸化する酵素量と定義されるものである。
ＤＨはザイモモナス属由来のものを使用するが、なかで
もザイモモナスモビリス由来のＡＤＨが特に好ましい。
微生物であるザイモモナスは（財）醗酵研究所やアメリ
カンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）などか
ら入手できる。入手したザイモモナスを培養してＡＤＨ
を精製することによりＡＤＨを得ることができる。ザイ
モモナスの培養は一般のバクテリアと同様の方法で、ま
た精製は、一般的なタンパク質と同様の方法で行うこと
ができるが、好ましくはヨーロピアンジャーナル オブ
バイオケミストリー １５４巻１１９〜１２４頁（１
９８６年）記載の方法で行う。またＡＤＨの精製につつ
いても同文献記載の方法で行えばよい。測定中のＡＤＨ
濃度は、０．０１〜１０００単位／ｍｌ、より好ましく
は０．１〜１００単位／ｍｌである。なおＡＤＨの活性
１単位とはｐＨ８，３０°Ｃで１分間当たりエタノール
を１μｍｏｌ酸化する酵素量と定義されるものである。
【００１１】測定溶液中のＡＤＨ以外の上記成分につい
ては、従来方法と同様のものを用いることができる。す
なわち、緩衝液としては、たとえばリン酸緩衝液、ジエ
タノール緩衝液等、中性〜アルカリ性付近に緩衝作用を
有するものを使用することができ、そのｐＨは５．０〜
１１．０、より好ましくは７．０〜１０．０程度とす
る。また、このときの測定溶液中の緩衝液濃度は、１０
００ｍＭ以下、より好ましくは５０〜５００ｍＭ程度で
ある。
ては、従来方法と同様のものを用いることができる。す
なわち、緩衝液としては、たとえばリン酸緩衝液、ジエ
タノール緩衝液等、中性〜アルカリ性付近に緩衝作用を
有するものを使用することができ、そのｐＨは５．０〜
１１．０、より好ましくは７．０〜１０．０程度とす
る。また、このときの測定溶液中の緩衝液濃度は、１０
００ｍＭ以下、より好ましくは５０〜５００ｍＭ程度で
ある。
【００１２】テトラゾリウム系色素としては、ｐ−ヨー
ドニトロテトラゾリウムバイオレット（以下、ＩＮＴと
略記する）、ニトロブル−テトラゾリウム、２，６−ジ
クロロフェノールインドフェノール等を例示することが
でき、その測定溶液中の濃度は０．１〜１０ｍＭ、より
好ましくは０．５〜２ｍＭ程度とする。ジアホラーゼに
ついては、その由来に特段の制限はないが、安定性に富
む例えばバチルスステアロサーモフィラス由来のものが
好ましく、その測定溶液中の濃度は０．０１〜１０００
単位／ｍｌ、より好ましくは０．１〜１００単位／ｍｌ
程度とする。なお、この場合のジアホラーゼ活性１単位
とは、ｐＨ８．０、３０℃で１分間あたりＩＮＴを１μ
ｍｏｌ環元する酵素量である。
ドニトロテトラゾリウムバイオレット（以下、ＩＮＴと
略記する）、ニトロブル−テトラゾリウム、２，６−ジ
クロロフェノールインドフェノール等を例示することが
でき、その測定溶液中の濃度は０．１〜１０ｍＭ、より
好ましくは０．５〜２ｍＭ程度とする。ジアホラーゼに
ついては、その由来に特段の制限はないが、安定性に富
む例えばバチルスステアロサーモフィラス由来のものが
好ましく、その測定溶液中の濃度は０．０１〜１０００
単位／ｍｌ、より好ましくは０．１〜１００単位／ｍｌ
程度とする。なお、この場合のジアホラーゼ活性１単位
とは、ｐＨ８．０、３０℃で１分間あたりＩＮＴを１μ
ｍｏｌ環元する酵素量である。
【００１３】界面活性剤としては、非イオン性界面活性
剤またはイオン性界面活性剤を用いることができ、なか
でもトライトン系界面活性剤が好ましく、さらにはトラ
イトンＸ−１００がより好ましい。また、その測定溶液
中の濃度は０．００１ｗ／ｖ％以上、より好ましくは
０．０２〜１ｗ／ｖ％程度とする。この発明の測定法に
おいては、吸光度の測定開始時点で、測定溶液中にＮＡ
ＤまたはＮＡＤＨと、上記各成分が存在すればよく、そ
れらの混合順序に特段の制限はない。
剤またはイオン性界面活性剤を用いることができ、なか
でもトライトン系界面活性剤が好ましく、さらにはトラ
イトンＸ−１００がより好ましい。また、その測定溶液
中の濃度は０．００１ｗ／ｖ％以上、より好ましくは
０．０２〜１ｗ／ｖ％程度とする。この発明の測定法に
おいては、吸光度の測定開始時点で、測定溶液中にＮＡ
ＤまたはＮＡＤＨと、上記各成分が存在すればよく、そ
れらの混合順序に特段の制限はない。
【００１４】この発明の測定法は具体的には例えば以下
のように行なうことができる。すなわち、酵素活性の発
現する温度約２０〜４０℃において、ＮＡＤまたはＮＡ
ＤＨを含む検体２００μｌに上記濃度のＡＤＨ、テトラ
ゾリウム系色素、ジアホラーゼおよび界面活性剤を含む
緩衝液４００μｌを加え、比色定量を行なう。比色定量
法としては、たとえば、吸光度変化を経時的に測定する
レートアッセイ法、あるいは酵素的サイクリングを一定
時間行なった後、酸を加え反応を停止させて吸光度を測
定するエンドポイントアッセイ法等が挙げられる。いず
れの方法でも、市販の分光光度計を用いて吸光度測定が
できる。
のように行なうことができる。すなわち、酵素活性の発
現する温度約２０〜４０℃において、ＮＡＤまたはＮＡ
ＤＨを含む検体２００μｌに上記濃度のＡＤＨ、テトラ
ゾリウム系色素、ジアホラーゼおよび界面活性剤を含む
緩衝液４００μｌを加え、比色定量を行なう。比色定量
法としては、たとえば、吸光度変化を経時的に測定する
レートアッセイ法、あるいは酵素的サイクリングを一定
時間行なった後、酸を加え反応を停止させて吸光度を測
定するエンドポイントアッセイ法等が挙げられる。いず
れの方法でも、市販の分光光度計を用いて吸光度測定が
できる。
【００１５】以下、実施例を示してこの発明をさらに詳
細かつ具体的に説明するが、この発明は以下の実施例に
限定されるものではない。
細かつ具体的に説明するが、この発明は以下の実施例に
限定されるものではない。
【００１６】
【実施例】参考例１ ザイモモナスモビリスＡＴＣＣ２９１９１を下記の培地
を用い３０°Ｃ、ｐＨ５．０で培養した。 培地組成 １５％ グルコース 0.5 ％ 酵母エキス 0.05 ％ リン酸二水素カリウム 0.05 ％ 硫酸マグネシウム７水和物 0.001 ％ パントテン酸カルシウム 0.00002 ％ ビチオン 培養終了後遠心分離により菌体を回収した。この菌体７
０ｇに０．５ｍＭ硫酸鉄（II）アンモニウム、１０ｍＭ
アスコルビン酸、０．１％ノニデットＰ−４００．００
０２％ＤＮａｓｅＩ、０．０２％リゾチームを含む３０
ｍＭリン酸一水素二カリウム溶液４００ｍｌを添加し、
懸濁させて３０°Ｃで２ｈインキュベートした。この懸
濁液から遠心分離により上清を得た。この上清を、３０
ｍＭ塩化ナトリウム、２ｍＭ塩化マグネシウム、０．５
ｍＭ硫酸鉄(II)アンモニウム、１０ｍＭアスコルビン酸
を含むＭｅｓによりｐＨ６．５に調整した。これをブル
ーセファロースＣＬ−６Ｂ（ファルマシア社）カラム
（径３．０ｃｍ×１５ｃｍ）に供し、４００ｍｌの同緩
衡液で洗浄し、１ｍＭニコチンアデニンジヌクレオチド
（酸化型）で溶出を行ない、そのＡＤＨ活性画分を回収
し、濃縮、透析して、ＡＤＨを調製した。実施例１ （１） 測定溶液の調製 以下の組成からなる測定溶液を調製した。
を用い３０°Ｃ、ｐＨ５．０で培養した。 培地組成 １５％ グルコース 0.5 ％ 酵母エキス 0.05 ％ リン酸二水素カリウム 0.05 ％ 硫酸マグネシウム７水和物 0.001 ％ パントテン酸カルシウム 0.00002 ％ ビチオン 培養終了後遠心分離により菌体を回収した。この菌体７
０ｇに０．５ｍＭ硫酸鉄（II）アンモニウム、１０ｍＭ
アスコルビン酸、０．１％ノニデットＰ−４００．００
０２％ＤＮａｓｅＩ、０．０２％リゾチームを含む３０
ｍＭリン酸一水素二カリウム溶液４００ｍｌを添加し、
懸濁させて３０°Ｃで２ｈインキュベートした。この懸
濁液から遠心分離により上清を得た。この上清を、３０
ｍＭ塩化ナトリウム、２ｍＭ塩化マグネシウム、０．５
ｍＭ硫酸鉄(II)アンモニウム、１０ｍＭアスコルビン酸
を含むＭｅｓによりｐＨ６．５に調整した。これをブル
ーセファロースＣＬ−６Ｂ（ファルマシア社）カラム
（径３．０ｃｍ×１５ｃｍ）に供し、４００ｍｌの同緩
衡液で洗浄し、１ｍＭニコチンアデニンジヌクレオチド
（酸化型）で溶出を行ない、そのＡＤＨ活性画分を回収
し、濃縮、透析して、ＡＤＨを調製した。実施例１ （１） 測定溶液の調製 以下の組成からなる測定溶液を調製した。
【００１７】 リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０） ２５０ｍＭ ＩＮＴ １ｍＭ エタノール ４％ トライトンＸ−１００ ０．１％ ジアホラーゼ（バチルスステアロサーモフィラス由来、 生化学工業社より入手） ３単位／ｍｌ ＡＤＨ（参考例１で調製した ザイモモナスモビリス由来） １．６単位／ｍｌ なお、比較例１として、ＡＤＨをパン酵母由来（ジクマ
社より入手）のものとする以外は、上記と同一組成から
なる測定溶液を調製した。
社より入手）のものとする以外は、上記と同一組成から
なる測定溶液を調製した。
【００１８】（２） 測定方法 室温で、９６穴マイクロタイタープレート（コーニング
社製）にそれぞれ測定溶液を１００μｌ添加し、これに
１μＭＮＡＤを１０μｌ加えた後、マイクロタイタープ
レート自動分析装置バイオメック−１０００（ベックマ
ン社製）を用いて０、５、１５、２５分と経時的に４９
０ｎｍにおける１分間当りの吸光度増加（△Ａ490 ）を
測定した。また、これらの吸光度測定値から、各々時間
０分の場合を１００としたサイクリング率（％）を算出
した。
社製）にそれぞれ測定溶液を１００μｌ添加し、これに
１μＭＮＡＤを１０μｌ加えた後、マイクロタイタープ
レート自動分析装置バイオメック−１０００（ベックマ
ン社製）を用いて０、５、１５、２５分と経時的に４９
０ｎｍにおける１分間当りの吸光度増加（△Ａ490 ）を
測定した。また、これらの吸光度測定値から、各々時間
０分の場合を１００としたサイクリング率（％）を算出
した。
【００１９】（３） 結果 この測定結果は、表１および図１に示した通りである。
これらの表１および図１から明らかなように、パン酵母
由来ＡＤＨを用いた比較例１では、吸光度およびサイク
リング率が時間経過とともに急激に減少するのに対し、
ザイモモナスモビリス由来ＡＤＨを用いるこの発明の方
法（実施例１）では、吸光度およびサイクリング率が時
間によらずほぼ一定であり、従来方法（比較例１）に比
べて、経時時間５分では２．５倍以上、２５分では８倍
以上もの検出感度を有することが実証された。
これらの表１および図１から明らかなように、パン酵母
由来ＡＤＨを用いた比較例１では、吸光度およびサイク
リング率が時間経過とともに急激に減少するのに対し、
ザイモモナスモビリス由来ＡＤＨを用いるこの発明の方
法（実施例１）では、吸光度およびサイクリング率が時
間によらずほぼ一定であり、従来方法（比較例１）に比
べて、経時時間５分では２．５倍以上、２５分では８倍
以上もの検出感度を有することが実証された。
【００２０】
【表１】
【００２１】参考例２ アルカリホスファターゼ（仔牛小腸由来、ベーリンガー
マンハイム社製）２ｍｇにＮ−スクシニミジル４−（Ｎ
−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシ
レート（ジーベンケミカル社製）３ｍｇをｐＨ７．０、
３０℃で１０分間反応させ、アルカリホスファターゼに
マレイミド基を導入した。ついで、これに抗癌胎児性抗
原抗体（以下、抗ＣＥＡ抗体と記載する）Ｆａｂ′（抗
体をペプシン消化し、その後環元して調製したもの）１
ｍｇをｐＨ６で混合し、マレイミド基とチオール基とを
架橋してアルカリホスファターゼ標識抗ＣＥＡ抗体を調
製した。実施例２ この発明の測定法を用いて、アルカリホスファターゼを
検出した。
マンハイム社製）２ｍｇにＮ−スクシニミジル４−（Ｎ
−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシ
レート（ジーベンケミカル社製）３ｍｇをｐＨ７．０、
３０℃で１０分間反応させ、アルカリホスファターゼに
マレイミド基を導入した。ついで、これに抗癌胎児性抗
原抗体（以下、抗ＣＥＡ抗体と記載する）Ｆａｂ′（抗
体をペプシン消化し、その後環元して調製したもの）１
ｍｇをｐＨ６で混合し、マレイミド基とチオール基とを
架橋してアルカリホスファターゼ標識抗ＣＥＡ抗体を調
製した。実施例２ この発明の測定法を用いて、アルカリホスファターゼを
検出した。
【００２２】参考例２で調製したアルカリホスファター
ゼ標識抗ＣＥＡ抗体５０μｌを、０、１．２５、２．
５、５．０、１０．０、２０．０ｎｇ／ｍｌの濃度で、
抗ＣＥＡ抗体固定化マイクロタイタープレート（メディ
ックス社製）の各ウェルに添加し、室温で２時間静置
し、抗原抗体反応を行った。次いで、０．２％ツウィー
ン２０、０．２％牛血清アルブミン、０．１５Ｍ塩化ナ
トリウムを含む２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．
２）でプレートを洗浄し、１ｍＭＮＡＤＰ、１ｍＭ塩化
マグネシウムを含む０．５Ｍジエタノールアミン（ｐＨ
９．８）５０μｌを各ウェルに加え、室温で正確に１０
分間反応させた後、実施例１と同様の測定溶液を１００
μｌ添加し、室温で１０分間反応させ、１Ｎ塩酸５０μ
ｌを加えて反応を停止させて、各々の吸光度（△
Ａ490 ）をマイクロタイタープレート自動分析装置バイ
オメック−１０００（ベックマン社製）を用いて測定し
た。なお、比較例２として、比較例１と同様の測定溶液
を用いた場合の各吸光度を上記と同様の手続で測定し
た。
ゼ標識抗ＣＥＡ抗体５０μｌを、０、１．２５、２．
５、５．０、１０．０、２０．０ｎｇ／ｍｌの濃度で、
抗ＣＥＡ抗体固定化マイクロタイタープレート（メディ
ックス社製）の各ウェルに添加し、室温で２時間静置
し、抗原抗体反応を行った。次いで、０．２％ツウィー
ン２０、０．２％牛血清アルブミン、０．１５Ｍ塩化ナ
トリウムを含む２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．
２）でプレートを洗浄し、１ｍＭＮＡＤＰ、１ｍＭ塩化
マグネシウムを含む０．５Ｍジエタノールアミン（ｐＨ
９．８）５０μｌを各ウェルに加え、室温で正確に１０
分間反応させた後、実施例１と同様の測定溶液を１００
μｌ添加し、室温で１０分間反応させ、１Ｎ塩酸５０μ
ｌを加えて反応を停止させて、各々の吸光度（△
Ａ490 ）をマイクロタイタープレート自動分析装置バイ
オメック−１０００（ベックマン社製）を用いて測定し
た。なお、比較例２として、比較例１と同様の測定溶液
を用いた場合の各吸光度を上記と同様の手続で測定し
た。
【００２３】これらの測定結果は表２および図２に示し
たとおりである。これらの結果から明らかなように、ホ
スファターゼ検出系において、この発明の方法（実施例
２）は従来方法（比較例２）に比べ約４倍のシグナルが
得られ、優れた検出感度を有することが明らかになっ
た。
たとおりである。これらの結果から明らかなように、ホ
スファターゼ検出系において、この発明の方法（実施例
２）は従来方法（比較例２）に比べ約４倍のシグナルが
得られ、優れた検出感度を有することが明らかになっ
た。
【００２４】
【表２】
【００２５】
【発明の効果】以上詳しく説明した通り、この発明の測
定法においては、酵素的サイクリングを促進するＡＤＨ
活性が経時的に低下することがなく、シグナル増幅反応
が長時間持続するため、ＡＤＨ少量で従来方法と同等の
ＮＡＤまたはＮＡＤＨ検出感度が得られる。また、ＡＤ
Ｈ量が同量の場合は、従来方法に比べはるかに優れた検
出感度が得られる。
定法においては、酵素的サイクリングを促進するＡＤＨ
活性が経時的に低下することがなく、シグナル増幅反応
が長時間持続するため、ＡＤＨ少量で従来方法と同等の
ＮＡＤまたはＮＡＤＨ検出感度が得られる。また、ＡＤ
Ｈ量が同量の場合は、従来方法に比べはるかに優れた検
出感度が得られる。
【図１】この発明の方法（●）と従来方法（○）との各
々におけるサイクリング率の経時的変化を示した相関図
である。
々におけるサイクリング率の経時的変化を示した相関図
である。
【図２】この発明の方法（●）と従来方法（○）との各
々における、ＣＥＡ濃度毎の吸光度（Ａ490 ）を示した
相関図である。
々における、ＣＥＡ濃度毎の吸光度（Ａ490 ）を示した
相関図である。
Claims (1)
- 【請求項１】 ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
またはその環元型の酵素的サイクリングを用いたシグナ
ル増幅系において、酵素的サイクリングの触媒としてザ
イモモナス属由来アルコール脱水素酵素を用いることを
特徴とする酵素的測定法。
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6074392A JP2738482B2 (ja) | 1992-03-17 | 1992-03-17 | 酵素的測定法 |
| DE69320224T DE69320224T2 (de) | 1992-03-17 | 1993-03-17 | Verfahren und Reagenz zur enzymatischen Analyse |
| EP93302015A EP0561626B1 (en) | 1992-03-17 | 1993-03-17 | A method for enzymatic analysis and reagent therefor |
| EP97112456A EP0806482A3 (en) | 1992-03-17 | 1993-03-17 | A method for enzymatic analysis and reagent therefor |
| US08/335,975 US5589349A (en) | 1992-03-17 | 1994-11-03 | Method for enzymatic analysis and reagant therefor |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6074392A JP2738482B2 (ja) | 1992-03-17 | 1992-03-17 | 酵素的測定法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05260995A true JPH05260995A (ja) | 1993-10-12 |
| JP2738482B2 JP2738482B2 (ja) | 1998-04-08 |
Family
ID=13151053
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6074392A Expired - Fee Related JP2738482B2 (ja) | 1992-03-17 | 1992-03-17 | 酵素的測定法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2738482B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8853590B2 (en) | 2002-10-22 | 2014-10-07 | Samsung Display Co., Ltd. | Device for irradiating a laser beam |
-
1992
- 1992-03-17 JP JP6074392A patent/JP2738482B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8853590B2 (en) | 2002-10-22 | 2014-10-07 | Samsung Display Co., Ltd. | Device for irradiating a laser beam |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2738482B2 (ja) | 1998-04-08 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |