JPH0523754B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、コレラ毒素および大腸菌毒素の中和
物質の製造法に関するものである。 コレラ毒素および大腸菌毒素（以下、単に毒素
というときはこれらの毒素を意味する）は、それ
ぞれコレラ菌および大腸菌による下痢症の原因因
子である。したがつて、これらの毒素に直接作用
してその毒性発揮を阻止し得る物質を用いれば、
上記菌による下痢を防止することができる筈であ
る。このような観点から開発された上記下痢の予
防法または治療法としては、毒素自身による免疫
療法、あるいは腸管内壁上にあつて毒素と腸管と
の結合の仲介役をしている糖脂質・ガングリオシ
ドGM1を活性炭等の担体に結合させて投与する
拮抗法などが知られている。なおI.D.ミツチエル
ら（J.Appl.Bact.41.163〜174）は、ラクトバチル
ス・ブルガリクスまたはストレプトコツカス・フ
エーカリスによる発酵乳から毒素中和作用を有す
る物質を発見したと報告しているが、この物質の
構造については分子量が10⁴以下であるというこ
と以外はわかつていないし、また、その後このよ
うな物質の存在を否定した報告（J.Appl.
Bact.45，157〜160）もあつて、上記下痢の予防
および治療用の薬剤として検討された例は見当ら
ない。 本発明者らは、これら公知の毒素中和物質とは
全く異なる毒素中和物質を発酵乳中に見いだし、
その精製法も確立して本発明を完成するに至つ
た。 すなわち本発明は、牛乳より後に詳述するよう
な毒素中和物質（この明細書ではこれをF1とい
う）を生成させる能力を有するビフイドバクテリ
ウム菌または乳酸菌（ラクトバチルス属乳酸菌；
以下同じ）により牛乳を発酵させ、得られた発酵
乳より菌体および酸凝固性蛋白質を除去し、残液
から50％飽和硫安塩析により析出する画分を採取
し、該画分をゲル濾過法により分子量分画して分
子量が1.5×10⁶以上の画分を分取することを特徴
とするF1の製造法の発明である。 F1は単一の化合物ではなく、主として糖蛋白
質（蛋白部分の全部または一部がリポ蛋白質であ
るものを含む）および糖脂質よりなる混合物であ
つて、下記のような物理的化学的性質を有するも
のである。 (1) 分子量 1.5×10⁶以上（Bio−Gel Ａ−5mを用いたゲル
濾過法による） (2) 糖質含有量（標準的な分析値例） ガラクトースに換算してヘキソース8.5％（重
量％、以下同じ）（アンスロン−硫酸法による） ガラクトサミンに換算してヘキソサミン0.2％
（エルソン＆モルガン法による） シアル酸1.4％（ワーレン法による） (3) 蛋白質含有量（標準的な分析値例） 牛血清アルブミンに換算して24.8％（ロウリー
法による） (4) 脂質含有量（標準的な分析値例） 64.8％（レーゼ・ゴツトリーブ法による） (5) 安定性 PH3.5〜8.4で安定。 100℃・60分間の加熱処理に耐える。 蛋白質分解酵素（プロナーゼ、トリプシン
等）で不活性化されない。 このように、F1は1.5×10⁶以上の分子量を持つ
高分子化合物である点で、前記ミツチエルらが発
酵乳中に見いだした毒素中和物質とは異なる。有
効成分が糖蛋白質および糖脂質であることは、上
記分析値、赤外線吸収スペクトル（第１図）、お
よび次の事実から明らかである。 (a) GM1−ELISA法により試験すると、F1は毒
素がGM1に吸着されるのを阻止することがわ
かる。 (b) ガラクトースまたはノイラミン酸を末端に持
つ糖蛋白質および糖脂質は毒素の腸管内壁上の
レセプターに対する拮抗物質であることが知ら
れている。 (c) RCA₁−セフアロースクロマトグラフイーに
より分画し、吸着部と非吸着部とを調べると、
前者は主としてガラクトース末端およびＮ−ア
セチルガラクトサミン末端を有する糖蛋白質で
あり、また後者は主として糖脂質であり、他
に、ガラクトース末端を持たない糖蛋白質およ
び蛋白質を少量含むことがわかる。 (d) 上記(c)の吸着部および非吸着部は、それぞれ
単独でも毒素中和能を示す。 上述のようなF1は多くの発酵乳の中に存在す
ることが確認されているので、事実上すべてのビ
フイドバクテリウム菌および乳酸菌が、発酵過程
で牛乳からF1を生成させると考えられる。しか
しながら、これらの菌のF1生成能の強さは菌株
間でかなりの差があり、F1製造用の菌として実
用性のない菌株が存在することも事実である。し
たがつて本発明の製法は、経済性も考慮して、あ
る水準以上の量のF1を発酵乳中に生成させるこ
とのできるビフイドバクテリウム菌または乳酸菌
を用いるものであり、この明細書で“F1を生成
させる能力を有する菌”とは、上記基準で選抜さ
れた菌株を意味する。なおビフイドバクテリウム
菌および乳酸菌のF1生成能の有無は、その菌に
よる発酵乳から分離した培養上清を用い、下記の
方法でその毒素中和能を測定することにより判定
する。 まず市販の精製コレラ毒素を400ng／ml濃度に
希釈し、その0.1mlに上記上清0.2mlを加えて37℃
で２時間静置する。その後、５％仔牛血清添加
HamF12培養液1.7mlを加え、得られた混合液0.5
mlをCHO−K₁細胞（あらかじめチヤンバースラ
イド内で２〜３時間、５％炭酸ガス下37℃で培養
することにより、スライド表面に付着させておい
たもの）に加える。細胞の培養を上記と同じ条件
で更に20時間続けた後、細胞をギムザ液で染色
し、顕微鏡を用いて、コレラ毒素による細胞の形
態の変化度を調べる。上清のかわりにリン酸緩衝
液を用いた場合の細胞形態変化率を基準にして、
形態変化抑制率が10％以上のとき、F1生成能あ
りと判定する（形態変化率は、細胞400個のうち
毒素による細胞の伸長を起こしているものを数
え、百分率で表示する。）。 本発明によるF1製造法において用いるビフイ
ドバクテリウム菌または乳酸菌としては、F1生
成能を有するものの中でも、上記試験における形
態変化抑制率が20％以上のものであることが、処
理効率の点で望ましい。上記試験における形態変
化抑制率が約40％以上であり、したがつて本発明
の製法において用いるのに特に適した菌株の具体
例としては、ビフイドバクテリウム・ブレーベ
YIT−4006（微工研菌寄第3906号）、ビフイドバ
クテリウム・ブレーベATCC15698、ラクトバチ
ルス・アシドフイルスYIT−0154（微工研菌寄第
7079号）、ラクトバチルス・アシドフイルスYIT
−0193（微工研菌寄第7080号）、ラクトバチルス・
アシドフイルスATCC4356、ラクトバチルス・カ
ゼイYIT−0009（微工研菌寄第7078号）などがあ
る。 F1生成能を有するビフイドバクテリウム菌ま
たは乳酸菌を用いて牛乳を発酵させる工程は、乳
酸菌飲料や発酵乳を製造する場合と全く同様にし
て行うことができる。この場合、ビフイドバクテ
リウム菌と乳酸菌を併用してもよい。また牛乳と
しては、全乳のほか、脱脂乳、またはこれらの粉
乳からの還元乳を用いても差支えなく、これに、
菌の増殖促進剤、たとえば酵母エキス、ビタミン
混合液等を添加してもよい。発酵はPHが5.0以下
になるまで行うことが望ましい。 発酵終了後、発酵乳をカセイソーダでPHを約
6.4に調整したのち遠心分離（たとえば
12000rpm・４℃・30分間）による除菌操作を行
う。 このあと、塩酸でPHを4.6に調整し、カゼイン
等を沈殿させて遠心分離する。 次に、遠心分離して残つた上清から、50％飽和
硫安で塩析される画分を採取する。この工程は、
標準的には硫安を約50％飽和まで添加することに
より行うが、これに限定されるわけではなく、実
質的に同等の処理効果のある他の処理手段によつ
て行なつてもよい。 塩析された画分は、常法により透析するなどし
て硫安等を除いた後、ゲル濾過法による分子量分
画処理に付する。たとえば0.5Mの食塩を含む
0.1Mトリス−塩酸緩衝液（PH8.3；以下トリス−
塩酸緩衝液という）に塩析画分を溶解してBio−
Gel Ａ−5m（分画分子量範囲10⁴〜1.5×10⁶）のカ
ラムに吸着させ、その後、トリス−塩酸緩衝液で
溶出する。F1は分子量1.5×10⁶以上の画分（上記
カラムを用いた場合、最初に溶出するvoid
volume）に現れるから、これを分取し、蒸留水
に対して低温で充分透析したのち凍結乾燥すれ
ば、F1が得られる。 以上のような本発明の製法によつて得られる
F1は、もとの培養上清と比べると約50倍以上の
毒素中和能力を示す。そしてこの精製F1は、
GM1−ELISA法により試験した場合、約50〜
240μg（乾物重量）で、コレラ毒素10ngのGM1へ
の結合をほぼ100％抑制する能力を持つ。 F1は古くからの食品である発酵乳に簡単な精
製処理を施すだけで製造されるものであるから、
安全性の点では全く問題がない。したがつて、本
発明によれば、コレラ毒素または大腸菌毒素によ
る下痢症の予防または治療に有効な、安全性の高
い薬剤の原料を安価に提供することが可能にな
る。 以下実施例を示して本発明を説明する。 実施例 １ 0.5％の酵母エキスを含む10％還元脱脂乳2.5
を滅菌後、これにF1生成能を有するビフイドバ
クテリウム・ブレーベYIT−4006（微工研菌寄第
3906号）のスターターを接種し、嫌気的条件下、
37℃で72時間培養して、PH4.4の発酵乳を得た。
5N−NaOHでPHを6.4に調整した後、この発酵乳
を12000rpmで30分間遠心分離することにより、
除菌操作を行なつた。次いで、得られた上清1.74
を限外濾過膜で限外濾過し（分画分子量
13000）、その残留液に6N−HCIを加えてPHを4.6
に下げ、3000rpm・15分間の遠心分離操作によ
り、カゼイン等の蛋白質を除去した。得られた透
明な上清に硫安を50％飽和まで添加すると、白色
の沈殿物が生じた。この沈殿物を遠心分離により
回収して蒸留水に溶解し、４〜５℃で蒸留水に対
して充分透析したのち透析内液を凍結乾燥した。
得られた透析内液の固形物1gをトリス−塩酸緩
衝液20mlに溶解してBio−Gel Ａ−5mのカラム
（3.2cmφ×46cm）に供給した。次いでトリス−塩
酸緩衝液で溶出させ、void volumeのF1画分を
採取した（この溶出処理における溶出液の吸光度
の変化を第２図に示す。）。この画分を透析後、凍
結乾燥してF1を得た。収量は、原料の還元脱脂
乳2.5当りに換算して500mgであつた。 このF1のコレラ毒素中和作用をさきに述べた
ビフイドバクテリウム菌または乳酸菌のF1生成
能の有無の判定法に準じて調べたところ、コレラ
毒素10ngによつて生じるCHO−K₁細胞の形態変
化を60μgの上記F1が100％抑制した。またGM1
−ELISA法による試験では、コレラ毒素20ngが
GM1に結合するのを120μgの上記F1がほぼ100％
抑制した。 また大腸菌毒素中和作用を同様にして調べたと
ころ、大腸菌毒素27μg（蛋白質換算）によつて生
じるCHO−K₁細胞の形態変化を60μgの上記F1が
100％抑制し、またGM1−ELISA法による試験で
は、大腸菌毒素135μgがGM1に結合するのを
120μgの上記F1が100％抑制した。 実施例 ２ 0.5％の酵母エキスを含む10％還元脱脂乳100ml
を滅菌後、これにF1生成能を有するラクトバチ
ルス・アシドフイルスYIT−0154のスターター
を接種し、嫌気的条件下、37℃で68時間培養し
て、PH3.9の発酵乳を得た。5N−NaOHでPHを7.4
に調整した後、この発酵乳を12000rpmで30分間
遠心分離することにより、除菌操作を行なつた。
次いで、得られた上清50mlを透析し、その残留液
に6N−HCIを加えてPHを4.6に下げ、3000rpm・
15分間の遠心分離操作により、カゼイン等の蛋白
質を除去した。得られた透明な上清に硫安を50％
飽和まで添加すると、白色の沈殿物が生じた。こ
の沈殿物を遠心分離により回収して蒸留水に溶解
し、４〜５℃で蒸留水に対して充分透析したのち
透析内液を凍結乾燥した。得られた透析内液の固
形物125mgを10mlのトリス−塩酸緩衝液に溶解し
てBio−Gel Ａ−5mのカラム（3.2cmφ×46cm）
に供給した。次いでトリス−塩酸緩衝液で溶出さ
せ、void volumeのF1画分を採取し、この画分
を透析し、次いで凍結乾燥してF1を得た。収量
は、原料の還元脱脂乳100ml当りに換算して18mg
であつた。 このF1の毒素中和作用を実施例１の場合と同
様にして調べたところ、コレラ毒素10ngによつ
て生じるCHO−K₁細胞の形態変化を45μgの上記
F1が61％抑制した。またGM1−ELISA法による
試験では、コレラ毒素10ngがGM1に結合するの
を90μgの上記F1がほぼ100％抑制した。 また、大腸菌易熱性粗毒素（LT）27μg（蛋白
質換算）によつて生じるCHO−K₁細胞の形態変
化を45μgの上記F1が67％抑制し、またGM1−
ELISA法による試験では、LT67.5μgがGM1に結
合するのを90μgの上記F1が100％抑制した。 実施例 ３〜６ 乳の発酵に用いた菌を種々変更したほかは実施
例１の場合と同様にしてF1を製造した。各例に
おけるF1の収量および得られたF1の毒素中和能
力は下記のとおりであつた。 【表】

【図面の簡単な説明】

第１図：毒素中和物質F1の赤外線吸収スペク
トル図。第２図：実施例１における溶出処理の説
明図（吸光度の変化を示すグラフ）。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 牛乳よりコレラ毒素および大腸菌毒素の中和
   物質を生成させる能力を有するビフイドバクテリ
   ウム菌またはラクトバチルス属乳酸菌により牛乳
   を発酵させ、得られた発酵乳の遠心上清から酸凝
   固性蛋白質を除去し、残液から50％飽和硫安塩析
   により析出する画分を採取し、該画分をゲル濾過
   法により分子量分画して分子量が1.5×10⁶以上の
   画分を分取することを特徴とするコレラ毒素およ
   び大腸菌毒素の中和物質の製造法〔ただし上記
   「牛乳よりコレラ毒素および大腸菌毒素の中和物
   質を生成させる能力」は次の方法により判定され
   る：その菌による発酵乳から分離した培養上清
   0.2mlを濃度400ng／mlの精製コレラ毒素溶液0.1
   mlに加え、37℃で２時間静置する。その後、５％
   仔牛血清添加HamF12培養液1.7mlを加え、得ら
   れた混合液0.5mlをCHO−K₁細胞（あらかじめチ
   ヤンバースライド内で２〜３時間、５％炭酸ガス
   下37℃で培養することにより、スライド表面に付
   着させておいたもの）に加える。細胞の培養を上
   記と同じ条件で更に20時間続けた後、細胞をギム
   ザ液で染色し、顕微鏡を用いて、コレラ毒素によ
   る細胞の形態の変化度を調べる。培養上清のかわ
   りにリン酸緩衝液を用いた場合の細胞形態変化率
   を基準にして、形態変化抑制率が10％以上のと
   き、牛乳よりコレラ毒素および大腸菌毒素の中和
   物質を生成させる能力ありと判定する（形態変化
   率は、細胞400個のうち毒素による細胞の伸長を
   起こしているものを数え、百分率で表示する。）〕。