JPH05236999A - 核酸の大フラグメントの配列決定 - Google Patents

核酸の大フラグメントの配列決定

Info

Publication number
JPH05236999A
JPH05236999A JP4237335A JP23733592A JPH05236999A JP H05236999 A JPH05236999 A JP H05236999A JP 4237335 A JP4237335 A JP 4237335A JP 23733592 A JP23733592 A JP 23733592A JP H05236999 A JPH05236999 A JP H05236999A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
nucleic acid
gel
bases
electric field
mobility
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
JP4237335A
Other languages
English (en)
Inventor
Jaan Noolandi
ノーランディー ジャーン
Chantal Turmel
テュルメル シャンタル
Eric Brassard
ブラッサード エリック
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Xerox Corp
Original Assignee
Xerox Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Xerox Corp filed Critical Xerox Corp
Publication of JPH05236999A publication Critical patent/JPH05236999A/ja
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/416—Systems
    • G01N27/447—Systems using electrophoresis
    • G01N27/44756—Apparatus specially adapted therefor
    • G01N27/44773—Multi-stage electrophoresis, e.g. two-dimensional electrophoresis

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Electrochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 〔構成〕ゲル電気泳動による一本鎖核酸の大フラグメン
トの塩基配列決定方法であって、ｎ＋１塩基の一本鎖核
酸フラグメントの移動速度が、定常電場の下で、ポリア
クリルアミドゲル中でのｎ塩基のそれと実質的に同じで
ある一本鎖核酸フラグメントの混合物をポリアクリルア
ミドゲルにかけ；ゲルに対してある大きさの多数の電界
パルスの連続を前記の一本鎖核酸フラグメントの混合物
にかけ、ｎ＋１塩基の一本鎖核酸フラグメントの移動速
度が、ｎ塩基のそれ以下に遅らされ、該連続の各々が、
期間Ｔ1の間の正の大きさＶ1の第一パルス、および期間
Ｔ2の間の負の大きさＶ2の第二パルスを含み、かつ、Ｔ
1Ｖ1がＴ2Ｖ2の絶対値と同じではなく；および前記一本
鎖核酸フラグメントの配列を決定する。 〔効果〕前記方法は、３００塩基より、好ましくは４０
０塩基より、より好ましくは６００塩基より長さの長い
核酸フラグメントの配列決定に有用である。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ゲル電気泳動を使用し
て、ポリアクリルアミドゲル上で一本鎖の核酸分子の配
列を決定する方法に関し、特にパルス電場ゲル電気泳動
を使用した上記の方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】近年、ＤＮＡおよびＲＮＡ探索の進歩
は、これらの酸のヌクレオチド塩基配列を決定する多く
の新規で改良された方法をもたらしている。クローニン
グに加えて、ポリメラーゼ鎖反応や酵素的配列決定プロ
トコール、ゲル電気泳動は、配列決定法に重要な役割を
果たしている。これにより、より高い解像度を有する方
法と同様により速いゲル電気泳動法が要求されている。
あいにく、均一ゲル（ポリアクリルアミド）中でセンチ
メートル当たり少なくとも１００Ｖ以下の連続的な電場
を用いるゲル電気泳動技術は、約３００塩基より大きい
ほぼ同じ長さのフラグメント間のゲル上での解像度を喪
失させる結果となる。このことは、サブクローニング工
程の数を増すときには、厳しい制限となる。というの
は、遺伝子は塩基配列を決定するために小フラグメント
に何回も切断しなければならないからであり、また、全
遺伝子の構造についての情報が喪失したり、得るのが困
難になったりするからである。
【０００３】アガロースゲルにおいて大きな二重鎖ＤＮ
Ａ分子を分離する電気泳動法のバンドの解像度を増加さ
せるいくつかの試みがなされてきた。例えば、キャンタ
ー(Cantor)らの米国特許第4,473,452 号は、低強度およ
び高強度間で変化する横電場の使用を教唆している。こ
のプロトコールによれば、アガロースゲル中で、より高
速にかつより高い解像度で二重鎖ＤＮＡのより大きいサ
イズのフラグメントの分離が可能である。ラース（Laa
s) らの米国特許第4,740,283 号は、電極を、ゲルの平
面にというより、ゲル面を横切る三次元電場を提供する
ように配向させたパルス電場勾配ゲル電気泳動装置を教
唆している。その結果、ゲルからの分子は、のこ歯物中
のそれぞれ対応するレーンを下る。'452号特許の電気泳
動法も'283号特許の電気泳動法も、特別な電極外形を必
要とするために通常の電気泳動装置上で行うことができ
ないので、不便である。さらに、配列決定プロトコール
におけるそれらの使用は不明確である。
【０００４】カール（Carle)らの米国特許第4,737,251
号は、電場が本質的にある大きさで周期的に変化するよ
うな、アガロースゲル中で大分子量のＤＮＡを分離する
電気泳動法を教唆している。より高い電圧とより長い時
間が他の方向よりもある方向で使用される。従って、こ
の方法は、秒から時間にわたる電場持続の時間間隔を使
用して、特に優れた解像度を必要としない、大分子量Ｄ
ＮＡを分離するために使用される。
【０００５】一本鎖ＤＮＡ分子の配列を決定するめため
のゲル電気泳動における解像度を上げる努力としては、
トキタらは、米国特許第4,904,366 号で、ＤＮＡ塩基配
列決定機上の検出器の近くのポリアクリルアミドゲル中
の緩衝液のイオン強度を低下させること教唆している。
検出器近くの電場強度がこのように増加すると、移動速
度がより速くなり、かつ、装置の解像力が増強する結果
となる。大きな一本鎖ＤＮＡフラグメント間のバンド解
像度の喪失は、直接ゲルのｐＨに関する現象というより
も、むしろ、ポリアクリルアミドゲル中の大きいサイズ
のフラグメントの移動パターンに影響する電場における
（ゲルポアサイズよりも大きな）大分子の整列に関する
現象により生じると考えられる。
【０００６】定常電場においては、約３００以下の塩基
を含有する核酸フラグメントは、その塩基含有数に逆比
例する速度で移動する。すなわち、ｎ＋１塩基長のフラ
グメントは、ｎ塩基長のものより移動速度が遅く、また
ｎ塩基長のものは、ｎ−１塩基長のものより移動速度が
遅い。この現象の結果、ポリアクリルアミド配列決定ゲ
ル上の核酸のバンドは、連続的に長い塩基長を有する核
酸フラグメント間で識別できる解像度を有することな
く、“圧縮”(compressed)される。自動化された配列決
定機においては、現在、ヒト遺伝子プログラムで使用さ
れているように、ゲルの底面に特定の塩基が到達したこ
とを示すバンドは、多くの理由から広がり、その結果、
チャート記録計上のそれらの解像度は低くなる。チャー
ト記録計印刷物のスキームの図１ａについて言うと、核
酸フラグメント中の同数の塩基に対応するバンド３０、
３１、３２、３３および３４は容易に分解される。対照
的に、バンド４００、４０１、４０２、４０３、および
４０４は、それらの間で非常に低い解像度を示す。この
解像度の限界を克服するための、先行技術におけるアプ
ローチは、パルス電場の使用を含むが、これによる成功
は限られたものであった。
【０００７】例えば、ライ(Lai) らは、" ポリアクリル
アミドゲル中の一本鎖ＤＮＡ分子の電気泳動の移動度に
対する電場スイッチングの影響 "，電気泳動，１０，６
５−７０，１９８９において、１３０より長い塩基長を
有する一本鎖ＤＮＡ分子への電場変換ゲル電気泳動の適
用を論じている。１３０塩基より大きいＤＮＡ分子の移
動速度は、通常の一方向のパルスをかけられたゲル中に
おけるそれらの移動速度と比較して、遅れることが示さ
れた。しかし、ライらの方法の適用は、６００塩基長よ
り大きい核酸フラグメントの移動を遅らせることは出来
なかった。１３０塩基長のフラグメントの移動速度を遅
らせることは確かに興味深いが、それはそれ程重要なこ
とではない。１３０塩基の長さにおいては、通常の電気
泳動技術を使用すると、核酸フラグメントはゲル中を、
塩基長に逆比例する速度で移動し、それ故、ゲル上に満
足なバント解像度を生じさせる。従って、より長い塩基
長の一本鎖ＤＮＡフラグメント（そのフラグメントは、
他の方法では定常電場電気泳動を用いたフラグメントと
同じ速度で移動する）を分解する方法は、いまだに必要
とされている。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、ゲル電気泳
動を使用して一本鎖核酸の大フラグメントの塩基配列を
決定する方法に関する。この方法は、ｎ＋１塩基の核酸
フラグメントの移動速度を、他の方法では、連続的な電
場ゲル電気泳動下でポリアクリルアミドゲル中のｎ塩基
の核酸フラグメントの移動速度と同じである移動速度以
下に遅らせることを含む。多数の電場パルスの連続をあ
る大きさでゲルに対してかける。この連続の各々は、第
一期間かけられる正の大きさの第一パルスと、第二期間
かけられる負の大きさの第二パルスとを含む。この方法
は、特に、長い核酸フラグメント、特に３００塩基より
長いもの、好ましくは６００塩基より長いものの配列決
定に有用である。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明の方法の準備にお
いて、一本鎖核酸、例えば、ＤＮＡを、電気泳動の前
に、当業界で公知のいかなるものでもよい方法、例え
ば、マキサムとギルバートの化学的方法、またはサンガ
ー、ニックラウス（Nicklaus) およびクールセン(Couls
en) 酵素法( サンブルック, マニアテスおよびフリッシ
ュ，分子クローニング：実験マニュアル，コールドスプ
リングハーバーラボラトリー（１９８９））で配列決定
の準備をしておくことができる。電気泳動ゲルをポリア
クリルアミド、または等価のゲルから作製し、核酸フラ
グメントを常法でこのゲル上に置く（例えば、４塩基の
一つに対応する各々に対し、ゲルの上端で４ウェル）。
ゲルを移動する蛍光標識されたＤＮＡフラグメントが、
底面でチャート記録計上に記録されるシグナルを発する
ことにより検出される自動化された配列決定機（例え
ば、ファーマシア、デュポン、アプライドシステム）を
使用することができる。または、本発明の方法は、ＤＮ
Ａの配列がゲルから離れて直接読み取られる、より通常
の配列決定方法とともに使用することができる。両方法
とも、当業界の熟練者にはすぐに認識されよう。
【００１０】多数のある大きさ(one dimension) の電場
パルスの連続をゲルに印加することにより、ｎ＋１塩基
を含有する、例えば、ＤＮＡおよびＲＮＡフラグメント
の核酸フラグメントの移動速度は、他の方法では、定常
電場の下で、ポリアクリルアミドゲル中でｎ塩基の核酸
フラグメントの移動速度と同じになる速度以下に遅らさ
れる。移動速度の遅延を支配する分子機構の詳細は非常
に複雑であるが、要約すると、負のパルスが印加される
時間中に、ゲル上でフラグメントの後方への置換（back
ward displacement)が起こる。期間が十分長く、ｎ塩基
のフラグメントが負の電場パルスに対して緩和する場合
には、ｎ＋１塩基を有するフラグメントのネット置換(n
et displacement)はｎ塩基を有するフラグメントのネッ
ト置換より少なく、それ故、その移動速度はｎ塩基を有
するフラグメントのネット置換以下になる。電場パルス
の連続の各々は、ある時間印加される正の大きさの第一
パルスとある時間印加さる負の大きさの第二パルスとを
含む。
【００１１】従って、その移動遅延効果のために、本発
明は、３００塩基より長さの長い、、好ましくは４００
塩基より長さの長い、より好ましくは６００塩基より長
さの長い核酸フラグメントの配列を決定するのに有用で
ある。これより短い塩基長の配列を決定するためには、
通常の定常電場電気泳動が通常非常に効果的である。従
って、配列決定がこれらの範囲に到達するまで、定常電
場を印加してもよく、この時、多数の電気的パルスの連
続をゲルに印加するようにする。本発明が分解し、それ
により配列決定をすることができる塩基の上限数に対し
ては理論的な限界はない。しかし、本発明の配列決定方
法は、入手できるポリメラーゼを使用して約２Ｋｂ以下
の核酸のフラグメントを合成することだけができる。配
列決定がこれらの範囲に到達できる前には、より多くの
ポリメラーゼが必要であろうが、それらの開発により本
発明はそのような長さのフラグメントの分解を許すであ
ろう。
【００１２】遅延された移動速度の結果、ゲル上の核酸
フラグメントのバンドは、“減圧”(decompressed)さ
れ、これにより解読可能なＤＮＡフラグメントの数が増
し、それ故ゲル当たりの解読可能な塩基が増すこととな
る。自動化された配列決定機を用いると、遅らされた移
動速度により、核酸塩基配列の解読を促進するように空
間的に分離した、チャート記録計上のバンドが形成され
る。チャート記録計上のバンド間の改良された解像度が
本発明の結果として例示されている図２を参照された
い。定常電場電気泳動のチャート記録計の配列データ
を、４００〜４０４塩基長の核酸フラグメントについて
最上列に示す。連続的なより長い塩基長のバント間の解
像度は、そのバンド幅のため、よく分解されない。対照
的に、下列は、本発明の方法を採用した場合に、４００
と４０１塩基長の核酸フラグメント間の、顕著に増大し
た解像度を示す。改良された解像度は、本発明により得
られた遅らされた移動速度の直接的な結果である。本質
的に、ゲル中のフラグメントの移動速度が遅くなるにつ
れ、記録計上の連続したシグナル検出間の時間間隔が長
くなる。
【００１３】本発明に従えば、第一期間（Ｔ1)と第二期
間（Ｔ2)の少なくとも一つの持続時間は、約１００マイ
クロ秒〜約１０ミリ秒、好ましくは、約１ミリ秒〜約５
ミリ秒、さらにより好ましくは約２ミリ秒〜約４ミリ秒
である。第一電圧（Ｖ1)と第二電圧（Ｖ2)の少なくとも
一つの絶対値は、ゼロよりも大きく、10,000Ｖより小さ
く、好ましくは約３００〜約５０００Ｖである。好まし
い態様においては、第一電圧Ｖ1 の絶対値は第二電圧Ｖ
2 の絶対値以上である。
【００１４】ある好ましい態様においては、第一期間と
正の大きさの第一電圧の積の値と第二期間と負の大きさ
の第二電圧の積の値とを足して、第一期間と第二期間の
和で割った値は、本質的にゼロではない。本質的にゼロ
とは、連続の持続時間を通して印加される平均電場がゼ
ロであるかまたはゼロに近いことを意味するものであ
る。例えば、連続が＋２０００Ｖで１ミリ秒かけられた
第一パルスを含み、かつ第二パルスが−１０００Ｖで２
ミリ秒かけられたとしたら、その平均電場はゼロにな
る。または、第一期間と正の大きさの第一電圧の積の値
と第二期間と負の大きさの第二電圧の積の値とを足し
て、第一期間と第二期間の合計で割った値が、第一と第
二電圧の大きい方の約５０％以下である場合には、本質
的にゼロとみなすことができる。
【００１５】＋１０，０００〜−１０，０００Ｖの使用
電圧範囲と２００〜５００ボルト／マイクロ秒のスルー
速度（slew rate)を有する直流電源を使用して、ゲルに
電場パルスの連続を供給してもよい。スルー速度は、当
業界において知られている意味に従って使用され、電圧
変化／時間の割合またはｄＶ／ｄｔとして定義されてい
る。マイクロ秒のオーダーで電圧を切り換えることがで
きるタイマー／スイッチャーを、電源の制御に使用すべ
きである。
【００１６】さらなる態様において、本発明の方法は、
さらに、多数の連続を繰り返す他の工程またはパルスの
連続における第一のパルスと第二のパルスの少なくとも
一つが多数のサブパルスを含む方法を含む。サブパルス
は、逆の大きさの他のサブパルスを印加する前に少なく
とも一回当初の大きさに戻る逆電圧の大きさまたはゼロ
のパルスである。変換の持続時間はマイクロ秒のオーダ
ーである。サブパルスは、核酸フラグメントがゲルの孔
を通って移動するのを助ける振動効果(shakingeffect)
と言われるものの原因となる。
【００１７】以下の例は例示的な性質のものであり、本
発明の範囲を限定する意図は全くない。本発明を実施す
る他の等価の方法も、本明細書を読むことにより、当業
界の熟練者は思いつくであろう。
【００１８】
【実施例】方法および材料 ７Ｍ尿素（２１ｇ、ＩＣＮバイオケミカルズ）、それぞ
れ、４％、６％、８％および１２％の最終アクリルアミ
ド濃度に至るアクリルアミド−Ｎ，Ｎ−メチレン−ビス
−アクリルアミドのストック溶液中のアクリルアミド
（３８：２バイオラッド）、および全体積５０ｍｌにな
るような水を共に混合して、ゲル溶液を調製した。ＴＢ
Ｅ緩衝液（0.9 モルトリス塩基、0.9 モル硼酸、20ミリ
モルＥＤＴＡ）を添加し、１０Ｘに濃縮したストック溶
液を使用して0.5 から1.5Xの緩衝液の最終濃度にした。
過硫酸アンモニウム(0.07 〜0.8 ％重量体積) およびN,
N'N'テトラ−メチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）
（体積当たり0.087 〜0.04％重量）をアクリルアミド濃
度に量を依存して、添加した。
【００１９】上記のゲル溶液を0.2 ミリメートル離れた
ガラス皿と恒温皿（ファーマシアＬＫＢ）（５５０ミリ
メートル×２２０ミリメートル）の間に注いだ。この２
つの皿をそれぞれ、忌避剤シラン（ファーマシアＬＫ
Ｂ）を結合することにより処理した。ゲル溶液は３０分
で重合可能になった。電気泳動は、２０１０ＭＡＣＲＯ
ＦＯＵＲユニット（ファーマシアＬＫＢ）を用い、ゲル
中と同じ電極緩衝液濃度を使用して行った。各ゲルに
は、前もって２０００ボルトの定常電圧を２時間、５０
℃で印加し、定常の電流プラトー値に到達させた。バク
テリアファージＭ１３ ＭＰ１８（ファーマシアＬＫ
Ｂ）からのＤＮＡを標準マーカーとして使用し、Ｔ７バ
クテリアファージＤＮＡフラグメントを使用したジデオ
キシ配列決定反応の放射性標識35Ｓ産物を標準配列決定
キット（ファーマシアＬＫＢ）を使用して調製した。
【００２０】ＤＮＡフラグメントの相対移動度を、ある
長さのフラグメントが、８０、９０または１００塩基長
のフラグメントに関して、ゲル中を移動したミリメート
ル単位の距離により、以下の式に従って計算した。 ｎ塩基のフラグメントが移動した距離（ｍｍ） ８０、９０、または１００塩基のフラグメントが移動した距離（ｍｍ） ゲル上をフラグメントが移動したミリメートル単位の実
際の距離と同様に、相対移動度も、以下の例１〜１０に
対応する表Ｉ〜Ｘに報告する。報告された電圧は、ゲル
の全長（５５０ｍｍ）を横切って印加された。
【００２１】
【比較例１】電気泳動を６％ポリアクリルアミドゲル中
で２０００Ｖの定常電場で行った。ゲルのイオン強度
は、0.5 ×〜1.5 ×ＴＢＥの範囲で変化させた。色素マ
ーカー対照キシレンシアノールがゲルの底面に到達した
ときに、電気泳動を終了した。ＤＮＡフラグメントの相
対移動度を８０塩基フラグメントと比較して記録し、表
Ｉに報告する。フラグメントの相対移動度に対する、イ
オン強度を変化させたすべての影響は図３に見出され
る。
【００２２】
【表１】 表Ｉ 塩基数 距離 相対 距離 相対 距離 相対 (mm) 移動度 (mm) 移動度 (mm) 移動度 １× １× 0.5 0.5 1.5 1.5 TBE TBE ×TBE ×TBE ×TBE ×TBE ──────────────────────────────────── 755 97 0.191 111 0.218 81 0.159 720 100 0.197 113 0.222 83 8.163 680 103 0.203 118 0.228 86 9.169 454 131 0.258 143 0.281 119 0.233 425 139 0.274 149 0.293 126 0.247 401 144 0.284 156 9.306 132 0.259 371 153 0.302 165 0.324 141 0.278 350 161 0.318 173 0.340 149 0.292 335 167 0.329 179 0.352 156 0.306 300 184 0.363 97 0.387 173 0.339 260 210 0.414 221 0.434 200 0.392 250 217 0.428 228 0.448 208 0.408 240 226 0.446 236 0.464 216 0.424 230 234 0.462 244 0.479 225 0.441 220 241 0.475 252 0.495 235 0.461 210 252 0.497 262 0.515 244 0.478 200 261 0.515 272 0.534 255 0.500 190 273 0.538 284 0.558 267 0.524 180 288 0.568 298 0.585 281 0.561 170 302 0.596 311 0.611 295 0.578 160 316 0.623 325 0.639 310 0.608 150 332 0.655 341 0.670 327 0.641 140 348 0.586 357 0.701 344 0.675 130 367 0.724 376 0.739 365 0.716 120 387 0.763 98 0.782 389 0.763 110 408 0.806 420 0.825 414 0.812 100 435 0.858 449 0.882 445 0.873 90 467 0.921 481 0.945 480 0.941 80 507 1.000 509 1.000 510 1.000
【００２３】
【比較例２】電気泳動を２０００Ｖの定常電場および１
×ＴＢＥの一定のイオン強度で４％、６％、８％および
１２％アクリルアミドゲル中で行った。色素マーカー対
照（キシレンシアノール）がゲルの底面に到達したとき
に、実験を終了した。８０塩基フラグメントと比較した
フラグメントの相対移動度を表ＩＩに報告する。アクリ
ルアミド濃度の影響を図４に示す。
【００２４】
【表２】 表ＩＩ 塩基数 距離 距離 距離 距離 相対 相対 相対 相対 (mm) (mm) (mm) (mm) 移動度 移動度 移動度 移動度 ４％ ６％ ８％ 12％ ４％ ６％ ８％ 12％ gel gel gel gel ──────────────────────────────────── 755 96 102 86 86 0.217 0.198 0.193 0.172 720 100 104 89 88 0.226 0.202 0.200 0.176 680 103 107 90 91 0.233 0.207 0.202 0.182 454 140 137 118 118 0.316 0.208 0.261 0.236 425 147 145 121 124 0.332 0.281 0.272 0.248 401 154 151 127 129 0.348 0.283 0.285 0.258 371 165 161 135 138 0.372 0.312 0.303 0.276 350 174 169 142 146 0.393 0.328 0.319 0.292 335 181 176 147 151 0.400 0.341 0.330 0.302 300 200 194 163 168 0.451 0.376 0.366 0.336 260 224 221 182 191 0.506 0.428 0.409 0.382 250 231 228 169 198 0.521 0.442 0.425 0.396 240 239 236 195 206 0.540 0.457 0.438 0.412 230 248 244 202 214 0.560 0.473 0.454 0.428 220 255 253 204 222 0.576 0.490 0.458 0.444 210 263 264 217 231 0.594 0.512 0.468 0.462 200 272 275 227 241 0.614 0.533 0.510 0.482 190 283 287 237 252 0.639 0.558 0.533 0.504 180 294 301 248 265 0.664 0.583 0.557 0.530 170 303 315 260 278 0.684 0.610 0.584 0.556 160 311 326 274 293 0.702 0.638 0.616 0.586 150 326 344 289 310 0.740 0.667 0.649 0.620 140 341 362 305 328 0.770 0.702 0.685 0.656 130 355 382 322 348 0.801 0.749 0.724 0.696 120 370 405 342 371 0.835 0.785 0.769 0.742 110 385 427 363 397 0.869 0.828 0.816 0.794 100 402 457 367 425 0.907 0.886 0.870 0.850 90 410 483 414 459 0.944 0.936 0.930 0.918 80 443 516 445 500 1.000 1.000 1.000 1.000
【００２５】
【比較例３】電気泳動を２０００Ｖの定常電場で６％ア
クリルアミドゲル中で、１×ＴＢＥのイオン強度で、５
５℃、４５℃、４０℃、３５℃および３０℃の温度で行
った。８０塩基フラグメントと比較した相対移動度を表
ＩＩＩに報告する。相対移動度に対する温度変化の影響
を図５に示す。
【００２６】
【表３】 表 III −１ 塩基数 距離 相対 距離 相対 距離 (mm) 移動度 (mm) 移動度 (mm) 56℃ 56℃ 45℃ 45℃ 40℃ ──────────────────────────────────── 755 96 0.191 95 0.187 100 720 97 0.183 98 0.193 103 680 101 0.201 101 0.199 107 454 133 0.265 132 0.260 143 425 140 0.279 138 0.272 150 401 147 0.293 144 0.283 158 371 156 0.311 153 0.301 189 350 165 0.829 161 0.317 178 335 171 0.341 167 0.329 184 300 188 0.375 184 0.362 202 260 211 0.420 210 0.413 228 250 219 0.436 216 0.425 235 240 228 0.450 225 0.443 240 230 234 0.466 233 0.459 254 220 244 0.486 241 0.474 262 210 253 0.504 250 0.492 273 200 263 0.524 261 0.514 282 190 275 0.548 272 0.535 284 180 288 0.574 285 0.581 305 170 300 0.598 299 0.589 317 160 315 0.827 313 0.616 329 150 332 0.661 329 0.648 343 140 350 0.497 345 0.679 360 130 379 0.737 363 0.715 380 120 392 0.781 385 0.758 402 110 415 0.827 409 0.805 427 100 440 0.874 440 0.866 453 90 470 0.936 475 0.935 482 80 502 1.000 508 1.000 509 表 III −２ 塩基数 相対 距離 相対 距離 相対 移動度 (mm) 移動度 (mm) 移動度 40℃ 35℃ 35℃ 30℃ 30℃ ──────────────────────────────────── 755 0.196 93 0.185 94 0.195 720 0.202 95 0.188 97 0.201 680 0.210 98 0.194 100 0.207 454 0.281 131 0.260 139 0.288 425 0.295 137 0.272 148 0.307 401 0.310 143 0.284 155 0.322 371 0.332 154 0.308 165 0.342 350 0.350 160 0.317 173 0.359 335 0.361 166 0.320 179 0.371 300 0.397 183 0.363 195 0.405 260 0.448 209 0.415 220 0.458 250 0.462 215 0.427 228 0.469 240 0.472 223 0.442 235 0.488 230 0.499 231 0.458 243 0.504 220 0.515 241 0.471 253 0.525 210 0.536 249 0.494 262 0.544 200 0.554 260 0.516 272 0.564 190 0.578 271 0.538 282 0.585 180 0.599 284 0.583 292 0.606 170 0.623 296 0.591 303 0.629 160 0.646 312 0.619 315 0.654 150 0.674 328 0.651 327 0.678 140 0.747 345 0.685 341 0.707 130 0.747 363 0.720 358 0.743 120 0.790 385 0.764 377 0.782 110 0.839 409 0.812 393 0.828 100 0.890 437 0.867 424 0.880 90 0.947 470 0.933 452 0.938 80 1.000 504 1.000 482 1.000
【００２７】
【比較例４】電気泳動を６％アクリルアミドゲル中で、
１×ＴＢＥのイオン強度で、５０℃の温度で７５０Ｖ、
１０００Ｖ、１５００Ｖ、２０００Ｖ、２５００Ｖ、３
０００Ｖ、４０００Ｖおよび５０００Ｖの定常電界強度
で行った。９０塩基フラグメントと比較したこのフラグ
メントの相対移動度を表ＩＶに報告する。相対移動度に
対する電界強度の影響を図６に示す。
【００２８】
【表４】 表ＩＶ−１ 塩基数 距離 距離 距離 距離 距離 距離 (mm) (mm) (mm) (mm) (mm) (mm) 500V 750V 1000V 1500V 2000V 2500V ──────────────────────────────────── 755 55 74 89 98 102 119 720 58 77 92 101 104 121 680 62 81 96 105 107 123 590 74 93 106 116 117 133 527 86 103 117 127 124 141 454 102 119 132 144 137 154 401 118 133 147 161 151 169 271 130 143 158 172 169 179 350 135 152 167 181 176 188 325 147 158 173 188 194 194 300 167 177 193 203 221 213 260 196 204 220 236 228 237 250 204 213 227 245 236 244 240 212 220 235 254 244 252 230 222 229 244 262 253 261 220 232 238 253 271 264 272 210 243 246 263 282 275 281 200 255 258 276 292 287 203 190 267 271 287 314 301 305 180 280 284 300 327 315 318 170 293 298 312 341 326 331 160 307 313 327 355 344 346 150 321 330 343 373 362 362 140 337 347 359 394 382 380 130 356 366 378 416 405 399 120 378 388 400 441 427 424 110 401 412 424 467 457 448 100 429 439 453 496 438 477 90 461 466 482 507 表ＩＶ−２ 塩基数 距離 距離 距離 相対 相対 相対 (mm) (mm) (mm) 移動度 移動度 移動度 3000V 4000V 5000V 500V 750V 1000V ──────────────────────────────────── 755 128 121 133 0.119 0.158 0.185 720 131 124 136 0.126 0.165 0.191 680 134 128 138 0.134 0.174 0.199 590 144 135 146 0.161 0.200 0.220 527 153 141 153 0.187 0.221 0.243 454 169 153 168 0.221 0.255 0.274 401 185 165 179 0.256 0.285 0.305 271 195 173 188 0.282 0.307 0.328 350 203 182 195 0.302 0.326 0.346 325 210 188 202 0.319 0.339 0.359 300 229 205 217 0.362 0.360 0.400 260 255 227 240 0.425 0.438 0.456 250 283 234 248 0.443 0.457 0.471 240 270 242 253 0.460 0.472 0.488 230 279 249 262 0.482 0.491 0.508 220 290 258 270 0.503 0.511 0.525 210 299 267 290 0.527 0.532 0.546 200 309 278 291 0.553 0.554 0.568 190 319 289 302 0.579 0.582 0.595 180 331 302 315 0.607 0.609 0.622 170 344 314 329 0.636 0.639 0.647 160 359 328 342 0.666 0.672 0.678 150 375 343 358 0.696 0.708 0.712 140 394 359 374 0.731 0.745 0.745 130 413 376 393 0.772 0.785 0.784 120 437 398 418 0.820 0.833 0.830 110 463 422 442 0.870 0.884 0.880 100 490 450 470 0.931 0.942 0.948 90 519 482 503 1.000 1.000 1.000 表ＩＶ−３ 塩基数 相対 相対 相対 相対 相対 相対 移動度 移動度 移動度 移動度 移動度 移動度 1500V 2000V 2500V 3000V 4000V 5000V ──────────────────────────────────── 755 0.198 0.211 0.235 0.247 0.251 0.264 720 0.204 0.215 0.239 0.252 0.257 0.268 680 0.212 0.222 0.243 0.258 0.261 0.274 590 0.234 0.242 0.262 0.277 0.280 0.290 527 0.256 0.257 0.278 0.295 0.293 0.304 454 0.290 0.284 0.304 0.326 0.317 0.330 401 0.325 0.313 0.333 0.356 0.342 0.356 271 0.347 0.333 0.353 0.376 0.359 0.374 350 0.365 0.350 0.371 0.381 0.376 0.384 325 0.379 0.364 0.383 0.405 0.390 0.402 300 0.419 0.402 0.420 0.441 0.425 0.431 260 0.476 0.458 0.467 0.491 0.471 0.477 250 0.494 0.472 0.481 0.507 0.485 0.489 240 0.512 0.489 0.497 0.520 0.502 0.503 230 0.528 0.505 0.515 0.538 0.517 0.521 220 0.546 0.524 0.536 0.559 0.535 0.537 210 0.569 0.547 0.554 0.576 0.554 0.567 200 0.589 0.569 0.578 0.595 0.577 0.579 190 0.600 0.594 0.602 0.615 0.600 0.600 180 0.633 0.623 0.627 0.638 0.627 0.626 170 0.659 0.652 0.653 0.663 0.651 0.654 160 0.688 0.679 0.882 0.692 0.680 0.680 150 0.716 0.712 0.714 0.723 0.712 0.712 140 0.752 0.749 0.750 0.759 0.745 0.744 130 0.794 0.791 0.787 0.798 0.784 0.781 120 0.839 0.839 0.836 0.842 0.826 0.827 110 0.889 0.884 0.894 0.892 0.876 0.879 100 0.942 0.946 0.941 0.944 0.934 0.934 90 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000
【００２９】
【比較例５】電気泳動を６％アクリルアミドゲル中で、
１×ＴＢＥのイオン強度および５０℃の温度で行った。
緩衝液は毎日交換した。１０００Ｖの定常電場を８時間
かけ、次いで１０００ボルトで１秒およびゼロボルトで
２秒のパルスの連続をかけ、次に、１０００ボルトで１
秒およびゼロボルトで５秒のパルスの連続、さらに１０
００ボルトで１秒およびゼロボルトで１秒のパルスの連
続をかけた。８０塩基長フラグメントと比較したこのフ
ラグメントの相対移動度を表Ｖに報告する。相対移動度
に対するこの“間欠性の”電場の影響を図７に示す。
【００３０】
【表５】 表Ｖ 塩基数 定常 距離 距離 距離 定常 相対 相対 相対 電場 (mm) (mm) (mm) 電場 移動度 移動度 移動度 距離 1s 1s 1s 相対 1s 1s 1s (mm) 1000V 1000V 1000V 移動度 1000V 1000V 1000V 2000V ; 1s ; 2s ; 5s 2000V ; 1s ; 2s ; 5s 0V 0V 0V 0V 0V 0V ──────────────────────────────────── 755 66 78 62 55 0.136 0.153 0.129 0.115 720 69 81 65 57 0.142 0.159 0.135 0.119 680 73 85 69 59 0.150 0.167 0.143 0.123 590 83 97 79 67 0.170 0.190 0.163 0.141 527 94 109 90 76 0.193 0.214 0.187 0.159 454 109 127 108 93 0.224 0.249 0.224 0.195 425 117 135 117 101 0.240 0.265 0.248 0.211 401 124 143 125 109 0.255 0.280 0.258 0.228 371 134 155 137 119 0.275 0.304 0.284 0.249 350 142 164 146 128 0.292 0.322 0.303 0.268 335 140 170 153 134 0.306 0.333 0.317 0.280 300 167 189 172 154 0.343 0.371 0.357 0.322 260 194 215 200 181 0.398 0.422 0.415 0.379 250 202 223 207 189 0.415 0.437 0.428 0.395 240 210 232 212 197 0.431 0.455 0.440 0.412 230 219 241 226 207 0.450 0.473 0.489 0.433 220 229 251 236 218 0.470 0.492 0.498 0.456 210 238 261 246 227 0.489 0.512 0.518 0.475 200 249 272 257 240 0.511 0.533 0.533 0.502 190 261 284 268 254 0.536 0.557 0.556 0.531 180 275 297 281 266 0.565 0.582 0.583 0.558 170 289 310 294 280 0.593 0.608 0.610 0.586 160 304 326 305 295 0.624 0.639 0.633 0.617 150 320 343 320 309 0.657 0.673 0.664 0.646 140 338 361 335 323 0.694 0.708 0.695 0.676 130 358 381 351 341 0.735 0.747 0.728 0.713 120 379 402 372 362 0.778 0.788 0.772 0.757 110 401 425 394 384 0.823 0.833 0.817 0.803 100 426 451 419 412 0.875 0.884 0.868 0.862 90 455 483 450 442 0.934 0.941 0.934 0.925 80 487 510 482 478 1.000 1.000 1.000 1.000
【００３１】
【実施例６】電気泳動を１×ＴＢＥのイオン強度を有す
る６％アクリルアミドゲル中で、５０℃の温度で行っ
た。２０００Ｖの連続した電場を４．４時間かけた。こ
れに続いて、以下のようなパルスの連続を数回かけた：
２０００ボルトで１ミリ秒および−３００ボルトで１ミ
リ秒の連続、２０００ボルトで１ミリ秒および−６２０
ボルトで１ミリ秒の連続、２０００ボルトで２ミリ秒お
よび−６３０ボルトで４ミリ秒の連続、２０００ボルト
で２ミリ秒および−１０００ボルトで２ミリ秒の連続、
２０００ボルトで２ミリ秒および−２０００ボルトで１
ミリ秒の連続。１００塩基長フラグメントに対するこの
フラグメントの相対移動度を表ＶＩに報告する。図８
は、このフラグメントの相対移動度に対するこれらのパ
ルスの連続の影響を示す。
【００３２】
【表６】 表ＶＩ−１ 塩基数 定常 距離 距離 距離 距離 距離 電場 (mm) (mm) (mm) (mm) (mm) 距離 1s 1s 1s 2s 2s (mm) 2KV; 2KV; 2KV; 2KV; KV; 2000V 1s 1s 4s 2s 1s /4.4 -300V -620V -630V -1000V -2KV hrs. ──────────────────────────────────── 755 110 73 70 68 73 80 720 113 76 74 72 79 86 680 117 80 78 77 83 91 590 127 90 92 94 98 106 527 136 98 104 108 111 121 454 154 113 119 131 132 142 425 162 120 127 141 142 152 401 170 127 136 151 152 162 371 182 136 144 164 162 176 350 190 144 155 174 174 185 335 197 149 141 183 182 194 300 217 166 182 204 204 216 260 247 191 211 238 235 249 250 254 198 219 246 243 259 240 263 206 228 256 252 266 230 273 213 237 267 262 278 220 282 222 248 277 273 288 210 292 230 257 288 283 298 200 302 240 268 299 294 309 190 314 250 282 310 305 321 180 326 260 296 323 316 334 170 341 273 312 337 331 347 160 355 287 327 351 344 364 150 374 302 344 370 361 383 140 394 317 362 390 380 404 130 417 335 381 415 402 427 120 441 353 404 442 426 455 110 485 371 430 470 453 481 100 488 393 461 490 481 507 表ＶＩ−２ 塩基数 定常 相対 相対 相対 相対 相対 電場 移動度 移動度 移動度 移動度 移動度 相対 1s 1s 1s 2s 2s 移動度 2KV; 2KV; 2KV; 2KV; KV; 2000V 1s 1s 4s 2s 1s /4.4 -300V -620V -630V -1000V -2KV hrs. ──────────────────────────────────── 755 0.225 0.166 0.152 0.136 0.152 0.158 720 0.232 0.193 0.161 0.144 0.164 0.170 680 0.240 0.204 0.169 0.154 0.173 0.179 590 0.260 0.226 0.200 0.188 0.204 0.209 527 0.279 0.249 0.226 0.216 0.231 0.239 454 0.316 0.288 0.258 0.263 0.274 0.280 425 0.332 0.305 0.275 0.283 0.295 0.300 401 0.348 0.323 0.293 0.303 0.316 0.320 371 0.373 0.346 0.312 0.329 0.337 0.347 350 0.389 0.368 0.336 0.349 0.362 0.365 335 0.404 0.379 0.349 0.367 0.378 0.383 300 0.445 0.422 0.395 0.409 0.424 0.426 260 0.506 0.486 0.458 0.477 0.489 0.491 250 0.520 0.504 0.475 0.493 0.505 0.511 240 0.539 0.524 0.495 0.513 0.524 0.529 230 0.559 0.542 0.514 0.535 0.545 0.548 220 0.578 0.585 0.536 0.555 0.568 0.568 210 0.598 0.585 0.557 0.577 0.586 0.588 200 0.619 0.611 0.581 0.599 0.611 0.609 190 0.643 0.636 0.612 0.621 0.634 0.633 180 0.672 0.662 0.642 0.647 0.661 0.650 170 0.699 0.695 0.677 0.675 0.686 0.684 160 0.727 0.730 0.709 0.703 0.715 0.718 150 0.766 0.768 0.746 0.741 0.751 0.755 140 0.807 0.807 0.785 0.782 0.790 0.797 130 0.855 0.862 0.826 0.832 0.836 0.842 120 0.904 0.897 0.876 0.886 0.886 0.897 110 0.953 0.944 0.933 0.942 0.942 0.949 100 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000
【００３３】
【実施例７】電気泳動を１×ＴＢＥのイオン強度を有す
る６％アクリルアミドゲル中で、５０℃の温度で行っ
た。２０００Ｖの連続した電場を４．４時間かけた。こ
れに続いて、２０００ボルトで１ミリ秒および−３００
ボルトで１ミリ秒のパルスの連続、２０００ボルトで２
ミリ秒および−３００ボルトで２ミリ秒の連続、２００
０ボルトで２ミリ秒および−３００ボルトで４ミリ秒の
連続をかけた。１００塩基長フラグメントに対するこの
フラグメントの相対移動度を表ＶＩＩに報告する。
【００３４】
【表７】 表ＶＩＩ 塩基数 定常 距離 距離 距離 定常 相対 相対 相対 電場 (mm) (mm) (mm) 電場 移動度 移動度 移動度 距離 1ms 2ms 2ms 相対 1ms 2ms 2ms (mm) 2KV 2KV 2KV 移動度 2KV; 2KV; 2KV; 2000V 1ms 2ms 4ms 2000V 1ms 2ms 4ms -300V -300V -300V -300V -300V -300V ──────────────────────────────────── 755 110 73 82 80 0.225 0.166 0.176 0.172 720 113 76 86 85 0.232 0.193 0.184 0.182 680 117 80 91 89 0.240 0.204 0.195 0.191 590 127 90 106 103 0.260 0.229 0.227 0.221 527 136 93 118 117 0.279 0.249 0.263 0.251 454 154 113 137 136 0.316 0.288 0.293 0.292 425 162 120 148 146 0.332 0.305 0.313 0.313 401 170 127 155 155 0.348 0.323 0.332 0.333 371 182 136 164 169 0.373 0.346 0.351 0.363 350 190 144 177 177 0.389 0.366 0.379 0.380 335 192 149 184 185 0.393 0.379 0.394 0.397 300 217 166 203 206 0.445 0.422 0.435 0.442 260 247 191 233 235 0.506 0.466 0.498 0.504 250 254 198 241 242 0.520 0.504 0.516 0.519 240 263 206 250 251 0.539 0.524 0.535 0.539 230 273 213 260 261 0.559 0.542 0.557 0.560 220 282 222 270 270 0.578 0.565 0.576 0.579 210 292 230 280 280 0.598 0.585 0.600 0.601 200 302 240 290 291 0.619 0.611 0.621 0.624 190 314 250 301 302 0.643 0.636 0.645 0.648 180 326 260 314 314 0.672 0.662 0.672 0.674 170 341 273 326 326 0.699 0.695 0.698 0.700 180 355 287 338 339 0.727 0.730 0.724 0.727 150 374 302 354 354 0.766 0.768 0.758 0.760 140 394 317 372 371 0.807 0.807 0.797 0.796 130 417 335 394 392 0.855 0.852 0.844 0.841 120 441 353 417 415 0.904 0.898 0.893 0.891 110 465 371 440 440 0.953 0.944 0.942 0.944 100 483 393 467 466 1.000 1.000 1.000 1.000
【００３５】
【実施例８】電気泳動を１×ＴＢＥのイオン強度を有す
る６％アクリルアミドゲル中で、５０℃の温度で行っ
た。２０００Ｖの連続した電場を４時間かけた。これに
続いて、以下のようなパルスの連続を数回行った：−６
２０ボルトで１秒に変わる２０００ボルトで１秒の連
続、−６２０ボルトで１０ミリ秒に変わる２０００ボル
トで１０ミリ秒の連続、−６２０ボルトで５ミリ秒に変
わる２０００ボルトで５ミリ秒の連続、−６２０ボルト
で２ミリ秒に変わる２０００ボルトで２ミリ秒の連続、
および最後に−６２０ボルトで１ミリ秒に変わる２００
０ボルトで１ミリ秒の連続。１００塩基長フラグメント
と比較したこのフラグメントの相対移動度を表ＶＩＩＩ
に報告する。
【００３６】
【表８】 表ＶIII −１ 塩基数 定常 距離 距離 距離 距離 距離 電場 (mm) (mm) (mm) (mm) (mm) 距離 1s 10ms 5ms 2ms 1ms (mm) 2KV; 2KV; 2KV; 2KV; 2KV; 2000V 1s 10ms 5ms 2ms 1ms /4 -620V -620V -620V -620V -620V 時間 ──────────────────────────────────── 755 104 116 114 90 84 70 720 106 122 118 94 89 74 680 109 124 121 99 93 78 590 118 133 131 112 107 92 527 127 142 142 123 119 104 454 143 158 159 141 138 119 425 150 165 166 150 146 127 401 158 174 174 158 155 135 371 167 186 185 171 167 144 350 176 196 194 181 178 155 335 182 203 201 189 186 161 300 200 223 221 210 209 182 260 225 253 251 239 239 211 250 233 260 260 247 249 219 240 241 271 270 257 257 228 230 249 281 280 267 268 237 220 259 293 290 278 280 246 210 269 305 301 289 292 257 200 280 318 314 301 305 268 190 293 331 328 314 319 282 180 305 345 344 328 333 296 170 319 360 360 343 349 310 160 334 377 376 358 365 323 150 351 396 395 377 383 340 140 369 416 415 396 403 358 130 389 443 440 419 425 378 120 410 470 466 449 454 400 110 433 500 495 479 483 426 表ＶIII −２ 塩基数 定常 相対 相対 相対 相対 相対 電場 移動度 移動度 移動度 移動度 移動度 相対 1s 10ms 5ms 2ms 1ms 移動度 2KV; 2KV; 2KV; 2KV; 2KV; 2000V 1s 10ms 5ms 2ms 1ms /4 -620V -620V -620V -620V -620V 時間 ──────────────────────────────────── 755 0.240 0.236 0.230 0.188 0.174 0.164 720 0.245 0.244 0.238 0.196 0.184 0.174 680 0.252 0.248 0.244 0.207 0.193 0.183 590 0.273 0.266 0.265 0.234 0.222 0.216 527 0.293 0.284 0.287 0.257 0.246 0.244 454 0.330 0.316 0.321 0.294 0.286 0.279 425 0.346 0.330 0.335 0.313 0.302 0.298 401 0.365 0.346 0.352 0.330 0.321 0.317 371 0.386 0.372 0.374 0.357 0.346 0.338 350 0.406 0.392 0.392 0.378 0.369 0.364 335 0.420 0.406 0.406 0.395 0.385 0.378 300 0.462 0.446 0.446 0.438 0.433 0.427 260 0.520 0.506 0.507 0.499 0.495 0.495 250 0.538 0.520 0.525 0.516 0.516 0.514 240 0.557 0.542 0.545 0.537 0.532 0.535 230 0.575 0.565 0.566 0.557 0.555 0.556 220 0.598 0.586 0.586 0.580 0.580 0.582 210 0.621 0.610 0.606 0.603 0.605 0.603 200 0.647 0.636 0.634 0.628 0.631 0.629 190 0.677 0.662 0.663 0.656 0.660 0.662 180 0.704 0.690 0.695 0.685 0.689 0.695 170 0.737 0.720 0.727 0.716 0.723 0.726 160 0.771 0.754 0.760 0.747 0.756 0.758 150 0.811 0.792 0.798 0.787 0.793 0.798 140 0.852 0.836 0.838 0.827 0.834 0.840 130 0.898 0.886 0.889 0.875 0.880 0.887 120 0.947 0.940 0.941 0.937 0.940 0.939 110 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000
【００３７】
【実施例９】電気泳動を１×ＴＢＥのイオン強度を有す
る６％アクリルアミドゲル中で、５０℃の温度で行っ
た。２０００Ｖの連続した電場を４．４時間かけた。こ
れに続いて、以下のようなパルスの連続を数回行った：
−６２０ボルトで１ミリ秒に変わる２０００ボルトで２
ミリ秒の連続、−６２０ボルトで２ミリ秒に変わる２０
００ボルトで２ミリ秒の連続、−６２０ボルトで３ミリ
秒に変わる２０００ボルトで２ミリ秒の連続。１００塩
基長フラグメントと比較したこのフラグメントの相対移
動度を表ＩＸに報告する。
【００３８】
【表９】 表ＩＸ 塩基数 定常 距離 距離 距離 定常 相対 相対 相対 電場 (mm) (mm) (mm) 電場 移動度 移動度 移動度 距離 2ms 2ms 2ms 相対 2ms 2ms 2ms (mm) 2KV; 2KV; 2KV; 移動度 2KV; 2KV; 2KV; 2000V 1ms 2ms 3ms 2000V 1ms 2ms 3ms /4.4 -620V -620V -620V /4.4 -620V -620V -620V 時間 時間 ──────────────────────────────────── 755 110 86 84 73 0.225 0.183 0.165 0.151 720 113 91 89 77 0.232 0.194 0.175 0.160 680 117 94 93 82 0.240 0.200 0.183 0.170 590 127 107 107 94 0.260 0.228 0.210 0.195 527 136 119 118 107 0.279 0.253 0.232 0.222 454 154 140 138 124 0.316 0.298 0.271 0.257 425 162 149 146 133 0.332 0.317 0.287 0.276 401 170 158 155 141 0.348 0.336 0.305 0.293 371 182 169 167 154 0.373 0.360 0.328 0.320 350 190 179 178 161 0.389 0.381 0.350 0.334 335 192 186 196 169 0.393 0.396 0.365 0.351 300 217 206 209 190 0.445 0.438 0.411 0.394 260 247 234 239 218 0.506 0.498 0.470 0.452 250 254 243 249 227 0.520 0.517 0.489 0.471 240 263 251 257 236 0.539 0.534 0.505 0.490 230 273 260 268 245 0.559 0.553 0.527 0.508 220 282 271 280 255 0.578 0.577 0.550 0.529 210 292 280 292 266 0.598 0.596 0.574 0.552 200 302 292 305 279 0.619 0.621 0.599 0.579 190 314 303 310 292 0.643 0.645 0.627 0.606 180 326 311 333 306 0.672 0.642 0.654 0.635 170 341 331 349 321 0.699 0.704 0.696 0.656 160 355 341 365 338 0.727 0.726 0.717 0.701 150 374 362 383 354 0.766 0.770 0.752 0.734 140 394 380 403 373 0.807 0.809 0.792 0.774 130 417 399 425 395 0.855 0.849 0.835 0.820 120 441 420 454 420 0.904 0.894 0.892 0.871 110 465 443 483 450 0.953 0.943 0.949 0.934 100 488 470 509 482 1.000 1.000 1.000 1.000
【００３９】
【実施例１０】電気泳動を１×ＴＢＥのイオン強度を有
する６％アクリルアミドゲル中で、５０℃の温度で行っ
た。２０００Ｖの連続した電場を４．４時間かけ、これ
に続いて、−６３０ボルトで４ミリ秒に変わる２０００
ボルトで１ミリ秒のパルス電場の連続を40.8時間かけ
た。１００塩基フラグメントに対するこのフラグメント
の相対移動度を表Ｘに報告する。
【００４０】
【表１０】 表Ｘ 塩基数 定常 距離 定常 相対 電場 (mm) 電場 移動度 距離 2ms 相対 2ms (mm) 2KV; 移動度 2KV; 2000V 4ms 2000V 4ms /4.4 -630V /4.4 -630V 時間 時間 ──────────────────────────────────── 755 110 68 0.225 0.136 720 113 72 0.232 0.144 600 117 77 0.240 0.154 590 127 94 0.260 0.188 527 136 108 0.279 0.216 454 154 131 0.316 0.263 425 162 141 0.332 0.283 401 170 151 0.348 0.303 371 182 164 0.373 0.329 350 190 174 0.389 0.349 335 196 183 0.402 0.367 300 217 204 0.445 0.409 260 247 238 0.506 0.477 250 254 246 0.520 0.493 240 263 256 0.539 0.513 230 273 267 0.559 0.535 220 282 277 0.578 0.555 210 292 288 0.598 0.577 200 302 299 0.619 0.599 190 314 310 0.643 0.621 180 328 323 0.672 0.647 170 341 337 0.699 0.675 160 355 351 0.727 0.703 150 374 370 0.766 0.741 148 394 390 0.807 0.782 130 417 415 0.855 0.832 120 441 442 0.904 0.886 110 465 470 0.953 0.942 100 488 499 1.000 1.000 本発明のさらに完全な理解は、添付された図面を参照す
ることにより得られる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、先行技術の方法を用いて、比較的短い
フラグメント長に対する、およびより長いフラグメント
長に拡張して用いられる自動化された配列決定機により
得られたスキーム化した蛍光データを示したものであ
る。
【図２】図２は、先行技術と本発明の比較を、より長い
フラグメント長に対して得られたスキーム化した蛍光デ
ータで示したものである。
【図３】図３は、ＤＮＡフラグメントの相対電気泳動移
動度に対するゲルのイオン強度（ＴＢＥ濃度）の影響を
示す（１×ＴＢＥ，○；0.5 ×ＴＢＥ，●;1.5×ＴＢ
Ｅ，□）。
【図４】図４は、一定の２０００ボルト下で、８０〜７
５５塩基長の範囲の一本鎖ＤＮＡフラグメントの相対移
動度に対するポリアクリルアミドゲル濃度（４％，○；
６％，●；８％□；１２％，■）の影響を示す。
【図５】図５は、ＤＮＡフラグメントの相対電気泳動移
動度に対する温度の影響を示す。（５５℃，■；４５
℃，●；４０℃，■；３５℃，○；３０℃，□）
【図６】図６は、ＤＮＡフラグメントの相対電気泳動移
動度の電界強度の影響を示す。（７５０Ｖ，＋；１００
０Ｖ，○；１５００Ｖ，●；２０００Ｖ，□；２５００
Ｖ，■；３０００Ｖ，Δ；４０００Ｖ，△；５０００
Ｖ，▲）
【図７】図７は、同強度の連続電場での移動度と比較し
た一本鎖ＤＮＡフラグメントの相対電気泳動移動度に対
する断続的な電場パルシングの影響を示す。（１０００
Ｖ，＋；１ｓ，１０００Ｖおよび２ｓ，０Ｖ，○；１
ｓ，１０００Ｖおよび５ｓ，０Ｖ，●）
【図８】図８は、ＤＮＡフラグメントの相対電気泳動移
動度に対する、本発明の態様に従ったパルス連続の影響
を、同強度の連続電場と比較して示す。（２０００Ｖ
＋；１ｍｓ，２０００Ｖおよび１ｍｓ，−３００Ｖ，
○；１ｍｓ，２０００Ｖおよび１ｍｓ，−６２０Ｖ，
●；２ｍｓ，２０００Ｖおよび４ｍｓ，−６３０Ｖ，
□；２ｍｓ，２０００Ｖおよび２ｍｓ，−１０００Ｖ，
■；２ｍｓ，２０００Ｖ，１ｍｓ，−２００Ｖ，Δ）
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 シャンタル テュルメル カナダ エイチ４ダブリュー １ティー１ ケベック コート セント ルカ コー ト フロイド アベニュー 5950 アパー トメント 25 (72)発明者 エリック ブラッサード カナダ エイチ２ジー ２ゼット５ モン トリオール セイブル ストリート 6735 アパートメント 23

Claims (1)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ゲル電気泳動を使用して一本鎖核酸の大
    フラグメントの塩基配列を決定する方法であって、 ｎ＋１塩基の一本鎖核酸フラグメントの移動速度が、定
    常電場の下で、ポリアクリルアミドゲル中でのｎ塩基の
    一本鎖核酸フラグメントの移動速度と実質的に同じであ
    るところの一本鎖核酸フラグメントの混合物をポリアク
    リルアミドゲルにかけ；ゲルに対してある大きさの多数
    の電界パルスの連続を前記の一本鎖核酸フラグメントの
    混合物にかけることにより、ｎ＋１塩基の一本鎖核酸フ
    ラグメントの移動速度が、ｎ塩基の一本鎖核酸フラグメ
    ントの移動速度以下に遅らされ、該連続の各々が、期間
    Ｔ1 の間かけられた正の大きさＶ1 の第一パルス、およ
    び期間Ｔ 2 の間かけられた負の大きさＶ2 の第二パルス
    を含み、かつ、Ｔ1 とＶ1 の積がＴ2 とＶ2 の積の絶対
    値と同じではなく；および前記一本鎖核酸フラグメント
    の配列を決定すること含む、前記の方法。
JP4237335A 1991-09-04 1992-09-04 核酸の大フラグメントの配列決定 Withdrawn JPH05236999A (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US07/754854 1991-09-04
US07/754,854 US5167784A (en) 1991-09-04 1991-09-04 Sequencing large nucleic acid fragments

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JPH05236999A true JPH05236999A (ja) 1993-09-17

Family

ID=25036646

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP4237335A Withdrawn JPH05236999A (ja) 1991-09-04 1992-09-04 核酸の大フラグメントの配列決定

Country Status (5)

Country Link
US (1) US5167784A (ja)
EP (1) EP0531169B1 (ja)
JP (1) JPH05236999A (ja)
CA (1) CA2074282C (ja)
DE (1) DE69220634T2 (ja)

Families Citing this family (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5453162A (en) * 1993-09-09 1995-09-26 University Of North Carolina At Chapel Hill Method and apparatus for gel electrophoresis using two electric fields
US6783651B1 (en) * 1994-03-31 2004-08-31 Invitrogen Corporation System for pH-neutral stable electrophoresis gel
US5989399A (en) * 1996-09-04 1999-11-23 The Research Foundation Of State University Of New York Effective surface treatment for a new separation medium in electrophoresis
US6001232A (en) * 1996-09-04 1999-12-14 The Research Foundation Of State University Of New York Separation medium for capillary electrophoresis
US6780591B2 (en) 1998-05-01 2004-08-24 Arizona Board Of Regents Method of determining the nucleotide sequence of oligonucleotides and DNA molecules
US7875440B2 (en) 1998-05-01 2011-01-25 Arizona Board Of Regents Method of determining the nucleotide sequence of oligonucleotides and DNA molecules
US6818395B1 (en) 1999-06-28 2004-11-16 California Institute Of Technology Methods and apparatus for analyzing polynucleotide sequences
JP2004523243A (ja) 2001-03-12 2004-08-05 カリフォルニア インスティチュート オブ テクノロジー 非同期性塩基伸長によってポリヌクレオチド配列を分析するための方法および装置
US7169560B2 (en) 2003-11-12 2007-01-30 Helicos Biosciences Corporation Short cycle methods for sequencing polynucleotides
ATE463584T1 (de) 2004-02-19 2010-04-15 Helicos Biosciences Corp Verfahren zur analyse von polynukleotidsequenzen
US7476734B2 (en) 2005-12-06 2009-01-13 Helicos Biosciences Corporation Nucleotide analogs
US7635562B2 (en) 2004-05-25 2009-12-22 Helicos Biosciences Corporation Methods and devices for nucleic acid sequence determination
US7220549B2 (en) 2004-12-30 2007-05-22 Helicos Biosciences Corporation Stabilizing a nucleic acid for nucleic acid sequencing
US7482120B2 (en) 2005-01-28 2009-01-27 Helicos Biosciences Corporation Methods and compositions for improving fidelity in a nucleic acid synthesis reaction
US7666593B2 (en) 2005-08-26 2010-02-23 Helicos Biosciences Corporation Single molecule sequencing of captured nucleic acids
US7397546B2 (en) 2006-03-08 2008-07-08 Helicos Biosciences Corporation Systems and methods for reducing detected intensity non-uniformity in a laser beam

Family Cites Families (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4473452A (en) * 1982-11-18 1984-09-25 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Electrophoresis using alternating transverse electric fields
US4729947A (en) * 1984-03-29 1988-03-08 The Board Of Regents Of The University Of Nebraska DNA sequencing
US4666581A (en) * 1984-05-09 1987-05-19 Hitachi, Ltd. Apparatus for two-dimensional electrophoresis
US4870004A (en) * 1984-06-08 1989-09-26 Autoseq, Inc. Apparatus and method of analyzing nucleic acid molecules
US4865968A (en) * 1985-04-01 1989-09-12 The Salk Institute For Biological Studies DNA sequencing
US4737251A (en) * 1985-09-27 1988-04-12 Washington University Field-inversion gel electrophoresis
US4663015A (en) * 1985-09-30 1987-05-05 Bio-Rad Laboratories, Inc. Electrophoresis apparatus for nucleic acid sequencing
US4740283A (en) * 1986-02-27 1988-04-26 University Patents, Inc. Pulsed-field gradient gel electrophoretic apparatus
JPS63115062A (ja) * 1986-11-04 1988-05-19 Hitachi Ltd Ｄｎａの塩基配列決定装置
JPS63149563A (ja) * 1986-12-12 1988-06-22 Hitachi Ltd 核酸塩基配列決定装置
US4971671A (en) * 1987-03-02 1990-11-20 Xerox Corporation Processes for separation of DNA fragments
DE3855429T2 (de) * 1987-12-18 1996-11-21 Fuji Photo Film Co Ltd Verfahren zur Elektrophorese
US4830726A (en) * 1988-02-03 1989-05-16 The Wistar Institute Separation of large DNA molecules in alternating asymmetric electric fields
US4911817A (en) * 1988-10-20 1990-03-27 Eastman Kodak Company Electrophoresis apparatus
US4959133A (en) * 1989-01-23 1990-09-25 Eastman Kodak Company Field inversion electroblotting & electroelution
CA2012379C (en) * 1989-04-24 2000-01-25 Gary W. Slater Processes for the preparation and separation of macromolecules

Also Published As

Publication number Publication date
CA2074282C (en) 1996-09-03
DE69220634D1 (de) 1997-08-07
DE69220634T2 (de) 1998-01-15
EP0531169A1 (en) 1993-03-10
US5167784A (en) 1992-12-01
CA2074282A1 (en) 1993-03-05
EP0531169B1 (en) 1997-07-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JPH05236999A (ja) 核酸の大フラグメントの配列決定
JP2531653B2 (ja) 電場反転ゲル電気泳動
Cantor et al. Pulsed-field gel electrophoresis of very large DNA molecules
US4729947A (en) DNA sequencing
Turmel et al. Molecular detrapping and band narrowing with high frequency modulation of pulsed field electrophoresis
ATE310102T1 (de) Dna-sequenzierung mit hoher auflösung mittels einem medium geringer viskosität
US20050161331A1 (en) Fractionation of macro-molecules using asymmetric pulsed field electrophoresis
Kim et al. Rapid pulsed field capillary electrophoretic separation of megabase nucleic acids
DK374686D0 (da) Knoglemorphogenetiske midler, fremgangsmaade til fremstilling deraf og dna-sekvenser, nucleinsyresonder og rekombinante udtrykkelsesmedier til anvendelse derved
ATE275423T1 (de) Verabreichung der nukleinsäure in den quergestreiften muskel
Mathew et al. High-resolution separation and accurate size determination in pulsed-field gel electrophoresis of DNA. 2. Effect of pulse time and electric field strength and implications for models of the separation process
US6051636A (en) Entrapment of nucleic acid sequencing template in sample mixtures by entangled polymer networks
Guttman et al. Prediction of migration behavior of oligonucleotides in capillary gel electrophoresis
Birren et al. Pulsed field gel electrophoresis techniques for separating 1-to 50-kilobase DNA fragments
US4830726A (en) Separation of large DNA molecules in alternating asymmetric electric fields
EP0644420A2 (en) Method and apparatus for gel electrophoresis
Lalande et al. Scrambling of bands in gel electrophoresis of DNA
Berka et al. Sequence dependent migration behavior of double‐stranded DNA in capillary electrophoresis
CA2082906C (en) Electrophoretic resolution of single strand dna by asymmetric field inversion
Cohen et al. Capillary gel electrophoresis of biopolymers
Dolník et al. Electromigration behavior of poly‐(l‐glutamate) conformers in concentrated polyacrylamide gels
EP0738272B1 (en) Method and separation substrate for analysing mononucleotides and oligonucleotides
JPH10502738A (ja) 粘性ポリマー溶液中の温度勾配でのキャピラリー電気泳動による核酸の分離
Talens et al. Electrophoretic separation of Escherichia coli ribosomal particles on polyacrylamide gels
JPH0660887B2 (ja) 電気泳動方法

Legal Events

Date Code Title Description
A300 Application deemed to be withdrawn because no request for examination was validly filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A300

Effective date: 19991130