JPH05203650A - 酵素標識試薬を使用する高感度の光学的免疫検定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 高感度の薄膜光学的免疫検定用具 【構成】 上側表面および下側表面をもち、その上側表
面上に、対象分析物に由来する過酸化物放出反応性物質
と相互作用して不溶性の反応生成物を生成することがで
きる固定化した過酸化酵素結合体を含有する少なくとも
一つの層を間接的に支える基体を含む。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】この発明は、対象分析物に由来す
る少量の物質を、酵素標識手段によって検出するための
高感度の薄膜免疫検定（ＯＩＡ）用具およびその方法に
関する。

【０００２】薄膜光学効果に基づく免疫検定法は、ジャ
イアエバー(Giaever)の業績にまでさかのぼる長い歴史
をもつ。そのような検定法は、肉眼または機器へ変色等
を含む光学的な可視効果を与える表面の厚みの増大によ
って行われるが、必ずしもそれだけに限らない。対象分
析物が光学的に好適な表面へ結合している場合は、それ
自身がはっきり観察できる厚みの変化を起こし得るほど
十分に多量であり得ることもある。しかし対象分析物の
多くは、追加的な粒子試薬を検定に添加して目的の厚み
に一層大きい変化を与えると、一層容易に検出される。
この目的のために選ばれた粒子は、その表面へ抗体を容
易に吸着でき、それによって対応する抗原の検出を増幅
するように作用するポリスチレンラテックスであった。
そのようなポリマーラテックスは広範な粒度で入手可能
であるが、実用上の目的のためには、検定におけるその
有用性は厚みを増大させる粒度と感度に寄与する表面積
とのかねあいであり、粒子が小さければ小さいほど厚み
の増大は減り、粒子が大きければ大きいほど抗体を結合
する表面積は小さくなる。したがって光学的薄膜免疫検
定に使用する粒子試薬増強剤には、検定感度の制約とい
う物理的な制限があり、臨床的に重要な対象分析物を測
定するそのような検定の適用範囲に制限を生じる。

【０００３】この発明は粒子試薬増強剤を使用する先行
技術に伴う制約を解消する。ラテックス試薬粒子の代わ
りに抗体−酵素結合体を使用することにより、特に不溶
性沈殿生成物を提供する酵素のために選ばれた基質で、
予想外にも一層高感度の光学的薄膜検定さえ可能である
ことが判明した。この発明は、髄膜炎および連鎖球菌の
ようなヒトにおける細菌感染症に共通の原因である細菌
群に由来する低濃度の多糖抗原を検出する薄膜検定に、
そのような酵素標識抗体法を使用することに関する。そ
のような抗原の検出および同定は、これらの重大な細菌
に起因する疾患群の診断および有効な処置の選択に重要
である。

【０００４】

【従来の技術】光学的免疫検定手法に有用な多くの診断
方法および要素がラテックスに基づく粒子によってお
り、そのあるものでは増強物質の使用が必要であること
が分かっている。これらの方法の幾つかでは、凝集免疫
検定は十分な粒度の粒子を産生する抗体によっており、
これらの粒子の集合によって可視シグナルを生じる。可
視化は光の散乱によって達成される。他の方法では、高
度に架橋した硬いコポリマーが対象分析物を捕獲し、こ
れを分離する固体保持体を提供する。また酵素結合免疫
吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）が、生体分子の定性および定
量の何れの検定にもよく受け入れられ広く利用されてい
ることは周知のことである。多数の研究者が測定すべき
分子（即ち、対象分析物）に対する抗体へ酵素を結合さ
せ、ついで可視的着色反応生成物を生じるその酵素に特
異的な色素産生基質と組み合わせてこれを使用する方法
を利用している。それらの方法では、測定すべき分子を
固定化する固相として試験管またはフィルター膜を使用
する。もっと一般的には膜に基づく検定では、発色のた
め２次抗体を着色ラテックスまたは金属粒子へ付着させ
る。そのような変色を含む反応については、ジャーナル
・オブ・イムノアッセイ(J. Immunoassay)、２巻（３巻
および４巻）、１８７〜２０４頁（１９８１年）に報告
されている。そのような着色生成物が得られれば、分光
測光法等を含む種々の手法によってこれを定性的に観察
でき、あるいは定量的に測定できる。そのような検定手
法の変法の種類は極めて多いが、それらは何れも専ら抗
原の存在および濃度に比例する発色率およびその程度に
依存している。

【０００５】ウオウィツウィローは、西洋ワサビ・ペル
オキシダーゼ（ＨＲＰ）のような各種の酵素を使用した
ＥＬＩＳＡの結果、光学的に検出可能な色形成の記録を
報告した（米国特許第５０１３６４６号）。またビショ
ップらは、ペルオキシダーゼを標識した特異的な結合化
合物をヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ＨＣＧ）に対する
抗体の形で利用し、存在する色素量を、存在するリガン
ド量の指標として測定する方法を報告した（米国特許第
５０２４９３５号）。マッククランは、色素を産生する
ペルオキシダーゼ反応系で、リガンドと受容体の免疫複
合体の生成および検出を含む方法によりリガンドを測定
した（米国特許第５０１７４７４号）。類似の方法がサ
トシらによって報告された（米国特許第４９２１７９１
号）。タングは、抗原および少なくとも２種の抗体によ
って生成する複合体を介して不溶性保持体へ結合させる
抗体標識として、西洋ワサビ・ペルオキシダーゼ酵素を
使用した（米国特許第４７８８１３８号）。

【０００６】この発明のように、２次酵素標識結合試薬
を免疫検定方法またはその要素に使用することによる抗
原の高感度な光学的検出は、先行技術に報告されていな
い。これらの方法では、基体表面上で生じた不溶性沈殿
と結合した免疫複合体の光学的厚みの増大によって、楕
円偏光法または目視的に測定可能な対象分析物の存在に
対する感度が改善された。この発明は、これらの要素を
使用して、極めて高感度で正確な、先行技術と比べて信
頼度が高く、比較的簡単で高価でない要素および方法を
報告する。

【０００７】この発明の目的は、ラテックス粒子凝集表
面系で示されるより、感度が一層増大した改善された光
学的免疫検定方法を提供することにある。

【０００８】もう１つの目的は、ナイセリア・メニンギ
チジス(Neisseria meningitidis)Ａ、Ｃ、Ｙ、Ｗ₁₃₅ 等
のような感染細菌性分析物の存在を検出するため、高感
度で信頼度が高く、正確かつ簡単な光学的免疫検定方法
を提供することにある。

【０００９】さらにこの発明のもう１つの目的は、極め
て低濃度の特異的抗原の存在でも、非粒子性の非ラテッ
クス基体表面上に不溶性の光学的に検出可能な厚みまた
は質量の変化を提供し得る酵素基質および酵素標識抗体
を利用することにある。

【００１０】この発明によって達成されたこれらおよび
その他の目的について、以下、さらに詳細に説明する。

【００１１】

【発明の構成】この発明は、血清または脳脊髄液（ＣＳ
Ｆ）のようなその他の体液、または同定を目的とする各
種の物質からの対象分析物を、どのような機序であれ、
直接選択的に結合する製造品を使用する新規組成物およ
び新規方法からなる。この発明は、最も広範な意味で、
未標識の受容物質を含む１層またはそれ以上の層で被覆
した非重合体、非粒子状の非ラテックス基体を利用す
る。この物質は高度の受容機能を有し、対象分析物およ
び酵素標識した２次受容物質からなる物質と直接相互作
用するのに適している。この２次受容物質は固体保持体
上に固定化した未標識の受容物質と同一、または同一で
なくてもよい。そのような物質は、ストレプトコッカス
(Streptococcus)、ナイセリア・メニンギチジス、およ
びヘモフィルス(Haemophilus)等のような各種の細菌の
表面抗原、または細胞成分の指標となる多糖であり得
る。

【００１２】

【図面の説明】図１は、リガンド層、酵素標識抗体層、
および沈殿剤を含んだ最上層の基質を含む種々の層を図
示した多層薄膜光学的免疫検定用具の縦断面図である。

【００１３】

【実施態様】図１は、上側表面および下側表面をもつ基
体１を含む多層ＯＩＡ用具の断面図であって、その上側
表面上には、種々の層が間接的および直接的に被覆され
ている。これらの層は、参考のために本明細書にその全
文を包含させた同時係属中の米国特許出願第４０８２９
１号（１９８９年９月１８日出願）に一層詳細に説明し
た窒化ケイ素の任意の層を上層にすぐ隣接して含んでい
る。この層があればその層の上に、なければ上側の層の
上に、重合体シロキサンのようなポリマー層３を被覆
し、または沈着させる。このポリマー層は、タンパク質
接着を改善し、リガンド層４を保持する環境を備えた中
間表面修飾層を提供する。このポリマー層は、基体によ
って提供されるかもしれないどのような有害効果でも、
保持する生体分子層をこれから絶縁し得るよう十分に厚
くなければならない。リガンド層は結合対の１要素であ
り、そのような対として、抗原−抗体、オリゴヌクレオ
チド／ＤＮＡ、キレート化剤／金属、酵素／阻害剤、酵
素／基質、細菌／受容体、ウイルス／受容体、ホルモン
／受容体、ＤＮＡ／ＲＮＡまたはＲＮＡ／ＲＮＡ、その
他、任意の種の結合または反応物の組み合わせが挙げら
れるが、それだけに限定されるものではない。リガンド
層または受容物質層は分析物層５を支え、ついでこの分
析物層は、対象分析物に由来しまたは由来し得る抗原に
特異的な抗体のような抗体標識酵素６からなる最上層の
相互作用層を支える。そのように組み合わせて複合させ
ると、酵素標識抗体層および分析物層は、同時に結合体
の質量を規定する複合固体である。この質量の上に最上
層被膜、または「ＴＭブルー」のような基質７を滴下す
ると、前述の沈殿を生じる。

【００１４】この発明の実施態様として、この発明を具
体化する方法、用具、およびキットはウイルス抗原、Ｄ
ＮＡ、ＲＮＡ、ホルモン、およびその他、任意の類似の
分析物のような対象分析物を含む。

【００１５】実施例３の表３は、先行技術、即ちラテッ
クス粒子試薬による免疫検定用具とこの発明の酵素標識
によるＯＩＡ用具とを比較したグラフを表す。希釈によ
って細菌性分析対象物に由来する抗原が減少すると、ラ
テックス試薬用具では、抗原−抗体−ラテックス層の光
学的厚みに基づく十分なシグナルの提供が著しく不可能
となる。これに反して、この発明の用具の酵素標識抗体
−抗原複合体では、測定可能な感度が少なくとも５倍増
大する。この発明に有用な代表的な酵素は、グルコース
オキシダーゼ、ガラクトシダーゼペルオキシダーゼ、ア
ルカリ性ホスファターゼ等である。特に注意すべきこと
は、高濃度の抗原が存在すると、酵素試薬は不安定な厚
みの増大を提供することである。これは機械的に安定で
なく、洗浄および乾燥によって容易に表面から除去され
る。これは沈殿生成物の単なる人為結果である見掛けの
飽和をシグナルに生じる。ただし過剰の液体を除去する
前に、試料スポットに濃い青色が現れ、陽性の結果を示
す。

【００１６】この発明の１態様では、上側表面および下
側表面をもち、その上側表面上に、対象分析物に由来す
る過酸化物放出反応性物質と相互作用して、不溶性の反
応生成物を生成することができる固定化した過酸化酵素
結合体を含有する少なくとも１層の層を間接的に支える
基体を含んだ高感度の薄膜光学的免疫検定用具を提供す
る。固定化した抗体−抗原−抗体ＨＲＰ複合体を含有す
るこの不溶性反応生成物は、アルギン酸、硫酸デキスト
ラン、メチルビニルエーテル／無水マレイン酸共重合
体、またはカラゲニン等を組み合わせて、反応生成物層
と接触する基質として存在する「ＴＭブルー」（３，
３'，５，５'−テトラメチルベンジデン）のような沈殿
試薬の作用によって沈殿する。またクロロナフトール、
ジアミノベンジデン四塩酸、アミノエチルカルバゾー
ル、オルトフェニレンジアミン等のようなその他の物質
も使用できる。これらの試薬は約１０〜約１００mMの濃
度で使用する。上記の過酸化酵素結合体層および未標識
抗体層上で、測定可能な増大が質量変化に起こる。この
質量変化は過酸化物放出反応性物質の発色（必ずしもそ
れだけではないが）によって影響されない。

【００１７】これに続く態様として、対象分析物に由来
する抗原、または対象分析物の何れかを直接溶液中の標
識抗体と反応させると、抗原標識抗体複合体が生じ、つ
いでこの複合体を、非ラテックス、非ポリマー、非粒子
状の保持体へ結合させた未標識抗体と反応させる。

【００１８】また別の態様では、上記の用具を用意し、
この用具を対象分析物に由来する過酸化物放出反応性物
質と相互作用させ、不溶性反応生成物を生じる段階によ
って対象分析物の存在を検出する方法を提供する。つい
で任意の未反応層物質を分離し、棄て、除去するため、
不溶性反応生成物を洗浄し、乾燥し、ついでその質量変
化を測定し、記録し、厚みの増大によって起こる光度差
を目視手段、または楕円偏光法のような機器の使用を含
む各種の手段によって過酸化酵素結合体層の増加を測定
する。したがって受容酵素物質は、薄膜中の可視的な質
量変化を得るために、対象分析物、より詳細には抗原の
ような分析物の証拠と直接相互作用することができる。
この変化は光学的厚みを測定することによって検出で
き、何ら基体物質の光反射性に依存する必要はない。そ
のような上記の機器の１つは、米国特許第４３３２４７
６号、および同第４６５５５９５号、第４６４７２０７
号、第４５５８０１２号に報告されたサガックス・エリ
プソメーター(Sagax Ellips-ometer)であり、それらを
参考のために引用し、本明細書の一部に包含させる。

【００１９】あらゆる種類の未標識受容物質を含み得る
が、これらは例えば毒素、抗体、抗原、ホルモン受容
体、寄生虫、細胞、ハプテン、代謝産物、アレルゲン、
核酸、核物質、自己抗体、血液タンパク質、細胞破片、
酵素、組織タンパク質、酵素基質、補酵素、神経伝達物
質、ウイルス、ウイルス粒子、微生物、細菌、金属、お
よびさまざまな化学種、およびそれらに由来する物質等
を含む。ここに挙げたものは被覆した基体表面上に被膜
を作り、酵素標識２次受容物質と光学的免疫検定系を生
じ得る多くの異なった物質の幾つかだけを包含させた。
選ばれた対象分析物が何であれ、その受容物質は対象分
析物と特異的に相互作用するように設計する。「酵素標
識」の用語は、結合され、さもなければ受容され得るよ
うに、例えば抗体酵素結合のように特別に調製された酵
素を意味する。酵素標識した２次受容物質は、固定化し
た未標識受容物質上でのみ抗原の存在で捕獲される。

【００２０】実施例ではシリコンウェーハーを基体とし
て使用するが、多くの基体物質が使用できるはずであ
る。基体はシリコン結晶から作成でき、これをダイアモ
ンドで切断してウェーハーを作り、ＫＯＨ中で異方性エ
ッチングを行い、ついで等方性にエッチングして一層平
滑な面を作る。そのようなウェーハーの１表面を磨いて
鏡のように反射する表面をもった平滑な鏡状仕上げを行
う。反対側の表面は、２００〜３００nm 程度の高さの
山と谷を有するわずかに不規則なままとし、散乱反射面
を生じる。鏡状の側面の方が機器検出に好ましいが、ウ
ェーハーの両側面とも使用できる。半導体産業では許容
されないシリコンウェーハーをこの発明に使用でき、し
たがって検定製造コストを減らすことができる。シリコ
ンウェーハー中のドーパントの量および種類はこの発明
に関係ない。

【００２１】図１に示したように、基体は追加的な物質
を支えるように適合させた上側表面をもつ。この上側表
面はシグナルを発生するのに必要な特性をもつ。中間層
物質は受容物質に好ましい微小環境を作り出し、それに
よって究極的に受容物質の濃密な実行可能な層を作り出
す任意の物質である。

【００２２】中間層は、より詳細には本明細書にその全
文を包含させた同時係属中の米国特許出願第６５３０６
４号（１９９１年２月１１日出願）に詳細に報告したよ
うに、さまざな機序によって基体へ接着し得る１または
それ以上の物質を適用することにより製造し得る。シロ
キサンは共有結合的に基体を修飾するが、その他の物質
はそのあと層間剥離することなく、最も機械的な操作に
も安定であるが、単に表面へ接着させるだけである。ポ
リマー物質を基体へ被覆する方法は、半導体に関する当
業者既知のものである。ポリマー物質はスピンコーティ
ング、エーロゾル噴霧、浸漬法等によって付着できるこ
とが期待される。コーティング方法は、使用する中間層
物質の種類に合わせて選ぶことができる。

【００２３】必ずしも必要なものではないが、所望の特
性を付与する追加的な物質を中間被覆した基体へ添加し
得る。そのような層は、配向抗体のためにプロテインＡ
またはプロテインＧを使用する際、受容物質の配向を改
善し得るものである。利用できるその他の物質として、
アビジン−ビオチン、合成または組換え体ペプチド等が
挙げられる。

【００２４】好ましい１態様として、中間層物質をスピ
ンコーティンまたはエーロゾル噴霧によって均一な形に
被覆する。５Å〜５００Åの厚み（それ以上の厚み量も
使用できる）で基体へ被覆すると、各種の中間層物質
は、先に挙げた利点を有する検定試験表面を提供する。
層は下記の機能を実現する任意の物質から調製でき、受
容物質に好ましい環境を作り出し、廉価な有効な方法で
受容物質を活性位置へ密に結合させ、低い非特異的相互
作用を示し、共有結合的にまたは密着して基体へ接着
し、基体へ均一に、ただし不必要に連続的でなく被覆で
きる特徴を有する。中間層物質はさまざまな方法で基体
上へ配置することができる。

【００２５】図１に示したように、中間層物質はその上
部の基体表面へ付着する下側表面を有する。この下側表
面は基体と調和し得るように適合させる。またポリマー
層物質は、相互作用性をもつ固定化した受容物質を接着
し得るように適合させた上部ポリマー面をもつ。中間被
覆をした試験表面は通常安定で、受容物質で被覆する前
に貯蔵することができる。

【００２６】中間層物質を基体へ被覆したあと、硬化期
間が必要である。Ｔ−ポリマーシロキサンの場合は、選
ばれた受容相互作用種の適用前に硬化期間を置くと、最
もよく操作できることを付記する。

【００２７】受容物質を中間層物質へ付着させる固定化
化学は、被覆する基体および受容物質の双方の性質に基
づいて選ぶ。受容物質は共有結合的にまたは受動的に中
間層物質へ付着させることができる。

【００２８】当業者であれば、抗体被覆したウェーハー
の安定性が、例えばゼラチン加水分解物等のような各種
の保護剤によって増強できることは理解し得よう。解決
すべき問題の１つは、上に被覆する保護剤の均一性およ
び被覆物質の展着能の一律性を得ることである。若干の
円偏光スポットは残ることがあるが、免疫検定を実施す
る前に、保護剤被膜を洗い落とし、ついで表面を空気乾
燥することによって、良好な結果が得られることが判明
した。ただし検定はスポットまたは色に依存するのでは
ないから、これはさほど重要ではない。

【００２９】実施例１ 試薬及びアッセー法の記載 西洋ワサビペルオキシダーゼ(シグマグレードＶ１)を、
ネイセリア・メニンギティディス(Ｎeisseria meningi
tidis)Ａ.Ｃ.Ｙ.Ｗ₁₃₅の培養液から、細胞の懸濁液をあ
らかじめ注射したウサギからの集めた高加価血清から、
カプリン酸沈殿により精製したイムノグロブリンと化学
的に結合させた。カップリングを試薬Ｓ−アセチルチオ
酢酸Ｎ−ヒドキロシコハク酸イミドエステル及びアナリ
テカル・バイオケミストリイ１３２(１９８３)６９−７
３に記載された方法を用いてなした。得られた抱合体は
ＭＯＰＳ．５０mＭ、pＨ７.０の緩衝液中、ペルオキシ
ダーゼ(１０４μＭ)及びイムノグロブリン(３５μＭ)を
含んだ。ペルオキシダーゼ−イムノグロブリン抱合体を
カゼイン(５mg／ml)を含むＭＯＰＳ緩衝液に希釈し、同
容量の、ネイセリア・メニンギティディス微生物の培養
液からの細胞フリー濾液の希釈液と混合した。混合物
(２５μl)を、シリコン窒化物、t−ポリマーシロキサン
及びネイセリア・メニンギティディスに対する同一ウサ
ギ抗血清からの精製イムノグロブリンの層で被覆したシ
リコンウエハーの表面にピペットで置いた。抗体は、５
０mＭ ＭＯＰＳ、pＨ＝７.０中１０μg／mlの抗体を含
む溶液からt−ポリマー／シリコンウエハーに被覆され
た。外界温度で１時間抗体が残ったウエハーを脱イオン
水ですすぎ、窒素流下乾燥した。抗体被覆基質はさらに
５０mＭ ＭＯＰＳ pＨ＝７.０中０.５mg／ml加水分解
カゼインに１時間外界温度で被覆基質をインキュベート
し、次いで既に記載したようにすすぎ、乾燥することに
より処理した。２分後、滴を水で洗い落としウエハーを
窒素液で乾燥するか又は、フィルター装置で水気を取っ
た。ＴＭブルー沈殿基質(ＴＭブルーは、トランスジエ
ニック・サイエンス、インコーポレイテッドにより商標
が付された商業的に入手可能な製品で、米国特許５,０
１３,６４６に開示された)をウエハーの同一範囲に適用
し、５分間放置した。ウエハーを洗浄し、乾燥した。紫
のスポットが見られた。そこで反応が起きた。この得ら
れた沈殿を目及びエリプソメーターで読み、エヌ・メリ
ンギティディスの存在を確認した。

【表１】 視覚的に抗原の１:２０,０００希釈は陰性から明らかに
決定された。ウエルコゲンキッドの感性カット−オフは
同じ抗原標品の１:４,０００希釈で１＋である。

【００３０】試験キット 試験キットは５０光学イムノアッセー急速試験まで実施
するに必要な全ての成分を含む。キットは必要とされる
適当な洗浄及び乾燥段階を容易にするよう設計された固
体支持試験場所を特徴づけられる。関心を引く抱合分析
物(analyte)に特異的な１から５の未反応試験表面を含
みうるスライドを試験場所上に置いた。最初の反応の終
了で、スライドをオペレーターから前方に傾ける。試験
表面(複数もあり)を、傾いた表面から下の容器に排出す
る洗浄溶液ですすぐ。容器は、生物を殺す働きのある物
質(biocide)で処理したセルロースアセテートの固体吸
収促進剤でロックを含む。次いでスライドを水平(leve
l)位置にもどし、一枚の吸収促進剤紙を直接試験表面上
に置いた。幾つかの二次接触時間がつまった芯材料を得
るのに認められる。吸収促進剤紙は、試験キットの前に
ある、個々のちぎり用紙のつめ物として提供されるが洗
浄／乾燥方法は交互の手段、例えば毛細管作用により達
成できる。加えて、酵素標識物質の溶液、関心をひく分
析物(例えば抗原)に特異的である酵素標識抗体も提供さ
れ、適当に緩衝化され、希釈される。最後に、沈殿手
段、例えば商業的に入手可能なＴＭブルー溶液のコンテ
ナーは都合のよい量で提供され、それにより１ないし３
滴又はそれ以上が粒で与えられ、洗浄前、沈殿物に変化
を起こす。二次インキュベーションを、基質を表面に加
えることにより開始し、洗浄／乾燥方法を繰り返して試
験を終える。

【００３１】実施例２ ２つの異なる型のシリコンウエハーを用いた。１つは金
シリコン窒化物被覆ウエハーで、他は窒化物被覆のない
銀色シリコンウエハーであった。ペルオキシダーゼ／沈
殿基質系でシリコン窒化物上に観察される視覚による色
彩は表面に沈殿した色素の吸収に全くよることが、考え
られる。これが本当で沈殿した色素が薄いフィルムとし
てふるまわないと、銀色シリコンウエハーは、ＴＭブル
ーのみの深いブルーである視覚化信号を作る。Ｔ−ポリ
マー被覆ウエハーは、商業的に入手可能なウエルコゲン
(ウエルカム・ディアグノスティックスの商標)ラテック
ス接着試験に用いられる生成等級抗体で処理した。５つ
の別々の試験エヌ・メニンギティディスＡ.Ｃ.Ｙ.
Ｗ₁₃₅;エヌ・メニンギティディスＢ．ストレプトコッカ
スＢ;エッチ．インスルエンザ及びストレプトコッカス
・プネウモニアについての試薬を生成した。各試験のた
めに生成した最初の試薬は、既に記載したように中間体
層(Ｔ−ポリマーシロキサン)で被覆したウエハー、金及
び銀であった。全ての５抗体は、ウエハーを適当な溶液
に１時間外界温度で浸すことにより５０mＭ ＭＯＰＳ,
pＨ＝７.０中、抗体の１０μg／ml濃度で、これらの型
のウエハーに被覆した。ウエハーは実施例１に記載した
ようにすすぎ、乾燥し、ブロックした。

【００３２】必要とされる第二試薬は、実施例１に記載
するように抗体−西洋ワサビペルオキシダーゼ抱合体の
生成のために同じ５抗体を用いた。蓄臓抱合標品は、５
０mＭ ＭＯＰＳ、pＨ＝７.０ ５mg／mlカゼイン中、
最後抱合比１:１００に希釈することにより作動抱合を
生成するのに用いた。作動抱合溶液の一部は標準抗原標
品の一部を混合し、２０μl試料を適当な抗体被覆ウエ
ハーに適用した。

【００３３】急速プロトコールを用い、２分の第１免疫
インキュベーション、続く洗浄、乾燥次いで５分基質イ
ンキュベーションしてウエハー表面上に生成物を蓄積さ
せた。洗浄及びブロット乾燥に続き試料は、裸眼及びエ
リプソメーターで読んだ。金、シリコン窒化物被覆ウエ
ハー上に拡がる強く見える紫色のスポット及び灰色スポ
ットが窒化物コーティングのない銀色シリコンウエハー
を用い見えた。厚さの増加はエリプソメーターを用い容
易に測定できた。全ての場合に視覚化しうる色が銀ウエ
ハーに生じ、これは、沈殿生成物が真の薄いフィルムと
してふるまい、抗反射コーティングがなくてさえ干渉効
果を生じることを示す。生じた色は色素の吸収特性に依
存しない。さらに色原体が観察された視覚応答の生成に
寄与しないという証拠が以下の実験で得られた。ＴＭＢ
／Ｈ₂Ｏ₂生成物を停止試薬Ｈ₂Ｏ₄で処理すると黄色の沈
殿を生ずる。ここでの研究下、光学支持体で観察された
視覚応答がもっぱら色原体によると、表面沈澱の停止試
薬による処理は黄色スポットを生じる。固定化表面沈殿
の硫酸による処理は、シリコン窒化物被覆ウエハー上に
生じた強い紫色又は青色のスポットを修飾しない。従っ
て、得られる信号は全く薄いフィルムの形成に依存す
る。付加的確認が、細長い粘着性物を用いシリコン窒化
物での表面から沈殿を除去して得た。粘着性物で除いた
沈殿は青白い灰色／青色の赤のない成分であった。観察
された干渉効果は、明るい紫／青色で強い赤の成分を示
した。これは、薄いフィルム形成が観察された色彩効果
の生成物の原因であることを強調する。

【００３４】

【表２】 ＊ＯＩＡに用いた抗血清のバッチは、ここで観察された
比較的おとった結果を説明するウェルコンキットの抗体
−ラテックスの生成での使用を拒絶したことが判った。 ＊＊ラテックス接着に比べＯＩＡで達した感性における
相対的増加を示す。 注 １) ＯＩＡは、希釈が視覚的に陽性結果を与える最終
希釈である。 ２) ここに記載した細胞スーパーネイトは、食塩水中
０.５％ホルマリンで作った重い細胞懸濁液を１晩＋４
℃で放置後除去した上清である。それらは高含量の多糖
を有し、従ってかなりの希釈を要する。 ３) ラテックス試験は、度をこえた満了日を有しない
ウェルコン生成物で行なった。

【００３５】実施例３ ラテックス粒子強化光学イムノアッセーでの比較 新しい酵素標識アッセーをストレプトカッカスＡから抗
原を検出するのに用い、アミド修飾表面アクチベーター
ラテックス０.１６１μm(ローンプーラン)を用いるアッ
セーで同一シリコンウエハー上で比較した。酵素抗体を
用いるアッセーはラテックス抗体を用いるものより５×
以上感受性に富んだ。

【００３６】感性での増加は、酵素技術での抗原コント
ロールの１:１６００希釈対ＯＩＡ技術に基づくラテッ
クスについての１:３２０希釈の視覚分析に基づいた。
両技術に、抗原の１:８０希釈でのカット−オフを有す
るラテックス接着技術よりも感受性に富んだ。二つの技
術の直接器具取付け比較は以下に示す。

【００３７】

【表３】 表３ 倍抗原希釈 ボルトラテックス ボルト酵素 ０ ３.０ １１.０ １:３２０ ３２.０ ２０３.０ １;１６０ ６３.０ ２９０.０ １:８０ １１３.０ ２７２.０ １:４０ １９５.０ １９４.０ １:２０ ３１６.０ １６８.０ １:１０ ４２８.０ ２５８.０

【００３８】

【表４】

【００３９】ストレプトカッカスＡ ペルオキシダーゼ 上のグラフは、このアッセーにおける酵素系がラテック
ス系よりも速やかに飽和する傾向にあるが、これは定性
試験系であり感性のカット−オフレベルで信号の最大生
成が望ましい結果であることを示す。酵素法の全部の実
施はストレプトカッカスＡ−ＣＩＡを劇的に改良する。

【００４０】実施例４ 多発試験方法 上掲した方法を用い、幾つかのペルオキシダーゼ−抗体
抱合体を１試薬(約３滴)と結合する。これを同容量(７
５μl)のＣＳＦ試料と結合し次いで混合し、適当な特異
性を有する５抗体スポット上に続いて１滴(２５μl)を
ピペットで分注した。インキュベーションを約２分行な
い、ウエハーを洗浄し乾燥した。１分インキュベーショ
ンし、次いで１滴(２５μl)を各特定抗体スポットに加
えた。この後、そして読み取り前に、ウエハーを洗浄し
乾燥した。この方法で、単一試料は１又はそれ以上の分
析物(analyte)の存在を容易に分析できる。視覚応答は
試料にない抗原に相当する抗原地帯に起きなかった。加
えられた抗原に対する陽性応答は単一試験方法に産生し
た信号に似ている信号を産生した。

【００４１】実施例５ 光学イムノアッセー(ＯＩＡ)の比較及び固相酵素免疫測
定法(エリサ)技術は、基質としてＴＭＢを用いるエリサ
に相対的なメニンギティディスＡ.Ｃ.Ｙ.Ｗ₁₃₅のための
酵素増幅ＯＩＡの実施を示す。

【００４２】同一試験をＯＩＡ及びエリサ技術を用い行
なった。これらの実験は、以下の表４,５及び６及び各
表に付属する図表に見られるようにエリサを越えてＯＩ
Ａで得られた感性と読みやすさでの利点を示す。

【００４３】これらの技術の間には２つの大きな差があ
る。第１に、ＯＩＡは抗体の固相吸着にみがいたシリコ
ンウエハーを利用し、一方エリサはきれいなポリスチレ
ンミクロタイタープレートを利用する。第２に、そして
より重要であるが、ＯＩＡのための反応を発達させるの
に用いた基質は、みがいたシリコンウエハーの表面上に
沈殿する不溶性生成物を生成し、一方エリサへの基質は
ミクロタイタープレートのウェルにおいて色のついた溶
液を生成する。結果間のこの重要な違いから、ＯＩＡが
より有効である。

【００４４】反射表面上に固りを置くことはその回りに
比べ固りを通る光通過の屈折指数を変える。従って、視
覚又は光学アッセーとして、うしろを反射した光は、光
変化として認められるが、技術は染料系を信頼していな
い。エリサ技術は単独で染料系を信頼し、ミクロタイタ
ーウェルの溶液は変色しなければならない。そうでない
と反応は検出不能である。

【００４５】表面標品 １つの表面はみがいたシリコンウエハー(ＯＩＡ)で他の
表面、きれいなポリスチレン、ミクロタイタープレート
(エリサ)

【００４６】両表面は、１時間室温で１０μg／ml抗体
溶液、１０分間室温で０.５mg／mlカゼイン閉鎖溶液及
び最脱イオン水リンスを受けた。

【００４７】アッセー実施 抱合体溶液: １:１００ ＨＲＰ標識抗体の希釈 ５mg／mlカゼイン ５０mＭ ＭＯＰＳＯ pＨ７.０

【００４８】各抗原希釈の１部を、使用前直ちに一部抱
合体溶液と結合し、各表面に適用した。これを２分間室
温で反応させ、次いで各表面を脱イオン水でリンスし
た。

【００４９】次いで基質を各表面に加えた。ＯＩＡシリ
コンウエハーはＴＭブルーを受け、エリサプレートはＴ
ＭＢを受けた。これを５分間室温で反応した。

【００５０】この点で、反応は終り、シリコンウエハー
を脱イオン水でリンスし、窒素で乾燥した。視覚読み取
りをなし、陰性から異なりうる最も遠い抗原希釈を測定
し、表面に沈殿した不溶性生成物を含む試料をエリプソ
メーターに置きそれぞれの電圧を測定した。

【００５１】エリサプレートを視覚で読み、依然として
反応させ、反応を酸溶液で停止し、再び読んだ。停止し
た反応プレートを分光測光器に置き、吸光度を測定し
た。結果は以下の通りである。

【００５２】視覚によってＯＩＡは、停止しないエリサ
の１:１０,０００−１:２０,０００希釈しか読めないの
に比べ１:４０,０００抗原希釈まで読めたが停止したも
のは１:５,０００−１:１０,０００希釈までしか読めな
かった。

【００５３】機械読み結果

【表５】 表５ インプットデータ Ｘ−値 背景 前景 Ｙ−値 5,000 0.3802 0.7010 0.3208 5,000 0.3802 0.7374 0.3572 10,000 0.3802 0.5198 0.1396 10,000 0.3802 0.5492 0.1690 20,000 0.3802 0.4340 0.0538 20,000 0.3802 0.4442 0.0640 40,000 0.3802 0.3985 0.0184 40,000 0.3802 0.4080 0.0278 80,000 0.3802 0.3913 0.0111 80,000 0.3802 0.3960 0.0158 160,000 0.3802 0.3879 0.0077 160,000 0.3802 0.3941 0.0139 0.000 0.3802 0.3865 0.0063 0.000 0.3802 0.3860 0.0058 OBS X-値 AVG-Y SD(N-1) CV(%) Y-/ + 1DS Ｙ−／ ＋ １
ＳＤ ２ ０．０００ ０．００６ ０．０００
５．４ ０．０１ ０．０１ ０．０１ ０．０１ ２ ５，０００ ０．３３９ ０．０２６
７．６ ０．３１ ０．３６ ０．２９ ０．３９ ２ １０，０００ ０．１５４ ０．０２１
１３．５ ０．１３ ０．１８ ０．１１ ０．２０ ２ ２０，０００ ０．０５９ ０．００７
１２．２ ０．０５ ０．０７ ０．０４ ０．０７ ２ ４０，０００ ０．０２３ ０．００７
２９．０ ０．０２ ０．０３ ０．０１ ０．０４ ２ ８０，０００ ０．０１３ ０．００３
２４．８ ０．０１ ０．０２ ０．０１ ０．０２ ２ １６０，０００ ０．０１１ ０．００４
４０．６ ０．０１ ０．０２ ０．００ ０．０２

【００５４】

【表６】

【００５５】

【表７】 表７ 希釈 ４５０での吸光度読み取り １ ２ ３
４ 0 0 0 0.013 0.003 1:160,000 0 0 0.008 0.015 1:80,000 0.006 0.036 0.037 0.045 1:40,000 0.006 0.005 0.027 0.001 1:20,000 0.015 0.012 0.012 0.041 1:10,000 0.030 0.043 0.068 0.053 1:5,000 0.081 0.085 0.097 0.123 1:5,000 0.063 0.064 0.094 0.088

【００５６】

【表８】 (商業的に入手しうるヌンクエリサポリスチレンミクロ
タイタープレートを使用)

【００５７】

【表９】 表９ 希釈 ４５０nmでの吸光度読み取り １ ２ ３ ４ ０ ０ ０
０ ０ １：１６０，０００ ０ ０
０ ０ １：８０，０００ ０．０２２ ０．０１０
０．０１１ ０．０２０ １：４０，０００ ０．０３０ ０．０２３
０．０４５ ０．０５０ １：２０，０００ ０．０２８ ０．０６２
０．０３８ ０．０３１ １：１０，０００ ０．０３５ ０．０３９
０．０４０ ０．０４０ １：５，０００ ０．０５７ ０．０６２
０．０７２ ０．０８６ １：５，０００ ０．０４０ ０．０４８
０．０７０ ０．０７０

【００５８】

【表１０】 （商業的に入手しうるダイナテックエリサポリスチレン
ミクロタイターを使用)

【００５９】以下の用語は上で定義される ＯＢＳ:Ｘの与えられた値でなした測定の数 Ｖ−値:試験した濃度: 既知 Ｙ−値:前景−背景の点で与えられた反応域のボルトで
ホトダイオード読み取り、未知 Ａvg−Ｙ:ホトダイオード即ちＹ₁＋Ｙ₂＋・・・ＹＮ／
Ｎ:式中Ｎ＝ＯＢＳにより測定したＹ(ボルト)の平均値 Ｓ.Ｄ.(n−１):Ｙの平均値においてＮ−１式、式中Ｎ＝
ＯＢＳ、で計算した標準偏差 ＣＶ(％):変動係数はＹ値から計算し、パーセンテージ
で表わすＹの平均値で割られたＣＶ−Ｓ.Ｄ. Ｙ＋／−１Ｓ.Ｄ.:可能なＹ値の範囲を計算する。可能
なＹ値の範囲は平均＋１×Ｓ.Ｄ.対平均−１×Ｓ.Ｄ.と
して表わす。 Ｙ＋／−２Ｓ.Ｄ.:可能なＹ値の範囲を計算する、可能
なＹ値の範囲は平均＋２×Ｓ.Ｄ.対平均−２×Ｓ.Ｄ.と
して表わす。 背景:テストピースを被覆した未反応抗体のボルトでの
強度読み取り 前景:テストピースの反応域のボルトでの強度読み取り 表において与えられたＸ値は以下である。 ０ ネガティブコントロール、緩衝液のみ ５ 保存抗原標品１:５,０００希釈を示す １０ 保存抗原標品の１:１０,０００希釈を示す ２０ 保存抗原標品の１:２０,０００希釈を示す ４０ 保存抗原標品の１:４０,０００希釈を示す ８０ 保存抗原標品の１:８０,０００希釈を示す １６０ 保存抗原標品の１:１６０,０００希釈を示す

【００６０】なされたホトダイオードデータ取得でのソ
フトウェアーパッケージが倍希釈でないng／mlの点で濃
度であるべきＸ値を予期するので、与えられたＸ値名称
を用いる。ボルトでの全てのＹ値は既知Ｘ値に関連して
集められ、値を供給された点で表示する。仕事を通じて
用いた抗原標品は以下の通り生成した。細菌はトッド−
ヘウィット ブロス中、２４−４８時間３７℃で嫌気的
に生育した。溶液を遠心分離して細胞を沈殿し、細胞を
緩衝液で洗浄し再び遠心分離し(２×)、細胞のペレット
を緩衝液に再び懸濁し、加熱不活性化又はホルマリン処
理した。不活性で溶解した細胞標品を濾過し、元の細菌
から誘導された細胞フリーの濾液を生成し、以下蓄積抗
原という。蓄積抗原を５０mＭ ＭＯＰＳ、pＨ＝７.０
で希釈し、試験実施の評価に用いる標準を生成した。

【００６１】陽性反応の結果として、比較エリプソメー
ターのホトダイオード修飾を光学厚さ変化又は光学かさ
変化させ、それは検出器で電圧における変化として記録
される輕強度での変化として知覚される。電圧はホトダ
イオードにより集められた光の強度での変化の直接関数
であり、スライドの表面上の固定リガンドとの分析物／
一次試薬コンプレックスの相互作用により生成した光学
かさ又は厚さの増加に比例する。方法は、引例及び試験
表面が光学厚さで同じである(厚さは反射指数により増
す)とき、光は検出器で知覚されず、真のゼロ(０ボル
ト)で観察されるという事実に依る。引例標準とテスト
ピースの間に少し不適合な組合せがあるので、テストピ
ースの背景は決して真のゼロではない。これはテストピ
ースの未反応帯の背景を測定し、テストピースの反応帯
の強度からこの値を引くことにより容易に補われる。反
応帯は陽性又は陰性コントロール或いは試料によりう
る。これらの試料では表面に適用される抗原の濃度から
判るように、観察された値は特異濃度に関連する。測定
は陰性コントロールを用いて実施する。これは、本シス
テムでは有効にブランクであり、要すれば陰性から生じ
た残留信号は陽性試料から引きうる。厚さ変化は別々の
物理測定、例えばオングストロームに換算して測定され
ない。

【００６２】酵素標識抗体はウエハーの表面に被覆され
ない。抗原が試料に存在するときだけ、酵素標識試薬
は、ウエハーの表面上に次いで抗原を通ってリガンドと
相互作用する機会がある。抗原は固定リガンド又は感受
性の鋭い材料と標識二次試薬との間のサンドイッチでの
つめ物として働く。特別な実施例では、リガンドと二次
試薬は共に抗体である。抗原／標識抗体コンプレックス
は、固定リガンドにより捕らえられ、層５及び６の複合
である新しい層を作成する。層５及び６は別々の層とし
て形成せず、むしろ同時に作成する。

【００６３】作成したコンプレックスは問題の分析物に
おける抗原と２つの抗体の間に存在する。抗体の一つは
その上の感受性の鋭い間接層として不溶性支持体に結合
し、他の抗体は第二の未結合標識抗体である。この標識
抗体の一部は形成されたコンプレックスを経て感受性の
鋭い材料を支持体に結合し、それが沈殿したとき、問題
の分析物の存在示す測定かさ変化を示す。

【００６４】実施例７ 商業的に入手しうる試験キット、ベクトンディキンソン
に含まれる抗ストレプトコッカスＡ抗体で被覆されたニ
トロセルロース膜を実施例４で用いた陽性ストレプトコ
ッカスＡ特異性抗原標品の希釈液と反応させた。抗原標
準は、５０mＭＭＯＰＳ、pＨ＝７.０中２０mg／mlカゼ
インとの抗ストレプトコッカスＡ抗体／ＨＲＰ抱合体の
１:１００希釈液と１:１で混合した。８０ミクロリット
ルの試料を膜に適用し、２分間インキュベートし、スト
レプトコッカスＡ−ＯＩＡ酵素アッセーした。膜を水で
リンスし、２５０μlのＴＭブルーを適用し５分間反応
した。膜を再びリンスし、アッセー感性の視覚解明をな
した。製造者試験としてきれいな三角を与えた抗原の
１:４０希釈は陽性反応でなすように設計される。非常
に弱い三角が標準の１:８０希釈で形成した。これは、
本発明の酵素増幅試料、ストレプトコッカスＡ−ＯＩＡ
で視覚しうる応答を生ずる１:１６００希釈と比較し
た。

【００６５】実施例８ ミリポアからのニトロセルロース膜を、ＯＩＡウエハー
のコーチングに用いた正確なプロトコールを用い抗スト
レプトコッカスＡポリクローナル抗体で被覆した。これ
らの膜は用いた試料容量が３０μlの試料及び３０μlの
ＴＭブルーを除き上で用いたプロトコールで試験した。
ベクトンディキンソン膜で観察したように、陰性に関係
がある視覚しうる陽性結果は抗原標品の１:４０希釈で
観察されただけである。感性でのきれいな改良は、薄い
フィルム光学検出計画及び沈殿剤ＴＭブルーの使用を結
びつける本発明の容器により達せられる。

【００６６】本実施例は、本発明の容器が、ＨＲＰコン
プレックス及び沈殿剤組合せでもなければ非ＨＲＰ組合
せ、例えばアルカリホスファターゼでもない従来技術の
容器はより問題の分析物の非常な低濃度の存在を立証す
る信号を示すのに少くとも４０倍も感受性であることを
示す。

【００６７】ここに記載した試験キット、イムノアッセ
ー容器並びに基本的コーチング及び検出方法は、記載さ
れたアッセー構成により、又は容量、濃度又は種々の試
薬に与えられた特異成分、コントロール及び検出器によ
り限定されることを意図しない。層、層コーチングで、
又は種々の試薬、添加物、コントロール及び検定器で用
いた成分の化学的又は他の機能的同等物が本発明の範囲
内で利用できることを理解すべきである。

【００６８】ここに記載した発明概念は依然として異な
る実施態様を有することを意図し、添付された請求の範
囲は従来技術により限定されるものを除き本発明の全て
の選択的実施態様を含むと解釈されることを意図する。

【図面の簡単な説明】

【図１】 上側表面及び下側表面をもつ基体を含む多層
ＯＩＡ用具の断面図である。

─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【提出日】平成４年１２月２２日

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正内容】

【特許請求の範囲】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 デビー・ゲイブル・クライダー アメリカ合衆国80301コロラド州ボールダ ー、ボスク・ストリート3895番 (72)発明者 ロバート・ジェイムズ・ビロデュー アメリカ合衆国80005コロラド州アルバダ、 ナンバー303、アリソン・ウェイ7819番 (72)発明者 グレゴリー・ロバート・ボガート アメリカ合衆国80521コロラド州フォー ト・コリンズ、アシュ・ドライブ1107番

Claims (16)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 上側及び下側表面を有する固体支持基質
   を含み、そしてその上側表面上に、該基質に結合する未
   標識リガンド抗体層を支持し、少なくとも一層は、分析
   物とコンプレックスを作り、酵素反応性送付基質とさら
   に相互作用しうる固定化酵素抱合体を含み、不溶性反応
   生成物を形成する薄膜光学的免疫検定用具。該酵素抱合
   体層及び該未標識抗体層は測定しうるように増加したか
   さ変化を有し、該かさは基質として適用された沈殿剤に
   より沈殿しうる。
2. 【請求項２】 かさ変化における得られる測定しうる増
   加がエリプソメーターで極性光を屈折しうる請求項１の
   用具。
3. 【請求項３】 問題の分析物が細菌又はそのポリクロー
   ナル抗体から誘導される請求項１の用具。
4. 【請求項４】 細菌がナイセリア・メニンギチデスＡ.
   Ｃ.ＹＷ１３５、ナイセリア・メニンギチデスＢ、ヘモ
   フィリス・インフルエンザＢ、ストレプトコッカスＡ、
   ストレプトコッカス・プネウモニア及びストレプトコッ
   カスＢからなる群から選ばれる請求項３の用具。
5. 【請求項５】 問題の分析物が細菌又はそのポリクロー
   ナル抗体から誘導された抗原である請求項３の用具。
6. 【請求項６】 該抗原が多糖である請求項５の用具。
7. 【請求項７】 沈殿剤が３,３’,５,５’−テトラメチ
   ルベンジデンを含む基質である請求項１の用具。
8. 【請求項８】 酵素抱合体が固定ペルオキシダーゼであ
   り、抗細菌−西洋ワサビペルオキシダーゼコンプレック
   スを含む請求項１の用具。
9. 【請求項９】 メディウムにおける問題の分析物を検出
   する方法であって、以下の段階を含む。 ａ）基質を含み上側及び下側表面を有し、そしてその上
   側表面に該基質に結合する未標識抗体層を間接的に支持
   し、少なくとも一層は分析物を含み、該分析物含有層は
   対象分析物とコンプレックスを作りうる酵素抱合物を含
   む少なくとも一層を支持する薄膜光学的免疫検定用具を
   備えること ｂ）該用具の上側表面と対象分析物を含む試験試料と接
   触させること ｃ）存在する対象分析物を該抱合体と結合するに充分な
   時間該試料をインキュベートし、それにより免疫反応生
   成物を形成すること ｄ）該反応生成物を沈殿する基質と接触させ、該固定及
   び不溶反応生成物と該沈殿剤との間の該沈殿を生ずるに
   充分な時間インキュベートすること ｅ）未反応材料を該反応生成物から分離すること ｆ）酵素抱合体層及び未標識抗体層のかさ変化の増加を
   光学的に測定すること 、該かさ変化は該試験試薬中の該分析物の量の表示であ
   る。
10. 【請求項１０】 かさ測定の変化が視覚又はエリプソメ
    ーター手段により達成される請求項９の方法。
11. 【請求項１１】 対象分析物が細菌誘導抗原又は該細菌
    に対するモノクローナル抗体である請求項９の方法。
12. 【請求項１２】 該抗原が多糖である請求項１１の方
    法。
13. 【請求項１３】 沈殿する基質が３,３’,５,５’−テ
    トラメチルベンジデンを含む請求項９の方法。
14. 【請求項１４】 対象分析物がナイセリア・メニンギチ
    デスＡ.Ｃ.ＹＷ１３５、ナイセリア・メニンギチデス
    Ｂ、ヘモフィリス・インフルエンザＢ、ストレプトコッ
    カスＡ、ストレプトコッカスＢ及びストレプトコッカス
    ・プネウモニアからなる群から選ばれる請求項９の用
    具。
15. 【請求項１５】 酵素抱合体が固定化ペルオキシダーゼ
    であり、抗細菌抗体−西洋ワサビペルオキシダーゼコン
    プレックスを含む請求項９の方法。
16. 【請求項１６】 対象分析物の存在を結びつけ、固定し
    検出しうる被覆固体支持体を含む少なくとも一つの薄層
    光学的免疫検定を実施するための診断試験キット、該キ
    ットは以下を含む。 ａ）固体支持試験配置手段 ｂ）対象分析物の抱合体に特異的な少なくとも一つの未
    反応試験表面を該支持手段上に提供するためのコーティ
    ング手段 ｃ）対象該分析物の反応及び凝集後、該試験表面を乾燥
    するための吸収又は毛細管手段 ｄ）対象分析物に特異的な酵素標識物質の溶液を含む抱
    合手段 ｅ）反応により形成され、該支持体上に付着し固定した
    抱合体に適用するための沈殿する基質手段