JPH05199886A - カフエオイル−ＣｏＡ３−Ｏ−メチルトランスフエラーゼ遺伝子 - Google Patents
カフエオイル−ＣｏＡ３−Ｏ−メチルトランスフエラーゼ遺伝子Info
- Publication number
- JPH05199886A JPH05199886A JP4129373A JP12937392A JPH05199886A JP H05199886 A JPH05199886 A JP H05199886A JP 4129373 A JP4129373 A JP 4129373A JP 12937392 A JP12937392 A JP 12937392A JP H05199886 A JPH05199886 A JP H05199886A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- gene
- ccoamt
- plants
- dna
- plant
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1003—Transferases (2.) transferring one-carbon groups (2.1)
- C12N9/1007—Methyltransferases (general) (2.1.1.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
- C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
- C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
- C12N15/8282—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for fungal resistance
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【目的】 カフェオイル−ＣｏＡ ３−Ｏ−メチルトラ
ンスフェラーゼ遺伝子。 【構成】 本発明は、植物から単離された新規カフェオ
イル−ＣｏＡ ３−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ遺伝
子（ＣＣｏＡＭＴ遺伝子）、そしてベクター類、宿主有
機体および植物を形質転換するためのそれらの使用、並
びに有害生物に対して増大した耐性を示す植物を再生す
るためのそれらの使用に関する。
ンスフェラーゼ遺伝子。 【構成】 本発明は、植物から単離された新規カフェオ
イル−ＣｏＡ ３−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ遺伝
子（ＣＣｏＡＭＴ遺伝子）、そしてベクター類、宿主有
機体および植物を形質転換するためのそれらの使用、並
びに有害生物に対して増大した耐性を示す植物を再生す
るためのそれらの使用に関する。
Description
【０００１】本発明は、植物から単離された新規カフェ
オイル−ＣｏＡ ３−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ遺
伝子（以後ＣＣｏＡＭＴ遺伝子と呼ぶ）、そしてベクタ
ー類、宿主有機体および植物を形質転換するためのそれ
らの使用、並びに有害生物に対して増大した耐性を示す
植物を再生するためのそれらの使用に関する。
オイル−ＣｏＡ ３−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ遺
伝子（以後ＣＣｏＡＭＴ遺伝子と呼ぶ）、そしてベクタ
ー類、宿主有機体および植物を形質転換するためのそれ
らの使用、並びに有害生物に対して増大した耐性を示す
植物を再生するためのそれらの使用に関する。
【０００２】以後ＣＣｏＡＭＴと呼ぶ酵素カフェオイル
−ＣｏＡ ３−Ｏ−メチルトランスフェラーゼは、トラ
ンス−４−クマロイル−ＣｏＡからトランス−フェルロ
イル−ＣｏＡを生じさせるところの、最近になってのみ
記述されるようになった生合成ルート（Matern, U.およ
びKneusel, R.E.、 1988、 Phytoparasitica 16:153-170;
Kneusel, R.E.、 Matern, U.およびNicolay, K.、 1989、
Arch. Biochem. Biophys. 269:455-462; そしてPakusc
h, A.-E.、 Kneusel, R.E.およびMatern, U.、 1989、 Arc
h. Biochem. Biophys. 271:488-494）におけるカフェオ
イル−ＣｏＡのメチル化を触媒する。
−ＣｏＡ ３−Ｏ−メチルトランスフェラーゼは、トラ
ンス−４−クマロイル−ＣｏＡからトランス−フェルロ
イル−ＣｏＡを生じさせるところの、最近になってのみ
記述されるようになった生合成ルート（Matern, U.およ
びKneusel, R.E.、 1988、 Phytoparasitica 16:153-170;
Kneusel, R.E.、 Matern, U.およびNicolay, K.、 1989、
Arch. Biochem. Biophys. 269:455-462; そしてPakusc
h, A.-E.、 Kneusel, R.E.およびMatern, U.、 1989、 Arc
h. Biochem. Biophys. 271:488-494）におけるカフェオ
イル−ＣｏＡのメチル化を触媒する。
【０００３】菌・カビの攻撃下で、植物は、桂皮酸の組
込みに続くそれらの架橋によってポリマー構造を生じる
か或はリグニンを蓄積することによって、非常に迅速に
それらの細胞壁を増強する。これらの条件下で、フェル
ロイル−ＣｏＡは、細胞壁多糖類のエステル化および木
化（コニフェリルアルコールへの還元）両方のための好
適なアシル供与体である。この細胞壁の変化速度および
その度合は、本質的に、植物の感染過程および寿命を決
定する、即ち「過度に敏感な反応」が、この細胞壁の特
に致命的および急激な変化に関連した植物の完全な耐
性、並びに直接影響を受けた細胞の死滅を特徴づける。
この過度に敏感な反応はまた、ウイルス感染に対する植
物の耐性反応でも観察される。最近になってのみ、フェ
ルロイル−ＣｏＡは、全ての場合においてフェルラ酸の
活性化によりインビボで生じるものではなく、クマロイ
ル−ＣｏＡの反応によっても生じることが見いだされ
た。この反応に参加する該カフェオイル−ＣｏＡ−特異
的メチルトランスフェラーゼは、以前に知られている酵
素（Pakusch, A.-E.、 Matern, U.およびSchiltz, E.、 1
991、 Plant Physiol. 95:137-143）に対してほとんど相
同性を示さず、植物中分類学的に幅広く存在しており、
そして例えば菌・カビの攻撃によってそこに誘発され得
る。
込みに続くそれらの架橋によってポリマー構造を生じる
か或はリグニンを蓄積することによって、非常に迅速に
それらの細胞壁を増強する。これらの条件下で、フェル
ロイル−ＣｏＡは、細胞壁多糖類のエステル化および木
化（コニフェリルアルコールへの還元）両方のための好
適なアシル供与体である。この細胞壁の変化速度および
その度合は、本質的に、植物の感染過程および寿命を決
定する、即ち「過度に敏感な反応」が、この細胞壁の特
に致命的および急激な変化に関連した植物の完全な耐
性、並びに直接影響を受けた細胞の死滅を特徴づける。
この過度に敏感な反応はまた、ウイルス感染に対する植
物の耐性反応でも観察される。最近になってのみ、フェ
ルロイル−ＣｏＡは、全ての場合においてフェルラ酸の
活性化によりインビボで生じるものではなく、クマロイ
ル−ＣｏＡの反応によっても生じることが見いだされ
た。この反応に参加する該カフェオイル−ＣｏＡ−特異
的メチルトランスフェラーゼは、以前に知られている酵
素（Pakusch, A.-E.、 Matern, U.およびSchiltz, E.、 1
991、 Plant Physiol. 95:137-143）に対してほとんど相
同性を示さず、植物中分類学的に幅広く存在しており、
そして例えば菌・カビの攻撃によってそこに誘発され得
る。
【０００４】作物植物の世界的収穫の大部分は、有害生
物によって一定して崩壊している（1967年には、可能な
収穫の損失は３５％であった；Chemistry of Pesticide
s、 K.H. Buechel発行、 John Wiley & Sons、 New York、
1983、 6頁を参照）。従って、有害生物による作物植物
の攻撃を減少させるか防止できる全ての可能性を研究お
よび利用することに対する緊急な必要性が存在してい
る。
物によって一定して崩壊している（1967年には、可能な
収穫の損失は３５％であった；Chemistry of Pesticide
s、 K.H. Buechel発行、 John Wiley & Sons、 New York、
1983、 6頁を参照）。従って、有害生物による作物植物
の攻撃を減少させるか防止できる全ての可能性を研究お
よび利用することに対する緊急な必要性が存在してい
る。
【０００５】全くＣＣｏＡＭＴを生じないか或は不適当
なＣＣｏＡＭＴのみを生じる植物の遺伝性因子（ゲノ
ム）に組み込むことができ、そしてそれによって有害生
物に対するこれらの植物の増大した耐性をもたらすこと
ができるところの、以後ＣＣｏＡＭＴ遺伝子と呼ぶ新規
なカフェオイル−ＣｏＡ ３−Ｏ−メチルトランスフェ
ラーゼ遺伝子をここに見い出した。
なＣＣｏＡＭＴのみを生じる植物の遺伝性因子（ゲノ
ム）に組み込むことができ、そしてそれによって有害生
物に対するこれらの植物の増大した耐性をもたらすこと
ができるところの、以後ＣＣｏＡＭＴ遺伝子と呼ぶ新規
なカフェオイル−ＣｏＡ ３−Ｏ−メチルトランスフェ
ラーゼ遺伝子をここに見い出した。
【０００６】植物のゲノムに外来性もしくは追加的ＤＮ
Ａとして組み込むことができ、それによって得られる形
質転換型植物の、有害生物に対する増大した耐性を達成
できるところの、新規な種類の耐性遺伝子を見いだすこ
とができたことは驚くべきことである。本発明の特別な
利点は、例えばキトアレキシン類の堆積が増大する場合
とは異なり、潜在的な毒性を示す代謝生成物の発生を目
的としたものではないことである。従って、いかなる毒
物貯蔵もない、何故ならば、この目的は、形質転換型植
物における、物理的防護壁として機能するか、或は「基
質」のアシル化による細胞壁多糖類に関する可能な病原
体誘発性酵素的溶解を防止するところの、主に不溶であ
り抗生物質的に不活性な化合物の迅速な合成であるから
である。溶菌性酵素、例えば最良で選択的活性を示すよ
うになることが可能なリゾチームもしくはまたキチナー
ゼなど、の遺伝子を用いた植物の形質転換とは異なり、
植物の細胞壁補強に関する増強した備えは、ウイルスを
含む病原体全ての形態に対して保護を与える。従って、
本発明は、ここに、幅広い用途を有する植物保護に関す
る新規な原理に従うものである。
Ａとして組み込むことができ、それによって得られる形
質転換型植物の、有害生物に対する増大した耐性を達成
できるところの、新規な種類の耐性遺伝子を見いだすこ
とができたことは驚くべきことである。本発明の特別な
利点は、例えばキトアレキシン類の堆積が増大する場合
とは異なり、潜在的な毒性を示す代謝生成物の発生を目
的としたものではないことである。従って、いかなる毒
物貯蔵もない、何故ならば、この目的は、形質転換型植
物における、物理的防護壁として機能するか、或は「基
質」のアシル化による細胞壁多糖類に関する可能な病原
体誘発性酵素的溶解を防止するところの、主に不溶であ
り抗生物質的に不活性な化合物の迅速な合成であるから
である。溶菌性酵素、例えば最良で選択的活性を示すよ
うになることが可能なリゾチームもしくはまたキチナー
ゼなど、の遺伝子を用いた植物の形質転換とは異なり、
植物の細胞壁補強に関する増強した備えは、ウイルスを
含む病原体全ての形態に対して保護を与える。従って、
本発明は、ここに、幅広い用途を有する植物保護に関す
る新規な原理に従うものである。
【０００７】ＣＣｏＡＭＴ遺伝子は、それをＲＮＡに転
写しそして蛋白質に翻訳した後、ＣＣｏＡＭＴの特性を
示す酵素の形成をもたらす核酸（ＤＮＡ）のいずれかで
あると理解され、この核酸は、その天然環境から単離さ
れるか、或はベクター中に組み込まれるか、或は原核も
しくは真核ＤＮＡ中に「外来性」ＤＮＡもしくは「追加
的」ＤＮＡとして含有させられる。ＣＣｏＡＭＴ遺伝子
はまた、それらの最初および／または最後に、これらの
遺伝子の機能を妨害しないか或は本質的に妨害しない追
加的ＤＮＡ配列を含んでいるＣＣｏＡＭＴ遺伝子である
と理解される。また「遺伝子単位」と呼ばれるこれらの
ＤＮＡ配列が、例えば制限酵素を用いた切除によって生
じる、と言うのは、通常の制限酵素は、この遺伝子の正
確な開始および終止部分に在るいかなる開裂部位も利用
できないからである。これらのＣＣｏＡＭＴ遺伝子もし
くは遺伝子単位はまた、それらの末端に、それらを操作
するに適当なＤＮＡ配列（例えば「リンカー」）を有す
ることができる。
写しそして蛋白質に翻訳した後、ＣＣｏＡＭＴの特性を
示す酵素の形成をもたらす核酸（ＤＮＡ）のいずれかで
あると理解され、この核酸は、その天然環境から単離さ
れるか、或はベクター中に組み込まれるか、或は原核も
しくは真核ＤＮＡ中に「外来性」ＤＮＡもしくは「追加
的」ＤＮＡとして含有させられる。ＣＣｏＡＭＴ遺伝子
はまた、それらの最初および／または最後に、これらの
遺伝子の機能を妨害しないか或は本質的に妨害しない追
加的ＤＮＡ配列を含んでいるＣＣｏＡＭＴ遺伝子である
と理解される。また「遺伝子単位」と呼ばれるこれらの
ＤＮＡ配列が、例えば制限酵素を用いた切除によって生
じる、と言うのは、通常の制限酵素は、この遺伝子の正
確な開始および終止部分に在るいかなる開裂部位も利用
できないからである。これらのＣＣｏＡＭＴ遺伝子もし
くは遺伝子単位はまた、それらの末端に、それらを操作
するに適当なＤＮＡ配列（例えば「リンカー」）を有す
ることができる。
【０００８】このＣＣｏＡＭＴ遺伝子（または遺伝子単
位）は、それらが植物のゲノム（「ゲノムの」形態に
は、ＣＣｏＡＭＴをコード化しない配列および／または
調整作用（例えばイントロン）を示さない配列が含まれ
ている）中に含まれている形態か、或は逆転写酵素／ポ
リメラーゼの助けでｍＲＮＡにより得られるｃＤＮＡ
（「コピー」ＤＮＡ）（イントロンをもはや含んでいな
い）に相当する形態で、存在できる。これらのＣＣｏＡ
ＭＴ遺伝子はまた、部分的もしくは完全な合成形態でも
存在できる。合成遺伝子はまた、天然遺伝子の部分を新
しく結合させることによって生じるものであると理解さ
れる。
位）は、それらが植物のゲノム（「ゲノムの」形態に
は、ＣＣｏＡＭＴをコード化しない配列および／または
調整作用（例えばイントロン）を示さない配列が含まれ
ている）中に含まれている形態か、或は逆転写酵素／ポ
リメラーゼの助けでｍＲＮＡにより得られるｃＤＮＡ
（「コピー」ＤＮＡ）（イントロンをもはや含んでいな
い）に相当する形態で、存在できる。これらのＣＣｏＡ
ＭＴ遺伝子はまた、部分的もしくは完全な合成形態でも
存在できる。合成遺伝子はまた、天然遺伝子の部分を新
しく結合させることによって生じるものであると理解さ
れる。
【０００９】本発明に従うＣＣｏＡＭＴ遺伝子（または
遺伝子単位）中のＤＮＡセグメントまたはＤＮＡは、本
質的に同じ作用を示す他のＤＮＡセグメントもしくはＤ
ＮＡによって置き換えることができる。
遺伝子単位）中のＤＮＡセグメントまたはＤＮＡは、本
質的に同じ作用を示す他のＤＮＡセグメントもしくはＤ
ＮＡによって置き換えることができる。
【００１０】これに関連して、「外来性」ＤＮＡは、特
定の原核もしくは真核ゲノム中には天然に存在していな
いが、ヒトが介在する結果としてのみこのゲノム中に取
り入れられるところの、ＤＮＡ（特に遺伝子もしくは遺
伝子単位か、或はそれらの構成要素）であると理解され
る。「追加的」ＤＮＡ（特に遺伝子もしくは遺伝子単位
か、或はそれらの構成要素）は、特別な原核もしくは真
核ゲノム中に天然に存在してはいるが、ヒトが介在する
ことによって追加的量でこのゲノム中に取り入れられた
ＤＮＡを意味することを意図している。この「外来性」
ＤＮＡもしくは「追加的」ＤＮＡの１種以上のコピー
が、問題となる場合の要求および特徴に応じて、組み込
まれ得る。本発明に従うＣＣｏＡＭＴ遺伝子（または遺
伝子単位）の助けで植物もしくは植物細胞中に生じるＣ
ＣｏＡＭＴは、ＣＣｏＡＭＴと同様に働きそして植物中
でそれらの有害生物に対する耐性を増大させる酵素のい
ずれかを意味している。
定の原核もしくは真核ゲノム中には天然に存在していな
いが、ヒトが介在する結果としてのみこのゲノム中に取
り入れられるところの、ＤＮＡ（特に遺伝子もしくは遺
伝子単位か、或はそれらの構成要素）であると理解され
る。「追加的」ＤＮＡ（特に遺伝子もしくは遺伝子単位
か、或はそれらの構成要素）は、特別な原核もしくは真
核ゲノム中に天然に存在してはいるが、ヒトが介在する
ことによって追加的量でこのゲノム中に取り入れられた
ＤＮＡを意味することを意図している。この「外来性」
ＤＮＡもしくは「追加的」ＤＮＡの１種以上のコピー
が、問題となる場合の要求および特徴に応じて、組み込
まれ得る。本発明に従うＣＣｏＡＭＴ遺伝子（または遺
伝子単位）の助けで植物もしくは植物細胞中に生じるＣ
ＣｏＡＭＴは、ＣＣｏＡＭＴと同様に働きそして植物中
でそれらの有害生物に対する耐性を増大させる酵素のい
ずれかを意味している。
【００１１】本発明に従う好適なＣＣｏＡＭＴ遺伝子
は、それらが、プラスミドｐＬ２−４に含まれているＣ
ＣｏＡＭＴ−ｃＤＮＡ配列またはその構成要素に対して
か、或はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に従うｃＤＮＡ配列また
はその構成要素に対して、雑種形成しそしてＣＣｏＡＭ
Ｔをコード化することを特徴とする。
は、それらが、プラスミドｐＬ２−４に含まれているＣ
ＣｏＡＭＴ−ｃＤＮＡ配列またはその構成要素に対して
か、或はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に従うｃＤＮＡ配列また
はその構成要素に対して、雑種形成しそしてＣＣｏＡＭ
Ｔをコード化することを特徴とする。
【００１２】本発明に従う好適なＣＣｏＡＭＴ遺伝子
は、パセリ（Petroselinum crispum）、人参（Daucus c
arota）、カーネーション（Dianthus caryophyllus）お
よび紅花（Carthamus tinctorius）、特に好適にはパセ
リ中に存在しているＣＣｏＡＭＴ遺伝子であり、そして
これらから単離できる。
は、パセリ（Petroselinum crispum）、人参（Daucus c
arota）、カーネーション（Dianthus caryophyllus）お
よび紅花（Carthamus tinctorius）、特に好適にはパセ
リ中に存在しているＣＣｏＡＭＴ遺伝子であり、そして
これらから単離できる。
【００１３】プラスミドｐＬ２−４（これは以下に詳細
に記述する）上にｃＤＮＡの形態で存在している（遺伝
子単位として）ＣＣｏＡＭＴ遺伝子、および本質的に同
じ作用を示すＤＮＡ配列が、本発明に従うＣＣｏＡＭＴ
遺伝子として特に好適である。
に記述する）上にｃＤＮＡの形態で存在している（遺伝
子単位として）ＣＣｏＡＭＴ遺伝子、および本質的に同
じ作用を示すＤＮＡ配列が、本発明に従うＣＣｏＡＭＴ
遺伝子として特に好適である。
【００１４】該プラスミド上に含まれているｃＤＮＡが
パセリから単離された。これは、３７０個のヌクレオチ
ド長から成る５’非翻訳リーダー配列および位置３７１
〜位置１０９３の完全な蛋白質コード化領域に続く、６
７個のヌクレオチドから成る３’非翻訳配列で構成され
ている。この全体フラグメントの両側に、EcoRIリンカ
ーを与え、そしてベクターpGEM 7（Promega Corp. Madi
son、 Wi.、 USA）中にクローン化した。位置１１６０〜
１２５８の３’非翻訳領域の残りの配列は、該プラスミ
ドｐＬ２−４上には存在していない。このポリアデニル
化配列は、合成的に製造できるか、或は他のポリ−Ａ配
列で置き換えることができる。この完全なｃＤＮＡ配列
は、配列プロトコルＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１から分かる。
パセリから単離された。これは、３７０個のヌクレオチ
ド長から成る５’非翻訳リーダー配列および位置３７１
〜位置１０９３の完全な蛋白質コード化領域に続く、６
７個のヌクレオチドから成る３’非翻訳配列で構成され
ている。この全体フラグメントの両側に、EcoRIリンカ
ーを与え、そしてベクターpGEM 7（Promega Corp. Madi
son、 Wi.、 USA）中にクローン化した。位置１１６０〜
１２５８の３’非翻訳領域の残りの配列は、該プラスミ
ドｐＬ２−４上には存在していない。このポリアデニル
化配列は、合成的に製造できるか、或は他のポリ−Ａ配
列で置き換えることができる。この完全なｃＤＮＡ配列
は、配列プロトコルＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１から分かる。
【００１５】該５’非翻訳領域、該完全コード化領域、
および６７個のヌクレオチドから成る該３’非翻訳領域
は、長さが約１１７０のフラグメントに関して、EcoRI
を用いた通常の様式で単離できる。
および６７個のヌクレオチドから成る該３’非翻訳領域
は、長さが約１１７０のフラグメントに関して、EcoRI
を用いた通常の様式で単離できる。
【００１６】ＴＲプロモーターもしくは３５Ｓプロモー
ターと、該ＣＣｏＡＭＴ遺伝子、好適にはパセリから得
られる遺伝子、特にプラスミドｐＬ２−４上のｃＤＮＡ
に相当する遺伝子の、蛋白質コード化領域との、キメラ
的遺伝子融合も特に好適なものとして挙げられる。植物
中に存在しているＣＣｏＡＭＴ遺伝子は幅広い範囲のＤ
ＮＡ配列相同性を有していることが見いだされた。従っ
て、この配列相同性を基準にして、本発明に従うＣＣｏ
ＡＭＴ遺伝子は、分子生物学の公知方法を用いた通常の
様式で、プラスミドｐＬ２−４上に含まれているｃＤＮ
Ａもしくはその構成要素か或はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１に
従う配列情報の補助による簡潔な様式により、植物から
単離できる。
ターと、該ＣＣｏＡＭＴ遺伝子、好適にはパセリから得
られる遺伝子、特にプラスミドｐＬ２−４上のｃＤＮＡ
に相当する遺伝子の、蛋白質コード化領域との、キメラ
的遺伝子融合も特に好適なものとして挙げられる。植物
中に存在しているＣＣｏＡＭＴ遺伝子は幅広い範囲のＤ
ＮＡ配列相同性を有していることが見いだされた。従っ
て、この配列相同性を基準にして、本発明に従うＣＣｏ
ＡＭＴ遺伝子は、分子生物学の公知方法を用いた通常の
様式で、プラスミドｐＬ２−４上に含まれているｃＤＮ
Ａもしくはその構成要素か或はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１に
従う配列情報の補助による簡潔な様式により、植物から
単離できる。
【００１７】本発明に従うＣＣｏＡＭＴ遺伝子を単離す
ることが可能な植物は、実際上、全ての単子葉もしくは
双子葉植物、好適には双子葉植物であり、パセリ、人
参、紅花およびカーネーションが例としてそして好適な
ものとして挙げられる。
ることが可能な植物は、実際上、全ての単子葉もしくは
双子葉植物、好適には双子葉植物であり、パセリ、人
参、紅花およびカーネーションが例としてそして好適な
ものとして挙げられる。
【００１８】既に述べたように、プラスミドｐＬ２−４
上に在るｃＤＮＡに相当するところの、ＣＣｏＡＭＴ遺
伝子もしくはそれらのコード化領域が、本発明に従い好
適である。この遺伝子もしくはこの遺伝子のコード化領
域は、ｃＤＮＡの補助を用いた通常の様式で得られる。
上に在るｃＤＮＡに相当するところの、ＣＣｏＡＭＴ遺
伝子もしくはそれらのコード化領域が、本発明に従い好
適である。この遺伝子もしくはこの遺伝子のコード化領
域は、ｃＤＮＡの補助を用いた通常の様式で得られる。
【００１９】大腸菌株のＤＳ ｐＬ２−４は、該プラス
ミドｐＬ２−４を有している。この株は、特許手続きの
ための微生物寄託の国際的認識に関するブタペスト条約
の条件に従うDeutsche Sammlung von Mikroorganismen
(DSM)［ドイツ国の微生物収集］、Mascheroder Weg 1b、
D-3300 Braunschweig、 Federal Republic of Germany
に寄託した（寄託日付：1991年5月28日）。寄託番号Ｄ
ＳＭ６５３６が与えられた。
ミドｐＬ２−４を有している。この株は、特許手続きの
ための微生物寄託の国際的認識に関するブタペスト条約
の条件に従うDeutsche Sammlung von Mikroorganismen
(DSM)［ドイツ国の微生物収集］、Mascheroder Weg 1b、
D-3300 Braunschweig、 Federal Republic of Germany
に寄託した（寄託日付：1991年5月28日）。寄託番号Ｄ
ＳＭ６５３６が与えられた。
【００２０】本発明はまた、この菌株およびその変異体
にも関する。この宿主の中に存在しているプラスミドｐ
Ｌ２−４は、この株を増殖させた後、このプラスミドを
単離することによる通常の様式で、所望量が容易に得ら
れる。
にも関する。この宿主の中に存在しているプラスミドｐ
Ｌ２−４は、この株を増殖させた後、このプラスミドを
単離することによる通常の様式で、所望量が容易に得ら
れる。
【００２１】機能的に完全な遺伝子、例えば本発明に従
うＣＣｏＡＭＴ遺伝子は、調節作用を示す構成要素（特
にプロモーター）と、この蛋白質ＣＣｏＡＭＴの遺伝情
報を指定する構造遺伝子とから成る。
うＣＣｏＡＭＴ遺伝子は、調節作用を示す構成要素（特
にプロモーター）と、この蛋白質ＣＣｏＡＭＴの遺伝情
報を指定する構造遺伝子とから成る。
【００２２】これらの遺伝子の両方の部分が互いに独立
して使用できる。従って、この調節作用を示す成分と、
植物のゲノムに組み込んだ後発現するもう１つのＤＮＡ
配列（このＣＣｏＡＭＴ遺伝子から派生する）とを融合
することも可能である。植物もしくは植物細胞中でそれ
らの作用を示すことができるいくつかの単離されたプロ
モーターのみが知られているため、同様に、本発明が関
係しているこのＣＣｏＡＭＴ遺伝子のプロモーターは、
形質転換した植物もしくは植物細胞の発生における有益
な補助となる。
して使用できる。従って、この調節作用を示す成分と、
植物のゲノムに組み込んだ後発現するもう１つのＤＮＡ
配列（このＣＣｏＡＭＴ遺伝子から派生する）とを融合
することも可能である。植物もしくは植物細胞中でそれ
らの作用を示すことができるいくつかの単離されたプロ
モーターのみが知られているため、同様に、本発明が関
係しているこのＣＣｏＡＭＴ遺伝子のプロモーターは、
形質転換した植物もしくは植物細胞の発生における有益
な補助となる。
【００２３】調節作用を示す「外来性」構成要素の後に
該ＣＣｏＡＭＴ構造遺伝子を含有させることも可能であ
る。これは、調節作用を示す特定な遺伝子構成要素（例
えばこの植物にとって内因性のもの）のみが特定の植物
中で充分な作用を示すことができる場合有利であり得
る。従って、これらのＣＣｏＡＭＴ構造遺伝子は、独立
して使用できる価値ある単位であり、そして既に述べた
ように、本発明はまたこれらにも関するものである。本
発明に従うＣＣｏＡＭＴ遺伝子は、通常の方法で、調節
作用を示す構成要素と構造遺伝子とに分離できる。天然
に存在している異なるＣＣｏＡＭＴ遺伝子の構成要素を
組み合わせて新規な機能的「合成」遺伝子を生じさせる
ことも可能である。本発明に従うこの天然に存在する完
全なＣＣｏＡＭＴ遺伝子（または遺伝子単位）が好適に
使用される。該プラスミドｐＬ２−４に含まれているｃ
ＤＮＡに相当するＣＣｏＡＭＴ構造遺伝子が、本発明に
従い好適である。
該ＣＣｏＡＭＴ構造遺伝子を含有させることも可能であ
る。これは、調節作用を示す特定な遺伝子構成要素（例
えばこの植物にとって内因性のもの）のみが特定の植物
中で充分な作用を示すことができる場合有利であり得
る。従って、これらのＣＣｏＡＭＴ構造遺伝子は、独立
して使用できる価値ある単位であり、そして既に述べた
ように、本発明はまたこれらにも関するものである。本
発明に従うＣＣｏＡＭＴ遺伝子は、通常の方法で、調節
作用を示す構成要素と構造遺伝子とに分離できる。天然
に存在している異なるＣＣｏＡＭＴ遺伝子の構成要素を
組み合わせて新規な機能的「合成」遺伝子を生じさせる
ことも可能である。本発明に従うこの天然に存在する完
全なＣＣｏＡＭＴ遺伝子（または遺伝子単位）が好適に
使用される。該プラスミドｐＬ２−４に含まれているｃ
ＤＮＡに相当するＣＣｏＡＭＴ構造遺伝子が、本発明に
従い好適である。
【００２４】通常の方法を用いて、該ＣＣｏＡＭＴ遺伝
子（または遺伝子単位）か、或は１つもしくはいくつか
のコピーで（例えば縦列配列で）それらの構成要素を、
好適には一度、「外来性」もしくは「追加的」ＤＮＡと
して所望の原核（好適にはバクテリア）または真核（好
適には植物）ＤＮＡのいずれかの中に組み込むことも可
能である。従って、例えば該ｃＤＮＡに相当する蛋白質
コード化ＤＮＡに調節配列を与えることができ、そして
それを植物中に組み込むことができる。本発明は、例え
ば植物もしくは植物細胞を形質転換するために使用で
き、そしてこの形質転換後の植物もしくは植物細胞中に
含まれているところの、この方法で「修飾した」組換え
型ＤＮＡに関する。
子（または遺伝子単位）か、或は１つもしくはいくつか
のコピーで（例えば縦列配列で）それらの構成要素を、
好適には一度、「外来性」もしくは「追加的」ＤＮＡと
して所望の原核（好適にはバクテリア）または真核（好
適には植物）ＤＮＡのいずれかの中に組み込むことも可
能である。従って、例えば該ｃＤＮＡに相当する蛋白質
コード化ＤＮＡに調節配列を与えることができ、そして
それを植物中に組み込むことができる。本発明は、例え
ば植物もしくは植物細胞を形質転換するために使用で
き、そしてこの形質転換後の植物もしくは植物細胞中に
含まれているところの、この方法で「修飾した」組換え
型ＤＮＡに関する。
【００２５】該ＣＣｏＡＭＴ遺伝子（または遺伝子単
位）および／またはそれらの構成要素および組換え型Ｄ
ＮＡは、「外来性」または「追加的」ＤＮＡとして、ベ
クター（特にプラスミド、コスミドまたはファージ）
中、形質転換した微生物（好適にはバクテリア、特にグ
ラム陰性バクテリア、例えば大腸菌）中、および形質転
換した植物細胞および植物中か、或はそれらのＤＮＡ中
に、含有させることができる。本発明は、上記ベクター
類、形質転換した微生物（これらはまた上記ベクター類
を含んでいる）および形質転換した植物細胞および植
物、並びにそれらのＤＮＡ、に関するものである。
位）および／またはそれらの構成要素および組換え型Ｄ
ＮＡは、「外来性」または「追加的」ＤＮＡとして、ベ
クター（特にプラスミド、コスミドまたはファージ）
中、形質転換した微生物（好適にはバクテリア、特にグ
ラム陰性バクテリア、例えば大腸菌）中、および形質転
換した植物細胞および植物中か、或はそれらのＤＮＡ中
に、含有させることができる。本発明は、上記ベクター
類、形質転換した微生物（これらはまた上記ベクター類
を含んでいる）および形質転換した植物細胞および植
物、並びにそれらのＤＮＡ、に関するものである。
【００２６】既に示したように、本発明に従い、これら
のＣＣｏＡＭＴ遺伝子（または遺伝子単位）は、１つも
しくはいくつかのコピー（該ゲノムの、同一もしくは異
なる地点）で、天然の植物ゲノム中に組み込まれ、そし
て異なるＣＣｏＡＭＴ遺伝子を互いに組み合わせること
も可能である。ＣＣｏＡＭＴを合成する能力を既に有す
る植物の場合、本発明に従う１種以上のＣＣｏＡＭＴ遺
伝子を組み込むことで、相当に改良された耐性をもたら
すことができる。ＣＣｏＡＭＴ遺伝子を全く有していな
い植物の場合、上記遺伝子を組み込むことにより、同様
に、有害生物に対する増大した耐性が達成される。適
宜、本発明に従い、構造遺伝子（これらは、特別な植物
から単離されたものでもよい調節ＤＮＡ要素に続く）の
みを使用する。
のＣＣｏＡＭＴ遺伝子（または遺伝子単位）は、１つも
しくはいくつかのコピー（該ゲノムの、同一もしくは異
なる地点）で、天然の植物ゲノム中に組み込まれ、そし
て異なるＣＣｏＡＭＴ遺伝子を互いに組み合わせること
も可能である。ＣＣｏＡＭＴを合成する能力を既に有す
る植物の場合、本発明に従う１種以上のＣＣｏＡＭＴ遺
伝子を組み込むことで、相当に改良された耐性をもたら
すことができる。ＣＣｏＡＭＴ遺伝子を全く有していな
い植物の場合、上記遺伝子を組み込むことにより、同様
に、有害生物に対する増大した耐性が達成される。適
宜、本発明に従い、構造遺伝子（これらは、特別な植物
から単離されたものでもよい調節ＤＮＡ要素に続く）の
みを使用する。
【００２７】本発明に従う形質転換した植物細胞および
植物の増大した耐性は、農業および林業、並びに鑑賞用
植物の栽培、医学用植物の栽培および植物育成にとって
重要である。例えば薬学的に有用な物質生産のための植
物細胞培養にとって、微生物有害生物、特に菌・カビに
よる攻撃に対して増大した耐性を示すところの、利用で
きる植物細胞が得られることも有利である。
植物の増大した耐性は、農業および林業、並びに鑑賞用
植物の栽培、医学用植物の栽培および植物育成にとって
重要である。例えば薬学的に有用な物質生産のための植
物細胞培養にとって、微生物有害生物、特に菌・カビに
よる攻撃に対して増大した耐性を示すところの、利用で
きる植物細胞が得られることも有利である。
【００２８】従って、本発明はまた、 （ａ）本発明に従う１種以上のＣＣｏＡＭＴ遺伝子（ま
たは遺伝子単位）および／またはこのＣＣｏＡＭＴ遺伝
子の（または該遺伝子単位の）構成要素および／または
組換え型ＤＮＡを、植物細胞（プロトプラストを含む）
のゲノム中に挿入し、そして適宜 （ｂ）該形質転換型植物細胞（プロトプラストを含む）
から完全な形質転換型植物を再生させ、そして適宜繁殖
させ、そして適宜 （ｃ）この親世代もしくはそれから得られる更に一層の
世代の、得られる形質転換型植物から所望の植物部分
（種子を含む）を得る、 ことを特徴とする、有害生物に対して増大した耐性を示
す形質転換型植物細胞（プロトプラストを含む）および
植物（植物部分および種子を含む）の製造方法にも関す
る。
たは遺伝子単位）および／またはこのＣＣｏＡＭＴ遺伝
子の（または該遺伝子単位の）構成要素および／または
組換え型ＤＮＡを、植物細胞（プロトプラストを含む）
のゲノム中に挿入し、そして適宜 （ｂ）該形質転換型植物細胞（プロトプラストを含む）
から完全な形質転換型植物を再生させ、そして適宜繁殖
させ、そして適宜 （ｃ）この親世代もしくはそれから得られる更に一層の
世代の、得られる形質転換型植物から所望の植物部分
（種子を含む）を得る、 ことを特徴とする、有害生物に対して増大した耐性を示
す形質転換型植物細胞（プロトプラストを含む）および
植物（植物部分および種子を含む）の製造方法にも関す
る。
【００２９】操作段階（ａ）、（ｂ）および（ｃ）は、
公知の操作および方法による通常の様式で実施できる。
公知の操作および方法による通常の様式で実施できる。
【００３０】本発明はまた、１種以上のＣＣｏＡＭＴ遺
伝子（または遺伝子単位）および／または該ＣＣｏＡＭ
Ｔ遺伝子（または該遺伝子単位）の構成要素を「外来
性」または「追加的」ＤＮＡとして含んでいる形質転換
した植物細胞（プロトプラストを含む）および植物（植
物部分および種子を含む）、並びに上記方法で得られる
形質転換した植物細胞および植物にも関する。
伝子（または遺伝子単位）および／または該ＣＣｏＡＭ
Ｔ遺伝子（または該遺伝子単位）の構成要素を「外来
性」または「追加的」ＤＮＡとして含んでいる形質転換
した植物細胞（プロトプラストを含む）および植物（植
物部分および種子を含む）、並びに上記方法で得られる
形質転換した植物細胞および植物にも関する。
【００３１】本発明はまた、（ａ）植物細胞（プロトプ
ラストを含む）および植物（植物部分および種子を含
む）を形質転換するための、本発明に従うＣＣｏＡＭＴ
遺伝子（または遺伝子単位）および／またはそれらの構
成要素および／または組換え型ＤＮＡおよび／または本
発明に従う組換え型ベクターおよび／または本発明に従
う形質転換した有機体の使用、（ｂ）繁殖材料の発生の
ため、そして新規植物およびその繁殖材料発生のため
の、本発明に従う形質転換した植物細胞（プロトプラス
トを含む）および植物（植物部分および種子を含む）の
使用、（ｃ）有害生物駆除のための、本発明に従うＣＣ
ｏＡＭＴ遺伝子（または遺伝子単位）および／またはそ
れらの構成要素および／または本発明に従う組換え型Ｄ
ＮＡの使用、そして（ｄ）植物からＣＣｏＡＭＴ遺伝子
もしくはそれらの構成要素を単離するため、そして植物
中のＣＣｏＡＭＴ遺伝子を測定するための、プラスミド
ｐＬ２−４上に含まれているｃＤＮＡもしくはその構成
要素、および配列プロトコルＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に従
う配列情報に相当するＤＮＡ配列の使用、にも関する。
ラストを含む）および植物（植物部分および種子を含
む）を形質転換するための、本発明に従うＣＣｏＡＭＴ
遺伝子（または遺伝子単位）および／またはそれらの構
成要素および／または組換え型ＤＮＡおよび／または本
発明に従う組換え型ベクターおよび／または本発明に従
う形質転換した有機体の使用、（ｂ）繁殖材料の発生の
ため、そして新規植物およびその繁殖材料発生のため
の、本発明に従う形質転換した植物細胞（プロトプラス
トを含む）および植物（植物部分および種子を含む）の
使用、（ｃ）有害生物駆除のための、本発明に従うＣＣ
ｏＡＭＴ遺伝子（または遺伝子単位）および／またはそ
れらの構成要素および／または本発明に従う組換え型Ｄ
ＮＡの使用、そして（ｄ）植物からＣＣｏＡＭＴ遺伝子
もしくはそれらの構成要素を単離するため、そして植物
中のＣＣｏＡＭＴ遺伝子を測定するための、プラスミド
ｐＬ２−４上に含まれているｃＤＮＡもしくはその構成
要素、および配列プロトコルＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に従
う配列情報に相当するＤＮＡ配列の使用、にも関する。
【００３２】該ＣＣｏＡＭＴ遺伝子もしくは遺伝子単位
か、或はそれらの構成要素を、「外来性」または「追加
的」ＤＮＡとして、植物もしくは植物細胞の遺伝材料中
に挿入するために利用できる数多くの異なる方法が存在
している。この遺伝子転移は、一般的に通常の公知方法
によって行うことができ、その結果、技術者は適切な特
定方法を困難さ無しに決定することができるであろう。
か、或はそれらの構成要素を、「外来性」または「追加
的」ＤＮＡとして、植物もしくは植物細胞の遺伝材料中
に挿入するために利用できる数多くの異なる方法が存在
している。この遺伝子転移は、一般的に通常の公知方法
によって行うことができ、その結果、技術者は適切な特
定方法を困難さ無しに決定することができるであろう。
【００３３】アグロバクテリウム・ツメファシエンス
（Agrobacterium tumefaciens）から得られるＴｉプラ
スミドは、外来性ＤＮＡを双子葉および単子葉植物のゲ
ノムに転移させるための、特に好ましくそして幅広く利
用できるベクターとして利用できる。ＣＣｏＡＭＴをコ
ード化する遺伝材料を、調節ＤＮＡ配列と一緒に適切な
ＴｉプラスミドのＴ−ＤＮＡ中に挿入した後（例えばZa
mbryski他、 1983）、これらの植物の感染、即ち植物部
分もしくは植物組織、例えば葉の盤、茎、胚軸、子葉、
分裂組織およびそれらから出る組織、例えば２番目の胚
およびカルスなどの感染によるか、或はプロトプラスト
とアグロバクテリウム・ツメファシエンスとの共培養に
よって転移させる。
（Agrobacterium tumefaciens）から得られるＴｉプラ
スミドは、外来性ＤＮＡを双子葉および単子葉植物のゲ
ノムに転移させるための、特に好ましくそして幅広く利
用できるベクターとして利用できる。ＣＣｏＡＭＴをコ
ード化する遺伝材料を、調節ＤＮＡ配列と一緒に適切な
ＴｉプラスミドのＴ−ＤＮＡ中に挿入した後（例えばZa
mbryski他、 1983）、これらの植物の感染、即ち植物部
分もしくは植物組織、例えば葉の盤、茎、胚軸、子葉、
分裂組織およびそれらから出る組織、例えば２番目の胚
およびカルスなどの感染によるか、或はプロトプラスト
とアグロバクテリウム・ツメファシエンスとの共培養に
よって転移させる。
【００３４】代替方法は、多カチオンまたはカルシウム
塩およびポリエチレングリコールの存在下、植物のプロ
トプラスト中で、所望の遺伝子を含んでいる精製ＤＮＡ
を培養することである（例えばHain他、 1985; Krens他、
1982; Paszkowski他、 1984）。
塩およびポリエチレングリコールの存在下、植物のプロ
トプラスト中で、所望の遺伝子を含んでいる精製ＤＮＡ
を培養することである（例えばHain他、 1985; Krens他、
1982; Paszkowski他、 1984）。
【００３５】このＤＮＡの取り込みもまた、更に、電場
（エレクトロポレーション）によって促進される（例え
ばFromm他、 1986)。
（エレクトロポレーション）によって促進される（例え
ばFromm他、 1986)。
【００３６】このＤＮＡを有するところの、物理的に促
進された粒子を用いて、花粉を「発芽」させることによ
る、植物花粉を用いた公知の方法でＤＮＡを導入するこ
ともできる（EP-A 0,270,356参照）。
進された粒子を用いて、花粉を「発芽」させることによ
る、植物花粉を用いた公知の方法でＤＮＡを導入するこ
ともできる（EP-A 0,270,356参照）。
【００３７】これらの植物は、適切な栄養培地の補助で
公知の方法により再生する（例えばNagyおよびMaliga、
1976）。
公知の方法により再生する（例えばNagyおよびMaliga、
1976）。
【００３８】本発明に従う方法の好適な具体例におい
て、該プラスミドｐＬ２−４から得られるｃＤＮＡを発
現ベクター（例えばpRT101、 Toepfer他、 1988）中にク
ローン化する。次に、このキメラ的に構築した遺伝子
を、制限酵素Hind IIIを用いて単離した後、アグロバク
テリウム・ツメファシエンスに対する中間的ベクター
（例えばpCV001、 KonczおよびSchell 1986）中に転移さ
せる（KonczおよびSchell 1986）。
て、該プラスミドｐＬ２−４から得られるｃＤＮＡを発
現ベクター（例えばpRT101、 Toepfer他、 1988）中にク
ローン化する。次に、このキメラ的に構築した遺伝子
を、制限酵素Hind IIIを用いて単離した後、アグロバク
テリウム・ツメファシエンスに対する中間的ベクター
（例えばpCV001、 KonczおよびSchell 1986）中に転移さ
せる（KonczおよびSchell 1986）。
【００３９】二者択一的に、このキメラ的に構築した遺
伝子を、プラスミドplGVneo 1103（Hain他 1985）のHin
d III位置中にクローン化し、そして特に好適な具体例
において、このプラスミドplGVneo 1103中のそのキメラ
的に構築した遺伝子を、通常の様式で、直接的遺伝子転
移により植物プロトプラストに転移させる（例えばHain
他 1985）。このプラスミドは環状であってもよいが、
好適にはここでは線状である。
伝子を、プラスミドplGVneo 1103（Hain他 1985）のHin
d III位置中にクローン化し、そして特に好適な具体例
において、このプラスミドplGVneo 1103中のそのキメラ
的に構築した遺伝子を、通常の様式で、直接的遺伝子転
移により植物プロトプラストに転移させる（例えばHain
他 1985）。このプラスミドは環状であってもよいが、
好適にはここでは線状である。
【００４０】このプラスミドをリポーター遺伝子と共に
使用する場合、次に、ＣＣｏＡＭＴの発現に関して、カ
ナマイシン耐性を示すプロトプラストを検査する。
使用する場合、次に、ＣＣｏＡＭＴの発現に関して、カ
ナマイシン耐性を示すプロトプラストを検査する。
【００４１】公知の方法、例えば再生用植物プロトプラ
ストもしくは細胞培養物とアグロバクテリウム・ツメフ
ァシエンスとを共培養（例えばMarton他 1979、 Hain他
1985）することによる葉盤状物の形質転換（例えばHors
ch他 1985）を行うか、或は直接的ＤＮＡ移入によっ
て、形質転換型（形質転換した）植物もしくは植物細胞
を再生させる。得られる形質転換型植物を、例えばイン
ビトロでの硫酸カナマイシンの燐酸化によるレポーター
遺伝子の発現に関する選択によってか（Reiss他1984; S
chreier他 1985）、或はノパリンシンターゼの発現によ
って（Aerts他 1983に従う）検出するか、或はＣＣｏＡ
ＭＴを、ノーザンブロット分析およびウエスタンブロッ
ト分析によって検出する。このＣＣｏＡＭＴはまた、形
質転換した植物中、特定の抗体の補助を用いた公知の様
式で検出される。
ストもしくは細胞培養物とアグロバクテリウム・ツメフ
ァシエンスとを共培養（例えばMarton他 1979、 Hain他
1985）することによる葉盤状物の形質転換（例えばHors
ch他 1985）を行うか、或は直接的ＤＮＡ移入によっ
て、形質転換型（形質転換した）植物もしくは植物細胞
を再生させる。得られる形質転換型植物を、例えばイン
ビトロでの硫酸カナマイシンの燐酸化によるレポーター
遺伝子の発現に関する選択によってか（Reiss他1984; S
chreier他 1985）、或はノパリンシンターゼの発現によ
って（Aerts他 1983に従う）検出するか、或はＣＣｏＡ
ＭＴを、ノーザンブロット分析およびウエスタンブロッ
ト分析によって検出する。このＣＣｏＡＭＴはまた、形
質転換した植物中、特定の抗体の補助を用いた公知の様
式で検出される。
【００４２】この形質転換した植物細胞の培養、そして
完全な植物を与えるための再生は、特に適切な栄養培地
の補助を用いた一般的に通常の方法で行われる。
完全な植物を与えるための再生は、特に適切な栄養培地
の補助を用いた一般的に通常の方法で行われる。
【００４３】本発明に従うＣＣｏＡＭＴ遺伝子を含んで
おり、そして本発明に関係したところの、形質転換型植
物細胞および形質転換型植物の両方共、有害生物、特に
植物病原性菌・カビ、に対してかなり高い耐性を示す。
おり、そして本発明に関係したところの、形質転換型植
物細胞および形質転換型植物の両方共、有害生物、特に
植物病原性菌・カビ、に対してかなり高い耐性を示す。
【００４４】本発明に関連したこの言葉「植物」は、完
全な植物およびまた植物の部分、例えば葉、種子、塊茎
および切片など、の両方を表している。「植物細胞」に
は、プロトプラスト、細胞系、および植物カルスなどが
含まれる。「繁殖材料」は、形質転換した植物および植
物細胞の繁殖で使用できる植物および植物細胞を表すも
のであり、従って、本発明はこの材料にも関する。
全な植物およびまた植物の部分、例えば葉、種子、塊茎
および切片など、の両方を表している。「植物細胞」に
は、プロトプラスト、細胞系、および植物カルスなどが
含まれる。「繁殖材料」は、形質転換した植物および植
物細胞の繁殖で使用できる植物および植物細胞を表すも
のであり、従って、本発明はこの材料にも関する。
【００４５】これに関連した言葉「本質的に同じ作用を
示すＤＮＡ配列」は、本発明はまた、ＣＣｏＡＭＴがも
はや生じなくなるとか或は調節遺伝子構成要素がもはや
活性を示さなくなるようには該ＣＣｏＡＭＴ遺伝子およ
びそれらの構成要素の機能が損なわれていない修飾物に
も関する、ことを意味している。相当する修飾は、ＤＮ
Ａ断片、個々のコドンおよび／または個々のヌクレオチ
ドの置換、付加および／または除去によって行われ得
る。
示すＤＮＡ配列」は、本発明はまた、ＣＣｏＡＭＴがも
はや生じなくなるとか或は調節遺伝子構成要素がもはや
活性を示さなくなるようには該ＣＣｏＡＭＴ遺伝子およ
びそれらの構成要素の機能が損なわれていない修飾物に
も関する、ことを意味している。相当する修飾は、ＤＮ
Ａ断片、個々のコドンおよび／または個々のヌクレオチ
ドの置換、付加および／または除去によって行われ得
る。
【００４６】本発明に従って使用できる微生物の場合、
「変異体」は、本発明の履行に必須な特徴をまだ有して
おり、そして特にその特別なプラスミドを含んでいると
ころの、修飾した微生物を意味している。
「変異体」は、本発明の履行に必須な特徴をまだ有して
おり、そして特にその特別なプラスミドを含んでいると
ころの、修飾した微生物を意味している。
【００４７】本発明に従うＣＣｏＡＭＴ遺伝子の組み込
み（形質転換）により、有害生物に対する耐性もしくは
増大した耐性を与え得る植物には、実際上全ての植物が
含まれる。勿論、作物植物、例えば森林植物、例えばエ
ゾマツ、モミ、アメリカマツ、マツ、カラマツ、ブナお
よびカシ、並びに食品および原料を供給する植物、例え
ば穀類（特にコムギ、ライムギ、オオムギ、カラスム
ギ、キビ、コメおよびトウモロコシ）、ジャガイモ、マ
メ科の植物（例えばマメ類、特にアルファルファおよび
ダイズ）、野菜類（特に種々のキャベツおよびトマ
ト）、果物（特にリンゴ、ナシ、サクランボ、ブドウ、
柑橘類、パイナップルおよびバナナ）、アブラヤシ、
茶、カカオおよびコーヒー低木、タバコ、シサル麻およ
び綿、そして薬用植物、例えばラウオルフィア（Rauwol
fia）およびジギタリスなどに、耐性を生じさせるため
の特別な必要性が存在している。ジャガイモ、トマトお
よびマメ科の植物が特に好適なものとして挙げられる。
本発明に従うＣＣｏＡＭＴ遺伝子は、好適には、「外来
性」ＤＮＡとして植物のゲノム中に組み込まれる。
み（形質転換）により、有害生物に対する耐性もしくは
増大した耐性を与え得る植物には、実際上全ての植物が
含まれる。勿論、作物植物、例えば森林植物、例えばエ
ゾマツ、モミ、アメリカマツ、マツ、カラマツ、ブナお
よびカシ、並びに食品および原料を供給する植物、例え
ば穀類（特にコムギ、ライムギ、オオムギ、カラスム
ギ、キビ、コメおよびトウモロコシ）、ジャガイモ、マ
メ科の植物（例えばマメ類、特にアルファルファおよび
ダイズ）、野菜類（特に種々のキャベツおよびトマ
ト）、果物（特にリンゴ、ナシ、サクランボ、ブドウ、
柑橘類、パイナップルおよびバナナ）、アブラヤシ、
茶、カカオおよびコーヒー低木、タバコ、シサル麻およ
び綿、そして薬用植物、例えばラウオルフィア（Rauwol
fia）およびジギタリスなどに、耐性を生じさせるため
の特別な必要性が存在している。ジャガイモ、トマトお
よびマメ科の植物が特に好適なものとして挙げられる。
本発明に従うＣＣｏＡＭＴ遺伝子は、好適には、「外来
性」ＤＮＡとして植物のゲノム中に組み込まれる。
【００４８】本発明に従うＣＣｏＡＭＴ遺伝子の助け
で、それに対する耐性もしくは上昇した耐性が達成され
得る有害生物として、動物有害生物、例えば昆虫、ダニ
および線虫、並びに微生物有害生物、例えば植物病原性
菌・カビ、バクテリアおよびウイルスが挙げられる。微
生物有害生物、特に植物病原性菌・カビが特に選ばれ
る。
で、それに対する耐性もしくは上昇した耐性が達成され
得る有害生物として、動物有害生物、例えば昆虫、ダニ
および線虫、並びに微生物有害生物、例えば植物病原性
菌・カビ、バクテリアおよびウイルスが挙げられる。微
生物有害生物、特に植物病原性菌・カビが特に選ばれ
る。
【００４９】有害な昆虫には、特に下記の目の昆虫が含
まれる：直し目（Orthoptera）、ハサミムシ目（Dermap
tera）、シロアリ目（Isoptera）、アザミウマ目（Thys
anoptera）、半し目（Heteroptera）、同し目（Homopte
ra）、鱗し目（Lepidoptera）、しょうし目（Coleopter
a）、膜し目（Hymenoptera）および双し目（Dipter
a）。
まれる：直し目（Orthoptera）、ハサミムシ目（Dermap
tera）、シロアリ目（Isoptera）、アザミウマ目（Thys
anoptera）、半し目（Heteroptera）、同し目（Homopte
ra）、鱗し目（Lepidoptera）、しょうし目（Coleopter
a）、膜し目（Hymenoptera）および双し目（Dipter
a）。
【００５０】有害なダニには、特に下記のものが含まれ
る：ホコリダニ（Tarsonemus spp.）、ミカンリンゴホ
コリダニ（Panonychus spp.）およびナミハダニ（Tetra
nychus spp.）。
る：ホコリダニ（Tarsonemus spp.）、ミカンリンゴホ
コリダニ（Panonychus spp.）およびナミハダニ（Tetra
nychus spp.）。
【００５１】有害な線虫には、特に下記のものが含まれ
る：プラチレンクス（Pratylenchus spp.）、ヘテロデ
ラ（Heterodera spp.）およびメロイドジン（Meloidogy
ne spp.）。
る：プラチレンクス（Pratylenchus spp.）、ヘテロデ
ラ（Heterodera spp.）およびメロイドジン（Meloidogy
ne spp.）。
【００５２】微生物有害生物には、特に下記の如き植物
病原性菌・カビが含まれる：プラスモジオフォロミセテ
ス（Plasmodiophoromycetes）、卵菌類（Oomycetes）、
キトリジオミセテス（Chytridiomycetes）、接合菌類
（Zygomycetes）、子のう菌類（Ascomycetes）、担子菌
類（Basidiomycetes）および不完全菌類（Deuteromycet
es）。
病原性菌・カビが含まれる：プラスモジオフォロミセテ
ス（Plasmodiophoromycetes）、卵菌類（Oomycetes）、
キトリジオミセテス（Chytridiomycetes）、接合菌類
（Zygomycetes）、子のう菌類（Ascomycetes）、担子菌
類（Basidiomycetes）および不完全菌類（Deuteromycet
es）。
【００５３】植物病原性バクテリアには、特にプソイド
モナス科（Pseudomonadaceae）、リゾビ科（Rhizobiace
ae）、腸内細菌科（Enterobacteriaceae）、コリネバク
テリウム科（Corynebacteriaceae）およびストレプトミ
セス科（Streptomycetaceae）が含まれる。
モナス科（Pseudomonadaceae）、リゾビ科（Rhizobiace
ae）、腸内細菌科（Enterobacteriaceae）、コリネバク
テリウム科（Corynebacteriaceae）およびストレプトミ
セス科（Streptomycetaceae）が含まれる。
【００５４】ウイルスの病気には、特にモザイク（mosa
ic）、発育不全（dwarfing）および黄枯れ（yellowin
g）ウイルス病が含まれる。
ic）、発育不全（dwarfing）および黄枯れ（yellowin
g）ウイルス病が含まれる。
【００５５】上に挙げた属名に入るウイルス、菌・カビ
およびバクテリア病の、いくつかの原因となる有機体の
例として、これに限定されるものではないが、次のもの
が挙げられる：オオムギ黄枯れ発育不全ウイルス（ＢＹ
ＤＶ）、ジャガイモウイルスＹ（ＰＶＹ）、キュウリモ
ザイクウイルス（ＣＭＶ）、スイカモザイクウイルス
（ＷＭＶ）、トリステザ（Tristeza）ウイルス、タバコ
モザイクウイルス（ＴＭＶ）、タバコたい壊ウイルス
（ＴＮＶ）、ビートたい壊黄枯れ葉脈ウイルス（ＢＮＹ
ＶＶ）、リゾマニア（rhizomania）ウイルス。
およびバクテリア病の、いくつかの原因となる有機体の
例として、これに限定されるものではないが、次のもの
が挙げられる：オオムギ黄枯れ発育不全ウイルス（ＢＹ
ＤＶ）、ジャガイモウイルスＹ（ＰＶＹ）、キュウリモ
ザイクウイルス（ＣＭＶ）、スイカモザイクウイルス
（ＷＭＶ）、トリステザ（Tristeza）ウイルス、タバコ
モザイクウイルス（ＴＭＶ）、タバコたい壊ウイルス
（ＴＮＶ）、ビートたい壊黄枯れ葉脈ウイルス（ＢＮＹ
ＶＶ）、リゾマニア（rhizomania）ウイルス。
【００５６】キサントモナス（Xanthomonas）種、例え
ばキサントモナス・カンペストリスpv.オリザエ（Xanth
omonas campestris pv. oryzae）；プソイドモナス（Ps
eudomonas）種、例えばプソイドモナス・シリンガエpv.
ラクリマンス（Pseudomonas syringae pv. lachryman
s);エルウイニア（Erwinia）種、例えばエルウイニア・
アミロヴォラ（Erwinia amylovora）；ピチウム（Pythi
um）種、例えば苗立ち枯れ病（Pythium ultimum）；フ
イトフトラ（Phytophthora）種、例えば疫病（Phytopht
hora infestans）；プソイドペロノスポラ（Pseudopero
nospora）種、例えばべと病（Pseudoperonospora humul
iまたはPseudoperonospora cubense）；プラスモパラ
（Plasmopara）種、例えばべと病（Plasmopara viticol
a）；ツユカビ（Peronospora）種、例えばべと病（Pero
nospora pisiまたはP. brassicae）；エリシフエ（Erys
iphe）種、例えばうどんこ病（Erysiphe graminis）；
スフアエロテカ（Sphaerotheca）種、例えばうどんこ病
（Sphaerotheca fuliginea）；ポドスフエラ（Podospha
era）種、例えばうどんこ病（Podosphaera leucotrich
a）；ベンチユリア（Venturia）種、例えば黒星病（Ven
turia inaequalis）；ピレノホラ（Pyrenophora）種、
例えば網斑病（Pyrenophora teresまたはP. gramine
a）；（分生胞子器型： Drechslera、同義： Helmintho
sporium）コクリオボルス（Cochliobolus）種、例えば
斑点病（Cochliobolus sativus）；（分生胞子器型： D
rechslera、同義： Helminthosporium）ウロミセス（Ur
omyces）種、例えばさび病（Uromyces appendiculatu
s）；プシニナ（Puccinia）種、例えば赤さび病（Pucci
nia recondita）；ふすべ菌属（Tilletia）種、例えば
網なまぐさ黒穂病（Tilletia caries）；黒穂病（Ustil
ago）種、例えば裸黒穂病（Ustilago nudaまたはUstila
go avenae）；ペリキユラリア（Pellicularia）種、例
えば紋枯病（Pellicularia sasakii）；ピリキユラリア
（Pyricularia）種、例えばいもち病（Pyricularia ory
zae)；フーザリウム（Fusarium）種、例えばフーザリウ
ム・クルモルム（Fusarium culmorum）；灰色かび属（B
otrytis）種、例えば灰色かび病（Botrytis cinere
a）；セプトリア（Septoria）種、例えばふ枯病（Septo
ria nodorum）；レプトスフエリア（Leptosphaeria）
種、例えばレプトスフエリア・ノドルム（Leptosphaeri
a nodorum）；セルコスポラ（Cercospora）種、例えば
セルコスポラ・カネセンス（Cercospora canescens）；
アルテルナリア（Alternaria）種、例えば黒斑病（Alte
rnaria brassicae）およびプソイドセルコスポレラ（Ps
eudocercosporella）種、例えばプソイドセルコスポレ
ラ・ヘルポトリコイデス（Pseudocercosporella herpot
richoides）。更にヘルミントスポリウム・カルボヌム
（Helminthosporium carbonum）も挙げられる。
ばキサントモナス・カンペストリスpv.オリザエ（Xanth
omonas campestris pv. oryzae）；プソイドモナス（Ps
eudomonas）種、例えばプソイドモナス・シリンガエpv.
ラクリマンス（Pseudomonas syringae pv. lachryman
s);エルウイニア（Erwinia）種、例えばエルウイニア・
アミロヴォラ（Erwinia amylovora）；ピチウム（Pythi
um）種、例えば苗立ち枯れ病（Pythium ultimum）；フ
イトフトラ（Phytophthora）種、例えば疫病（Phytopht
hora infestans）；プソイドペロノスポラ（Pseudopero
nospora）種、例えばべと病（Pseudoperonospora humul
iまたはPseudoperonospora cubense）；プラスモパラ
（Plasmopara）種、例えばべと病（Plasmopara viticol
a）；ツユカビ（Peronospora）種、例えばべと病（Pero
nospora pisiまたはP. brassicae）；エリシフエ（Erys
iphe）種、例えばうどんこ病（Erysiphe graminis）；
スフアエロテカ（Sphaerotheca）種、例えばうどんこ病
（Sphaerotheca fuliginea）；ポドスフエラ（Podospha
era）種、例えばうどんこ病（Podosphaera leucotrich
a）；ベンチユリア（Venturia）種、例えば黒星病（Ven
turia inaequalis）；ピレノホラ（Pyrenophora）種、
例えば網斑病（Pyrenophora teresまたはP. gramine
a）；（分生胞子器型： Drechslera、同義： Helmintho
sporium）コクリオボルス（Cochliobolus）種、例えば
斑点病（Cochliobolus sativus）；（分生胞子器型： D
rechslera、同義： Helminthosporium）ウロミセス（Ur
omyces）種、例えばさび病（Uromyces appendiculatu
s）；プシニナ（Puccinia）種、例えば赤さび病（Pucci
nia recondita）；ふすべ菌属（Tilletia）種、例えば
網なまぐさ黒穂病（Tilletia caries）；黒穂病（Ustil
ago）種、例えば裸黒穂病（Ustilago nudaまたはUstila
go avenae）；ペリキユラリア（Pellicularia）種、例
えば紋枯病（Pellicularia sasakii）；ピリキユラリア
（Pyricularia）種、例えばいもち病（Pyricularia ory
zae)；フーザリウム（Fusarium）種、例えばフーザリウ
ム・クルモルム（Fusarium culmorum）；灰色かび属（B
otrytis）種、例えば灰色かび病（Botrytis cinere
a）；セプトリア（Septoria）種、例えばふ枯病（Septo
ria nodorum）；レプトスフエリア（Leptosphaeria）
種、例えばレプトスフエリア・ノドルム（Leptosphaeri
a nodorum）；セルコスポラ（Cercospora）種、例えば
セルコスポラ・カネセンス（Cercospora canescens）；
アルテルナリア（Alternaria）種、例えば黒斑病（Alte
rnaria brassicae）およびプソイドセルコスポレラ（Ps
eudocercosporella）種、例えばプソイドセルコスポレ
ラ・ヘルポトリコイデス（Pseudocercosporella herpot
richoides）。更にヘルミントスポリウム・カルボヌム
（Helminthosporium carbonum）も挙げられる。
【００５７】以下に示す具体例を用いて本発明を更に詳
しく説明する。
しく説明する。
【００５８】１． パセリからの、ＣＣｏＡＭＴに関す
る遺伝子の単離 パセリ（Petroselinum crispum）から得られる植物およ
び細胞培養物は、ＣＣｏＡＭＴの生成をもたらすＣＣｏ
ＡＭＴのための遺伝子を含んでいる（この蛋白質の大き
さ２７，０００Ｄ；特異的抗血清と反応）。
る遺伝子の単離 パセリ（Petroselinum crispum）から得られる植物およ
び細胞培養物は、ＣＣｏＡＭＴの生成をもたらすＣＣｏ
ＡＭＴのための遺伝子を含んでいる（この蛋白質の大き
さ２７，０００Ｄ；特異的抗血清と反応）。
【００５９】例えば、下記のハンドブック中に詳細に記
述されている如き分子生物学に関する公知の操作および
方法を、該ＣＣｏＡＭＴ遺伝子の単離で用いた：Maniat
is,T.、 Fritsch, E.F.、 Sambrook, J.:「分子クローニ
ング：実験室マニュアル」」（Molecular Cloning:A La
boratory Manual）；Cold Spring Harbor Laboratory、
第2版、 1989。
述されている如き分子生物学に関する公知の操作および
方法を、該ＣＣｏＡＭＴ遺伝子の単離で用いた：Maniat
is,T.、 Fritsch, E.F.、 Sambrook, J.:「分子クローニ
ング：実験室マニュアル」」（Molecular Cloning:A La
boratory Manual）；Cold Spring Harbor Laboratory、
第2版、 1989。
【００６０】パセリの「遺伝子ライブラリー」を最初に
下記の如く確立する：富裕化した細胞核から得られるゲ
ノム状ＤＮＡ（Bedbrook, J.、 Plant Molecular Biolog
y Newsletter 2、 24、 1981）を、制限酵素NdeIIで切断
することにより、約１２，０００個のヌクレオチド対か
ら成る平均長を有するＤＮＡフラグメントを生じさせ
る。これらのフラグメントを、ラムダファージEMBL4のB
amHI部位にクローン化し（Frischauf他、 J. Mol. Biol.
170、 827-842、 1983）そしてこれらのファージを大腸
菌中で繁殖させる。このファージ量は全体として、サブ
フラグメントにクローン化したとき、パセリ全体のゲノ
ム状ＤＮＡを含んでおり、従ってＣＣｏＡＭＴのための
遺伝子も含んでいる。
下記の如く確立する：富裕化した細胞核から得られるゲ
ノム状ＤＮＡ（Bedbrook, J.、 Plant Molecular Biolog
y Newsletter 2、 24、 1981）を、制限酵素NdeIIで切断
することにより、約１２，０００個のヌクレオチド対か
ら成る平均長を有するＤＮＡフラグメントを生じさせ
る。これらのフラグメントを、ラムダファージEMBL4のB
amHI部位にクローン化し（Frischauf他、 J. Mol. Biol.
170、 827-842、 1983）そしてこれらのファージを大腸
菌中で繁殖させる。このファージ量は全体として、サブ
フラグメントにクローン化したとき、パセリ全体のゲノ
ム状ＤＮＡを含んでおり、従ってＣＣｏＡＭＴのための
遺伝子も含んでいる。
【００６１】ＣＣｏＡＭＴのための遺伝子、それらのｍ
ＲＮＡおよびＣＣｏＡＭＴシンターゼｃＤＮＡ各々は、
同じ核酸配列を有している、と言うのは、それらは互い
から派生し得るからである（遺伝子→ｍＲＮＡ→ｃＤＮ
Ａ）。このことは、ＣＣｏＡＭＴのための遺伝子は、Ｃ
ＣｏＡＭＴ−ｃＤＮＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１を参照）
か、或はこの配列から誘導できる特異的オリゴヌクレオ
チド、に対して特異的に雑種形成させることによって同
定できる。これらの遺伝子を有するファージを雑種形成
によって同定し、そしてそれらを単離した後、増殖させ
る。このファージ中にクローン化したところの、パセリ
から得られるゲノム状ＤＮＡの地図を更に、種々の制限
酵素を用いた分析で決定し、そしてｃＤＮＡ配列もしく
は合成オリゴヌクレオチドを用いた更に一層の雑種形成
実験によって、ＣＣｏＡＭＴ遺伝子の位置を決定する。
最後に、制限酵素を用いた消化により、これらの遺伝子
単位を該ファージから切り出し、相当して切り出したプ
ラスミドベクター中にクローン化した後、組換え型プラ
スミドとして増殖させる。
ＲＮＡおよびＣＣｏＡＭＴシンターゼｃＤＮＡ各々は、
同じ核酸配列を有している、と言うのは、それらは互い
から派生し得るからである（遺伝子→ｍＲＮＡ→ｃＤＮ
Ａ）。このことは、ＣＣｏＡＭＴのための遺伝子は、Ｃ
ＣｏＡＭＴ−ｃＤＮＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１を参照）
か、或はこの配列から誘導できる特異的オリゴヌクレオ
チド、に対して特異的に雑種形成させることによって同
定できる。これらの遺伝子を有するファージを雑種形成
によって同定し、そしてそれらを単離した後、増殖させ
る。このファージ中にクローン化したところの、パセリ
から得られるゲノム状ＤＮＡの地図を更に、種々の制限
酵素を用いた分析で決定し、そしてｃＤＮＡ配列もしく
は合成オリゴヌクレオチドを用いた更に一層の雑種形成
実験によって、ＣＣｏＡＭＴ遺伝子の位置を決定する。
最後に、制限酵素を用いた消化により、これらの遺伝子
単位を該ファージから切り出し、相当して切り出したプ
ラスミドベクター中にクローン化した後、組換え型プラ
スミドとして増殖させる。
【００６２】配列相同性のため、プラスミドｐＬ２−４
上のｃＤＮＡ中に含まれている配列に相当するＤＮＡ配
列は、本発明に従う他のＣＣｏＡＭＴ遺伝子を単離する
ためのプローブとして使用できる。
上のｃＤＮＡ中に含まれている配列に相当するＤＮＡ配
列は、本発明に従う他のＣＣｏＡＭＴ遺伝子を単離する
ためのプローブとして使用できる。
【００６３】２． タバコの形質転換 ａ）タバコシュートの培養およびタバコプロトプラスト
単離：ニコチアナ・タバクム（Nicotiana tabacum）（P
etit Havanna SR1）を、ホルモンが入っていないＬＳ培
地上の無菌シュート培養物として繁殖させる（Linsmaie
rおよびSkoog 1965）。約６〜８週の間隔で、シュート
断片を新鮮なＬＳ培地に転移させる。これらのシュート
培養物を、２４〜２６℃の培養室中、光（１０００〜３
０００ルックス）の中に１２時間保つ。
単離：ニコチアナ・タバクム（Nicotiana tabacum）（P
etit Havanna SR1）を、ホルモンが入っていないＬＳ培
地上の無菌シュート培養物として繁殖させる（Linsmaie
rおよびSkoog 1965）。約６〜８週の間隔で、シュート
断片を新鮮なＬＳ培地に転移させる。これらのシュート
培養物を、２４〜２６℃の培養室中、光（１０００〜３
０００ルックス）の中に１２時間保つ。
【００６４】葉のプロトプラストを単離する目的で、約
２ｇの葉（約３〜５ｃｍ長）を、新しい剃刀の刃で小さ
い片（０．５ｃｍｘ１ｃｍ）に切断する。この葉材料
を、Ｋ３培地（NagyおよびMaliga 1976）、０．４Ｍの
スクロース、ｐＨ５．６、２％のZellulase R10（Serv
a）および０．５％のMacerozym R10（Serva）が入って
いる酵素溶液２０ｍＬ中、室温で１４〜１６時間培養す
る。次に、０．３０ｍｍｘ０．１ｍｍの鋼製ふるいを用
いて濾過することにより、細胞残渣からプロトプラスト
を分離する。この濾液を１００ｘｇで１０分間遠心分離
する。この遠心分離中、無傷のプロトプラストが浮遊
し、そしてこの酵素溶液の上縁に帯として集積する。細
胞残渣のペレットおよび酵素溶液を、ガラス製毛細管で
吸い出す。新鮮なＫ３培地（浸透剤として０．４Ｍのス
クロース）を用いて、この前精製したプロトプラストの
量を１０ｍＬにした後、再び浮遊させる。この洗浄用培
地を吸い出した後、これらのプロトプラストを、培養も
しくは引き続くアグロバクテリウムによる感染（共培
養）のため、１〜２ｘ１０5／ｍＬに希釈する。このプ
ロトプラストの濃度を計数チャンバ中で測定する。
２ｇの葉（約３〜５ｃｍ長）を、新しい剃刀の刃で小さ
い片（０．５ｃｍｘ１ｃｍ）に切断する。この葉材料
を、Ｋ３培地（NagyおよびMaliga 1976）、０．４Ｍの
スクロース、ｐＨ５．６、２％のZellulase R10（Serv
a）および０．５％のMacerozym R10（Serva）が入って
いる酵素溶液２０ｍＬ中、室温で１４〜１６時間培養す
る。次に、０．３０ｍｍｘ０．１ｍｍの鋼製ふるいを用
いて濾過することにより、細胞残渣からプロトプラスト
を分離する。この濾液を１００ｘｇで１０分間遠心分離
する。この遠心分離中、無傷のプロトプラストが浮遊
し、そしてこの酵素溶液の上縁に帯として集積する。細
胞残渣のペレットおよび酵素溶液を、ガラス製毛細管で
吸い出す。新鮮なＫ３培地（浸透剤として０．４Ｍのス
クロース）を用いて、この前精製したプロトプラストの
量を１０ｍＬにした後、再び浮遊させる。この洗浄用培
地を吸い出した後、これらのプロトプラストを、培養も
しくは引き続くアグロバクテリウムによる感染（共培
養）のため、１〜２ｘ１０5／ｍＬに希釈する。このプ
ロトプラストの濃度を計数チャンバ中で測定する。
【００６５】ｂ）キメラ的ＣＣｏＡＭＴ遺伝子の構築、
およびアグロバクテリウム・ツムファシエンス中への転
移 ｐＬ２−４から得られるEcoRIフラグメント（約１．２
ｋｂ）を、ベクターpRT101のEcoRI位置にクローン化す
る（Toepfer他、 1988）。これが、このｃＤＮＡの５’
末端上にCaMVの３５Ｓプロモーターと、その３’末端に
CaMVからのポリアデニル化配列を生じさせる。次に、こ
のキメラ的に構築した遺伝子を、HindIIIを用いた開裂
により、約１．９ｋｂから成るフラグメントとして機能
的に単離する。次に、このHindIIIフラグメントを、通
常の方法により、中間的ベクター、例えばpCV001（Konc
zおよびSchell、 1986）中に転移させる。上に挙げたベ
クターの代わりに、相当する開裂部位を有する他の所望
の発現ベクターおよび中間的ベクターのいずれかが使用
でき、上記情報を基にして技術者は容易に適切な選択を
行い得るであろう。この得られる中間的ベクター（これ
は該ＣＣｏＡＭＴ遺伝子を含んでいる）を、機能的vir
領域を含んでいるアグロバクテリウム・ツムファシエン
スに転移させる（KonczおよびSchell 1986、van Haute
他 1983）。
およびアグロバクテリウム・ツムファシエンス中への転
移 ｐＬ２−４から得られるEcoRIフラグメント（約１．２
ｋｂ）を、ベクターpRT101のEcoRI位置にクローン化す
る（Toepfer他、 1988）。これが、このｃＤＮＡの５’
末端上にCaMVの３５Ｓプロモーターと、その３’末端に
CaMVからのポリアデニル化配列を生じさせる。次に、こ
のキメラ的に構築した遺伝子を、HindIIIを用いた開裂
により、約１．９ｋｂから成るフラグメントとして機能
的に単離する。次に、このHindIIIフラグメントを、通
常の方法により、中間的ベクター、例えばpCV001（Konc
zおよびSchell、 1986）中に転移させる。上に挙げたベ
クターの代わりに、相当する開裂部位を有する他の所望
の発現ベクターおよび中間的ベクターのいずれかが使用
でき、上記情報を基にして技術者は容易に適切な選択を
行い得るであろう。この得られる中間的ベクター（これ
は該ＣＣｏＡＭＴ遺伝子を含んでいる）を、機能的vir
領域を含んでいるアグロバクテリウム・ツムファシエン
スに転移させる（KonczおよびSchell 1986、van Haute
他 1983）。
【００６６】ｃ）アグロバクテリウム・ツムファシエン
スとの共培養による、再生用タバコプロトプラストの形
質転換 最小限の修飾を行い、下記のMarton他 1979の方法を用
いる。記述したようにしてプロトプラストを単離した
後、２６℃で、暗所中２日間そして弱い光（５００ルッ
クス）の下で１〜２日間、Ｋ３培地（０．４Ｍのスクロ
ース、０．１ｍｇ／ＬのＮＡＡ、０．２ｍｇのキネチ
ン）中１〜２ｘ１０5／ｍＬの密度で培養する。これら
のプロトプラストの第一分裂が生じたら直ぐ、最小Ａ
（Ａｍ）培地中、ｂ）に従うアグロバクテリウム懸濁液
３０μＬ（約１０9個のアグロバクテリウム／ｍＬから
成る密度）を、再生用プロトプラスト３ｍＬに加える。
この共培養の期間は、暗所中２０℃で３〜４日間であ
る。その後、これらのタバコ細胞を１２ｍＬの遠心分離
管に入れ、海水（６００ｍＯｓｍ／ｋｇ）で１０ｍＬに
希釈した後、６０ｘｇで１０分間ペレット化する。この
洗浄操作を更に１〜２回繰り返して、大部分のアグロバ
クテリウムを除去する。この細胞懸濁液を、１ｍｇ／Ｌ
のＮＡＡ（ナフチル−１−酢酸）、０．２ｍｇ／Ｌのキ
ネチンおよび５００ｍｇ／Ｌのセファロスポリン系抗生
物質セフォタキシムが入っているＫ３培地（０．３Ｍの
スクロース）中、５ｘ１０4／ｍＬの密度で培養する。
この細胞懸濁液を毎週新鮮なＫ３培地で希釈し、そして
この培地の浸透値を、１週当たり０．０５Ｍのスクロー
ス（約６０ｍＯｓｍ／ｋｇ）で徐々に低下させる。アガ
ロース「ビード型培養」（Shillito他 1983）中で共培
養した後、２〜３週で、カナマイシン（１００ｍｇ／Ｌ
の硫酸カナマイシン（Sigma）、６６０ｍｇ／ｇの活性
ｋｍ）を用いた選択を開始する。この選択開始後３〜４
週間で、遅れたコロニーの背景から、カナマイシン耐性
コロニーが区別できる。
スとの共培養による、再生用タバコプロトプラストの形
質転換 最小限の修飾を行い、下記のMarton他 1979の方法を用
いる。記述したようにしてプロトプラストを単離した
後、２６℃で、暗所中２日間そして弱い光（５００ルッ
クス）の下で１〜２日間、Ｋ３培地（０．４Ｍのスクロ
ース、０．１ｍｇ／ＬのＮＡＡ、０．２ｍｇのキネチ
ン）中１〜２ｘ１０5／ｍＬの密度で培養する。これら
のプロトプラストの第一分裂が生じたら直ぐ、最小Ａ
（Ａｍ）培地中、ｂ）に従うアグロバクテリウム懸濁液
３０μＬ（約１０9個のアグロバクテリウム／ｍＬから
成る密度）を、再生用プロトプラスト３ｍＬに加える。
この共培養の期間は、暗所中２０℃で３〜４日間であ
る。その後、これらのタバコ細胞を１２ｍＬの遠心分離
管に入れ、海水（６００ｍＯｓｍ／ｋｇ）で１０ｍＬに
希釈した後、６０ｘｇで１０分間ペレット化する。この
洗浄操作を更に１〜２回繰り返して、大部分のアグロバ
クテリウムを除去する。この細胞懸濁液を、１ｍｇ／Ｌ
のＮＡＡ（ナフチル−１−酢酸）、０．２ｍｇ／Ｌのキ
ネチンおよび５００ｍｇ／Ｌのセファロスポリン系抗生
物質セフォタキシムが入っているＫ３培地（０．３Ｍの
スクロース）中、５ｘ１０4／ｍＬの密度で培養する。
この細胞懸濁液を毎週新鮮なＫ３培地で希釈し、そして
この培地の浸透値を、１週当たり０．０５Ｍのスクロー
ス（約６０ｍＯｓｍ／ｋｇ）で徐々に低下させる。アガ
ロース「ビード型培養」（Shillito他 1983）中で共培
養した後、２〜３週で、カナマイシン（１００ｍｇ／Ｌ
の硫酸カナマイシン（Sigma）、６６０ｍｇ／ｇの活性
ｋｍ）を用いた選択を開始する。この選択開始後３〜４
週間で、遅れたコロニーの背景から、カナマイシン耐性
コロニーが区別できる。
【００６７】ｄ）ＤＮＡを用いたタバコプロトプラスト
の直接的形質転換。硝酸カルシウム−ＰＥＧ形質転換 ２０μｇのプラスミドpCV001::ＣＣｏＡＭＴ（図３を参
照）を含有しているＤＮＡ水溶液２０μＬと一緒に、ペ
トリ皿中、Ｋ３培地１８０μＬ中約１０6個のプロトプ
ラストを注意深く混合する。このプラスミドpCV001::Ｃ
ＣｏＡＭＴは、該プラスミドpCV001、pRT101およびｐＬ
２−４（図１〜３参照）から公知の方法で得られる。次
に、２００μＬの融合用溶液（０．１Ｍの硝酸カルシウ
ム、０．４５Ｍのマンニトール、２５％のポリエチレン
グリコール（ＰＥＧ６０００）、ｐＨ９）を注意深く加
える。１５分後、５ｍＬの洗浄用溶液（０．２７５Ｍの
硝酸カルシウム、ｐＨ６）を加え、そして更に５分後、
該プロトプラストを遠心分離管中に移した後、６０ｘｇ
でペレット化する。このペレットを少量のＫ３培地中に
取り上げた後、次のセクションに記述するように培養す
る。二者択一的に、これらのプロトプラストは、Hain他
1985が記述するようにして形質転換できる。
の直接的形質転換。硝酸カルシウム−ＰＥＧ形質転換 ２０μｇのプラスミドpCV001::ＣＣｏＡＭＴ（図３を参
照）を含有しているＤＮＡ水溶液２０μＬと一緒に、ペ
トリ皿中、Ｋ３培地１８０μＬ中約１０6個のプロトプ
ラストを注意深く混合する。このプラスミドpCV001::Ｃ
ＣｏＡＭＴは、該プラスミドpCV001、pRT101およびｐＬ
２−４（図１〜３参照）から公知の方法で得られる。次
に、２００μＬの融合用溶液（０．１Ｍの硝酸カルシウ
ム、０．４５Ｍのマンニトール、２５％のポリエチレン
グリコール（ＰＥＧ６０００）、ｐＨ９）を注意深く加
える。１５分後、５ｍＬの洗浄用溶液（０．２７５Ｍの
硝酸カルシウム、ｐＨ６）を加え、そして更に５分後、
該プロトプラストを遠心分離管中に移した後、６０ｘｇ
でペレット化する。このペレットを少量のＫ３培地中に
取り上げた後、次のセクションに記述するように培養す
る。二者択一的に、これらのプロトプラストは、Hain他
1985が記述するようにして形質転換できる。
【００６８】ｅ）ＤＮＡと一緒に培養したプロトプラス
トの培養、およびカナマイシン耐性カルスの選択 以下記述するカナマイシン耐性コロニーの培養および選
択で、修飾した「ビード型培養」技術（Shillito他 198
3）を用いる。ＤＮＡを用いて該プロトプラストを処理
して１週後（ｄを参照）、５ｃｍのペトリ皿中、３ｍＬ
のＫ３培地（０．３Ｍのスクロース＋ホルモン類；１．
２％（Seaplaque）のＬＭＴアガロース（低融点のアガ
ロース、Marine Colloids）と一緒に上記細胞懸濁液３
ｍＬを混合する。この目的のため、上記アガロースを乾
燥状態でオートクレーブにかけ、そしてＫ３培地を添加
した後、これを少しの間電子レンジ中で沸騰させる。こ
のアガロースが固化した後、更に一層の培養および選択
のため、埋め込んだタバコのミクロカルスが入っている
１０ｃｍのペトリ皿中に、該アガロース盤（「ビー
ド」）を移し、そして各場合共、１０ｍＬのＫ３培地
（０．３Ｍのスクロース、１ｍｇ／ＬのＮＡＡ、０．２
ｍｇ／Ｌのキネチン）および１００ｍｇ／Ｌの硫酸カナ
マイシン（Sigma）を加える。この液体培地を毎週交換
する。この操作中、この培地の浸透値は段階的に低下す
る。
トの培養、およびカナマイシン耐性カルスの選択 以下記述するカナマイシン耐性コロニーの培養および選
択で、修飾した「ビード型培養」技術（Shillito他 198
3）を用いる。ＤＮＡを用いて該プロトプラストを処理
して１週後（ｄを参照）、５ｃｍのペトリ皿中、３ｍＬ
のＫ３培地（０．３Ｍのスクロース＋ホルモン類；１．
２％（Seaplaque）のＬＭＴアガロース（低融点のアガ
ロース、Marine Colloids）と一緒に上記細胞懸濁液３
ｍＬを混合する。この目的のため、上記アガロースを乾
燥状態でオートクレーブにかけ、そしてＫ３培地を添加
した後、これを少しの間電子レンジ中で沸騰させる。こ
のアガロースが固化した後、更に一層の培養および選択
のため、埋め込んだタバコのミクロカルスが入っている
１０ｃｍのペトリ皿中に、該アガロース盤（「ビー
ド」）を移し、そして各場合共、１０ｍＬのＫ３培地
（０．３Ｍのスクロース、１ｍｇ／ＬのＮＡＡ、０．２
ｍｇ／Ｌのキネチン）および１００ｍｇ／Ｌの硫酸カナ
マイシン（Sigma）を加える。この液体培地を毎週交換
する。この操作中、この培地の浸透値は段階的に低下す
る。
【００６９】１週当たり０．０５Ｍのスクロース（約６
０ｍＯｓｍ）により、この置換した培地（Ｋ３＋ｋｍ）
を低下させる。
０ｍＯｓｍ）により、この置換した培地（Ｋ３＋ｋｍ）
を低下させる。
【００７０】 ＤＮＡ形質転換後の、カナマイシン耐性タバココロニー選択に関する時間表： 0.4M 0.3M 0.25M 0.20M 0.15M 0.10M (液状培地中のスクロース) AES K 1 2 3 4 5 6 (DNA 吸収後の週数) （Ｋ３培地 １ｍｇのＮＡＡ、０．２ｍｇのキネチン） Ａ＝ＤＮＡ吸収 Ｅ＝アガロース中の埋め込み Ｓ＝カナマイシンを用いた選択（１００ｍｇ／Ｌの硫酸
カナマイシン） Ｋ＝カナマイシン耐性コロニーが背景から明確に区別で
きる。
カナマイシン） Ｋ＝カナマイシン耐性コロニーが背景から明確に区別で
きる。
【００７１】ｅ）カナマイシン耐性植物の再生 カナマイシン耐性コロニーの直径が約０．５ｃｍに達し
たら直ぐ、それらの半分を再生用培地（ＬＳ培地、２％
のスクロース、０．５ｍｇ／Ｌのベンジルアミノプリン
ＢＡＰ）上に撒き、そして２４℃で、光（３０００〜５
０００ルックス）中１２時間、培養室の中に置く。もう
１つの半分を、１ｍｇ／ＬのＮＡＡ、０．２ｍｇ／Ｌの
キネチン、０．１ｍｇ／ＬのＢＡＰおよび１００ｍｇ／
Ｌの硫酸カナマイシンが入っているＬＳ培地上で、カル
ス培養物として繁殖させる。この再生したシュートの大
きさが約１ｃｍになった時、それらを切り出し、そして
根だしのため、成長制御剤無しの１／２ＬＳ培地（１％
のスクロース、０．８％の寒天）上に撒く。これらのシ
ュートを、１００ｍｇ／Ｌの硫酸カナマイシンが入って
いる１／２ＭＳ培地上で根だしさせた後、土壌中に移
す。
たら直ぐ、それらの半分を再生用培地（ＬＳ培地、２％
のスクロース、０．５ｍｇ／Ｌのベンジルアミノプリン
ＢＡＰ）上に撒き、そして２４℃で、光（３０００〜５
０００ルックス）中１２時間、培養室の中に置く。もう
１つの半分を、１ｍｇ／ＬのＮＡＡ、０．２ｍｇ／Ｌの
キネチン、０．１ｍｇ／ＬのＢＡＰおよび１００ｍｇ／
Ｌの硫酸カナマイシンが入っているＬＳ培地上で、カル
ス培養物として繁殖させる。この再生したシュートの大
きさが約１ｃｍになった時、それらを切り出し、そして
根だしのため、成長制御剤無しの１／２ＬＳ培地（１％
のスクロース、０．８％の寒天）上に撒く。これらのシ
ュートを、１００ｍｇ／Ｌの硫酸カナマイシンが入って
いる１／２ＭＳ培地上で根だしさせた後、土壌中に移
す。
【００７２】ｇ）アグロバクテリウム・ツムファシエン
スによる葉盤状物の形質転換 葉盤状物を形質転換するため（Horsch他 1985）、無菌
のシュート培養物から、長さが約２〜３ｃｍの葉を、直
径が１ｃｍの盤状物に打ち抜いた後、Ａｍ培地（以下を
参照）中の適当なアグロバクテリウム（約１０9／ｍ
Ｌ）（ｃ参照）懸濁液と一緒に約５分間培養する。この
感染した葉片を、約２４℃で３〜４日間、ホルモンが入
っていないＭＳ培地（以下を参照）上に保存する。この
期間中、アグロバクテリウムはその葉片上で増殖する。
次に、これらの葉片をＭＳ培地（０．５ｍｇ／ｍＬのＢ
ＡＰ、０．１ｍｇ／ｍＬのＮＡＡ）中で洗浄した後、５
００μｇ／ｍＬのセフォタキシムおよび１００μｇ／ｍ
Ｌの硫酸カナマイシンが入っている同じ培地（０．８％
の寒天）上に置く。この培地は２週間後再び新しくすべ
きである。更に２〜３週間後に、形質転換したカナマイ
シン耐性シュートが現れる。
スによる葉盤状物の形質転換 葉盤状物を形質転換するため（Horsch他 1985）、無菌
のシュート培養物から、長さが約２〜３ｃｍの葉を、直
径が１ｃｍの盤状物に打ち抜いた後、Ａｍ培地（以下を
参照）中の適当なアグロバクテリウム（約１０9／ｍ
Ｌ）（ｃ参照）懸濁液と一緒に約５分間培養する。この
感染した葉片を、約２４℃で３〜４日間、ホルモンが入
っていないＭＳ培地（以下を参照）上に保存する。この
期間中、アグロバクテリウムはその葉片上で増殖する。
次に、これらの葉片をＭＳ培地（０．５ｍｇ／ｍＬのＢ
ＡＰ、０．１ｍｇ／ｍＬのＮＡＡ）中で洗浄した後、５
００μｇ／ｍＬのセフォタキシムおよび１００μｇ／ｍ
Ｌの硫酸カナマイシンが入っている同じ培地（０．８％
の寒天）上に置く。この培地は２週間後再び新しくすべ
きである。更に２〜３週間後に、形質転換したカナマイ
シン耐性シュートが現れる。
【００７３】形質転換に関する生化学的検出方法 ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＮＰＴ Ｉ
Ｉ）酵素試験：下記のように、Reiss他（1984）が記述
しそしてSchreier他 （1985）が修飾した如く、カナマ
イシンのインサイチュー燐酸化によって、植物組織中の
ＮＰＴＩＩ活性を検出する。ガラス粉末を添加した５０
μＬの抽出用緩衝液（１０％のグリセロール、５％の２
−メルカプトエタノール、０．１％のＳＤＳ、０．０２
５％のブロモフェノールブルー、６２．５ｍＭのトリ
ス、ｐＨ６．８）中、氷上で５０ｍｇの植物組織を均一
化した後、エッペンドルフ遠心分離中、４℃で１０分間
遠心分離する。この上澄み液５０μＬを、未変性のポリ
アクリルアミドゲル（１４５ｘ１１０ｘ１．２ｍｍ；分
離用ゲル：１０％のアクリルアミド、０．３３％のビス
アクリルアミド、０．３７５ＭのトリスｐＨ８．８、採
取用ゲル：５％のアクリルアミド、０．１６５％のビス
アクリルアミド、０．１２５ＭのトリスｐＨ６．８）に
かけた後、４℃で一晩、６０Ｖの電気泳動を行った。ブ
ロモフェノールブルーのマーカーがそのゲルから流れ出
た後直ぐ、このゲルを２回蒸留水で１０分間洗浄し、そ
して一度反応用緩衝液（６７ｍＭのトリス−マレート、
ｐＨ７．１、４２ｍＭのＭｇＣｌ2、４００ｍＭの塩化
アンモニウム）で３０分間洗浄する。このゲルを、同じ
大きさのガラス製プレート上に置いた後、その基質であ
る硫酸カナマイシン（２０μｇ／ｍＬ）と２０〜２００
μＣｉの32Ｐ ＡＴＰ（Amersham）とが入っている反応
用緩衝液中１％濃度のアガロース４０ｍＬから成る層で
覆った。このサンドイッチ状にしたゲルを、室温で３０
分間培養した後、１枚のホスホセルロース紙Ｐ８１（Wh
atman）をそのアガロース上に置く。４層の３ＭＭ濾紙
（Whatman）と数枚の紙ハンカチーフを上に重ねる。こ
のＰ８１紙上にインサイチューで燐酸化した放射性燐酸
カナマイシンの転移を、３〜４時間後停止させる。この
Ｐ８１紙を、プロテイナーゼＫと１％のドデシル硫酸ナ
トリウム（ＳＤＳ）とから成る６０℃溶液中で３０分間
培養した後、２５０ｍＬの１０ｍＭ燐酸塩緩衝液ｐＨ
７．５中８０℃で３〜４回洗浄し、乾燥し、そして−７
０℃で１〜１２時間オートラジオグラフィーにかける
（コダック製ＸＡＲ５フィルム）。
Ｉ）酵素試験：下記のように、Reiss他（1984）が記述
しそしてSchreier他 （1985）が修飾した如く、カナマ
イシンのインサイチュー燐酸化によって、植物組織中の
ＮＰＴＩＩ活性を検出する。ガラス粉末を添加した５０
μＬの抽出用緩衝液（１０％のグリセロール、５％の２
−メルカプトエタノール、０．１％のＳＤＳ、０．０２
５％のブロモフェノールブルー、６２．５ｍＭのトリ
ス、ｐＨ６．８）中、氷上で５０ｍｇの植物組織を均一
化した後、エッペンドルフ遠心分離中、４℃で１０分間
遠心分離する。この上澄み液５０μＬを、未変性のポリ
アクリルアミドゲル（１４５ｘ１１０ｘ１．２ｍｍ；分
離用ゲル：１０％のアクリルアミド、０．３３％のビス
アクリルアミド、０．３７５ＭのトリスｐＨ８．８、採
取用ゲル：５％のアクリルアミド、０．１６５％のビス
アクリルアミド、０．１２５ＭのトリスｐＨ６．８）に
かけた後、４℃で一晩、６０Ｖの電気泳動を行った。ブ
ロモフェノールブルーのマーカーがそのゲルから流れ出
た後直ぐ、このゲルを２回蒸留水で１０分間洗浄し、そ
して一度反応用緩衝液（６７ｍＭのトリス−マレート、
ｐＨ７．１、４２ｍＭのＭｇＣｌ2、４００ｍＭの塩化
アンモニウム）で３０分間洗浄する。このゲルを、同じ
大きさのガラス製プレート上に置いた後、その基質であ
る硫酸カナマイシン（２０μｇ／ｍＬ）と２０〜２００
μＣｉの32Ｐ ＡＴＰ（Amersham）とが入っている反応
用緩衝液中１％濃度のアガロース４０ｍＬから成る層で
覆った。このサンドイッチ状にしたゲルを、室温で３０
分間培養した後、１枚のホスホセルロース紙Ｐ８１（Wh
atman）をそのアガロース上に置く。４層の３ＭＭ濾紙
（Whatman）と数枚の紙ハンカチーフを上に重ねる。こ
のＰ８１紙上にインサイチューで燐酸化した放射性燐酸
カナマイシンの転移を、３〜４時間後停止させる。この
Ｐ８１紙を、プロテイナーゼＫと１％のドデシル硫酸ナ
トリウム（ＳＤＳ）とから成る６０℃溶液中で３０分間
培養した後、２５０ｍＬの１０ｍＭ燐酸塩緩衝液ｐＨ
７．５中８０℃で３〜４回洗浄し、乾燥し、そして−７
０℃で１〜１２時間オートラジオグラフィーにかける
（コダック製ＸＡＲ５フィルム）。
【００７４】４． ソラヌム・ツベロスム（Solanum tu
berosum）（ジャガイモ）の形質転換 この形質転換を、EP-A-0,242,246、14-15頁中に記述し
たのと全く同様にして行い、即ち、このアグロバクテリ
ウムは、該ＣＣｏＡＭＴ遺伝子もしくはＣＣｏＡＭＴ遺
伝子類を有するＴｉプラスミドを含んでいる。
berosum）（ジャガイモ）の形質転換 この形質転換を、EP-A-0,242,246、14-15頁中に記述し
たのと全く同様にして行い、即ち、このアグロバクテリ
ウムは、該ＣＣｏＡＭＴ遺伝子もしくはＣＣｏＡＭＴ遺
伝子類を有するＴｉプラスミドを含んでいる。
【００７５】上記実施例中の全てのパーセントに関する
データは、特に明記されていない限り、重量％に関す
る。
データは、特に明記されていない限り、重量％に関す
る。
【００７６】上記実施例に従って得られる植物細胞およ
び植物（タバコ）中に該ＣＣｏＡＭＴ遺伝子が存在して
いることを、サザンブロット分析によって確認した。こ
のＣＣｏＡＭＴ遺伝子の発現をノーザンブロット分析に
より検出し、そしてＣＣｏＡＭＴを特異的抗体の助けで
検出した。
び植物（タバコ）中に該ＣＣｏＡＭＴ遺伝子が存在して
いることを、サザンブロット分析によって確認した。こ
のＣＣｏＡＭＴ遺伝子の発現をノーザンブロット分析に
より検出し、そしてＣＣｏＡＭＴを特異的抗体の助けで
検出した。
【００７７】植物および植物細胞の形質転換で用いた培
地のいくつかを以下に記述する。
地のいくつかを以下に記述する。
【００７８】Ａｍ培地 ３.５ｇ の Ｋ2ＨＰＯ4 １.５ｇ の ＫＨ2ＰＯ4 ０.５ｇ の クエン酸Ｎａ3 ０.１ｇ の ＭｇＳＯ4×７Ｈ2Ｏ １ ｇ の （ＮＨ4）2ＳＯ4 ２ ｇ の グルコース １１にたいしてタバコの無菌シュート培養用培地 多量要素 ＭＳ塩濃度の１／２ 少量要素 ＭＳ塩濃度の１／２ Ｆｅ−ＥＤＴＡ MurashigeおよびSkoog（ＭＳ） ミオ−イノシトール １００ｍｇ／ｌ スクロース １０ｍｇ／ｌ 寒天 ８ｍｇ／ｌ ビタミン類 パントテン酸Ｃａ １ｍｇ／ｌ ビオチン １０ｍｇ／ｌ ニコチン酸 １ｍｇ／ｌ ピリドキシン １ｍｇ／ｌ チアミン １ｍｇ／ｌ オートクレーブかける前ｐＨ５．７Ｋ３培地 ニコチアナ・タバクム・ペチト（Nicotiana tabacum pe
tit）Havana SR1、ニコチアナ・タバクムWisconsin 38
およびニコチアナ・プルマギニホリア（Nicotiana plum
aginifolia）のプロトプラスト培養用（NagyおよびMali
ga、 1976） 多量要素 ＮＨ4ＮＯ3 ２５０ ｍｇ／ｌ ＫＮＯ3 ２５００ ｍｇ／ｌ ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ ９００ ｍｇ／ｌ ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ２５０ ｍｇ／ｌ ＮａＨ2ＰＯ4・１Ｈ2Ｏ １５０ ｍｇ／ｌ （ＮＨ4）2ＳＯ4 １３４ ｍｇ／ｌ ＣａＨＰＯ4・１Ｈ2Ｏ ５０ ｍｇ／ｌ 少量要素 Ｈ3ＢＯ3 ３ ｍｇ／ｌ ＭｎＳＯ4・１Ｈ2Ｏ １０ ｍｇ／ｌ ＺｎＳＯ4・４Ｈ2Ｏ ２ ｍｇ／ｌ ＫＩ ０．７５ ｍｇ／ｌ Ｎａ2ＭｏＯ4・２Ｈ2Ｏ ０．２５ ｍｇ／ｌ ＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ ０．０２５ｍｇ／ｌ ＣｏＣｌ2・６Ｈ2Ｏ ０．０２５ｍｇ／ｌ Ｆｅ−ＥＤＴＡ Ｎａ2ＥＤＴＡ ３７．２ ｍｇ／ｌ ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ２７．８ ｍｇ／ｌ イノシトール １００ ｍｇ／ｌ スクロース １３７ ｇ／ｌ (＝０．４Ｍ) キシロース ２５０ ｍｇ／ｌ ビタミン類 ニコチン酸 １ ｍｇ／ｌ ピリドキシン １ ｍｇ／ｌ チアミン １０ ｍｇ／ｌ ホルモン類 ＮＡＡ １．０ ｍｇ／ｌ キネチン ０．２ ｍｇ／ｌ ｐＨ５．６ 無菌フィルターLinsmaierおよびSkoog培地 （LinsmaierおよびSkoog 196
5） 再生用プロトプラストの培養用、およびタバコ腫瘍およ
びカルスの組織培養用。LinsmaierおよびSkoog（ＬＳ）
培地は、下記の修飾を行ったMurashigeおよびSkoog培地
（MurashigeおよびSkoog 1962）である： − ０．１ｍｇ／Ｌの代わりに０．４ｍｇ／Ｌの高濃度
で、チアミンを計量して入れる； − グリシン、ピリドキシンおよびニコチン酸を存在さ
せない。
tit）Havana SR1、ニコチアナ・タバクムWisconsin 38
およびニコチアナ・プルマギニホリア（Nicotiana plum
aginifolia）のプロトプラスト培養用（NagyおよびMali
ga、 1976） 多量要素 ＮＨ4ＮＯ3 ２５０ ｍｇ／ｌ ＫＮＯ3 ２５００ ｍｇ／ｌ ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ ９００ ｍｇ／ｌ ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ２５０ ｍｇ／ｌ ＮａＨ2ＰＯ4・１Ｈ2Ｏ １５０ ｍｇ／ｌ （ＮＨ4）2ＳＯ4 １３４ ｍｇ／ｌ ＣａＨＰＯ4・１Ｈ2Ｏ ５０ ｍｇ／ｌ 少量要素 Ｈ3ＢＯ3 ３ ｍｇ／ｌ ＭｎＳＯ4・１Ｈ2Ｏ １０ ｍｇ／ｌ ＺｎＳＯ4・４Ｈ2Ｏ ２ ｍｇ／ｌ ＫＩ ０．７５ ｍｇ／ｌ Ｎａ2ＭｏＯ4・２Ｈ2Ｏ ０．２５ ｍｇ／ｌ ＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ ０．０２５ｍｇ／ｌ ＣｏＣｌ2・６Ｈ2Ｏ ０．０２５ｍｇ／ｌ Ｆｅ−ＥＤＴＡ Ｎａ2ＥＤＴＡ ３７．２ ｍｇ／ｌ ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ２７．８ ｍｇ／ｌ イノシトール １００ ｍｇ／ｌ スクロース １３７ ｇ／ｌ (＝０．４Ｍ) キシロース ２５０ ｍｇ／ｌ ビタミン類 ニコチン酸 １ ｍｇ／ｌ ピリドキシン １ ｍｇ／ｌ チアミン １０ ｍｇ／ｌ ホルモン類 ＮＡＡ １．０ ｍｇ／ｌ キネチン ０．２ ｍｇ／ｌ ｐＨ５．６ 無菌フィルターLinsmaierおよびSkoog培地 （LinsmaierおよびSkoog 196
5） 再生用プロトプラストの培養用、およびタバコ腫瘍およ
びカルスの組織培養用。LinsmaierおよびSkoog（ＬＳ）
培地は、下記の修飾を行ったMurashigeおよびSkoog培地
（MurashigeおよびSkoog 1962）である： − ０．１ｍｇ／Ｌの代わりに０．４ｍｇ／Ｌの高濃度
で、チアミンを計量して入れる； − グリシン、ピリドキシンおよびニコチン酸を存在さ
せない。
【００７９】 多量要素 ＮＨ4ＮＯ3 １６５０ ｍｇ／ｌ ＫＮＯ3 １９００ ｍｇ／ｌ ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ ４４０ ｍｇ／ｌ ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ３７０ ｍｇ／ｌ ＫＨ2ＰＯ4 １７０ ｍｇ／ｌ 少量要素 Ｈ3ＢＯ3 ６．２ ｍｇ／ｌ ＭｎＳＯ4・１Ｈ2Ｏ ２２．３ ｍｇ／ｌ ＺｎＳＯ4・４Ｈ2Ｏ ８．６ ｍｇ／ｌ ＫＩ ０．８３ ｍｇ／ｌ Ｎａ2ＭｏＯ4・２Ｈ2Ｏ ０．２５ ｍｇ／ｌ ＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ ０．０２５ｍｇ／ｌ ＣｏＣｌ2・６Ｈ2Ｏ ０．０２５ｍｇ／ｌ Ｆｅ−ＥＤＴＡ Ｎａ2ＥＤＴＡ ３７．２ ｍｇ／ｌ ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ２７．８ ｍｇ／ｌ イノシトール １００ ｍｇ／ｌ スクロース ３０ ｇ／ｌ 寒天 ８ ｇ／ｌ ビタミン類 チアミン ０．４ ｍｇ／ｌ ホルモン類 ＮＡＡ １ ｍｇ／ｌ キネチン ０．２ ｍｇ／ｌ オートクレーブにかける前のｐＨ５．７。
【００８０】以下に示す文献が、植物および植物細胞の
形質転換に関して引用できる：Fraley R.T., Rogers S.
G., Horsch R.B., Sanders P.R., Flick J.S., AdamsS.
P., Bittner M.L., Brand L.A., Fink C.L., Fry J.S.,
Fallupi G.R.,Goldberg S.B., Hoffmann N.L., Woo S.
C. (1983) 「植物細胞中でのバクテリア遺伝子の発現」Proc. Nat
l. Acad. Sci. USA 80:4803-4807。 Fromm ME, Taylor LP, Walbot V (1986) 「エレクトロポレーションによる遺伝子転移後のトウモ
ロコシの安定な形質転換」Nature 319:791-793。
形質転換に関して引用できる：Fraley R.T., Rogers S.
G., Horsch R.B., Sanders P.R., Flick J.S., AdamsS.
P., Bittner M.L., Brand L.A., Fink C.L., Fry J.S.,
Fallupi G.R.,Goldberg S.B., Hoffmann N.L., Woo S.
C. (1983) 「植物細胞中でのバクテリア遺伝子の発現」Proc. Nat
l. Acad. Sci. USA 80:4803-4807。 Fromm ME, Taylor LP, Walbot V (1986) 「エレクトロポレーションによる遺伝子転移後のトウモ
ロコシの安定な形質転換」Nature 319:791-793。
【００８１】Hain, R., Stabel, P., Czernilofsky, A.
P., SteinbiВ, H.H., Herrera-Estrella, L., Schell,
J. (1985) 「植物プロトプラストによる選択性キメラ遺伝子の吸
収、組み込み、発現および遺伝的伝達」Molec Gen Gene
t 199:161-168。
P., SteinbiВ, H.H., Herrera-Estrella, L., Schell,
J. (1985) 「植物プロトプラストによる選択性キメラ遺伝子の吸
収、組み込み、発現および遺伝的伝達」Molec Gen Gene
t 199:161-168。
【００８２】Hernalsteens JP, Thia-Tong L, Schell
J, Van Montagu M (1984) 「モノコット（monocot）のアスパラガス・オフィシナ
リス（Asparagus officinalis）から得られるアグロバ
クテリウムで形質転換した細胞培養」、EMBO J 3:3039-
3041。
J, Van Montagu M (1984) 「モノコット（monocot）のアスパラガス・オフィシナ
リス（Asparagus officinalis）から得られるアグロバ
クテリウムで形質転換した細胞培養」、EMBO J 3:3039-
3041。
【００８３】Herrera-Estrella L., De Block M., Mess
ens E., Hernal-steens JP., van Montagu M., Schell
J. (1983) EMBO J. 2:987-995。
ens E., Hernal-steens JP., van Montagu M., Schell
J. (1983) EMBO J. 2:987-995。
【００８４】Horsch RB, Fry JE, Hoffmann NL, Eichho
ltz D, Rogers SG, Fraley RT (1985) 「遺伝子を植物に転移させるための簡単で一般的な方
法」Science 277:1229-1231。
ltz D, Rogers SG, Fraley RT (1985) 「遺伝子を植物に転移させるための簡単で一般的な方
法」Science 277:1229-1231。
【００８５】Krens FH, Molendijk L, Wullems GJ, Sch
ilperoort RA (1982) 「Ｔｉ−プラスミドＤＮＡを用いた植物プロトプラスト
のインビトロ形質転換」Nature 296:72-74。
ilperoort RA (1982) 「Ｔｉ−プラスミドＤＮＡを用いた植物プロトプラスト
のインビトロ形質転換」Nature 296:72-74。
【００８６】Koncz C, Schell J 「新規な種類のアグロバクテリウム・リナリ（Agrobact
erium linary）ベクターによって運ばれるキメラ遺伝子
の組織特異的発現を、ＴLＤＮＡ遺伝子５のプロモータ
ーが制御する」Mol. Gen. Genet. (1986) 204:338-396。 Linsmaier DM, Skoog F (1965) 「タバコ組織培養に関する有機的成長因子要求」Physio
l Plant 18:100-127。 Marton L, Wullems GJ, Molendijk L, Schilperoort PR
(1979) 「アグロバクテリウム・ツメファシエンスによる、ニコ
チアナ・タバクムから得られる培養細胞のインビトロ形
質転換」Nautre 277:1229-131。 Nagy JI, Maliga P (1976) 「ニコチアナ・シルヴェストリス（Nicotiana sylvestr
is）のメソフィルプロトプラストからのカルス導入およ
び植物再生」Z Pflanzenphysiol 78:453-455。 Paszkowski J, Shillito RD, Saul M, Mandak V, Hohn
T, Hohn B, PotrykusI (1984) 「植物への直接的遺伝子転移」EMBO J 3:2717-2722。 Shillito RD, Paszkowski J. Potrykus I (1983) 「アガロースプレーティングおよびビード型培養技術
は、数多くの植物種中での、プロトプラスト誘導コロニ
ーの発育を可能にしそして刺激する」Pl Cell Rep2:244
-247。 Van den Elzen PJM, Townsend J, Lee KY, Bedbrook JR
(1985) 「植物細胞中の選択性マーカーとしてのキメラ耐性遺伝
子」Plant Mol. Biol.5, 299-302。 Velten J, Velten L, Hain R, Schell J (1984) 「アグロバクテリウム・ツメファシエンスのＴｉプラス
ミドからの、重複植物プロモーターフラグメントの単
離」EMBO J 12:2723-2730。 Van Haute E, Joos H, Maes M, Warren G, Van Montagu
M, Schell J (1983) 「pBR322中の制限フラグメントクローンの遺伝子間転移
および交換組換え：アグロバクテリウム・ツメファシエ
ンスのＴｉプラスミドの、逆遺伝学に対する新規方策」
EMBO J 2:411-418。 Zambryski P, Joos H, Genetello C, van Montagu M, S
chell J (1983) 「正常な再生能力を変更させることなく、植物細胞中に
ＤＮＡを導入するためのＴｉプラスミドベクター」EMBO
J 12:2143-2150。 Reiss, B., Sprengel, Will H., and Schaller H (198
4) 「粗細胞部中のネオマイシンホスホトランスフェラーゼ
の定性および定量分析用新規高感度方法」GENE 1081:21
1-217。 「光調節合成に特異的な核コード化配列の使用、および
植物クロロプラストへの外来性蛋白質の移送」以下に示
す公開特許出願も更に挙げられる： ＥＰ−Ａ １１６，７１８ ＥＰ−Ａ−１２６，５４６ ＥＰ−Ａ １５９，４１８ ＥＰ−Ａ−１６４，５９７ ＥＰ−Ａ １２０，５１５ ＥＰ−Ａ−１７５，９６６ ＥＰ−Ａ−１２０，５１６ ＷＯ ８４／０２９１３ ＥＰ−Ａ−１７２，１１２ ＷＯ ８４／０２９１９ ＥＰ−Ａ−１４０，５５６ ＷＯ ８４／０２９２０ ＥＰ−Ａ−１７４，１６６ ＷＯ ８３／０１１７６ ＥＰ−Ａ−１２２，７９１ 以下に示す実施例を用いて、本発明に従い形質転換した
植物の増大した耐性を説明する。
erium linary）ベクターによって運ばれるキメラ遺伝子
の組織特異的発現を、ＴLＤＮＡ遺伝子５のプロモータ
ーが制御する」Mol. Gen. Genet. (1986) 204:338-396。 Linsmaier DM, Skoog F (1965) 「タバコ組織培養に関する有機的成長因子要求」Physio
l Plant 18:100-127。 Marton L, Wullems GJ, Molendijk L, Schilperoort PR
(1979) 「アグロバクテリウム・ツメファシエンスによる、ニコ
チアナ・タバクムから得られる培養細胞のインビトロ形
質転換」Nautre 277:1229-131。 Nagy JI, Maliga P (1976) 「ニコチアナ・シルヴェストリス（Nicotiana sylvestr
is）のメソフィルプロトプラストからのカルス導入およ
び植物再生」Z Pflanzenphysiol 78:453-455。 Paszkowski J, Shillito RD, Saul M, Mandak V, Hohn
T, Hohn B, PotrykusI (1984) 「植物への直接的遺伝子転移」EMBO J 3:2717-2722。 Shillito RD, Paszkowski J. Potrykus I (1983) 「アガロースプレーティングおよびビード型培養技術
は、数多くの植物種中での、プロトプラスト誘導コロニ
ーの発育を可能にしそして刺激する」Pl Cell Rep2:244
-247。 Van den Elzen PJM, Townsend J, Lee KY, Bedbrook JR
(1985) 「植物細胞中の選択性マーカーとしてのキメラ耐性遺伝
子」Plant Mol. Biol.5, 299-302。 Velten J, Velten L, Hain R, Schell J (1984) 「アグロバクテリウム・ツメファシエンスのＴｉプラス
ミドからの、重複植物プロモーターフラグメントの単
離」EMBO J 12:2723-2730。 Van Haute E, Joos H, Maes M, Warren G, Van Montagu
M, Schell J (1983) 「pBR322中の制限フラグメントクローンの遺伝子間転移
および交換組換え：アグロバクテリウム・ツメファシエ
ンスのＴｉプラスミドの、逆遺伝学に対する新規方策」
EMBO J 2:411-418。 Zambryski P, Joos H, Genetello C, van Montagu M, S
chell J (1983) 「正常な再生能力を変更させることなく、植物細胞中に
ＤＮＡを導入するためのＴｉプラスミドベクター」EMBO
J 12:2143-2150。 Reiss, B., Sprengel, Will H., and Schaller H (198
4) 「粗細胞部中のネオマイシンホスホトランスフェラーゼ
の定性および定量分析用新規高感度方法」GENE 1081:21
1-217。 「光調節合成に特異的な核コード化配列の使用、および
植物クロロプラストへの外来性蛋白質の移送」以下に示
す公開特許出願も更に挙げられる： ＥＰ−Ａ １１６，７１８ ＥＰ−Ａ−１２６，５４６ ＥＰ−Ａ １５９，４１８ ＥＰ−Ａ−１６４，５９７ ＥＰ−Ａ １２０，５１５ ＥＰ−Ａ−１７５，９６６ ＥＰ−Ａ−１２０，５１６ ＷＯ ８４／０２９１３ ＥＰ−Ａ−１７２，１１２ ＷＯ ８４／０２９１９ ＥＰ−Ａ−１４０，５５６ ＷＯ ８４／０２９２０ ＥＰ−Ａ−１７４，１６６ ＷＯ ８３／０１１７６ ＥＰ−Ａ−１２２，７９１ 以下に示す実施例を用いて、本発明に従い形質転換した
植物の増大した耐性を説明する。
【００８７】形質転換した植物の増大した耐性の検出 実施例Ａ 植物の病気に対する増大した耐性を試験する目的で、植
物に病原体を接種した後、攻撃の度合をパラメーターと
して用いる。ボトリチス・シネレア（Botrytiscinere
a）Pers.を試験病原体として用いる。
物に病原体を接種した後、攻撃の度合をパラメーターと
して用いる。ボトリチス・シネレア（Botrytiscinere
a）Pers.を試験病原体として用いる。
【００８８】タバコ植物を予め組織培地中で成長させた
後、温室の中で、ポット（直径１１ｃｍ）中の標準土壌
（Balster）に植え付けた後、実験を開始するまで、２
３℃で７０〜８０％の大気相対湿度の温室中で発育させ
る。これらの植物には、要求に応じて水および肥料を与
える。接種するため、植物の葉（温室に移した後３〜４
週）に、滴り落ちるまで病原体の胞子懸濁液を噴霧す
る。その後、これらの植物を、１００％の大気相対湿度
および１０〜２０℃で培養する。４〜８日後、攻撃され
た葉の面積により、パーセントとして、これらの植物の
健康状態を測定する。
後、温室の中で、ポット（直径１１ｃｍ）中の標準土壌
（Balster）に植え付けた後、実験を開始するまで、２
３℃で７０〜８０％の大気相対湿度の温室中で発育させ
る。これらの植物には、要求に応じて水および肥料を与
える。接種するため、植物の葉（温室に移した後３〜４
週）に、滴り落ちるまで病原体の胞子懸濁液を噴霧す
る。その後、これらの植物を、１００％の大気相対湿度
および１０〜２０℃で培養する。４〜８日後、攻撃され
た葉の面積により、パーセントとして、これらの植物の
健康状態を測定する。
【００８９】本発明に従うＣＣｏＡＭＴ遺伝子が挿入さ
れている形質転換型タバコ植物は、非形質転換型植物の
それよりも有意に低い、ボトリチス・シネレアによる攻
撃を示している。
れている形質転換型タバコ植物は、非形質転換型植物の
それよりも有意に低い、ボトリチス・シネレアによる攻
撃を示している。
【００９０】好適な雑種形成条件 上述したように、本発明に従う好適なＣＣｏＡＭＴ遺伝
子は、それらが、プラスミドｐＬ２−４に含まれている
ＣＣｏＡＭＴ−ｃＤＮＡ配列もしくはそれらの構成要素
か、或はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に従うｃＤＮＡ配列もし
くはそれらの構成要素に対して雑種形成しそしてＣＣｏ
ＡＭＴをコード化することを特徴としている。
子は、それらが、プラスミドｐＬ２−４に含まれている
ＣＣｏＡＭＴ−ｃＤＮＡ配列もしくはそれらの構成要素
か、或はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に従うｃＤＮＡ配列もし
くはそれらの構成要素に対して雑種形成しそしてＣＣｏ
ＡＭＴをコード化することを特徴としている。
【００９１】好適な中間緊縮条件を用いる。中間緊縮条
件は、好適には、３〜４倍に濃縮されたＳＳＣ中５８〜
６５℃（特に好適には６３℃）であることを意味してい
る。他の給源からＣＣｏＡＭＴ遺伝子を単離するために
この方法を用いる場合、通常、関連した配列を有するｃ
ＤＮＡの集団が得られ、これらは、例えば大腸菌中で発
現し得る。この酵素活性を測定することができ（例えば
Pakusch他、 Arch. Biochem. Biophys. 271 (1989）、 48
8-494頁）、そして所望のｃＤＮＡが単離できる。
件は、好適には、３〜４倍に濃縮されたＳＳＣ中５８〜
６５℃（特に好適には６３℃）であることを意味してい
る。他の給源からＣＣｏＡＭＴ遺伝子を単離するために
この方法を用いる場合、通常、関連した配列を有するｃ
ＤＮＡの集団が得られ、これらは、例えば大腸菌中で発
現し得る。この酵素活性を測定することができ（例えば
Pakusch他、 Arch. Biochem. Biophys. 271 (1989）、 48
8-494頁）、そして所望のｃＤＮＡが単離できる。
【図１】 図１は、EcoRVフラグメント上にＣＣｏＡＭ
Ｔ遺伝子の蛋白質コード化配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１
参照）を含んでいるプラスミドｐＬ２−４の図を示して
いる。
Ｔ遺伝子の蛋白質コード化配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１
参照）を含んでいるプラスミドｐＬ２−４の図を示して
いる。
【図２】 図２は、キメラＣＣｏＡＭＴ遺伝子を含んで
いるプラスミドpRT101::ＣＣｏＡＭＴの図を示してい
る。
いるプラスミドpRT101::ＣＣｏＡＭＴの図を示してい
る。
【図３】 図３は、キメラＣＣｏＡＭＴ遺伝子を含んで
いるプラスミドpCV001::ＣＣｏＡＭＴの図を示してい
る。
いるプラスミドpCV001::ＣＣｏＡＭＴの図を示してい
る。
１ ：コード化領域の開始 ２ ：コード化領域の終止 CaMV ：カリフラワーモザイクウイルス CbR ：カルベニシリン耐性遺伝子 Ｅ ：EcoRI開裂部位 Ｈ ：HindIII開裂部位 KmR ：植物に関するカナマイシン耐性遺伝子 P35S ：CaMV35Sプロモーター pA35S ：CaMVのポリアデニル化配列 ＲＶ ：EcoRV Ｓ ：ＳＳＴ１開裂部位 矢印方向 ：プロモーターおよび遺伝子の方向 ＬＢ ：アグロバクテリウム・ツメファシエンスの
Ｔ−ＤＮＡの左境界配列 ＲＢ ：アグロバクテリウム・ツメファシエンスの
Ｔ−ＤＮＡの右境界配列 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１ 配列の種類：相当する蛋白質と共にヌクレオチド 配列長：１２５８個の塩基対 ストランド形態：１本鎖 トポロジー：線状 分子の種類：ｃＤＮＡ 元の源 有機体：パセリ 直接実験源 細胞系の名称：パセリ細胞培養（ペトロセリヌム・クリ
スプム（Petroselinum crispum)） 特徴：１〜３７０ＢＰ ５’非翻訳領域 ３７１〜１０９３ＢＰ 成熟ペプチド １０９４〜１２５８ＢＰ ３’非翻訳領域 特性：パセリから得られるカフェオイル−ＣｏＡ ３−
Ｏ−メチルトランスフェラーゼに関するｃＤＮＡ
Ｔ−ＤＮＡの左境界配列 ＲＢ ：アグロバクテリウム・ツメファシエンスの
Ｔ−ＤＮＡの右境界配列 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１ 配列の種類：相当する蛋白質と共にヌクレオチド 配列長：１２５８個の塩基対 ストランド形態：１本鎖 トポロジー：線状 分子の種類：ｃＤＮＡ 元の源 有機体：パセリ 直接実験源 細胞系の名称：パセリ細胞培養（ペトロセリヌム・クリ
スプム（Petroselinum crispum)） 特徴：１〜３７０ＢＰ ５’非翻訳領域 ３７１〜１０９３ＢＰ 成熟ペプチド １０９４〜１２５８ＢＰ ３’非翻訳領域 特性：パセリから得られるカフェオイル−ＣｏＡ ３−
Ｏ−メチルトランスフェラーゼに関するｃＤＮＡ
【化１】
【化２】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ａ０１Ｈ 7/00 8502−2Ｂ Ｃ１２Ｎ 1/21 7236−4Ｂ 5/10 9/10 7823−4Ｂ 15/70 15/84 //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 ハンス−イエルク・ライフ ドイツ連邦共和国デー5000ケルン41・ゴツ テスベーク165 (72)発明者 クラウス・シユテンツエル ドイツ連邦共和国デー4000デユツセルドル フ・ゼーゼネルシユトラーセ17 (72)発明者 ユルゲン・トムツイク ドイツ連邦共和国デー4018ランゲンフエル ト・ザウアーブルフシユトラーセ13アー
Claims (21)
- 【請求項１】 カフェオイル−ＣｏＡ ３−Ｏ−メチル
トランスフェラーゼ遺伝子（ＣＣｏＡＭＴ遺伝子）。 - 【請求項２】 プラスミドｐＬ２−４に含まれているＣ
ＣｏＡＭＴ−ｃＤＮＡ配列またはその構成要素に対して
か、或はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に従うｃＤＮＡ配列また
はその構成要素に対して、雑種形成しそしてＣＣｏＡＭ
Ｔをコード化することを特徴とするＣＣｏＡＭＴ遺伝
子。 - 【請求項３】 双子葉植物から得られうる請求項１およ
び２記載のＣＣｏＡＭＴ遺伝子。 - 【請求項４】 パセリから得られうる請求項１〜３記載
のＣＣｏＡＭＴ遺伝子。 - 【請求項５】 プラスミドｐＬ２−４に含まれているか
或はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されているｃＤＮＡに相
当する蛋白質コード化領域を有するＣＣｏＡＭＴ遺伝
子、および本質的に同じ作用を示すＤＮＡ配列。 - 【請求項６】 プロモーターとしてＴＲプロモーターも
しくは３５Ｓプロモーターを含んでいる請求項１〜５記
載のＣＣｏＡＭＴ遺伝子。 - 【請求項７】 プラスミドｐＬ２−４に含まれているか
或はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されているｃＤＮＡに相
当する蛋白質コード化領域を有し、そして該ＴＲプロモ
ーターもしくは３５Ｓプロモーターを有する、請求項１
〜６記載のＣＣｏＡＭＴ遺伝子。 - 【請求項８】 調節作用を有するところの、請求項１〜
５記載ＣＣｏＡＭＴ遺伝子の構成要素。 - 【請求項９】 請求項１〜７に従う該ＣＣｏＡＭＴ遺伝
子そしてプラスミドｐＬ２−４に含まれているか或はＳ
ＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されているｃＤＮＡに相当する
該ＤＮＡ配列の、構造遺伝子。 - 【請求項１０】 「外来性」ＤＮＡとしてか或は「追加
的」ＤＮＡとして、請求項１〜９に従う１種以上のＣＣ
ｏＡＭＴ遺伝子もしくはそれらの構成要素を含んでいる
組換え型の原核もしくは真核ＤＮＡ。 - 【請求項１１】 植物細胞（プロトプラストを含む）ま
たは植物（植物部分および種子を含む）中に含まれてい
るところの、請求項１０記載の組換え型ＤＮＡ。 - 【請求項１２】 請求項１〜９に従う１種以上のＣＣｏ
ＡＭＴ遺伝子もしくはそれらの構成要素および／または
請求項１０に従う組換え型ＤＮＡを含んでいるベクター
類。 - 【請求項１３】 ベクタープラスミドｐＬ２−４。
- 【請求項１４】 請求項１〜９に従う１種以上のＣＣｏ
ＡＭＴ遺伝子もしくはそれらの構成要素および／または
請求項１０に従う組換え型ＤＮＡか、或は請求項１２お
よび１３に従うベクター類を含んでいる形質転換した微
生物。 - 【請求項１５】 大腸菌株の大腸菌ＤＳ ｐＬ２−４お
よびその変異体。 - 【請求項１６】 植物細胞（プロトプラストを含む）ま
たは植物（植物部分および種子を含む）を形質転換する
ための、請求項１〜１５に従う該ＣＣｏＡＭＴ遺伝子お
よび／またはそれらの構成要素および／または該組換え
型ＤＮＡおよび／または該ベクター類および／または形
質転換型微生物の使用。 - 【請求項１７】 「外来性」か或は「追加的」ＤＮＡと
して、請求項１〜１０に従う１種以上のＣＣｏＡＭＴ遺
伝子および／またはそれらの構成要素を含んでいる形質
転換した植物細胞（プロトプラストを含む）および植物
（植物部分および種子を含む）。 - 【請求項１８】（ａ）請求項１〜１０に従う１種以上の
ＣＣｏＡＭＴ遺伝子もしくはそれらの構成要素および／
または組換え型ＤＮＡを、植物細胞（プロトプラストを
含む）中に挿入し、そして適宜 （ｂ）該形質転換型植物細胞（プロトプラストを含む）
から完全な形質転換型植物を再生させ、そして適宜 （ｃ）この親世代もしくはそれから得られる更に一層の
世代の、得られる形質転換型植物から所望の植物部分
（種子を含む）を得る、ことを特徴とする、有害生物に
対して増大した耐性を示す形質転換した植物細胞（プロ
トプラストを含む）および植物（植物部分および種子を
含む）の製造方法。 - 【請求項１９】 繁殖材料の発生、並びに請求の範囲１
〜９に従う該ＣＣｏＡＭＴ遺伝子もしくはそれらの構成
要素か或は請求項１０に従う組換え型ＤＮＡを含む新規
植物およびそれらの繁殖材料の発生、のための請求項１
７に従う形質転換型植物細胞（プロトプラストを含む）
および植物（植物部分および種子を含む）の使用。 - 【請求項２０】 請求項１７に従う形質転換型植物細胞
および植物の繁殖によって得られる繁殖材料。 - 【請求項２１】 植物からＣＣｏＡＭＴ遺伝子を単離す
るための、該プラスミドｐＬ２−４に含まれているか或
はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されているｃＤＮＡに完
全もしくは部分的に相当しているＤＮＡ配列の使用。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE4117747.9 | 1991-05-30 | ||
| DE4117747A DE4117747A1 (de) | 1991-05-30 | 1991-05-30 | Kaffeoyl-coa 3-o-methyltransferase-gene |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05199886A true JPH05199886A (ja) | 1993-08-10 |
| JP3272031B2 JP3272031B2 (ja) | 2002-04-08 |
Family
ID=6432809
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP12937392A Expired - Fee Related JP3272031B2 (ja) | 1991-05-30 | 1992-04-23 | カフエオイル−ＣｏＡ３−Ｏ−メチルトランスフエラーゼ遺伝子 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US5728570A (ja) |
| EP (1) | EP0516958A3 (ja) |
| JP (1) | JP3272031B2 (ja) |
| CA (1) | CA2067317A1 (ja) |
| DE (1) | DE4117747A1 (ja) |
Families Citing this family (23)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE4117747A1 (de) * | 1991-05-30 | 1992-12-03 | Bayer Ag | Kaffeoyl-coa 3-o-methyltransferase-gene |
| DE4423022C1 (de) * | 1994-06-30 | 1995-05-24 | Lutz Prof Dr Heide | Transgene Pflanzen mit erhöhtem Gehalt an Sekundärstoffen |
| DE4440200A1 (de) * | 1994-11-10 | 1996-05-15 | Bayer Ag | DNA-Sequenzen und ihre Verwendung |
| US5850020A (en) * | 1996-09-11 | 1998-12-15 | Genesis Research & Development Corporation, Ltd. | Materials and method for the modification of plant lignin content |
| US6410718B1 (en) | 1996-09-11 | 2002-06-25 | Genesis Research & Development Corporation Ltd. | Materials and methods for the modification of plant lignin content |
| US6204434B1 (en) | 1996-09-11 | 2001-03-20 | Genesis Research & Development Corporation Limited | Materials and methods for the modification of plant lignin content |
| US7087426B2 (en) | 1996-09-11 | 2006-08-08 | Agrigenesis Biosciences Ltd. | Materials and methods for the modification of plant lignin content |
| AU9072298A (en) * | 1997-08-13 | 1999-03-08 | Vlaams Interuniversitair Instituut Voor Biotechnologie Vzw | Tissue-specific poplar promoters |
| AU9117598A (en) * | 1997-08-27 | 1999-03-16 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Genes encoding enzymes for lignin biosynthesis and uses thereof |
| CA2336706A1 (en) * | 1998-07-27 | 2000-02-10 | Cuiying Chen | Bending and/or leaning-induced plant promoter |
| ATE358731T1 (de) | 1998-10-09 | 2007-04-15 | Arborgen Llc | Polypeptide mit 4-cumarate:coa ligase-aktivität und deren verwendungen. |
| US6441272B1 (en) * | 1998-12-02 | 2002-08-27 | The University Of Georgia Research Foundation, Inc. | Modification of lignin content and composition in plants |
| US6465229B2 (en) | 1998-12-02 | 2002-10-15 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Plant caffeoyl-coa o-methyltransferase |
| US7122718B2 (en) | 2000-07-28 | 2006-10-17 | Dairy Australia Limited | Modification of plant resistance to diseases and/or pests |
| KR20030021618A (ko) * | 2001-09-07 | 2003-03-15 | 이용섭 | 현사시에서 분리한 신규한 유전자와, 이 유전자를 이용한리그닌 함량 감소 방법 |
| FR2833615A1 (fr) * | 2001-12-14 | 2003-06-20 | Genoplante Valor | POLYMORPHISMES DU GENE CCoAOMT2 DE MAIS, ET LEURS UTILISATIONS POUR AMELIORER LA DIGESTIBILITE DES PLANTES |
| FR2875677B1 (fr) | 2004-09-29 | 2010-09-10 | Biogemma Fr | Mais presentant une digestibilite amelioree |
| US9758790B2 (en) | 2004-12-08 | 2017-09-12 | Ceres, Inc. | Modulating the level of components within plants |
| US8088975B2 (en) * | 2006-10-27 | 2012-01-03 | Ceres, Inc. | Phenylpropanoid related regulatory protein-regulatory region associations |
| WO2008069878A2 (en) | 2006-10-27 | 2008-06-12 | Ceres, Inc. | Modulating lignin in plants |
| FR2907464B1 (fr) * | 2006-10-24 | 2010-09-10 | Biogemma Fr | Mais presentant une tolerance accrue aux maladies fongiques |
| FR2919465B1 (fr) | 2007-07-31 | 2009-10-30 | Biogemma Soc Par Actions Simpl | Mais presentant une digestibilite amelioree |
| CN116396972B (zh) * | 2023-03-23 | 2024-03-22 | 青岛农业大学 | 一种大豆甲基转移酶基因GmCCOMT及其应用 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4652639A (en) * | 1982-05-06 | 1987-03-24 | Amgen | Manufacture and expression of structural genes |
| US4757006A (en) * | 1983-10-28 | 1988-07-12 | Genetics Institute, Inc. | Human factor VIII:C gene and recombinant methods for production |
| DE4117747A1 (de) * | 1991-05-30 | 1992-12-03 | Bayer Ag | Kaffeoyl-coa 3-o-methyltransferase-gene |
-
1991
- 1991-05-30 DE DE4117747A patent/DE4117747A1/de not_active Withdrawn
-
1992
- 1992-04-21 EP EP19920106761 patent/EP0516958A3/de not_active Withdrawn
- 1992-04-23 JP JP12937392A patent/JP3272031B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1992-04-27 CA CA002067317A patent/CA2067317A1/en not_active Abandoned
-
1994
- 1994-11-07 US US08/335,518 patent/US5728570A/en not_active Expired - Fee Related
-
1997
- 1997-12-10 US US08/988,054 patent/US6160205A/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA2067317A1 (en) | 1992-12-01 |
| JP3272031B2 (ja) | 2002-04-08 |
| DE4117747A1 (de) | 1992-12-03 |
| EP0516958A2 (de) | 1992-12-09 |
| EP0516958A3 (en) | 1993-07-21 |
| US5728570A (en) | 1998-03-17 |
| US6160205A (en) | 2000-12-12 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP3272031B2 (ja) | カフエオイル−ＣｏＡ３−Ｏ−メチルトランスフエラーゼ遺伝子 | |
| US5834268A (en) | Stilbene synthase genes for grapevine | |
| US5985647A (en) | Stilbene synthase gene | |
| US5689046A (en) | Stilbene synthase gene | |
| KR100217517B1 (ko) | 살충성 단백질-인코우딩 유전자, 이 유전자로 형질전환된 벼과 식물 및 그 제조방법 | |
| US5530187A (en) | Transgenic plants containing multiple disease resistance genes | |
| US5391724A (en) | Pinosylvine synthase genes | |
| AU620039B2 (en) | Inducible virus resistance in plants | |
| JP3320064B2 (ja) | 抵抗力を増大させるための植物中のリゾチーム遺伝子構造の使用 | |
| CA2078327A1 (en) | Plant promoter | |
| AU700022B2 (en) | DNA sequences and their use | |
| CN102482683A (zh) | 能够提供热耐受性的转录调节因子的表达 | |
| CA2261580A1 (en) | Antimicrobial peptides | |
| AU701718B2 (en) | Processes for modifying plant flowering behaviour | |
| EP0707070B1 (en) | Method for enhancing disease and pest resistance of plants | |
| US5589620A (en) | Bibenzyl synthase genes | |
| US6262338B1 (en) | Resistance genes | |
| AU769546B2 (en) | Method for obtaining transgenic plants expressing a protein with activity producing hydrogen peroxide by transformation by Agrobacterium rhizogenes | |
| JPH0576373A (ja) | 耐性遺伝子 | |
| RU2103361C1 (ru) | Рекомбинантная плазмидная днк pgii, определяющая синтез бета-интерферона человека в трансгенных растениях, и способ получения трансгенных растений, устойчивых к вирусной инфекции | |
| CN118374517A (zh) | Dna分子、生物材料以及获得抗草甘膦转基因植物的方法 | |
| KR20120052794A (ko) | 벼 형질전환용 재조합 벡터 및 이를 이용한 소 트립신의 대량생산방법 | |
| Burke et al. | Selection procedure for identifying transgenic cells, embryos, and plants without the use of antibiotics | |
| CA2204744A1 (en) | Dna sequence and its use | |
| MXPA97003431A (es) | Secuencia de dna que codifica para una sintetasa de estilbeno y sus usos |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |