JPH05155782A

JPH05155782A - ウマ鼻肺炎用ワクチン

Info

Publication number: JPH05155782A
Application number: JP4152992A
Authority: JP
Inventors: Joseph Macek; ジヨセフ・マセク; Karen K Brown; カレン・ケイ・ブラウン; Nathan D Greene; ネイサン・デイ・グリーン; Richard D Smith; リチヤード・デイ・スミス
Original assignee: Miles Inc
Current assignee: Bayer Corp
Priority date: 1991-05-28
Filing date: 1992-05-21
Publication date: 1993-06-22
Also published as: EP0532833A1

Abstract

(57)【要約】【構成】不活化ウマヘルペスウイルス１型、不活化ウ
マヘルペスウイルス４型及びアジュバントを組み合わせ
て製造したウマ鼻肺炎に対して効果のある混合ワクチ
ン。ヘルペスウイルス１型とヘルペスウイルス４型とは
約４：１ないし約１：１で混合する。アジュバントは好
ましくはＨａｖｌｏｇｅｎ、１種のＣａｒｂｏｐｏｌア
クリル酸基体のアジュバントである。【効果】馬の呼吸性鼻肺炎用のワクチンが提供され
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】発明の背景本発明はウマ鼻肺炎用混合ワクチン、及びこのワクチン
を使用する馬をウマ鼻肺炎から保護する方法に関する。

【０００２】ウマヘルペスウイルスには４つの類型(typ
e)又は亜類型(subtype)が存在することが一般に認めら
れている。ウマヘルペスウイルス(ＥＨＶ)-１の亜類型
１は又、ウマ流産ウイルスとして知られている。ＥＨＶ
-１の亜類型２は呼吸性鼻肺炎ウイルスである。ＥＨＶ-
２はしばしば、ウマサイトメガロウイルスと呼ばれる。
ＥＨＶ-３はウマ交疹ウイルスとして知られている。最
近のＤＮＡ相同性の研究から、ＥＨＶ-１の亜類型１と
２との間にはかなりの違いがあることが判った。それで
科学者の中には、ＥＨＶ-１、亜類型２のこの相違を考
慮に入れてＥＨＶ-４と改名しようと提案している人達
がいる。本発明ではＥＨＶ-１、亜類型２をＥＨＶ-４と
呼ぶことにする。

【０００３】鼻肺炎は急性のウイルス感染症で、発熱、
白血球減少、そして呼吸管にカタル性炎症を引き起こ
す。ウイルス性疾患は呼吸管の到るところで、二次的に
細菌感染を起こし易くする。妊娠した雌が感染するとし
ばしば流産が起こる。

【０００４】鼻肺炎に対して有効なワクチンが長い間探
し求められてきた。例えば米国特許第4,110,433号は、
ウマ鼻肺炎ウイルスの伝染力の強い系統から、これをウ
イルスが抗原性を失わずに、無発病性状態にまで弱毒化
されるような条件下に、Ｖｅｒｏ細胞（サルの腎臓）を
通して充分な回数継代培養して製造した弱毒化ウイルス
の鼻肺炎ワクチンを開示している。しかしこの特許で開
示されたワクチンは不活化されていない。生ワクチンな
のでウイルスが病毒性を取り戻すこともあり得る。事
実、このワクチンが発売されて間もなく、無発病性であ
る筈のワクチンがウマに病気を起こし、場合によってそ
れが死につながった。

【０００５】米国特許第4,083,958号は、ウマ鼻肺炎ウ
イルスを感染し易い、クローン化した二倍体ウマ細胞系
列中で増殖させ、得られたウイルスを無血清培地に集
め、そのウイルスを化学的に不活化し、そして不活化剤
を中和して調製される不活化ウマ鼻肺炎ウイルスワクチ
ンを開示している。得られたウイルスは濃縮し、免疫ア
ジュバントを添加する。得られたワクチンは若い雌ウマ
に規則正しい間隔で、妊娠するまで、そして妊娠期間中
投与する。しかし開示されたこのワクチンは、ウマヘル
ペスウイルス１型の２つの亜類の混合物ではない。本発
明のワクチンはＥＨＶ-１及びＥＨＶ-４を含んでいる。

【０００６】米国特許第4,225,582号もまた、ウマ鼻肺
炎用ワクチンを開示している。上で議論したワクチンと
異なり、このワクチンは生のウシヘルペスウイルス [A.
T.C.C. VR-2003]である。この株を我々の実験室で試験
して、妊娠した雌に流産が起こるのを観察した。制限エ
ンドヌクレアーゼ分析した所、開示されたワクチンを製
造するのに使用した株は典型的な野生ＥＨＶ-１である
ことが判った。

【０００７】米国特許第4,466,957号は、不活化生物、
例えばウマ鼻肺炎ウイルスを基にしたワクチンで有用な
アジュバントを開示している。この特許はしかし、ポア
クリル酸化合物、例えばＣａｒｂｏｐｏｌをワクチン中
のアジュバントとして使用することは教えていない。

【０００８】発明の要約本発明の目的は、ウマ鼻肺炎とウマ流産を予防するのに
効果的な新規な混合ワクチンを提供するにある。

【０００９】本発明の目的はまた、不活化ウイルスから
形成した、ウマ鼻肺炎及びウマ流産を予防するのに効果
的な新規な混合ワクチンを提供するにある。

【００１０】本発明の目的は更にウマ鼻肺炎ウイルス
を、公知のウマ鼻肺炎ウイルスワクチンよりも効果的に
予防する混合ワクチンを提供するにある。

【００１１】本発明のもう一つの目的は、ウマ鼻肺炎ウ
イルス及び同ウイルスに起因する流産から守るためにウ
マを治療する方法を提供するにある。

【００１２】本発明のこれら及びその他の目的は、当技
術分野の熟達者にとって明らかであり、不活化ウマヘル
ペスウイルス１型、不活化ヘルペスウイルス４型、及び
アジュバントを、不活化ウマヘルペスウイルス１型と不
活化ウマヘルペスウイルス４型との重量比が約４：１な
いし約１：１、好ましくは約３：１ないし２：１になる
ように混合することにより達成される。本発明のワクチ
ンを製造するにはウマヘルペスウイルス１型及びウマヘ
ルペスウイルス４型との間を区別することが必要であ
る。抗原捕捉モードでのＥＬＩＳＡ法により、ウマワク
チンに保護免疫性を与えるウマヘルペスウイルス４型に
ついてその検出及び定量が可能である。同ワクチンは、
公知の投与法のいずれの方法によってもウマに投与でき
るが、好ましくは筋肉内注射によって投与する。

【００１３】発明の詳細な説明Ａ．ワクチンウイルスＤＡ-８ウイルス単離ＥＨＶ-１の原種を、Ｍａｒｙｌａｎｄ大学のＳ.Ｄ
ｕｔｔａ博士から入手し、それをＤＡ-８と名付けた。
Ｓ.Ｄｕｔｔａ博士はＤＡ-８を流産で生まれた仔馬から
単離した。この単離物は、ワクチン化、誘発試験、及び
誘発からハムスターを守り、更にウマも守ることから証
明されるように、単離ＤＡ-３５（後述）より病毒性は
弱い。原種は続いて当技術分野の熟達者には公知の基本
原種ウイルス製造技術によって、ウマ皮膚細胞（ＥＤ）
を４回継代培養した。使用種はマスター種ウイルスをＥ
Ｄ細胞中を通過させて、（即ち原種のＥＤ細胞中第５継
代培養によって）作った。

【００１４】ＥＨＶ-１種を継代培養するのに使用した
ＥＤ細胞は、ＡＴＣＣから入手した公知の技術によって
約４０回継代培養したＡＴＣＣＣＣＣ５７と名付けら
れた細胞である。ＥＤ細胞は、同細胞が同族ホストであ
り、従ってワクチン化した馬中で反応を起こすことが少
ない様なので使用した。ＥＨＶ-１種は他の細胞系列、
例えばＭＤＢＫ(Madin Darby Bovine Kidney)及びＶｅ
ｒｏ(サル腎臓）中で継代培養することも可能である。
しかし、これらの細胞は馬から誘導されたものではない
ので、これら細胞系列を継代培養して得たＥＨＶ-１か
ら誘導されたワクチンでワクチン化した馬中で反応が起
こることもあり得る。

【００１５】ワクチンを製造するのに使用したウイルス
は、（Ｄｕｔｔａ博士から入手した原種をＥＤ細胞中で
第５代まで継代培養した）発酵用種（ワクチン製造用）
から製造した２０リットルロットである。同ロットの力
価は１０^6.0ＴＣＩＤ₅₀（50％細胞培養感染量：50% Tis
sue Culture Infective Doses)／ｍｌであった。同ロッ
トの３リットル分は非濃縮型ワクチンとして保存した。
残り１７リットルは４℃で７日間静置した。その最上部
を、下に沈んだ細胞壊死片を騒がないように注意深くサ
イホンで吸い出した。細胞の入っていないウイルス懸濁
液を、30,000Dalton 分子量以上を遮断する渦巻き型ラ
ップカートリッジを取り付けたAmiconCH₂ 限外濾過装置
を使用して濃縮した。最初の懸濁液をその１０倍以上に
濃縮した濃縮液（以後、10Ｘ濃縮液と呼ぶ）をこの方法
で製造した。静置したＥＤ細胞壊死片は10Ｘ濃縮液中に
再懸濁した（力価：１０^6.8ＴＣＩＤ₅₀／ｍｌ）。

【００１６】ＤＡ-３５ウイルス我々がＤＡ-３５と名付けたＥＨＶ-１原種株はメアリー
ランド (Maryland) 大学Ｓ.Ｄｕｔｔａ博士から得た。
流産で生まれた仔うまから単離したこの種は、ハムスタ
ー及びウマで実施したワクチン化、誘発及び保護試験の
結果によっても示されたように、単離ＤＡ-８よりも毒
性が強い。ＤＡ-８の場合について述べたのと同じ方法
によって原種ウイルス及び発酵用種をウマ皮膚細胞で継
代培養して製造した。

【００１７】ワクチンを製造するのに使用したウイルス
は、（Ｄｕｔｔａ博士から入手した原種をＥＤ細胞中で
５回の継代培養を行って得た）発酵用種から製造した４
１リットルロットである。同ロットの力価は１０^7.0Ｔ
ＣＩＤ₅₀／ｍｌであった。同ロットの３リットル分は非
濃縮型ワクチンとして保存した。２９リットルは４℃で
７日間静置し，その最上部をサイホンで吸い出し、そし
て上記したのと同じ様に限外濾過により、最初の懸濁液
をその１０倍以上に濃縮した。静置したＥＤ細胞壊死片
は10Ｘ濃縮液中に再懸濁した（力価：１０^8.2ＴＣＩＤ
₅₀／ｍｌ）。

【００１８】ＥＨＶ-４ウイルス本発明のワクチンを製造するにはウマヘルペスウイルス
１型とウマヘルペスウイルス４型との間の区別をするこ
とが必要である。抗原捕捉モードでのＥＬＩＳＡ技術に
よってウマのワクチン化に保護免疫性を与えるウマヘル
ペスウイルス４型上の抗原を検出し、その量を測定する
ことができる。本発明のワクチンを製造するのに使用し
たＥＨＶ-４の原種は、国立獣医学サービス実験所（Nat
ional Veterinary Service Laboratory:NVSL、Ames Iow
a)のＰｅａｒｓｏｎ博士から入手した。その壜にはウマ
ヘルペスウイルス１の分離亜類２,761036-1, 8/27/82の
ラベルがついていた。この種はＰｅａｒｓｏｎ博士がウ
マ鼻肺炎と診断された馬から分離したものである。その
原種は、当技術分野で公知の原種ウイルス製造法によっ
て、ＥＤ細胞中で継代培養を５回実施した。

【００１９】ワクチンを製造するのに使用したウイルス
は、Ｐｅａｒｓｏｎ博士から入手した原種をＥＤ細胞中
で６回継代培養して得た発酵用種から製造した２０リッ
トルロットである。同ロットの力価は１０^5.9ＴＣＩＤ
₅₀／ｍｌであった。同ロットの３リットル分は非濃縮型
ワクチンとして保存し、一方残り１７リットルは先にＥ
ＨＶ-１ＤＡ-３５に記載した方法により１０倍に濃縮し
た（力価：１０^7.0ＴＣＩＤ₅₀）。

【００２０】表１は各種ワクチンウイルスの、ウイルス
株、ウイルス増殖で使用した細胞培地、及び非濃縮ウイ
ルス及び１０倍濃縮物のウイルス力価ＴＣＩＤ₅₀を要約
したものである。

【００２１】Ｂ．ワクチン上記の方法によって製造したウイルスの６ロット（即
ち、ＥＨＶ-１（ＤＡ-８及びその濃縮物、ＥＨＶ-１
（ＤＡ-３５）及びその濃縮物、及びＥＨＶ-４及びその
濃縮物）それぞれを、下記に記載する方法によってワク
チン配合物を製造するのに使用した。

【００２２】ウイルス試料６ロットそれぞれをβ-プロ
ピオラクトン（ＢＰＬ）で不活性化した。ＢＰＬは氷冷
した蒸留水中で１：１０に希釈した。このＢＰＬ溶液
の、ＢＰＬの最終濃度を０.１５％にするのに充分な量
を各ウイルス試料に、４℃で添加した。それから温度を
ゆっくりと（約１時間以上かけて）３７℃迄上げた。各
試料は３７℃に保持して残っていたＢＰＬを加水分解し
た。この加水分解の間、５Ｎ水酸化ナトリウム溶液を必
要に応じて添加し、媒体中の指示薬、例えばフェノール
レッドで測定しながら、そのｐＨを中性に維持した。同
加水分解は約５時間で終了した。得られたウイルス試料
を、不活化確認試験が完了するまで４℃で保存した。

【００２３】ウイルスの不活化が完了したかどうかを試
験するために、ＢＰＬ処理したウイルス１０ｍｌを取
り、ＥＤ細胞の７５ｃｍ²組織培養フラスコ中で培養し
た。細胞は１週間、細胞変性効果（ＣＰＥ）の兆候があ
るかどうか監視した。１週間の培養後、ＣＰＥが観察さ
れなかったら、細胞を更に１週間２次培養（植えかえ培
養）した。第２週の終わりにでもＣＰＥが観察されなか
ったら、そのウイルスは不活化したと見做した。

【００２４】それぞれのウイルス試料は別々にＨａｖｌ
ｏｇｅｎの商品名で販売されているＣａｒｂｏｐｏｌポ
リアクリル酸基体のアジュバントでアジュバント化し、
Ｔ-リンパ球及びＢリンパ球応答性を刺激した。適当な
アジュバントは反応してはいけない（馬は非常に敏感で
あるので）。以下に述べる本発明のワクチンで使用する
Ｈａｖｌｏｇｅｎアジュバントは最終濃度が１０％(Ｃ
ａｒｂｏｐｏｌポリアクリル酸０.２５％）になるよう
に添加する。

【００２５】これらのウイルス試料を含むＨａｖｌｏｇ
ｅｎアジュバントは、表２に示したワクチンを製造する
のに使用した。各ワクチンは、筋肉注射によって投与さ
れ、その１回量が２.０ｍｌになるように調合された。

【００２６】Ｃ．実験動物本発明のワクチンの効果を検討するために６０頭の馬が
用いられた。それぞれの馬を４グループ中の１つに、Ｅ
ＨＶ抗体力価、馬の種類などを見て、グループ間がバラ
ンスするように割り当てた。２０頭をグループ１及び２
に、グループ３及び４には各１０頭を割り当てた。グル
ープ４に割り当てられた馬の１頭は、実験に無関係な病
気に感染したので、誘発処理の前に研究から外した。そ
れ故対照動物は９頭であった。誘発処理後９０日目にＥ
ＨＶ-１（ＤＨ-３５）濃縮物／ＥＨＶ-４濃縮物ワクチ
ン化グループ中の雌馬の１頭がシュート（動物に焼印を
押したり、角を切り落とすために動物を追い込むための
囲いを付けた狭い通路）を飛び越えて、降りるときにそ
の腹部を後部ゲートに打ち付けて裂傷を負った。彼女は
この傷で死亡した。従ってこの馬の誘発処理後１０日又
は１１日の結果は無い。

【００２７】Ｄ．ワクチン化この研究で使用した６０頭の馬を上記のように４つのグ
ループに分けた。それぞれの馬を、グループ毎に以下の
ようにワクチン化した。

【００２８】グループ１：ワクチンＢ（表２に記載）の
筋肉内注射（ＩＭ）を２回（各２ｍｌ）、３週間間隔で
首にして投与した。

【００２９】グループ２：ワクチンＡ（表２に記載）の
ＩＭ注射を２回（各２ｍｌ）、３週間間隔で首にして投
与した。

【００３０】グループ３：ワクチンＣ（表２に記載）の
ＩＭ注射を２回（各２ｍｌ）、３週間間隔で首にして投
与した。

【００３１】グループ４：ワクチン化しない対照群Ｅ．ＥＨＶを使用した馬の誘発試験誘発試験ウイルスＥＨＶ-１の、高度に毒性の高い原種（ＭＳＵ）は１９
７９年２月２６日にミシシッピー州立大学Ｃ.Ｗ. Ｐｕ
ｒｄｙ博士から入手した。誘発試験で使用したウイルス
はウマ皮膚（ＥＤ）細胞上、２回継代培養したものであ
る。誘発試験をした混合液を集め、凍結させた。その力
価は１０^6.0ＴＣＩＤ₅₀／ｍｌであった。

【００３２】馬それぞれは、力価約１０^5.3ＴＣＩＤ₅₀
／ｍｌのＥＨＶ-１（ＭＳＵ）(力価１０^6.0ＴＣＩＤ₅₀
の誘発ウイルスを１：５希釈して調製）で誘発試験し
た。ウイルスはネビュライザー（１種の噴霧器）（Cade
ma Medical Products社製：Middleton、ニューヨーク
州）を使用してエアゾルとして鼻腔内に投与した。１：
５希釈した誘発試験用ウイルス１ｍｌをネビュライザー
に入れた。内径１／２インチ断面で、長さが約２フィー
トのシリコーンチューブをネビュライザーの出口の部分
に取り付けた。圧力ホースをエアーコンプレッサーから
ネビュライザーの入り口部分に取り付けた。

【００３３】誘発試験に先立って、各馬に、Ｒｏｍｐｕ
ｎ（キシラジン）、１種の沈静鎮痛剤、を体重１００ポ
ンド当たり、０．５ｍｌ（０．５ｍｇ／ｌｂ）静脈内投
与した。こうすることによって、馬又は人に対する不快
感及び傷害の危険を最小にした。ネビュライザーの出口
からのチューブを馬の鼻腔に挿入し、１０ｐｓｉの空気
圧を入り口部分に５分間かけた。この間にウイルス液１
ｍｌがエアゾル化されて、直接鼻腔内に噴霧された。

【００３４】Ｆ．臨床評価毎日観察を続け、それを記録した。観察項目は下記のよ
うである。

【００３５】１．直腸温度の測定、２．分泌物の鼻腔の通り具合、及び粘膜炎症の観察、３．肺音の聴診、４．目を観察して、結膜炎、化膿あるいはその他の病気
の兆候を調べる。

【００３６】５．血液試料を取り、凝固防止剤としてエ
チレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含む瓶（紫栓瓶）
２個につめる。１個は白血球の数（ＷＢＣ）を調べるの
に使用し、もう１個はバッフィコートからウイルスを単
離するのに使用した。

【００３７】６．誘発試験の日、及び試験最後の日（誘
発試験の２週間後）に、馬毎に３０ｍｌの血液を採取
し、凝固させた。その血清を使用して、抗体力価の増加
を血清中和法によって試験した。

【００３８】馬毎の直腸温度は毎日°Ｆで記録した。馬
毎の毎日の直腸温度は基線上華氏温度で表され、それを
測定した。基線は誘発試験の日と、試験前２日間に測定
した温度の平均値である。基線より低い温度は０として
記録された。表３は、各グループの馬の基線温度より高
くなった温度変化の平均値を、誘発試験後の観察期間中
毎日測定して示したものである。誘発試験の２日後に、
ワクチンＢ（表２に記載）でワクチン化した馬の平均温
度が、対照馬のそれより有意に低くなった（ｐ≦０.０
５）。

【００３９】各馬で観察した分泌物の重症度を試験期間
中毎日観察して記録した。誘発試験の後１１日間鼻から
の分泌物を各馬について監視した。ワクチンＢでワクチ
ン化したグループで、僅かな分泌が２２０回の観察に対
して５回（２.３％）観察された。ワクチンＡでワクチ
ン化したグループでは２２０回に対して３回（１.３
％）の僅かな分泌が観察された。ワクチンＣでワクチン
化したグループでは１１０回に対して３回（２.７％）
で僅かな分泌であり、１回（０.９％）が中程度の分泌
であった。比較対照グループでは９９回の観察に対して
７回（７.１％）が僅かな分泌であり、２回（２.０％）
が中程度の分泌、そして２回（２.０％）が重度な分泌
であった。

【００４０】比較対照グループは、他のどのグループよ
りも有意に分泌が多いことが証明された（ｐ≦０.０
５）。

【００４１】Ｇ．白血球（ＷＢＣ）数の測定白血球数はCoulter Counter モデルＺＢＩ(Coulter Ele
ctronics社(Hialeath：米国フロリダ州）から販売）を
使用して測定した。血液を１：４９５にISOTONII (これ
もCoulter Electronics社から販売）中で希釈した。赤
血球を除去するのに使用するCoulter Electronics社か
ら市販されている試薬：ZAP-OGOLOBIN II*を添加して溶
解し、最後に白血球数を数える為に１：５００に希釈し
た。希釈試料はCoulter ＺＢＩで測定した。結果は細胞
数／ｍｍ³で表した。白血球数は全て20,000細胞／ｍｍ³
以下であったので、１回の開口で通過する細胞数が１個
より多い場合に対する補正は行わなかった。

【００４２】白血球数は各馬について、試験中毎日測定
した。白血球数は血液１ｍｍ³当たりの細胞数で表し
た。白血球数を基線の百分率として求めた。基線は各馬
についての誘発試験日及び試験前２日間に測定した白血
球数の平均値である。１００％より大きい値はどれも１
００％と記録した。表４は各グループの全ての馬の白血
球数の、各基線に対する百分率で表した値の平均値を示
したものである。誘発試験５日後に、ワクチンＢでワク
チン化した馬の白血球数（基線の８３％＝１７％の白血
球数減少）減少が非ワクチン化対照（基線の６８％＝３
２％白血球数減少）よりも有意に少なかった（ｐ≦０.
０５）。

【００４３】Ｈ．バッフィコートからＥＨＶの単離バッフィコートを全血試料から分離し、ウマ皮膚細胞を
含むフラスコに接種した。フラスコは３７℃で１週間培
養し、１日毎に監視制御した。細胞変性効果の無かった
フラスコはウイルス単離はマイナスであった（ウイルス
単離されず）。鼻の分泌で使用した方法と同じ計算法
（即ち全観測回数に対する発生率）を用いた所、下記の
ようなパターンがを見られた。即ち、ワクチンＢでワク
チン化したグループではウイルスが、誘発試験後２２０
回単離操作を行って７回単離された（３.２％）。ワク
チンＡでワクチン化したグループ、ワクチンＣでワクチ
ン化したグループ及び非ワクチン化対照グループでの単
離操作の試みに対して単離された割合は、それぞれ５／
２２０、８／１１０及び４／９９であった。これらは
２.３％、７.３％及び４.０％に相当する。

【００４４】Ｉ．ＥＨＶの鼻スワブ（綿棒）からの単離長さ５インチの、その先に消毒綿を付けたスワブ（一般
に言う綿棒）を使用して馬それぞれから鼻の分泌物を集
めた。スワブ１本１本を直ちに３ｍｌの輸送媒体［アー
ル塩（Ｅａｒｌｅｓｓａｌｔ）を含む最小必須培地
（ＭＥＭＥ）］に浸漬し、そしてそれらを実験室に送っ
た。試料は当技術分野の熟達者にとって公知の方法で調
製し、個々にＥＤ細胞単一層に接種した。細胞は１週間
に亙り隔日に、細胞変性（ＣＰＥ）の兆候が無いかどう
かを観察した。

【００４５】ウイルスはワクチンＢでワクチン化したグ
ループ中の馬の鼻腔道から、２２０回の分離操作で２回
単離された（０.９％）。ワクチンＡでワクチン化した
グループでの単離頻度は２２０回中６回（２.７％）で
あった。ワクチンＣでワクチン化したグループで頻度は
３／１１０（２.７％）であった。非ワクチン化馬から
の単離頻度は１３／９９（１３.１％）であった。

【００４６】Ｊ．血清学的評価ワクチン化及び誘発試験対する血清学的応答を、当技術
分野では公知のマイクロ血清中和法を使用して測定し
た。血清中和試験で使用したウイルスはＥＨＶ-１（Ｍ
ＳＵ）であった。この株系列は誘発試験で使用されたの
でこの場合にも選ばれた。

【００４７】血清中和力価は Reed 及び Muench の方法
を使用して計算した。この方法はウイルス及びリケッチ
ャ感染症の診断法(Diagnostic Procedures for Viral a
nd Rickettsial Infections)（１９６９年発行、Edwin
H. Lennette及びNatholie J.Schmidtによる第４編集
版）の４６ー５２頁に記載されている。

【００４８】血清中和試験力価の幾何平均値の要約を下
記に示す。

【００４９】

【表１】ワクチン化ワクチン化後３週間追加免疫誘発試験ワクチンワクチン化前後２週間 (追加免疫前) 後２週間後２週間Ｂ１１１１４９２６７２１１Ａ１０９２６９６１２７２Ｃ９９５７１５０２７７非ワクチン７５５５２００化対照統計処理は全て統計分析方式（ＳＡＳ）、即ちＳＡＳ協
会 (ＳＡＳＣｉｒｃｌｅ、Ｃａｒｙ、ＮＣ２７５１
２）から入手できる普通に使用されているコンピュータ
化統計用プログラムを使用して計算した。分散分析（Ａ
ＮＯＶＡ）法は研究中のいずれかの日に、４グループの
間で統計的に有意差があるかどうかを決定するのに使用
した。分散分析によって差が検知されたときは、その日
のデータをＴｕｋｅｙのＳｔｕｄｅｎｔ方式テスト(い
わゆるｔ−検定）によりグループ間に有意差があるかど
うかを決定した。有意性は９５％信頼度で検定した(ｐ
≦０.０５)。

【００５０】結果の考察これらのデータはワクチンそれぞれが保護作用を有して
いるが、その中でワクチンＢが他の２つのワクチンより
も優れた保護作用を有していることを示している。

【００５１】ＥＨＶ-１(ＭＳＵ)で誘発試験をすると、
誘発試験の次の日に体温が上昇し、それが僅か２日又は
３日間と短期間ではあるが継続した。これがこの誘発試
験の場合の問題である。しかし、誘発試験後２日目に、
ワクチンＢでワクチン化したグループでは、その平均温
度が、非ワクチン化対照グループよりも有意に低かっ
た。表３は、ワクチンＡ及びＣでワクチン化した馬の平
均温度も対照グループより低かったことを示している。
事実、ワクチンＡでワクチン化したグループはワクチン
Ｂでワクチン化したグループと同じ量の温度上昇を示し
た（即ち温度上昇は少なかった）。ワクチンＡグループ
では分散がより大きかったために、対照グループからの
差が統計的に有意とならなかったのである。

【００５２】この研究で鼻の分泌物は非常に少ないこと
が観察された。グループ間の差は小さいように見える
が、分泌が非常に多いと判断されたただ１頭の馬は、非
ワクチン化対照グループの馬であった。非ワクチン化対
照グループと３つのワクチン化グループとの差は統計的
に有意であった。

【００５３】バッフィコート調製物からのウイルス単離
頻度は低かった（誘発試験後でのウイルス単離頻度：
３.７％）。単離頻度のグループ間差は少なかった。ワ
クチンＢ、ワクチンＡ、ワクチンＣでワクチン化した各
グループ及び非ワクチン化対照グループの分離頻度はそ
れぞれ、３.２％、２.３％、７.３％及び４.０％であっ
た。

【００５４】白血球の平均低下は、ワクチンＢでワクチ
ン化した馬のグループと非ワクチン化動物との間に有意
差があった。上に示したように、誘発試験後５日目、ワ
クチンＢでワクチン化した馬での白血球減少が対照グル
ープよりも有意に低かった（ｐ≦０.０５）。白血球減
少でのこの差が統計的に有意であったのは１日だけであ
ったが、表４は誘発試験３日後から７日迄の間、ワクチ
ンＢでワクチン化した馬が対照動物の場合よりも白血球
減少が一様に少なかったことを示している。

【００５５】ワクチン化動物と対照動物との最も印象的
な差の一つは鼻分泌物から出たウイルスであった。ウイ
ルスは対照動物９頭中の８頭から単離され、一方ワクチ
ンＢでワクチン化した動物２０頭のうち僅か２頭から単
離されただけであった。ウイルスは２頭のワクチン化動
物のそれぞれから１日だけ単離され、従って、このワク
チン化グループからウイルスが出た平均日数は０.１日
であった。対照グループからウイルスが出た平均日数は
１.４日（１３／９）であった。下記の表はウイルス単
離頻度をリストにまとめ、そしてワクチン化グループそ
れぞれを非ワクチン化対照グループと比較してウイルス
が出現減少率を％で表したものである。

【００５６】

【表２】グループ出現頻度減少率* （単離回数／試行回数）Ｂ２／２２０（０.９％）９３％Ａ６／２２０（２.７％）７９％Ｃ３／１１０（２.７％）７９％非ワクチン化１３／９９（１３.１％）注＊

【００５７】

【数１】減少率＝（１３.１ − Ｐ）／１３.１ｘ１００式中Ｐは各ワクチン化グループでウイルス単離を試み
た回数に対する、ウイルスが単離された回数の百分率
（％）これらの馬について血清中和試験を実施した結果、１）非ワクチン化対照グループの力価は誘発試験後まで
低いままであった。これは対照グループの馬が誘発試験
の前に生きたＥＨＶにさらされなかったことを示してい
る。

【００５８】２）追加免疫を実施したがその結果力価が
増加したようには見えなかった。これは追加免疫を初め
の免疫化のすぐ後に加えた為かもしれない。

【００５９】ということが示された。

【００６０】

【表３】表１ＥＨＶウイルスのＴＣＩＤ₅₀力価ウイルス細胞系列ＴＣＩＤ₅₀力価／ｍｌＤＡ-８（非ワクチン化）Ｅ.Ｄ. １０^6.0 (１０Ｘ）１０^6.8 ＤＡ-３５ (非ワクチン化）Ｅ.Ｄ. １０^7.0 （１０Ｘ）１０^8.2 ＥＨＶ-４（非ワクチン化）Ｅ.Ｄ. １０^5.9 （１０Ｘ）１０^7.0

【００６１】

【表４】表２ＥＨＶワクチン１回投与分当りの各成分の容量 EHV-1 EHV-4 EHV-1 EHV-1 EHV-4 ワクチン名 (DA-35) (DA-8) (DA-35) 投与合計濃縮物濃縮物濃縮物容量Ｃ 0.67 0.67 0.67 2.0 Ｂ 1.34 0.67 2.0 Ａ 1.34 0.67 2.0

【００６２】

【表５】

【００６３】

【表６】

【００６４】本発明を説明する為に上記に詳しく述べた
が、これらの記述は単に説明を目的としたものであり、
本発明は本発明の精神及び範囲から離れることなく、た
だ本発明の特許請求の範囲によって制限され得ることは
あっても、当技術分野の熟達者によっていろいろと変化
させ得るものであると理解されたい。

【００６５】本発明の主なる特徴及び態様は下記のよう
である。

【００６６】１．ウマ鼻肺炎用ワクチンにおいてａ）不活化ウマヘルペスウイルス１型、ｂ）不活化ヘルペスウイルス４型、及びｃ）アジュバントからなり、そしてａ）とｂ）との重量比が約４：１ない
し約１：１であることを特徴とするウマ鼻肺炎用ワクチ
ン。

【００６７】２．上記第１項においてａ）とｂ）の比が
約３：１ないし２：１であることを特徴とするワクチ
ン。

【００６８】３．上記第１項においてａ）とｂ）の比が
約２：１であることを特徴とするワクチン。

【００６９】４．上記第１項のワクチンにおいて、ウマ
ヘルペスウイルス１型をβ-プロピオラクトンで不活化
したことを特徴とするワクチン。

【００７０】５．上記第４項のワクチンにおいて、ウマ
ヘルペスウイルス４型をβープロピオラクトンで不活化
したことを特徴とするワクチン。

【００７１】６．上記第５項のワクチンにおいて、アジ
ュバントが水溶性ビニールポリマーを基体としたアジュ
バントであることを特徴とするワクチン。

【００７２】７．上記第１項記載のワクチンにおいて、
ウマヘルペスウイルス４型をβ-プロピオラクトンで不
活化したことを特徴とするワクチン。

【００７３】８．上記第１項記載のワクチンにおいて、
アジュバントがＨａｖｌｏｇｅｎ、即ち１種のＣａｒｂ
ｏｐｏｌポリアクリル酸を基体としたアジュバントであ
ることを特徴とするワクチン。

【００７４】９．上記第１項記載のワクチンにおいて、
ヘルペスウイルス１型がワクチン化誘発試験で、ハムス
ター及び馬の両方の保護効果を誘発することを特徴とす
るＥＨＶ亜類１型の株であるワクチン。

【００７５】１０．上記第１項記載のワクチンにおい
て、ヘルペスウイルス４型が公知の保護ワクチンと比較
して少なくとも１.０の相対効力を有することを特徴と
するＥＨＶ亜類２型の株であるワクチン。

【００７６】１１．上記第１項記載のワクチンを馬に対
して投与することを特徴とする、馬を呼吸性鼻肺炎から
保護する方法。

【００７７】１２．上記第１１項において、ワクチンを
馬の首に筋肉注射することを特徴とする投与法。

【００７８】１３．上記第１１項において、ワクチンを
少なくとも３週間の間隔を空けて２回分投与することを
特徴とする投与法。

【００７９】１４．上記第１１項において、ワクチンを
２ｍｌ量を２回投与することを特徴とする投与法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ネイサン・デイ・グリーンアメリカ合衆国カンザス州66224リーウツド・オーバーブルツクレイン15463 (72)発明者リチヤード・デイ・スミスアメリカ合衆国カンザス州66219レネクサ・トマシヨウレイン9310

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ウマ鼻肺炎用ワクチンにおいてａ）不活化ウマヘルペスウイルス１型、ｂ）不活化ヘルペスウイルス４型、及びｃ）アジュバントからなり、そしてａ）とｂ）との重量比が約４：１ない
し約１：１であることを特徴とするウマ鼻肺炎用ワクチ
ン。
【請求項２】請求項１記載のワクチンを馬に対して投
与することを特徴とする、馬を呼吸性鼻肺炎から保護す
る方法。