JPH05149948A - 炎症の検出方法 - Google Patents
炎症の検出方法Info
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Abstract
量を測定することによる該患者中の炎症の存在を検出す
る方法を提供することにある。 【構成】 患者の1種異常の体液試料中のcICAM-1 の量
を測定し、次いで該試料中のcICAM-1 の量を、該1種異
常の体液に対する正常な標準と比較する工程を含む、該
患者の炎症の検出方法。
Description
胞間付着分子-1(circulating intercellularadhesion m
olecule-1; cICAM-1)の量を測定することにより、該患
者における炎症の存在を検出する方法に関する。特に、
本発明は細胞間付着分子-1(ICAM-1)に特異的な抗体を使
用して該患者の体液中のcICAM-1 の量を測定することに
よる、該患者における炎症の存在を検出する方法に関す
る。
において、多重系(multiple lineages)の細胞上に発現
するシトキン誘発性付着分子である(例えば、ベイルス
ガード(Vejlsgaard)等のJ. Amer. Acad. Demtol., 198
9,20, p. 782およびソベル(Sobel) 等のAm. J. Patho
l., 1990, 136, p. 1309を参照のこと)。これは白血球
付着分子(LFA-1およびMac-1)および媒介物のCD18群、一
部には顆粒球浸潤、リンパ球媒介細胞毒性および細胞−
細胞相互作用を含む特異的な免疫応答の発現の少なくと
も2種に対するリガンドである(例えば、スプリンガー
(Springer), T.A.,Nature, 1990, 346, p. 425 を参照
のこと)。ICAM-1に対する抗体は内皮細胞への白血球の
付着、内皮を介する顆粒球の移動、マイトジェンおよび
抗原誘発性リンパ球増殖およびインビトロでの混合リン
パ球反応を阻害することが示されている(例えば、スミ
ス(Smith) 等のJ. Clin. Invest., 1987, 82, p. 813を
参照のこと)。インビボにおいて、ICAM-1に対する抗体
はラビットにおける好中球の炎症性肺臓への侵入、ヒト
以外の霊長類の腎臓および心臓の同種移植修復、および
抗原誘発性気道好酸球流入および気道の過度の応答性を
阻害する(例えば、バートン(Barton)等のJ. Immunol.,
1989, 143, p. 1278 を参照のこと)。構造的には、IC
AM-1は5つの免疫グロブリン−様ドメイン、単一のトラ
ンスメンブラン領域および短い細胞質テールを有する免
疫グロブリンスーパー遺伝子(supergene)群の一員であ
る(例えば、スタウントン(Staunton)等のCell, 1988,
52,p. 925を参照のこと)。ICAM-1は主なライノウイル
ス群に対するレセプタとして同定され、かつ細胞質テー
ルおよびトランスメンブラン領域をもたないICAM-1の遺
伝子操作された形態はインビトロでのライノウイルス感
染を阻害することが示されている。マーリン(Marlin)等
のNature, 1990, 344, p. 70(以下「マーリン等」と言
う)を参照のこと。この文献を本発明の参考文献とす
る。
体液中の循環ICAM-1(cICAM-1) の可溶性状態にある量を
測定することによる、該患者中の炎症の存在を検出する
方法を提供することにある。
上の体液試料中のcICAM-1 の量を測定し、次いで該試料
中のcICAM-1 の量を、該アッセイした1種以上の体液に
対する正常な標準値と比較する工程を含む、該患者の炎
症の検出方法に係わる。正常な量を越えて高いcICAM-1
の量は炎症の存在の指標となる。
1」または「cICAM-1 」とは、例えば血清、胆汁液、骨
液および羊水等を含む患者の体液中を循環する可溶性状
態のICAM-1を意味する。ICAM-1に結合する殆どのモノク
ロ−ナル抗体はcICAM-1 に結合する。更に、固定化cICA
M-1 はLFA-1 担持細胞に結合し、このことは遺伝的に操
作されたsICAM-1 (マーリン等)に構造的に類似するこ
とを立証している。cICAM-1 の見掛けの分子量はサイズ
排除クロマトグラフィーにより測定した値として、約15
0 kDである。マーリン等により調製された如きsICAM-1
は同様な見掛けの分子量を有する。体液中におけるcICA
M-1 の発見および患者の体液中におけるcICAM-1 のレベ
ルが正常な値よりも高いことが炎症の存在の指標となる
という観測は、本発明の方法において有用なアッセイの
基本である。ここで使用する「炎症」なる用語は特異的
防御システムの反応、および非特異的防御システムの反
応両者を包含することを意味する。ここで使用する用語
「特異的防御システム」とは、特異的な抗原の存在に対
して反応する免疫系の該当成分を言うものとする。炎症
は、該炎症が該特異的防御システムの反応により生じ、
該反応により媒介され、もしくは該反応と関連する場合
に、該特異的防御システムの応答の結果であるといわれ
る。該特異的防御システムの応答の結果生ずる炎症の例
は抗原、例えば風疹ウイルスに対する応答、自己免疫疾
患、例えばエリテマトーデス、リウマトイド関節炎、レ
イノルド症候群、多発性硬化症等、T-細胞により媒介さ
れる遅延型過敏性応答等を包含する。慢性的炎症性疾患
および移植臓器並びに組織に対する拒絶反応は、更に特
異的防御システムの炎症性反応の例である。
とは、免疫学的記憶の不可能な白血球により媒介される
反応を意味するものとする。このような細胞は顆粒球お
よびマクロファージを含む。ここで使用するように、炎
症は、該炎症が該非特異的防御系の反応により生じ、該
反応により媒介され、もしくは該反応と関連する場合
に、該非特異的防御システムの応答の結果として生ずる
といわれる。少なくとも部分的に該非特異的防御システ
ムの応答の結果として生ずる炎症の例は、状態、例えば
成人呼吸窮迫症候群(ARDS)または敗血症または外傷に対
する二次的な多重器官傷害症候群;心筋または他の組織
の再灌流傷害;急性糸球体腎炎;反応性関節炎症;急性
緩衝性成分を含む皮膚炎;急性化膿性髄膜炎または他の
中枢神経系炎症性疾患;熱的傷害;血液透析;白血球泳
動(leukophoresis);潰瘍性大腸炎;クローン病;壊死性
全腸炎;顆粒球輸液関連症候群;およびシトキン誘発性
毒性に関連する炎症を包含する。アッセイすべき体液の
選択は、主として検出すべき炎症の型に依存して変化す
るであろう。選択される体液は該当する炎症の部位と接
するまたは該部位で生成されるものであるべきである。
本発明の方法の目的にとって、該体液は実質的に細胞を
含まないものであるべきである。例えば、骨液中におけ
る炎症の存在(即ち、高いレベルのcICAM-1)はリウマト
イド関節炎の存在の指標となり得る。川崎病はこの疾病
に苦しめられた患者の血清中におけるcICAM-1 の高い濃
度をもたらす。肝臓の移植の進行を監視する際に、肝臓
移植を受けた患者の胆汁液中における高いcICAM-1 濃度
が該移植の拒絶反応の指標となる。受胎した女性の羊水
中の高いcICAM-1 濃度は問題のある妊娠の高い危険性の
指標となる。
イは患者中における炎症の存在を検出するためのイムノ
アッセイであり、該アッセイはa)該患者の1種以上の体
液の試料をICAM-1に結合できる第一の抗体およびICAM-1
に結合できる標識された第二の抗体と接触させる工程
と、b)該試料中のcICAM-1 の量の尺度として、結合した
該標識第二抗体の量を測定する工程と、c)該試料中のcI
CAM-1 の量を、アッセイした該1種以上の体液に対して
正常なcICAM-1 の標準量と比較する工程とを包含する。
好ましくは、該抗体はモノクロ−ナル抗体である。定量
可能な結果を与える任意のイムノアッセイが利用でき
る。これは単一部位または多重部位の競合並びに非競合
結合アッセイを包含する。好ましくは、使用する該イム
ノアッセイはサンドイッチアッセイであり、そこでは該
第一の抗体が固定化され、かつ標識された第二の抗体は
可溶性である。サンドイッチアッセイは、例えば米国特
許第4,376,110 号および同第4,244,940 号に記載されて
いる。本発明のより好ましい態様において、該イムノア
ッセイは以下の諸工程を含むサンドイッチアッセイであ
る。即ち、a)患者の1種以上の体液の試料を、該試料に
対して不溶性である、ICAM-1に結合できる固定化された
第一の抗体およびICAM-1に結合できる可溶性の標識され
た第二の抗体と接触させて、該標識された第二の抗体と
cICAM-1 と該固定化第一抗体との最終的な不溶性の錯体
を形成する工程と、b)該試料中のcICAM-1 の量の尺度と
して、該最終的な不溶性錯体と結合した該標識された第
二の抗体の量を測定する工程と、c)該試料中のcICAM-1
の量を、アッセイした該1種以上の体液に対する正常な
cICAM-1 の標準量と比較する工程を含む。
固体担体上に固定化される。該固体担体は公知のアッセ
イにおいて有用なあらゆる公知の担体材料、例えばセル
ロース、アガロース、セファロース、ポリスチレン、ナ
イロン、ポリアクリルアミド、ラテックス、ガラス、磁
化可能な粒子、ニトロセルロース等であり得る。好まし
くは、該固体担体はポリスチレンである。該抗体は、IC
AM-1に結合できる固定化抗体を生成し得る任意の方法、
例えば吸着または共有結合により該固体担体上に固定化
できる。このような固定化を達成する方法は当分野で周
知である。例えば、該抗体は以下の実施例1に記載する
ようにおよびエーリッヒ(Erlich)等のMethods in Enzym
ology, 1979, 68, p. 443 に記載されているようにマイ
クロタイタウエルに吸着させることができ、あるいはカ
ゲダル(Kagedal) 等のClinica Chimica Acta, 1977, 7
8, p. 103に記載されているように二官能性の試薬を使
用して固体担体上に固定化することができる。本発明の
方法において使用する固定化第一抗体の量はcICAM-1 の
検出量を結合するのに十分な量でなければならない。こ
の量は検出すべき炎症の種類、抗体、使用する標識等に
依存して変化し、かつ経験的に決定すべきである。一般
に、流体試料50μlにつき約1μg〜約10μgの該固体
担体上に固定化された第一抗体を使用することが好まし
い。
えば、酵素、螢光、放射性、生物発光性、親和性、化学
ルミネセンス、比色等の標識およびマーカー)により標
識できるが、該標識が該抗体のcICAM-1 に対する結合に
有害な影響を与えないことを条件とする。このような標
識を達成するための方法は当分野で周知である。例え
ば、実施例1に記載の手順を、本発明の目的のために抗
体をビオチンと結合する際に利用でき、またウッドヘッ
ド(Woodhead)等のClinical Chemistry, 1983, 29(8),
p. 1474に記載の如き方法を本発明の目的のために抗体
を標識するのに利用できる。本発明の方法で使用する標
識された第二の抗体の量は該標識第二抗体に結合された
該cICAM-1 の検出を可能とするのに十分な量である必要
がある。この量は主として使用した標識の型に依存して
変化し、かつ経験的に決定されるはずである。好ましく
は、該第二抗体はcICAM-1 の存在の指標となる色変化を
起こし得る標識を担持する。該標識された第二の抗体と
cICAM-1 と固体担体に結合した固定化第一抗体との最終
的な不溶性の錯体は3つのアッセイ手順、即ちそれぞれ
前アッセイ(forwardassay) 、逆アッセイ(reverse assa
y)および同時アッセイ(simultaneous assay)と呼ばれる
手順を利用して生成できる。該前アッセイにおいては、
該試料をまず適当な時間固定化した第一抗体と共にイン
キュベートして、第一の不溶性錯体を形成し、次いでか
くして形成した該第一の不溶性錯体を適当な時間可溶性
の標識した第二の抗体と共にインキュベートして、該最
終的な不溶性固体を形成する。該前アッセイにおいて、
該固定化第一抗体および該可溶性の標識第二抗体は2種
の異なる抗−ICAM-1抗体であるべきであり、これらは相
互のcICAM-1 分子に対する結合を妨害しない。
当な時間可溶性の標識された第二の抗体と共にインキュ
ベートして、可溶性の標識された第二の抗体とcICAM-1
との可溶性の錯体を形成する。かくして形成した可溶性
の錯体を、次に適当な時間固定化された第一の抗体と共
にインキュベートして、該最終的な錯体を形成する。こ
の逆アッセイにおいて、該可溶性の標識された第二の抗
体および該固定化された第一の抗体は2種の異なる抗−
ICAM-1抗体であるべきであり、これらは相互のcICAM-1
分子に対する結合を妨害しない。該同時アッセイにおい
ては、該試料を同時に固定化した第一の抗体および可溶
性の標識された第二の抗体と共にインキュベートして、
該最終的な錯体を形成する。この同時アッセイにおい
て、該固定化した第一の抗体および可溶性の標識された
第二の抗体は2種の異なる抗−ICAM-1抗体であるべきで
あり、これらは相互のcICAM-1 分子に対する結合を妨害
しない。該前、逆および同時アッセイの工程各々に対す
るインキュベーション条件は時間、温度、および最終の
インキュベーション体積に依存して変化するが、好まし
くは各インキュベーション工程は少なくとも15分間、よ
り好ましくは30分またはそれ以上、室温以上の温度で、
より好ましくは37°C で実施すべきである。このインキ
ュベーションの後、該最終的な錯体を該インキュベーシ
ョン用媒体(即ち、試料、未結合の可溶性標識第二抗体
等)から分離する。この最終的な不溶性の錯体は該イン
キュベーション用媒体に対して不溶性であるので、公知
の手段により該インキュベーション用媒体から分離でき
る。
に結合した該cICAM-1 の存在と直接関連ずけられる。該
最終的な不溶性錯体と結合した標識の量は少なくとも2
つの方法:即ち(1) 該最終的な不溶性錯体と結合した該
標識の直接的定量または(2)分離後の該インキュベーシ
ョン用媒体中に残存する該標識の直接的定量およびこれ
に引き続き行われる使用した全標識量からの該測定され
た標識量の引算により決定できる。妥当な定量手順は使
用した該標識に大きく依存する。本発明の方法において
有用な該抗−ICAM-1抗体はポリクローナル、モノクロ−
ナルまたは組み換え手法により生成されたものであり得
る。該抗−ICAM-1抗体の調製のために有用な技術は当分
野で周知である。例えば、ケーラー&ミルシュタイン(K
ohler and Milstein) のNature, 1975, 356, p.495;米
国特許第4,816,567 号;ロスレイン(Rothlein)等の上記
文献および欧州特許出願第289,949 号を参照のこと。他
のICAM-1用のリガンド、例えばLFA-1 も患者の体液中の
cICAM-1 の検出並びに測定に利用できる。
である。実施例1 :ヒト血清中のcICAM-1 の検出 10人の正常な個体からの血清を白血球付着不全(LAD) に
罹患した4人の患者からの血清および川崎病に罹患した
12人の患者からの血清と比較して、血清試料中に検出可
能なcICAM-1 の量が存在するか否かを決定した。 A. 生化学的製剤の調製 可溶性ICAM-1(sICAM-1) をマーリン等に記載の如く調製
した。即ち、1%ウシ血清(シグマ社、セントルイス、M
O)ドゥルベコ燐酸緩衝塩水(メディアテック(Media Te
ch)、ワシントン、DC)(BSA-dPBS)で逐次希釈し、かつ
アリコートを-70°C で凍結した。正常なヒト血液由来
の血清を静脈穿刺により薬物が投与されていないドナー
(10)から滅菌ファクテイナー(Vacuutainers)に採取し
た。血液は、血清の収集前に少なくとも1/2時間凝固さ
せた。白血球付着不全症患者(4) からの血清はベイラー
(Baylor)大学(ヒューストン、TX)のDr. ドナルドアン
ダーソン(Donald Anderson) から入手した。川崎病患者
(12)からの血清は血液研究センター(the Center for Bl
ood Research, Inc)、ボストンMAのDr. ジェインニュー
バーガー(JaneNeuberger)およびDr. フレッドローセン
(Fred Rosen)から入手した。
R6.5はロスレイン(Rothlein)等のJ. Immunol., 1986, 1
37, p. 1270 および欧州特許出願第289,949 号に記載の
如く調製した。ICAM-1のドメイン4に対する抗体CL203.
4 はニューヨークメディカルカレッジ(New York Medica
l Callege)、バルハラ、NYのDr. ソルダノフェロン(Sol
dano Ferrone)により提供された。ICAM-1のドメイン5
に対する抗体CA7 は以下の如く調製した。即ち、BALB/C
マウスを0.2 mlの完全フロインドアジュバント:塩水
(1:1エマルション)に分散した150 μgのsICAM-1 で皮
下投与により76日前に免疫し、45日前に0.2 mlの不完全
フロインドアジュバント:塩水(1:1エマルション)に分
散した100 μgのsICAM-1 で免疫した。4および3日前
に、該マウスを更に150 μgのsICAM-1 を腹腔内投与し
て免疫した。細胞融合は、該免疫したマウスの脾臓細胞
とP3x63Ag8.658ミエローマ細胞との間で、ロスレイン等
のJ. Immunol., 1986, 139, p. 1270 に記載のプロトコ
ールを利用して実施した。得られたハイブリド−マ抗体
をELISA法により、プレート上のsICAM-1 に対する結合
能についてスクリーニングした。選別されたハイブリド
−マを2度サブクローニングした。CA7 は、血液研究セ
ンター、ボストンMAのDr. ドナルドシュタウントン(Don
ald Staunton) およびDr.チモシースプリンガー(Timoth
y Springer)から入手したICAM-1欠落変異体の種々の構
築体とトランスフェクションしたCOS 細胞の細胞遠心処
方物のイムノペルオキシダーゼ染色によりICAM-1のドメ
イン5に結合するものとして決定した。抗−LFA-1 (抗
−CD11a)抗体R3.1はスミス(Smith) 等のJ. Clin. Inves
t. 1988, 82, p. 1746に記載の如く調製した。抗体をゲ
スドン(Guesdon) 等のJ. Histochem. Cytochem., 1979,
27, p. 1113に記載のようにしてビオチンに結合させ
た。
ロタイタープレート(リンブロ(Linbro))の各ウエルに5
0μl/ウエルの量で添加し、室温にて1時間保った。
次いで、ウエルをDPBSで3回洗浄し、次に2% BSA-DPBS
200 μlにより37°C にて1時間遮断した。次いで、ウ
エルを急速に振って空にし、sICAM-1 標準(8〜1024ng
/ml)および血清試料の滴定物(1%BSA-DPBS中で滴定)を
添加(50μl/ウエル)し、各3例を37°C にて1時間
保った。次いで、ウエルを3回DPBSで洗浄した。次に、
ビオチン付加したR6.5を2μg/ml(50 μl/ウエル)の量
で各ウエルに添加し、37°C にて30分間維持した。次い
で、ウエルを3回DPBSで洗浄した。次いで、50μl/ウ
エルの量のホースラディッシュペルオキシダーゼストレ
プタビジン(ジメッド(Zymed) 、サンフランシスコ、CA
(1:4000)を各ウエルに添加して、37°C にて30分間維持
し、3回DPBSで洗浄し、基質緩衝液(ジメッド)で1回
洗浄した。次に、基質緩衝液中の50μl/ウエルの2,2-
アジノ- ジ-(3-エチルベンゾチアゾリン)-スルフォン酸
(ABTS;ジメッド)を添加した。次いで、該プレートを、
最大のODの読みが得られるまで、ダイナテックマイクロ
タイターELISA リーダー(Dynatech Microtiter ELISA r
eader)(410nm) によりODを読み取った。ODの読みの平均
値を算出し、該sICAM-1 の滴定により得られた回帰曲線
からcICAM-1 濃度を計算した。正常なヒト由来の血清お
よびLAD 患者由来の血清に対するこのELISA から得た結
果を以下の表1に示す。
D 患者由来の血清および川崎病患者の血清中の、該ELIS
A 法を利用して得られたcICAM-1 の濃度をグラフで示し
たものである。これらの結果はcICAM-1 が血清中に存在
し、しかもドメイン4にCL203.4 により認識される機能
性エピトープおよびドメイン2にR6.5により認識される
機能性エピトープを保持していることを示す。
タイタープレート(リンブロ(Linbro)) の各ウエルに添
加し、室温にて1時間保った。次いで、ウエルをDPBSで
3回洗浄し、次に2% BSA-DPBS 200 μlにより37°C に
て1時間遮断した。100 μlの正常なヒト血清または1%
BSA-DPBS中の100 ngのsICAM-1 を各ウエルに添加し、37
°C にて1時間インキュベートした。次いで、ウエルを
DPBSで3回洗浄した。50μg/mlのゲンタマイシン、1mM
のL-グルタミンおよび10% の熱で不活性化した子牛血清
(ギブコ;完全培地)を補充したRPMI-1640(ギブコ(Gib
co) 、グライドアイランド、NY)、R6.5(100μg/ml)、
またはCL203.4(100 μg/ml)50μlを適当なウエルに添
加した。完全培地中のSKW-3 細胞(ヒトT-リンパ球細胞
(スローン−ケッタリングウァランス(Sloan-Kettering
Wallance)、スローン−ケッタリングメモリアル(Sloan
-Kettering Memorial)、ライエ、NY)(2x106細胞/ml の
50μl)を次に各ウエルに添加し、37°C にて30分間イ
ンキュベートした。非接着性細胞をRPMI-1640 で穏やか
に洗い流した。接着細胞の数を以下の如くMTT(3-〔4,5-
ジメチルチアゾール-2- イル〕-22,5-ジフェニル−テト
ラゾリウムブロミド:チアゾールブルー;シグマ社)の
ミトコンドリア還元により決定した。即ち、該接着細胞
を100 μlの完全培地および20μlのMTT(5 mg/ml)と共
に37°C にて3時間インキュベートした。このように形
成された還元MTT 結晶を0.1N HCl中の1%トライトン(Tri
ton)-X100 (バイオラド(Biorad)、リッチモンド、CA)
60μl/ウエルに可溶化した。プレートをマイクロ波処理
して該MTT沈澱を穏やかに加熱した。10μlのエタノー
ルを添加して、あらゆる洗浄剤の泡を除去した。次い
で、該ウエルのODをダイナテックマイクロタイターELIS
A リーダーにより、570 nmにて測定した。同じ手順を利
用して、上記のアッセイを繰り返した。但し、(1) 該ウ
エルにはsICAM-1 もヒト血清も添加せず、(2) 該ウエル
はまずCA7 に代えてR6.5と共にインキュベートし、また
は(3) 該ウエルはまずCA7 に代えてBSA と共にインキュ
ベートした。このアッセイの結果は以下の表2にまとめ
た。
としてのCA7 の使用はSKW-3 接着を何等示さない。
LFA-1 依存性接着を媒介する能力を保持することを立証
している。SKW-3細胞の結合は、ICAM-1(R6.5)のドメイ
ン1および2に結合する抗−LFA-1 抗体(R3.1)および該
抗−ICAM-1抗体両者により阻害された。これらの結果は
cICAM-1 がドメイン1、2および5の機能性エピトープ
を保持していることを示す。
以下の如き臨床群から得た。(1) 妊娠16週目に、高い母
体年齢に関連する遺伝的評価を実施するために、羊水穿
刺により得た試料(39)、(2) 羊水液中のα−フェトタン
パクの高い濃度に従う遺伝的評価を実施するために、羊
水穿刺により得た試料(21)、(3) 妊娠37週以前の、肺成
熟期または帝王切開分娩における羊水穿刺により得た試
料(12)、(4) 出産期における分娩を伴う帝王切開により
得たまたは胎児監視電極の設置時点における経子宮頚の
カテーテル法により得た試料(10)。母体血清のα−フェ
トタンパクの濃度は放射性免疫法により測定した。評価
された値は妊娠年齢の>2.0倍数として定義され、かつ母
体の体重および人種に対する補正として使用した。母体
血清のα−フェトタンパクの濃度が高かった全ての場合
において、羊水のα−フェトタンパクの濃度は正常であ
った。 B. モノクロ−ナル抗体の調製 モノクロ−ナル抗体は実施例1Bに記載の如く調製した。 C. ELISA 実施例1Cに記載したものと同様なアッセイを利用した
が、羊水試料を血清試料の代わりに使用した。このELIS
A の結果を以下の表3に記載する。
種々の妊娠期および条件において存在する羊水中のcICA
M-1 の平均濃度をグラフで示した図である。これらのデ
ータは出産期の分娩前の羊水中におけるcICAM-1 の正常
な濃度を越える濃度が異常妊娠の可能性の指標となるこ
とを示している。
の検出 A. 生物学的物質の調製 sICAM-1 は実施例1Aに記載の如く調製した。リウマトイ
ド関節炎に罹患した患者由来の骨液(8) 、骨関節炎に罹
患した患者由来の骨液(4) 、乾癬性関節炎に罹患した患
者の骨液(1) 、痛風性関節炎に罹患した患者由来の骨液
(1) 、軟骨石灰化症患者由来の骨液(1) を関節鏡検査法
により採取した。 B. モノクロ−ナル抗体の調製 モノクロ−ナル抗体は実施例1Bに記載の如く調製した。 C. ELISA 血清試料に代えて骨液の試料を使用して、cICAM-1 の濃
度を実施例1Cに記載のELISA を利用して測定した。この
アッセイの結果は図4にグラフで示した。炎症を伴うリ
ウマトイド関節炎に罹患した患者由来の試料は高い濃度
のcICAM-1 を含み、一方で炎症を伴わない骨関節炎患者
由来の試料は高濃度のcICAM-1 を含んでいなかった。
M-1 の濃度 A. 生物学的物質の調製 sICAM-1 は実施例1Aに記載の如く調製した。アダムズ(A
dams) 等のThe Lancet, 1989, 3月4日、pp. 469-471
に記載の如く、肝臓移植に対して拒絶反応を示す該移植
患者由来の胆汁液および血漿の試料(14)、該移植後合併
症を患うもの(7) および該移植後安定であるもの(10)を
肝臓の移植後2〜15日に渡り毎日採取した。 B. モノクロ−ナル抗体の調製 モノクロ−ナル抗体は実施例1Bに記載の如く調製した。 C. ELISA 血清試料に代えて胆汁の試料を使用して、cICAM-1 の濃
度を実施例1Cに記載のELISA を利用して測定した。図5
は、移植後15日間に渡る、該移植に対して拒絶反応を示
した患者の胆汁および血漿試料並びに拒絶反応を示さな
い患者の胆汁および血漿試料中のcICAM-1の濃度を図示
したものである。付随的な免疫抑制治療は移植の11日後
に開始し、該治療は該拒絶反応を示した患者におけるcI
CAM-1 の濃度の低下をもたらした。図6は、拒絶反応の
診断時点で移植した肝臓に対して拒絶反応を示した患者
の該試料中における測定されたcICAM-1 の濃度、該移植
に伴う合併症を被った患者の試料中における測定された
cICAM-1 の濃度および安定な患者の試料におけるcICAM-
1 の濃度を示す。1試料の例外を除き、該移植した肝臓
に対して拒絶反応を示した患者の試料全てが高濃度のcI
CAM-1 を含んでいた。安定な(拒絶反応を起こさなかっ
た)患者由来の試料は正常な濃度のcICAM-1 を含んでい
た。
の血清中のcICAM-1 の検出 A. 生物学的物質の調製 sICAM-1 は実施例1Aに記載の如く調製した。血清を、段
階(Stage) I(14)、II(24)およびIII(18)の皮膚悪性黒
色腫であると確認された患者および正常な個体(12)から
得た。段階Iの疾病は血清の採取時点で臨床的に観察可
能な転移性疾病をもたない初期的病巣の存在として定義
され、段階IIの疾病は局所リンパ節への転移、局所リン
パ節を包含するもしくは包含しない局所的再発、あるい
は認識可能な初期病巣をもたない単一のリンパ節群にお
ける黒色腫の初期的発現として定義され、段階III の疾
病は遠隔位の皮膚、皮下または内蔵への転移があるもの
と定義された。生存率は月単位で測定し、診断から評価
または死亡の日までの時間として定義した。 B. モノクロ−ナル抗体の調製 モノクロ−ナル抗体は実施例1Bに記載の如く調製した。 C. ELISA 血清試料中のcICAM-1 濃度を実施例1Cに記載のELISAを
利用して測定した。このアッセイの結果を以下の表5に
示した。
>288.0 ng/ml 。 3:対照または段階IIの患者と比較した場合、p < 0.00
1。 4:対照と比較した場合、p < 0.01。
> 288.0 ng/ml であり、「正常」な患者の血清cICAM-1
のレベルは < 288.0 ng/mlである。 2: 月で表示。 3: 段階IIの「高い患者」と比較した場合、p < 0.01。 4: 段階III の「高い患者」と比較した場合、p < 0.0
5。
III の黒色腫患者において有意に高く、段階IIの患者に
おいては著しく高い。cICAM-1 の異常に高い血清中のレ
ベルは段階Iの93% 、段階IIの25% および段階III の60
% に存在するが、正常な個体には見られなかった。最も
軽度の腫瘍であると思われる段階Iの患者はcICAM-1 の
有意の増大レベル(p < 0.001) および高いレベルのcICA
M-1 の発生率(93%) 両者を示した。すべての黒色腫患者
は血清cICAM-1 の異常に高いレベルを示した。cICAM-1
の高いレベルを有する段階IIの黒色腫患者は、正常なレ
ベルのcICAM-1 を有する患者と比較した場合に、平均生
存率の大幅な減少を示した。平均生存率は、また異常に
高いcICAM-1 のレベルを有する段階III の患者において
も減少した。
抗体およびICAM-1のドメイン1に対する標識した抗−IC
AM-1抗体を使用した、ICAM-1に対するサンドイッチアッ
セイを模式的に示した図である。
病患者由来の血清中のcICAM-1のレベルをグラフで示し
た図である。
切開により早期分娩した妊婦、出生期に帝王切開により
分娩した妊婦および出産期に自然分娩した妊婦の羊水中
のcICAM-1 レベルをグラフで示した図である。
性関節炎、痛風性関節炎、および軟骨石灰化症患者の骨
液中のcICAM-1 レベルをグラフで示した図である。
絶反応を示した患者および拒絶反応を示さない患者の胆
汁および血漿中のcICAM-1 レベルをグラフで示した図で
ある。
症を起こした患者および安定な患者の胆汁中のcICAM-1
レベルをグラフで示した図である。
Claims (13)
- 【請求項1】 患者の1種以上の体液試料中のcICAM-1
の量を測定し、次いで該試料中のcICAM-1 の量を、該1
種以上の体液に対する正常な標準と比較する工程を含
む、該患者の炎症の検出方法。 - 【請求項2】 以下の諸工程: a) 該患者の1種以上の体液試料をICAM-1に結合できる
第一の抗体およびICAM-1に結合できる標識された第二の
抗体と接触させ、 b) 該試料中のcICAM-1 の量の尺度として、結合した該
標識された第二の抗体の量を測定し、および c) 該試料中のcICAM-1 の量を、アッセイした該1種以
上の体液に対する正常なcICAM-1 の標準量と比較する、 を含む請求項1記載の方法。 - 【請求項3】 該第一の抗体および該標識された第二の
抗体がモノクロ−ナル抗体である請求項2記載の方法。 - 【請求項4】 該第一の抗体が固定化されており、かつ
該標識された第二の抗体が可溶性である請求項3記載の
方法。 - 【請求項5】 以下の諸工程: a) 該患者の1種以上の体液試料を、該試料に対して不
溶性である、ICAM-1に結合できる固定化された第一の抗
体と接触させて、cICAM-1 と該固定化第一抗体との第一
の不溶性錯体を形成し、 b) 該第一の不溶性錯体を、ICAM-1に結合できる可溶性
の標識された第二の抗体と共にインキュベートして、該
標識された第二の抗体、cICAM-1 および該固定化第一抗
体の最終的な不溶性の錯体を形成し、 c) 該最終的な不溶性錯体を該試料およびあらゆる未反
応の可溶性の標識された第二の抗体から分離し、 d) 該試料中のcICAM-1 の量の尺度として、該最終的な
不溶性錯体と結合した標識の量または未反応標識の量を
測定し、および e) 該試料中のcICAM-1 の量を、該1種以上の体液に対
する正常なcICAM-1 の標準量と比較する、 を含む請求項1〜4の何れか1項に記載の方法。 - 【請求項6】 以下の諸工程: a) 該患者の1種以上の体液試料を、ICAM-1に結合でき
る可溶性の標識された第二の抗体と共にインキュベート
して、cICAM-1 と該可溶性の標識された第二の抗体との
可溶性錯体を形成し、 b) 上記工程a)の可溶溶性錯体を、該試料に対して不溶
性の、ICAM-1に結合できる固定化された第一の抗体と共
にインキュベートして、該標識された第二の抗体、cICA
M-1 および該固定化第一抗体の最終的な不溶性錯体を形
成し、 c) 該最終的な不溶性錯体を該試料およびあらゆる未反
応の可溶性の標識された第二の抗体から分離し、 d) 該試料中のcICAM-1 の量の尺度として、該最終的な
不溶性錯体と結合した標識の量または未反応標識の量を
測定し、および e) 該試料中のcICAM-1 の量を、該1種以上の体液に対
する正常なcICAM-1 の標準量と比較する、 を含む請求項1〜4の何れか1項に記載の方法。 - 【請求項7】 以下の諸工程: a) 該患者の1種以上の体液試料を、(i) 該試料に対し
て不溶性の、ICAM-1に結合できる固定化された第一の抗
体および(ii)ICAM-1に結合できる可溶性の標識された第
二の抗体と共にインキュベートして、該標識された第二
の抗体、cICAM-1 および該固定化第一抗体の最終的な不
溶性錯体を形成し、 b) 該最終的な不溶性錯体を該試料およびあらゆる未反
応の可溶性の標識された第二の抗体から分離し、 c) 該試料中のcICAM-1 の量の尺度として、該最終的な
不溶性錯体と結合した標識の量または未反応標識の量を
測定し、および d) 該試料中のcICAM-1 の量を、該1種以上の体液に対
する正常なcICAM-1 の標準量と比較する、 を含む請求項1〜4の何れか1項に記載の方法。 - 【請求項8】 該固定化第一抗体が固体担体上に固定化
されている請求項5〜7の何れか1項に記載の方法。 - 【請求項9】 該1種以上の体液が血清、胆汁、羊水、
骨液または血漿である上記請求項の何れか1項に記載の
方法。 - 【請求項10】 a) 受胎した女性由来の羊水または血清
の試料を、該試料に対して不溶性である、ICAM-1に結合
できる固定化された第一の抗体と接触させて、cICAM-1
と該固定化第一抗体との第一の不溶性錯体を形成し、 b) 該第一の不溶性錯体を、可溶性の標識された第二の
抗体と接触させて、該標識された第二の抗体、cICAM-1
および該固定化第一抗体の最終的な不溶性錯体を形成
し、 c) 該最終的な不溶性錯体を、該試料およびあらゆる未
反応の可溶性の標識された第二の抗体から分離し、 d) 該試料中のcICAM-1 の量の尺度として、該最終的な
不溶性錯体と結合した標識の量または未反応標識の量を
測定し、および e) 該試料中のcICAM-1 の量を、該受胎した女性の妊娠
の該当する段階の羊水または血清に対する正常なcICAM-
1 の標準量と比較する、 諸工程を含む受胎した女性の病的妊娠を検出する方法。 - 【請求項11】 リウマトイド間接炎に罹患したものと思
われる患者のリウマトイド関節炎の存在を検出する方法
であって、 a) 該患者の骨液試料を、該試料に対して不溶性であ
る、ICAM-1に結合できる固定化された第一の抗体と接触
させて、cICAM-1 と該固定化第一抗体との第一の不溶性
錯体を形成し、 b) 該第一の不溶性の錯体を、可溶性の標識された第二
の抗体と接触させて、該標識された第二の抗体、cICAM-
1 および該固定化第一抗体の最終的な不溶性錯体を形成
し、 c) 該最終的な不溶性錯体を、該試料およびあらゆる未
反応の可溶性の標識された第二の抗体から分離し、 d) 該試料中のcICAM-1 の量の尺度として、該最終的な
不溶性錯体と結合した標識の量または未反応標識の量を
測定し、および e) 該試料中のcICAM-1 の量を、骨液に対する正常なcI
CAM-1 の標準量と比較する、 諸工程を含む上記方法。 - 【請求項12】 患者の器官移植または組織移植に対する
拒絶反応の存在を検出する方法であって、 a) 該移植器官または組織と接触するもしくはこれによ
り生成される1種以上の試料を、該試料に対して不溶性
であり、ICAM-1に結合できる固定化された第一の抗体と
接触させて、cICAM-1 と該固定化第一抗体との第一の不
溶性錯体を形成し、 b) 該第一の不溶性の錯体を、可溶性の標識された第二
の抗体と接触させて、該標識された第二の抗体、cICAM-
1 および該固定化第一抗体の最終的な不溶性錯体を形成
し、 c) 該最終的な不溶性錯体を、該試料およびあらゆる未
反応の可溶性の標識された第二の抗体から分離し、 d) 該試料中のcICAM-1 の量の尺度として、該最終的な
不溶性錯体と結合した標識の量または未反応標識の量を
測定し、および e) 該試料中のcICAM-1 の量を、該1種以上の体液に対
する正常なcICAM-1 の標準量と比較する、 諸工程を含む上記方法。 - 【請求項13】 該移植器官または組織が肝臓であり、か
つ該体液が胆汁液であるか、または該移植器官または組
織が心臓であり、かつ該体液が血漿である、請求項12記
載の方法。
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