JPH05103677A - ヒト細胞質ゾルホスホリパーゼａ２を発現させるための化合物、ベクターおよび方法 - Google Patents
ヒト細胞質ゾルホスホリパーゼａ２を発現させるための化合物、ベクターおよび方法Info
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- JPH05103677A JPH05103677A JP4090788A JP9078892A JPH05103677A JP H05103677 A JPH05103677 A JP H05103677A JP 4090788 A JP4090788 A JP 4090788A JP 9078892 A JP9078892 A JP 9078892A JP H05103677 A JPH05103677 A JP H05103677A
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- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
- C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 細胞質ゾルホスホリパーゼＡ2(cＰＬＡ2)を
コードしている遺伝子、cＰＬＡ2を発現させるのに有用
なベクターおよび宿主細胞ならびにcＰＬＡ2を発現させ
るための方法が提供される。さらに、化合物をスクリー
ニングしてcＰＬＡ2の阻害物質を同定するための方法が
提供される。 【効果】 レセプター媒介のcＰＬＡ2活性を特異的な阻
害物質によって調節することに基づいて、喘息、虚血、
関節炎、敗血性発作および皮膚の炎症疾患のための新し
い治療法を導くことができる。特定の疾患状態に関連す
るcＰＬＡ2活性の不活性化法または特異的な阻害法は医
学界において大きな用途を有する。
コードしている遺伝子、cＰＬＡ2を発現させるのに有用
なベクターおよび宿主細胞ならびにcＰＬＡ2を発現させ
るための方法が提供される。さらに、化合物をスクリー
ニングしてcＰＬＡ2の阻害物質を同定するための方法が
提供される。 【効果】 レセプター媒介のcＰＬＡ2活性を特異的な阻
害物質によって調節することに基づいて、喘息、虚血、
関節炎、敗血性発作および皮膚の炎症疾患のための新し
い治療法を導くことができる。特定の疾患状態に関連す
るcＰＬＡ2活性の不活性化法または特異的な阻害法は医
学界において大きな用途を有する。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は分子生物学の全般的な分
野に属するものであり、極めて希少なヒト細胞質ゾルホ
スホリパーゼＡ2(cＰＬＡ2)酵素を発現させるために有
用な組換えＤＮＡ化合物、ベクターおよび方法を包含す
る。さらに、本発明は化合物をスクリーニングしてcＰ
ＬＡ2の阻害物質を同定するための方法を包含する。
野に属するものであり、極めて希少なヒト細胞質ゾルホ
スホリパーゼＡ2(cＰＬＡ2)酵素を発現させるために有
用な組換えＤＮＡ化合物、ベクターおよび方法を包含す
る。さらに、本発明は化合物をスクリーニングしてcＰ
ＬＡ2の阻害物質を同定するための方法を包含する。
【０００２】
【従来の技術】本発明前には、多量のcＰＬＡ2を得るた
めの容易な方法は存在しなかった。ヒトcＰＬＡ2および
精製法は米国特許出願番号０７／５７３,５１３に記載
されている。cＰＬＡ2と反応する抗体およびcＰＬＡ2を
単離および同定するための方法は米国特許出願番号０７
／６６３,３３５に記載されている。cＰＬＡ2はそれを
天然に含有する細胞の細胞質において希少であるため、
これらの方法によると最大でも限られた量のcＰＬＡ2し
か得ることができない。cＰＬＡ2の極めてまれな性質を
示すためには、また、本発明が解決する問題を強調する
ためには、ヒト単球セルラインの培養液８０リットル中
に存在する全細胞中に１００μg以下のcＰＬＡ2しか存
在しないことを挙げれば十分である。即ち、本発明はこ
の希少かつ重要な酵素を比較的大量に得ることの困難性
を克服するものである。
めの容易な方法は存在しなかった。ヒトcＰＬＡ2および
精製法は米国特許出願番号０７／５７３,５１３に記載
されている。cＰＬＡ2と反応する抗体およびcＰＬＡ2を
単離および同定するための方法は米国特許出願番号０７
／６６３,３３５に記載されている。cＰＬＡ2はそれを
天然に含有する細胞の細胞質において希少であるため、
これらの方法によると最大でも限られた量のcＰＬＡ2し
か得ることができない。cＰＬＡ2の極めてまれな性質を
示すためには、また、本発明が解決する問題を強調する
ためには、ヒト単球セルラインの培養液８０リットル中
に存在する全細胞中に１００μg以下のcＰＬＡ2しか存
在しないことを挙げれば十分である。即ち、本発明はこ
の希少かつ重要な酵素を比較的大量に得ることの困難性
を克服するものである。
【０００３】ホスホリパーゼＡ2(ＰＬＡ2)は、ホスホグ
リセリドのｓｎ-２-アシルエステル結合の加水分解(等
モル量のリゾリン脂質と遊離脂肪酸とを産する)を触媒
するホスファチド２-アシルヒドロラーゼの一般名であ
る[Dennis,E.A., The Enzymes，Vol.16，Academic Pres
s, New York (1983)]。ホスホリパーゼＡ2酵素はすべて
の生物種に見い出され、種々の群の酵素から構成され
る。現在までに研究されているホスホリパーゼＡ2の大
多数は分子量約１４kＤaであり、それらのアミノ酸配列
は相同性が高い。
リセリドのｓｎ-２-アシルエステル結合の加水分解(等
モル量のリゾリン脂質と遊離脂肪酸とを産する)を触媒
するホスファチド２-アシルヒドロラーゼの一般名であ
る[Dennis,E.A., The Enzymes，Vol.16，Academic Pres
s, New York (1983)]。ホスホリパーゼＡ2酵素はすべて
の生物種に見い出され、種々の群の酵素から構成され
る。現在までに研究されているホスホリパーゼＡ2の大
多数は分子量約１４kＤaであり、それらのアミノ酸配列
は相同性が高い。
【０００４】最も豊富かつ広く研究されているＰＬＡ2
は分泌型のものである。これらの酵素は細胞内で産生さ
れ、分泌小胞中にパッケージされ、そして後に細胞外環
境に放出され、ここで生物学的物質の消化を助ける。対
照的に、cＰＬＡ2はほとんど無いといってよい程に少量
でしか見い出されず、細胞内に残っており、分泌型のも
のとは全く相違する能力において役立っている。これら
細胞内ＰＬＡ2群の細胞内における濃度が極めて低いこ
とから、これら酵素の十分な研究は妨げられていた[Vad
asおよびPruzanski, Lab.Investigation 55, 4:391 (19
86)]。
は分泌型のものである。これらの酵素は細胞内で産生さ
れ、分泌小胞中にパッケージされ、そして後に細胞外環
境に放出され、ここで生物学的物質の消化を助ける。対
照的に、cＰＬＡ2はほとんど無いといってよい程に少量
でしか見い出されず、細胞内に残っており、分泌型のも
のとは全く相違する能力において役立っている。これら
細胞内ＰＬＡ2群の細胞内における濃度が極めて低いこ
とから、これら酵素の十分な研究は妨げられていた[Vad
asおよびPruzanski, Lab.Investigation 55, 4:391 (19
86)]。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】特異的な阻害物質によ
ってレセプター媒介のcＰＬＡ2活性を調節できることが
所望の目的であり、これは、喘息、虚血、関節炎、敗血
性発作および皮膚の炎症疾患のための新しい治療法を導
くことができる。特定の疾患状態に関連するcＰＬＡ2活
性の不活性化法または特異的な阻害法は、医学界におい
てその大きな用途を有しているであろう。この目的を達
成するためには、初めに、特定の疾患の発生に関連して
いると推定されるcＰＬＡ2を同定し、単離しなければな
らない。これは先に出願された上記の米国特許出願中で
行われ、そして記載されている。本発明は、cＰＬＡ2を
コードしている遺伝子、cＰＬＡ2を発現させるのに有用
なベクターおよび宿主細胞、ならびにcＰＬＡ2を発現さ
せるための方法を提供するものである。
ってレセプター媒介のcＰＬＡ2活性を調節できることが
所望の目的であり、これは、喘息、虚血、関節炎、敗血
性発作および皮膚の炎症疾患のための新しい治療法を導
くことができる。特定の疾患状態に関連するcＰＬＡ2活
性の不活性化法または特異的な阻害法は、医学界におい
てその大きな用途を有しているであろう。この目的を達
成するためには、初めに、特定の疾患の発生に関連して
いると推定されるcＰＬＡ2を同定し、単離しなければな
らない。これは先に出願された上記の米国特許出願中で
行われ、そして記載されている。本発明は、cＰＬＡ2を
コードしている遺伝子、cＰＬＡ2を発現させるのに有用
なベクターおよび宿主細胞、ならびにcＰＬＡ2を発現さ
せるための方法を提供するものである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明は、以下に示すア
ミノ酸配列：
ミノ酸配列：
【化１０】
【化１１】
【化１２】
【化１３】 を有するタンパク質をコードしている組換えＤＮＡ配列
を含有するcＰＬＡ2遺伝子、ならびにこのＤＮＡ配列を
含有するベクターおよび宿主細胞を包含するものであ
る。また、本発明は、cＰＬＡ2をコードしている遺伝子
を含有する発現ベクターで細胞を形質転換することから
なるcＰＬＡ2遺伝子の使用方法を包含するものである。
本発明の他の態様は、cＰＬＡ2発現ベクターで形質転換
した細胞を適当な増殖培地で培養し、該培養された細胞
からcＰＬＡ2を単離することからなるcＰＬＡ2遺伝子の
使用方法である。さらに、本発明は、この単離したcＰ
ＬＡ2酵素を該cＰＬＡ2の酵素活性を阻害しうると推測
される化合物と接触させ、そして該cＰＬＡ2の酵素活性
が該化合物によって阻害されるか否かを測定することか
らなる、cＰＬＡ2をコードしている遺伝子を用いて薬物
をスクリーニングする方法を包含するものである。
を含有するcＰＬＡ2遺伝子、ならびにこのＤＮＡ配列を
含有するベクターおよび宿主細胞を包含するものであ
る。また、本発明は、cＰＬＡ2をコードしている遺伝子
を含有する発現ベクターで細胞を形質転換することから
なるcＰＬＡ2遺伝子の使用方法を包含するものである。
本発明の他の態様は、cＰＬＡ2発現ベクターで形質転換
した細胞を適当な増殖培地で培養し、該培養された細胞
からcＰＬＡ2を単離することからなるcＰＬＡ2遺伝子の
使用方法である。さらに、本発明は、この単離したcＰ
ＬＡ2酵素を該cＰＬＡ2の酵素活性を阻害しうると推測
される化合物と接触させ、そして該cＰＬＡ2の酵素活性
が該化合物によって阻害されるか否かを測定することか
らなる、cＰＬＡ2をコードしている遺伝子を用いて薬物
をスクリーニングする方法を包含するものである。
【０００７】図１は、pＨＤＣＰＦの制限部位および機
能地図を示す模式図である。図２は、pＨＤＣＰＦＳの
制限部位および機能地図を示す模式図である。図３は、
pＥＣＰＬＡ２１の制限部位および機能地図を示す模式
図である。図４は、形質転換および未形質転換の大腸菌
細胞において見い出された酵素活性とタンパク質含量の
関係を示すグラフである。この結果は、本発明のベクタ
ーのいずれかで形質転換された大腸菌細胞が対照細胞に
比べて有意に多くのcＰＬＡ2を発現することを明確に示
している。図５は、ベクターpＨＤＣＰＦＳで形質転換
した２９３細胞の培養物を用いて一時的な発現実験を行
なった結果を示すグラフである。図６および図７は、p
ＨＤＣＰＦＳで形質転換したＡＶ１２ハムスターセルラ
インのcＰＬＡ2活性を示すグラフである。図８は、pＨ
ＤＣＰＦＳで形質転換した２９３ヒト腎セルラインのc
ＰＬＡ2活性を示すグラフである。図９は、pＥＣＰＬＡ
２２で形質転換した大腸菌の培養物(レーン１)における
cＰＬＡ2の発現を、未形質転換の大腸菌培養物(レーン
２)およびヒト単芽球様セルラインから単離した天然のc
ＰＬＡ2(レーン３)と比較する免疫ブロットの結果を示
す模式図である。
能地図を示す模式図である。図２は、pＨＤＣＰＦＳの
制限部位および機能地図を示す模式図である。図３は、
pＥＣＰＬＡ２１の制限部位および機能地図を示す模式
図である。図４は、形質転換および未形質転換の大腸菌
細胞において見い出された酵素活性とタンパク質含量の
関係を示すグラフである。この結果は、本発明のベクタ
ーのいずれかで形質転換された大腸菌細胞が対照細胞に
比べて有意に多くのcＰＬＡ2を発現することを明確に示
している。図５は、ベクターpＨＤＣＰＦＳで形質転換
した２９３細胞の培養物を用いて一時的な発現実験を行
なった結果を示すグラフである。図６および図７は、p
ＨＤＣＰＦＳで形質転換したＡＶ１２ハムスターセルラ
インのcＰＬＡ2活性を示すグラフである。図８は、pＨ
ＤＣＰＦＳで形質転換した２９３ヒト腎セルラインのc
ＰＬＡ2活性を示すグラフである。図９は、pＥＣＰＬＡ
２２で形質転換した大腸菌の培養物(レーン１)における
cＰＬＡ2の発現を、未形質転換の大腸菌培養物(レーン
２)およびヒト単芽球様セルラインから単離した天然のc
ＰＬＡ2(レーン３)と比較する免疫ブロットの結果を示
す模式図である。
【０００８】本発明の中核部分は、天然に見い出される
メッセンジャーＲＮＡから酵素を用いてコピーした、単
離され精製されたヒトcＰＬＡ2のcＤＮＡである。この
ＤＮＡ配列を以下に示す：
メッセンジャーＲＮＡから酵素を用いてコピーした、単
離され精製されたヒトcＰＬＡ2のcＤＮＡである。この
ＤＮＡ配列を以下に示す：
【化１４】
【化１５】
【化１６】
【化１７】
【化１８】 このＤＮＡ配列がコードしているアミノ酸配列は先に挙
げた化１０〜化１３に示されている。遺伝コードの縮重
に基づいて、同じ長さの多数の他のヌクレオチド配列が
cＰＬＡ2酵素をコードしうることは当業者の認識すると
ころであろう。このような配列のすべても、天然の配列
が固有に含んでいる情報の故に、本発明の一部である。
げた化１０〜化１３に示されている。遺伝コードの縮重
に基づいて、同じ長さの多数の他のヌクレオチド配列が
cＰＬＡ2酵素をコードしうることは当業者の認識すると
ころであろう。このような配列のすべても、天然の配列
が固有に含んでいる情報の故に、本発明の一部である。
【０００９】本発明は全体として、cＰＬＡ2をコードし
ているＤＮＡ配列、組換えＤＮＡベクター、組換え宿主
細胞、およびその使用方法を包含している。この態様の
それぞれが、特許請求の範囲に記載したＤＮＡ配列によ
ってコードされているタンパク質配列により限定され
る。しかし、当業者なら、異種タンパク質が外来の宿主
細胞において発現したときに酵素による消化を受けるこ
とが多いことを認識しているであろう。例えば、セリン
残基の前にあるＮ-末端のメチオニン残基は原核細胞中
のある種の酵素によって除去されることが多いが、この
ようなものは本発明の範囲内に意図されている。さら
に、本発明は、本発明の説明を助けるために用いた図面
や実施例によって限定されるものではない。
ているＤＮＡ配列、組換えＤＮＡベクター、組換え宿主
細胞、およびその使用方法を包含している。この態様の
それぞれが、特許請求の範囲に記載したＤＮＡ配列によ
ってコードされているタンパク質配列により限定され
る。しかし、当業者なら、異種タンパク質が外来の宿主
細胞において発現したときに酵素による消化を受けるこ
とが多いことを認識しているであろう。例えば、セリン
残基の前にあるＮ-末端のメチオニン残基は原核細胞中
のある種の酵素によって除去されることが多いが、この
ようなものは本発明の範囲内に意図されている。さら
に、本発明は、本発明の説明を助けるために用いた図面
や実施例によって限定されるものではない。
【００１０】本明細書の記述においては、組換えＤＮＡ
ベクターを単にベクターと記すこともある。この両用語
は２種類のベクター、即ちクローニングおよび発現ベク
ターを包含する。当業者の知るように、クローニングベ
クターは適当な宿主細胞中で複製することができるプラ
スミドである。発現ベクターは、ポリペプチドに転写お
よび翻訳される特定のタンパク質の暗号化配列をプラス
ミド中に含むことができるプラスミドである。この両ベ
クターは、形質転換した細胞だけが選択培地で増殖する
ことを可能にする抗生物質耐性遺伝子などの選択マーカ
ーを含んでいるのが好ましい。
ベクターを単にベクターと記すこともある。この両用語
は２種類のベクター、即ちクローニングおよび発現ベク
ターを包含する。当業者の知るように、クローニングベ
クターは適当な宿主細胞中で複製することができるプラ
スミドである。発現ベクターは、ポリペプチドに転写お
よび翻訳される特定のタンパク質の暗号化配列をプラス
ミド中に含むことができるプラスミドである。この両ベ
クターは、形質転換した細胞だけが選択培地で増殖する
ことを可能にする抗生物質耐性遺伝子などの選択マーカ
ーを含んでいるのが好ましい。
【００１１】ある態様では、本発明はcＰＬＡ2をコード
しているＤＮＡ配列を含有する組換えＤＮＡクローニン
グベクターを提供する。このようなベクターを、cＰＬ
Ａ2遺伝子を得るための、それを増殖させるための、他
の有用な組換えＤＮＡベクターを構築するための、この
ベクターを種々の目的に用いるための手段として利用す
ることは当業者なら容易に理解できるであろう。
しているＤＮＡ配列を含有する組換えＤＮＡクローニン
グベクターを提供する。このようなベクターを、cＰＬ
Ａ2遺伝子を得るための、それを増殖させるための、他
の有用な組換えＤＮＡベクターを構築するための、この
ベクターを種々の目的に用いるための手段として利用す
ることは当業者なら容易に理解できるであろう。
【００１２】他の態様には、これまで極めて希少であっ
たcＰＬＡ2酵素を多量に得るのに有用な組換えＤＮＡ発
現ベクターが含まれる。本発明のcＰＬＡ2をコードして
いるＤＮＡ配列が与えられると、当業者は既知の機能要
素を用いて発現ベクターを容易に構築することができる
であろう。以下に４種類の代表的な発現ベクターを挙げ
て本発明のこの態様の説明を助ける。これらベクターは
単に例示の目的で挙げるものであって、いかなる意味に
おいても本発明を限定しようとするものではない。
たcＰＬＡ2酵素を多量に得るのに有用な組換えＤＮＡ発
現ベクターが含まれる。本発明のcＰＬＡ2をコードして
いるＤＮＡ配列が与えられると、当業者は既知の機能要
素を用いて発現ベクターを容易に構築することができる
であろう。以下に４種類の代表的な発現ベクターを挙げ
て本発明のこの態様の説明を助ける。これらベクターは
単に例示の目的で挙げるものであって、いかなる意味に
おいても本発明を限定しようとするものではない。
【００１３】２種類の異なる大腸菌株を４つの発現ベク
ターで形質転換し、得られた組換え宿主細胞をブダペス
ト条約の規定もとでノーザン・リージョナル・リサーチ
・ラボラトリーズ(Northern Regional Research Labora
tories；ＮＲＲＬ)に寄託した。それぞれのベクターは
その宿主細胞株において複製するために必要な機能要素
を保持しているので、クローニングベクターを構成して
いる。さらに、これら寄託したベクターの内の２種は原
核性発現ベクターとして機能し、２種は真核性発現ベク
ターとして機能する。各ベクターを次に説明する。
ターで形質転換し、得られた組換え宿主細胞をブダペス
ト条約の規定もとでノーザン・リージョナル・リサーチ
・ラボラトリーズ(Northern Regional Research Labora
tories；ＮＲＲＬ)に寄託した。それぞれのベクターは
その宿主細胞株において複製するために必要な機能要素
を保持しているので、クローニングベクターを構成して
いる。さらに、これら寄託したベクターの内の２種は原
核性発現ベクターとして機能し、２種は真核性発現ベク
ターとして機能する。各ベクターを次に説明する。
【００１４】プラスミドpＥＣＰＬＡ２１(ＮＲＲＬ受託
番号Ｎo.１８７７４)を用いて大腸菌株Ｋ１２ ＤＨ５α
を形質転換した。化１４〜化１８に示したＤＮＡ配列が
このベクターのcＰＬＡ2をコードする部分である。ま
た、このベクターは、複製起点配列、テトラサイクリン
耐性付与(tet)配列、誘導可能なプロモーター配列(ＰL)
を調節する温度感受性リプレッサー(cＩ８５７)、およ
び転写終止配列を含んでいる(すべてが大腸菌またはラ
ムダファージに由来する)。プラスミドのこれら機能要
素は、宿主細胞がプラスミドの多数のコピーを複製する
こと、および誘導したときにはcＰＬＡ2遺伝子を転写お
よび翻訳することを可能にする。pＥＣＰＬＡ２１に実
際に使用した配列の代わりに類似の機能を有する他の多
数の配列を置換してよいことは、勿論、当業者の認める
ところであろう。
番号Ｎo.１８７７４)を用いて大腸菌株Ｋ１２ ＤＨ５α
を形質転換した。化１４〜化１８に示したＤＮＡ配列が
このベクターのcＰＬＡ2をコードする部分である。ま
た、このベクターは、複製起点配列、テトラサイクリン
耐性付与(tet)配列、誘導可能なプロモーター配列(ＰL)
を調節する温度感受性リプレッサー(cＩ８５７)、およ
び転写終止配列を含んでいる(すべてが大腸菌またはラ
ムダファージに由来する)。プラスミドのこれら機能要
素は、宿主細胞がプラスミドの多数のコピーを複製する
こと、および誘導したときにはcＰＬＡ2遺伝子を転写お
よび翻訳することを可能にする。pＥＣＰＬＡ２１に実
際に使用した配列の代わりに類似の機能を有する他の多
数の配列を置換してよいことは、勿論、当業者の認める
ところであろう。
【００１５】プラスミドpＥＣＰＬＡ２２(ＮＲＲＬ受託
番号Ｎo.１８７７５)はpＥＣＰＬＡ２１と同一であると
考えられる。しかし、これは異なるクローンから得られ
るので、いくつかの塩基対が、特にスプライシング領域
の塩基対がpＥＣＰＬＡ２１と異なっている可能性があ
る。それでも、pＥＣＰＬＡ２２はpＥＣＰＬＡ２１と機
能的に区別することができず、複製起点配列、tet遺伝
子、ＰL誘導性プロモーター配列を調節するcＩ８５７温
度感受性リプレッサーおよび転写終止配列、ならびに化
１４〜化１８に示すＤＮＡ配列を含んでいる。先に記載
した形質転換株を越える発現の利点を得ることを期待し
て、大腸菌の異なる菌株(大腸菌Ｋ１２と大腸菌Ｂのハ
イブリッドＲＲ１)をpＥＣＰＬＡ２２で形質転換した。
今までのところ、形質転換された大腸菌の両菌株は発現
および取扱い性に関しては同等のようである。
番号Ｎo.１８７７５)はpＥＣＰＬＡ２１と同一であると
考えられる。しかし、これは異なるクローンから得られ
るので、いくつかの塩基対が、特にスプライシング領域
の塩基対がpＥＣＰＬＡ２１と異なっている可能性があ
る。それでも、pＥＣＰＬＡ２２はpＥＣＰＬＡ２１と機
能的に区別することができず、複製起点配列、tet遺伝
子、ＰL誘導性プロモーター配列を調節するcＩ８５７温
度感受性リプレッサーおよび転写終止配列、ならびに化
１４〜化１８に示すＤＮＡ配列を含んでいる。先に記載
した形質転換株を越える発現の利点を得ることを期待し
て、大腸菌の異なる菌株(大腸菌Ｋ１２と大腸菌Ｂのハ
イブリッドＲＲ１)をpＥＣＰＬＡ２２で形質転換した。
今までのところ、形質転換された大腸菌の両菌株は発現
および取扱い性に関しては同等のようである。
【００１６】化１４〜化１８の配列を基に２種類の異な
る真核性発現ベクター(pＨＤＣＰＦおよびpＨＤＣＰＦ
Ｓ)を構築した。pＨＤＣＰＦが化１４〜化１８の配列の
３'側にＩＳ１０細菌性挿入配列を含有していることを
除き、これらベクターは同一である。ＩＳ１０挿入配列
がcＰＬＡ2のcＤＮＡの３'非暗号領域に存在すると、Ｉ
Ｓ１０を欠く形態に比べてさらに安定な形態になると考
えられるプラスミドが得られる。ＩＳ１０は周知であり
[Halling,S.M.およびKleckner,N., Cell 28, 155 (198
2)]、ＤＮＡ中の優先的な９塩基対部位への挿入体であ
る(その２つがcＰＬＡ2遺伝子の３'非暗号領域中に存在
する)。ＩＳ１０がcＰＬＡ2の合成レベルに影響するか
否かが確かではなかったので、細菌性発現ベクターpＥ
ＣＰＬＡ２１およびpＥＣＰＬＡ２２においてはこの挿
入配列を２つの９塩基対部位と共に削除した。しかし、
真核性発現ベクターpＨＤＣＰＦにはＩＳ１０が含まれ
ていた。
る真核性発現ベクター(pＨＤＣＰＦおよびpＨＤＣＰＦ
Ｓ)を構築した。pＨＤＣＰＦが化１４〜化１８の配列の
３'側にＩＳ１０細菌性挿入配列を含有していることを
除き、これらベクターは同一である。ＩＳ１０挿入配列
がcＰＬＡ2のcＤＮＡの３'非暗号領域に存在すると、Ｉ
Ｓ１０を欠く形態に比べてさらに安定な形態になると考
えられるプラスミドが得られる。ＩＳ１０は周知であり
[Halling,S.M.およびKleckner,N., Cell 28, 155 (198
2)]、ＤＮＡ中の優先的な９塩基対部位への挿入体であ
る(その２つがcＰＬＡ2遺伝子の３'非暗号領域中に存在
する)。ＩＳ１０がcＰＬＡ2の合成レベルに影響するか
否かが確かではなかったので、細菌性発現ベクターpＥ
ＣＰＬＡ２１およびpＥＣＰＬＡ２２においてはこの挿
入配列を２つの９塩基対部位と共に削除した。しかし、
真核性発現ベクターpＨＤＣＰＦにはＩＳ１０が含まれ
ていた。
【００１７】２種類の真核性発現ベクターは同じ前駆体
プラスミドpＨＤから導いた。従って、pＨＤＣＰＦおよ
びpＨＤＣＰＦＳの両方に対して等しくpＨＤの機能要素
を説明し、適用する。pＨＤベクターは、大腸菌の複製
起点およびアンピシリン耐性を付与する遺伝子(amp)を
含有する。これらの要素は、プラスミドpＨＤが大腸菌
中でクローニングベクターとして機能するのを可能にす
る。先に記したように、他の多数の配列があるベクター
に同じ性質を付与しうること、およびその環境下で何が
適切であるかに基づいて常法により互いに置換されるこ
とは当業者の知るところである。例えば、本態様は選択
マーカーとしてamp遺伝子に限定されるものではない
が、これは当分野で多数の他の同等のマーカーが周知で
あり、使用されているためである。また、テトラサイク
リンおよびカナマイシン耐性付与遺伝子などの他の抗生
物質耐性付与遺伝子が本発明に適合する。
プラスミドpＨＤから導いた。従って、pＨＤＣＰＦおよ
びpＨＤＣＰＦＳの両方に対して等しくpＨＤの機能要素
を説明し、適用する。pＨＤベクターは、大腸菌の複製
起点およびアンピシリン耐性を付与する遺伝子(amp)を
含有する。これらの要素は、プラスミドpＨＤが大腸菌
中でクローニングベクターとして機能するのを可能にす
る。先に記したように、他の多数の配列があるベクター
に同じ性質を付与しうること、およびその環境下で何が
適切であるかに基づいて常法により互いに置換されるこ
とは当業者の知るところである。例えば、本態様は選択
マーカーとしてamp遺伝子に限定されるものではない
が、これは当分野で多数の他の同等のマーカーが周知で
あり、使用されているためである。また、テトラサイク
リンおよびカナマイシン耐性付与遺伝子などの他の抗生
物質耐性付与遺伝子が本発明に適合する。
【００１８】さらに、このベクターは、ベクターによっ
て形質転換された真核性クローンの単離を可能にする２
種類の他の選択マーカーを含有している。ハイグロマイ
シン耐性遺伝子(hyg)は、未形質転換細胞の増殖を阻害
する濃度(約２００〜４００μg／ml)のハイグロマイシ
ンを含む培地で増殖する能力を、ベクターで形質転換さ
れた真核細胞に与える。発現を増幅するためにも用いる
ことができる他の選択マーカーはネズミジヒドロ葉酸還
元酵素(ＤＨＦＲ)遺伝子である。この遺伝子は当分野で
既知であり、約０.５〜１３０μＭのメトトレキセート
に対する耐性に基づいて真核細胞を選択することを可能
にする。
て形質転換された真核性クローンの単離を可能にする２
種類の他の選択マーカーを含有している。ハイグロマイ
シン耐性遺伝子(hyg)は、未形質転換細胞の増殖を阻害
する濃度(約２００〜４００μg／ml)のハイグロマイシ
ンを含む培地で増殖する能力を、ベクターで形質転換さ
れた真核細胞に与える。発現を増幅するためにも用いる
ことができる他の選択マーカーはネズミジヒドロ葉酸還
元酵素(ＤＨＦＲ)遺伝子である。この遺伝子は当分野で
既知であり、約０.５〜１３０μＭのメトトレキセート
に対する耐性に基づいて真核細胞を選択することを可能
にする。
【００１９】pＨＤベクターにおいては、アデノウイル
ス-２主後期プロモーター(ＭＬＰ)が所望の遺伝子、こ
こではcＰＬＡ2を発現させる。当業者なら、ＭＬＰの代
わりに機能する他の多数の真核性プロモーターを容易に
想定することができる。その例には、ＳＶ４０の初期お
よび後期プロモーター、エストロゲン誘導性のニワトリ
卵アルブミン遺伝子プロモーター、インターフェロン遺
伝子のプロモーター、グルココルチコイド誘導性のチロ
シンアミノトランスフェラーゼ遺伝子プロモーター、チ
ミジンキナーゼ遺伝子プロモーター、およびアデノウイ
ルス初期プロモーターが含まれるが、これらに限定はさ
れない。
ス-２主後期プロモーター(ＭＬＰ)が所望の遺伝子、こ
こではcＰＬＡ2を発現させる。当業者なら、ＭＬＰの代
わりに機能する他の多数の真核性プロモーターを容易に
想定することができる。その例には、ＳＶ４０の初期お
よび後期プロモーター、エストロゲン誘導性のニワトリ
卵アルブミン遺伝子プロモーター、インターフェロン遺
伝子のプロモーター、グルココルチコイド誘導性のチロ
シンアミノトランスフェラーゼ遺伝子プロモーター、チ
ミジンキナーゼ遺伝子プロモーター、およびアデノウイ
ルス初期プロモーターが含まれるが、これらに限定はさ
れない。
【００２０】本発明の好ましいcＰＬＡ2クローニングベ
クターは大腸菌中で機能するベクターである。好ましい
原核性cＰＬＡ2ベクターはクローニングおよび発現の両
ベクターとして作動する型のものである。さらに好まし
い原核性cＰＬＡ2ベクターはpＥＣＰＬＡ２１およびpＥ
ＣＰＬＡ２２である。好ましい真核性cＰＬＡ2ベクター
は、大腸菌中でクローニングベクターとして機能し、ま
た真核細胞中で発現ベクターとして作動することができ
るベクターである。さらに好ましい真核性cＰＬＡ2ベク
ターは、哺乳動物細胞中で発現ベクターとして機能する
という追加の特徴を備えた好ましい型と同じ性質を有し
ている。尚一層好ましい真核性cＰＬＡ2ベクターはpＨ
ＤＣＰＦおよびpＨＤＣＰＦＳであり、最も好ましいベ
クターはpＨＤＣＰＦＳである。
クターは大腸菌中で機能するベクターである。好ましい
原核性cＰＬＡ2ベクターはクローニングおよび発現の両
ベクターとして作動する型のものである。さらに好まし
い原核性cＰＬＡ2ベクターはpＥＣＰＬＡ２１およびpＥ
ＣＰＬＡ２２である。好ましい真核性cＰＬＡ2ベクター
は、大腸菌中でクローニングベクターとして機能し、ま
た真核細胞中で発現ベクターとして作動することができ
るベクターである。さらに好ましい真核性cＰＬＡ2ベク
ターは、哺乳動物細胞中で発現ベクターとして機能する
という追加の特徴を備えた好ましい型と同じ性質を有し
ている。尚一層好ましい真核性cＰＬＡ2ベクターはpＨ
ＤＣＰＦおよびpＨＤＣＰＦＳであり、最も好ましいベ
クターはpＨＤＣＰＦＳである。
【００２１】本発明の別の態様には、種々の型の組換え
ＤＮＡ宿主細胞が含まれる。本明細書においては、組換
えＤＮＡ宿主細胞を組換え宿主細胞または単に宿主細胞
と呼ぶこともある。組換え宿主細胞とは、そのゲノムが
外来ＤＮＡの付加によって変化している細胞である。最
も普通の型の宿主細胞は、異種ＤＮＡを含有するベクタ
ーで形質転換された細胞である。宿主細胞は、その細胞
装置をベクターの複製および／またはベクター中のタン
パク質暗号化領域の発現に供することによって２つの目
的を果たす。
ＤＮＡ宿主細胞が含まれる。本明細書においては、組換
えＤＮＡ宿主細胞を組換え宿主細胞または単に宿主細胞
と呼ぶこともある。組換え宿主細胞とは、そのゲノムが
外来ＤＮＡの付加によって変化している細胞である。最
も普通の型の宿主細胞は、異種ＤＮＡを含有するベクタ
ーで形質転換された細胞である。宿主細胞は、その細胞
装置をベクターの複製および／またはベクター中のタン
パク質暗号化領域の発現に供することによって２つの目
的を果たす。
【００２２】本発明の好ましい宿主細胞は、cＰＬＡ2遺
伝子を含むベクターを含有し、クローニングおよび発現
の両能力を発揮しうる大腸菌細胞である。cＰＬＡ2遺伝
子はヒト細胞から単離したので、より好ましい宿主細胞
はcＰＬＡ2をコードしているＤＮＡ配列を含有する真核
性発現ベクターで形質転換した真核細胞である。さらに
好ましい宿主細胞は、cＰＬＡ2遺伝子を含有する真核性
発現ベクターで形質転換した哺乳動物セルラインであ
る。最も好ましい宿主細胞は、pＨＤＣＰＦまたはpＨＤ
ＣＰＦＳで形質転換したヒト胚腎セルライン２９３およ
びpＨＤＣＰＦまたはpＨＤＣＰＦＳで形質転換したＡＶ
１２ハムスターセルラインである。さらに最も好ましい
本発明のcＰＬＡ2宿主細胞は、pＨＤＣＰＦＳで形質転
換したヒト胚腎セルライン２９３およびpＨＤＣＰＦＳ
で形質転換したＡＶ１２ハムスターセルラインである。
これらの未形質転換セルラインはアメリカン・タイプ・
カルチャー・コレクション(American Type Culture Col
lection；ＡＴＣＣ)の永久保存物である。
伝子を含むベクターを含有し、クローニングおよび発現
の両能力を発揮しうる大腸菌細胞である。cＰＬＡ2遺伝
子はヒト細胞から単離したので、より好ましい宿主細胞
はcＰＬＡ2をコードしているＤＮＡ配列を含有する真核
性発現ベクターで形質転換した真核細胞である。さらに
好ましい宿主細胞は、cＰＬＡ2遺伝子を含有する真核性
発現ベクターで形質転換した哺乳動物セルラインであ
る。最も好ましい宿主細胞は、pＨＤＣＰＦまたはpＨＤ
ＣＰＦＳで形質転換したヒト胚腎セルライン２９３およ
びpＨＤＣＰＦまたはpＨＤＣＰＦＳで形質転換したＡＶ
１２ハムスターセルラインである。さらに最も好ましい
本発明のcＰＬＡ2宿主細胞は、pＨＤＣＰＦＳで形質転
換したヒト胚腎セルライン２９３およびpＨＤＣＰＦＳ
で形質転換したＡＶ１２ハムスターセルラインである。
これらの未形質転換セルラインはアメリカン・タイプ・
カルチャー・コレクション(American Type Culture Col
lection；ＡＴＣＣ)の永久保存物である。
【００２３】本発明のさらに別の態様は、cＰＬＡ2をコ
ードしている遺伝子を用いて細胞を形質転換する方法で
ある。原核および真核性の両細胞に適用しうる多種多様
の形質転換法が存在するが、このような形質転換法は当
分野では常法であるのでここでは説明しない。
ードしている遺伝子を用いて細胞を形質転換する方法で
ある。原核および真核性の両細胞に適用しうる多種多様
の形質転換法が存在するが、このような形質転換法は当
分野では常法であるのでここでは説明しない。
【００２４】本発明の他の態様は、cＰＬＡ2宿主細胞を
用いてcＰＬＡ2を発現させる方法である。この態様にお
いては、形質転換された原核性または真核性のいずれか
の宿主細胞を大きな細胞塊が得られるまで適当な培地で
培養する。形質転換した原核細胞の発酵および形質転換
した真核細胞の塊細胞培養は当分野では常法であるの
で、ここでは説明しない。
用いてcＰＬＡ2を発現させる方法である。この態様にお
いては、形質転換された原核性または真核性のいずれか
の宿主細胞を大きな細胞塊が得られるまで適当な培地で
培養する。形質転換した原核細胞の発酵および形質転換
した真核細胞の塊細胞培養は当分野では常法であるの
で、ここでは説明しない。
【００２５】この態様の第２の工程は、培養した細胞か
らのcＰＬＡ2の単離である。未形質転換哺乳動物セルラ
インからcＰＬＡ2を精製するための２つの方法が米国特
許出願番号０７／５７３,５１３に記載されている。以
下にこれら方法の要約を挙げる。細胞を増殖させ、集め
たら、この培養細胞をプロテアーゼ阻害物質の存在下に
窒素キャビテーションによって溶菌する。この溶菌液か
ら超遠心によって可溶性分画を調製する。得られた細胞
質ゾルタンパク質の溶液はcＰＬＡ2を含有しており、こ
れを一連の精製操作にかける。
らのcＰＬＡ2の単離である。未形質転換哺乳動物セルラ
インからcＰＬＡ2を精製するための２つの方法が米国特
許出願番号０７／５７３,５１３に記載されている。以
下にこれら方法の要約を挙げる。細胞を増殖させ、集め
たら、この培養細胞をプロテアーゼ阻害物質の存在下に
窒素キャビテーションによって溶菌する。この溶菌液か
ら超遠心によって可溶性分画を調製する。得られた細胞
質ゾルタンパク質の溶液はcＰＬＡ2を含有しており、こ
れを一連の精製操作にかける。
【００２６】細胞溶菌液の可溶性分画を一連のカラムク
ロマトグラフィー操作にかける。アニオン交換クロマト
グラフィーに続いて疎水性相互作用法、分子サイジング
法、そして最後に別の疎水性相互作用法を行なう(cＰＬ
Ａ2が樹脂に弱く結合するような条件を用いる)。それぞ
れのカラムは個別に行ない、２８０nmでの吸光度をモニ
ターしながら溶出液を分画として集める。分画のホスホ
リパーゼＡ2活性を検定し、次いで、所望の活性を含む
分画を均質なcＰＬＡ2溶液が得られるまで次のカラムに
かける。
ロマトグラフィー操作にかける。アニオン交換クロマト
グラフィーに続いて疎水性相互作用法、分子サイジング
法、そして最後に別の疎水性相互作用法を行なう(cＰＬ
Ａ2が樹脂に弱く結合するような条件を用いる)。それぞ
れのカラムは個別に行ない、２８０nmでの吸光度をモニ
ターしながら溶出液を分画として集める。分画のホスホ
リパーゼＡ2活性を検定し、次いで、所望の活性を含む
分画を均質なcＰＬＡ2溶液が得られるまで次のカラムに
かける。
【００２７】抗-cＰＬＡ2抗体を用いる免疫アフィニテ
ィー精製法が、上に挙げた一連のクロマトグラフィー法
の代替法である。精製されたタンパク質に指向性の抗血
清またはモノクローナル抗体の作成は当分野で周知であ
り、当業者なら抗-cＰＬＡ2抗体を容易に調製すること
ができる。また、このような抗体を用いて免疫アフィニ
ティーマトリックスを作成することおよびこの免疫アフ
ィニティーマトリックスを用いてcＰＬＡ2を単離するこ
とも当業者には周知である[Affinity Chromatography P
rinciples & Methods, Pharmacia Fine Chemicals (198
3)を参照]。
ィー精製法が、上に挙げた一連のクロマトグラフィー法
の代替法である。精製されたタンパク質に指向性の抗血
清またはモノクローナル抗体の作成は当分野で周知であ
り、当業者なら抗-cＰＬＡ2抗体を容易に調製すること
ができる。また、このような抗体を用いて免疫アフィニ
ティーマトリックスを作成することおよびこの免疫アフ
ィニティーマトリックスを用いてcＰＬＡ2を単離するこ
とも当業者には周知である[Affinity Chromatography P
rinciples & Methods, Pharmacia Fine Chemicals (198
3)を参照]。
【００２８】また、本発明はcＰＬＡ2をコードしている
遺伝子を用いてある化合物をスクリーニングする方法を
包含する。精製した組換えまたは天然産生のcＰＬＡ2を
用いることによって、特定の化合物がcＰＬＡ2酵素活性
を阻害または遮断しうるか否かを試験することができ
る。後記実施例１に記載の基質溶液に広範囲な濃度の被
験化合物を加えることによって、ある化合物がこの酵素
の活性を阻害または遮断しうるか否かを決定するのは常
法である。
遺伝子を用いてある化合物をスクリーニングする方法を
包含する。精製した組換えまたは天然産生のcＰＬＡ2を
用いることによって、特定の化合物がcＰＬＡ2酵素活性
を阻害または遮断しうるか否かを試験することができ
る。後記実施例１に記載の基質溶液に広範囲な濃度の被
験化合物を加えることによって、ある化合物がこの酵素
の活性を阻害または遮断しうるか否かを決定するのは常
法である。
【００２９】
【実施例】以下に実施例を挙げて本発明の実施態様の説
明を助け、特許請求の範囲に記載した本発明のcＰＬＡ2
をコードしている遺伝子、ベクター、宿主細胞、および
方法を例示する。実施例１ cＰＬＡ2酵素活性の検定 １−パルミトイル−２−[14Ｃ]アラキドノイル−ｓｎ−
グリセロ−３−ホスホコリン([14Ｃ]ＰＣ)[５５mＣi／m
mol；NEN Research Productsから入手]およびｓｎ−１,
２−ジオレオイルグリセロール(ＤＧ)[Avanti Polar Li
pids, Birmingham, AL]をモル比２：１で含有する超音
波処理リポソーム基質を以下のようにして調製した。[
14Ｃ]ＰＣ(２０nmol、１×１０6dpm、５０μＣi／ml、
トルエン／エタノール中)およびＤＧ(１０nmol、１００
μg／ml、クロロホルム中)を窒素下に乾燥した。Ｍicro
son probeソニケーター[Heat Systems Ultrasonics]を
用いて４５秒間隔で４×１５秒間、４℃で超音波処理を
行うことにより、脂質を１５０mＭ ＮaＣl、５０mＭ Ｈ
epes(pＨ７.５)[検定緩衝液；１ml]中に分散させた。ウ
シ血清アルブミン[実質的に脂肪酸を含まない；水中１
００mg／mlストック(Sigma)から]を終濃度４mg／mlにな
るまで加えた。cＰＬＡ2活性の検定を行なう試料を、１
mＭ ＣaＣl2および１mＭ ２-ＭＥを含有する検定緩衝液
(総量 ０.２ml)中、リポソーム[０.５nmol[14Ｃ]ＰＣ；
５０,０００dpm；０.２５nmolのＤＧを含有](５０μl)
と共にインキュベートした。インキュベートは３７℃で
１５分間行い、ドール試薬[１０μg／mlのステアリン酸
を含有する４０：１０：１の２-プロパノール／ヘプタ
ン／０.５Ｍ 硫酸](２ml)を添加することによって終了
した。混合した後、ヘプタン(１.２ml)および水(１ml)
を加えた。この混合物を短時間旋回し、この上部の相
を、ヘプタン(２ml)および使用前に１３０℃で活性化し
たＢio-Ｓil[Bio-Rad Laboratories](１５０mg)を入れ
た試験管に移した。この試験管を十分に旋回撹拌し、遠
心した(１０００×g、５分間)。この上清をシンチレー
ション用バイアルにデカンテーションした。液体シンチ
レーション混液[Ready Protein+；Beckman](１０ml)を
添加した後、Ｂeckman液体シンチレーションカウンター
ＬＳ７０００型を使用して放射活性をカウントした。高
い放射活性のカウント数は酵素活性と相互に関係してい
る。
明を助け、特許請求の範囲に記載した本発明のcＰＬＡ2
をコードしている遺伝子、ベクター、宿主細胞、および
方法を例示する。実施例１ cＰＬＡ2酵素活性の検定 １−パルミトイル−２−[14Ｃ]アラキドノイル−ｓｎ−
グリセロ−３−ホスホコリン([14Ｃ]ＰＣ)[５５mＣi／m
mol；NEN Research Productsから入手]およびｓｎ−１,
２−ジオレオイルグリセロール(ＤＧ)[Avanti Polar Li
pids, Birmingham, AL]をモル比２：１で含有する超音
波処理リポソーム基質を以下のようにして調製した。[
14Ｃ]ＰＣ(２０nmol、１×１０6dpm、５０μＣi／ml、
トルエン／エタノール中)およびＤＧ(１０nmol、１００
μg／ml、クロロホルム中)を窒素下に乾燥した。Ｍicro
son probeソニケーター[Heat Systems Ultrasonics]を
用いて４５秒間隔で４×１５秒間、４℃で超音波処理を
行うことにより、脂質を１５０mＭ ＮaＣl、５０mＭ Ｈ
epes(pＨ７.５)[検定緩衝液；１ml]中に分散させた。ウ
シ血清アルブミン[実質的に脂肪酸を含まない；水中１
００mg／mlストック(Sigma)から]を終濃度４mg／mlにな
るまで加えた。cＰＬＡ2活性の検定を行なう試料を、１
mＭ ＣaＣl2および１mＭ ２-ＭＥを含有する検定緩衝液
(総量 ０.２ml)中、リポソーム[０.５nmol[14Ｃ]ＰＣ；
５０,０００dpm；０.２５nmolのＤＧを含有](５０μl)
と共にインキュベートした。インキュベートは３７℃で
１５分間行い、ドール試薬[１０μg／mlのステアリン酸
を含有する４０：１０：１の２-プロパノール／ヘプタ
ン／０.５Ｍ 硫酸](２ml)を添加することによって終了
した。混合した後、ヘプタン(１.２ml)および水(１ml)
を加えた。この混合物を短時間旋回し、この上部の相
を、ヘプタン(２ml)および使用前に１３０℃で活性化し
たＢio-Ｓil[Bio-Rad Laboratories](１５０mg)を入れ
た試験管に移した。この試験管を十分に旋回撹拌し、遠
心した(１０００×g、５分間)。この上清をシンチレー
ション用バイアルにデカンテーションした。液体シンチ
レーション混液[Ready Protein+；Beckman](１０ml)を
添加した後、Ｂeckman液体シンチレーションカウンター
ＬＳ７０００型を使用して放射活性をカウントした。高
い放射活性のカウント数は酵素活性と相互に関係してい
る。
【００３０】実施例２ cＰＬＡ2の原核細胞発現 大腸菌Ｋ１２ ＤＨ５α／pＥＣＰＬＡ２１および大腸菌
Ｋ１２と大腸菌ＢのハイブリッドＲＲ１／pＥＣＰＬＡ
２２は、ノーザン・リージョナル・リサーチ・ラボラト
リーズ(ＮＲＲＬ)にそれぞれ受託番号ＮＲＲＬ Ｂ-１８
７７４およびＮＲＲＬ Ｂ-１８７７５のもとで寄託され
ている。この寄託はブダペスト条約に規定に則って為さ
れている。この両菌株は、cＰＬＡ2をコードしているc
ＤＮＡ、テトラサイクリン耐性付与遺伝子、ラムダpＬ
プロモーターを調節する温度感受性cＩ８５７リプレッ
サー、ならびに大腸菌中での転写および翻訳に必要なそ
の他の調節要素を含有する閉環したプラスミドを保持し
ている。大腸菌Ｋ１２ ｘ 大腸菌Ｂ ハイブリッドＲＲ
１／pＥＣＰＬＡ２２を、１０μg／mlテトラサイクリン
を追加したトリプトン・ブロス(ＴＹ)中、２８℃で一晩
増殖させ、次いでＴＹブロスで１：１０に希釈し、２８
℃で６０分間撹拌した。最初の増殖期が終わった後、培
養温度を４２℃まで高めることによって細胞を６時間誘
導した。この誘導した細胞を１mg／ml(水中の終濃度)の
リソチーム溶液で処理して溶菌し、４５秒間隔で１５秒
間×６回の超音波処理を行った。形質転換および未形質
転換細胞の溶菌液を調製し、そのタンパク質含有量を測
定した。次いで、実施例１に従ってこの試料のcＰＬＡ2
活性を検定した。図４は、それぞれの試料中に見い出さ
れる酵素活性とそのタンパク質含有量の関係を示すもの
である。cＰＬＡ2をコードしているＤＮＡを含有しない
大腸菌細胞をネガティブ対照として用いた。この結果
は、本発明のベクターの１つで形質転換された大腸菌細
胞が対照細胞に比べて有意に多いcＰＬＡ2を発現するこ
とを明白に示している。
Ｋ１２と大腸菌ＢのハイブリッドＲＲ１／pＥＣＰＬＡ
２２は、ノーザン・リージョナル・リサーチ・ラボラト
リーズ(ＮＲＲＬ)にそれぞれ受託番号ＮＲＲＬ Ｂ-１８
７７４およびＮＲＲＬ Ｂ-１８７７５のもとで寄託され
ている。この寄託はブダペスト条約に規定に則って為さ
れている。この両菌株は、cＰＬＡ2をコードしているc
ＤＮＡ、テトラサイクリン耐性付与遺伝子、ラムダpＬ
プロモーターを調節する温度感受性cＩ８５７リプレッ
サー、ならびに大腸菌中での転写および翻訳に必要なそ
の他の調節要素を含有する閉環したプラスミドを保持し
ている。大腸菌Ｋ１２ ｘ 大腸菌Ｂ ハイブリッドＲＲ
１／pＥＣＰＬＡ２２を、１０μg／mlテトラサイクリン
を追加したトリプトン・ブロス(ＴＹ)中、２８℃で一晩
増殖させ、次いでＴＹブロスで１：１０に希釈し、２８
℃で６０分間撹拌した。最初の増殖期が終わった後、培
養温度を４２℃まで高めることによって細胞を６時間誘
導した。この誘導した細胞を１mg／ml(水中の終濃度)の
リソチーム溶液で処理して溶菌し、４５秒間隔で１５秒
間×６回の超音波処理を行った。形質転換および未形質
転換細胞の溶菌液を調製し、そのタンパク質含有量を測
定した。次いで、実施例１に従ってこの試料のcＰＬＡ2
活性を検定した。図４は、それぞれの試料中に見い出さ
れる酵素活性とそのタンパク質含有量の関係を示すもの
である。cＰＬＡ2をコードしているＤＮＡを含有しない
大腸菌細胞をネガティブ対照として用いた。この結果
は、本発明のベクターの１つで形質転換された大腸菌細
胞が対照細胞に比べて有意に多いcＰＬＡ2を発現するこ
とを明白に示している。
【００３１】実施例３ cＰＬＡ2の真核細胞発現 cＰＬＡ2の一時的な発現をヒト胚腎セルライン２９３で
行なった。このセルラインはアメリカン・タイプ・カル
チャー・コレクション(ＡＴＣＣ)の永久保存物であり、
受託番号ＣＲＬ １５７３のもとで入手可能である。大
腸菌Ｋ１２ ＤＨ５α／pＨＤＣＰＦおよび大腸菌Ｋ１２
ＤＨ５α／pＨＤＣＰＦＳは、ノーザン・リージョナル
・リサーチ・ラボラトリーズ(ＮＲＲＬ)にそれぞれ受託
番号ＮＲＲＬ Ｂ-１８７７２およびＮＲＲＬ Ｂ-１８７
７３のもとで寄託されている。この寄託はブダペスト条
約に規定に則って為されている。この両菌株は、cＰＬ
Ａ2をコードしているcＤＮＡ、アンピシリンおよびハイ
グロマイシン耐性付与遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素遺
伝子、アデノウイルス主後期プロモーター、ならびに真
核細胞中での転写および翻訳に必要なその他の調節要素
を含有する閉環したプラスミドを保持している。
行なった。このセルラインはアメリカン・タイプ・カル
チャー・コレクション(ＡＴＣＣ)の永久保存物であり、
受託番号ＣＲＬ １５７３のもとで入手可能である。大
腸菌Ｋ１２ ＤＨ５α／pＨＤＣＰＦおよび大腸菌Ｋ１２
ＤＨ５α／pＨＤＣＰＦＳは、ノーザン・リージョナル
・リサーチ・ラボラトリーズ(ＮＲＲＬ)にそれぞれ受託
番号ＮＲＲＬ Ｂ-１８７７２およびＮＲＲＬ Ｂ-１８７
７３のもとで寄託されている。この寄託はブダペスト条
約に規定に則って為されている。この両菌株は、cＰＬ
Ａ2をコードしているcＤＮＡ、アンピシリンおよびハイ
グロマイシン耐性付与遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素遺
伝子、アデノウイルス主後期プロモーター、ならびに真
核細胞中での転写および翻訳に必要なその他の調節要素
を含有する閉環したプラスミドを保持している。
【００３２】Ａ．プラスミドの単離 １００μg／mlのアンピシリンを含有するＤＳブロス[１
Ｌあたりにトリプトン(１２g)、酵母エキス(２４g)、グ
リセロール(４ml)、０.１７Ｍ ＫＨ2ＰＯ4＋０.７２Ｍ
Ｋ2ＨＰＯ4(１００ml)](０.５Ｌ)に大腸菌Ｋ１２ ＤＨ
５α／pＨＤＣＰＦＳ細胞を接種し、エアー振盪器中、
３７℃で一晩インキュベートした。次いで、この培養物
を取り、Ｓorvall ＧＳＡローター(Dupont Co., Instru
ment Products, Newtown, CT.06470)中、７５００rpmで
１０分間、４℃において遠心した。この上清を捨て、細
胞ペレットを２５％スクロースおよび５０mＭトリス／
ＨＣl(Sigma；pＨ８.０)の溶液(１４ml)に再懸濁し、次
にこの混合物をオークリッジ(oakridge)管に移した。こ
の溶液に１０mg／mlリソチーム溶液(２ml)および０.５
Ｍエチレンジアミン四酢酸(ＥＤＴＡ；pＨ８.４)(０.７
５ml)を加え、次いでこれを氷上で１５分間インキュベ
ートした。トリトン(Triton)溶菌混合液[３％ トリトン
Ｘ-１００(Sigma)、０.１９Ｍ ＥＤＴＡ、０.１５Ｍ ト
リス／ＨＣl(pＨ８.０)](１.５ml)をこの溶液に加え、
次いで１５分間インキュベートした。この溶液を、Ｓor
vall ＳＳ３４ローター(Dupont Co., Instrument Produ
cts, Newtown, CT 06470)中、２０,０００rpmで４５分
間、４℃において遠心した。得られたプラスミドＤＮＡ
を含む上清を取り、ＣsＣl(２０.５５g)、１Ｍトリス／
ＨＣl(pＨ８.０)(０.２８ml)および１０mg／ml臭化エチ
ジウム(ＥtＢr)(１.３５ml)の溶液と混合した。この混
合物の最終容量を水で２７mlにした。この混合物を、２
個のＱuick-密封管[Beckman Cat.#342413]中、Ｔi７５
ローター[Beckman Instruments, Inc.]において、４５,
０００rpmで４日間、２０℃において遠心した。プラス
ミドのバンドを２個の新しいＱuick-密封管に別々に集
めた。１０mg／ml ＥtＢr(１５０μl)をそれぞれの管に
加え、次にこの管をＣsＣl／Ｈ2Ｏ(２回蒸留、脱イオン
水)溶液(密度＝１.５６g／ml)で満たし、Ｔi７５ロータ
ー中、４５,０００rpmで２４時間、２０℃で遠心した。
プラスミドのバンドを集め、等容量の水を加えてＣsＣl
を希釈した。ＥtＢrを２〜３倍容量の１−ブタノールで
５回抽出した。プラスミドを含む抽出溶液に２.５倍容
量の無水エタノールを加え、これを室温で５〜１０分間
インキュベートし、次いでＳorvall ＳＳ３４ローター
中、１０,０００rpmで１０分間遠心した。このＤＮＡペ
レットを乾燥し、次いでＴＥ溶液[１mＭ ＥＤＴＡ、１
０mＭトリス／ＨＣl(pＨ８.０)](２００μl)に溶解し
た。
Ｌあたりにトリプトン(１２g)、酵母エキス(２４g)、グ
リセロール(４ml)、０.１７Ｍ ＫＨ2ＰＯ4＋０.７２Ｍ
Ｋ2ＨＰＯ4(１００ml)](０.５Ｌ)に大腸菌Ｋ１２ ＤＨ
５α／pＨＤＣＰＦＳ細胞を接種し、エアー振盪器中、
３７℃で一晩インキュベートした。次いで、この培養物
を取り、Ｓorvall ＧＳＡローター(Dupont Co., Instru
ment Products, Newtown, CT.06470)中、７５００rpmで
１０分間、４℃において遠心した。この上清を捨て、細
胞ペレットを２５％スクロースおよび５０mＭトリス／
ＨＣl(Sigma；pＨ８.０)の溶液(１４ml)に再懸濁し、次
にこの混合物をオークリッジ(oakridge)管に移した。こ
の溶液に１０mg／mlリソチーム溶液(２ml)および０.５
Ｍエチレンジアミン四酢酸(ＥＤＴＡ；pＨ８.４)(０.７
５ml)を加え、次いでこれを氷上で１５分間インキュベ
ートした。トリトン(Triton)溶菌混合液[３％ トリトン
Ｘ-１００(Sigma)、０.１９Ｍ ＥＤＴＡ、０.１５Ｍ ト
リス／ＨＣl(pＨ８.０)](１.５ml)をこの溶液に加え、
次いで１５分間インキュベートした。この溶液を、Ｓor
vall ＳＳ３４ローター(Dupont Co., Instrument Produ
cts, Newtown, CT 06470)中、２０,０００rpmで４５分
間、４℃において遠心した。得られたプラスミドＤＮＡ
を含む上清を取り、ＣsＣl(２０.５５g)、１Ｍトリス／
ＨＣl(pＨ８.０)(０.２８ml)および１０mg／ml臭化エチ
ジウム(ＥtＢr)(１.３５ml)の溶液と混合した。この混
合物の最終容量を水で２７mlにした。この混合物を、２
個のＱuick-密封管[Beckman Cat.#342413]中、Ｔi７５
ローター[Beckman Instruments, Inc.]において、４５,
０００rpmで４日間、２０℃において遠心した。プラス
ミドのバンドを２個の新しいＱuick-密封管に別々に集
めた。１０mg／ml ＥtＢr(１５０μl)をそれぞれの管に
加え、次にこの管をＣsＣl／Ｈ2Ｏ(２回蒸留、脱イオン
水)溶液(密度＝１.５６g／ml)で満たし、Ｔi７５ロータ
ー中、４５,０００rpmで２４時間、２０℃で遠心した。
プラスミドのバンドを集め、等容量の水を加えてＣsＣl
を希釈した。ＥtＢrを２〜３倍容量の１−ブタノールで
５回抽出した。プラスミドを含む抽出溶液に２.５倍容
量の無水エタノールを加え、これを室温で５〜１０分間
インキュベートし、次いでＳorvall ＳＳ３４ローター
中、１０,０００rpmで１０分間遠心した。このＤＮＡペ
レットを乾燥し、次いでＴＥ溶液[１mＭ ＥＤＴＡ、１
０mＭトリス／ＨＣl(pＨ８.０)](２００μl)に溶解し
た。
【００３３】Ｂ．真核セルライン２９３のトランスフェ
クション トランスフェクションの１日前に、２９３細胞を２つの
１００cm2培養皿(Falcon #1005)に皿あたり１ｘ１０6細
胞の密度で蒔いた。細胞を、５％ＣＯ2の加湿した３７
℃のインキュベーター中、１０％ウシ胎児血清[Hyclon
e; Ogden, UT]と５０mg／mlゲンタマイシン(GIBCO)を追
加したＤＭＥＭ[ダルベッコの改良イーグル培地；GIBC
O, Grand Island, N.Y.]に蒔き、増殖させた。精製した
pＨＤＣＰＦ ＤＮＡ(約２０μg)を、担体ＤＮＡの全く
存在しないリン酸カルシウム トランスフェクション緩
衝液[Wiglerら, P.N.A.S. 76 (1979)を参照]に加えた。
トランスフェクションを３７℃で４時間進行させ、次い
でトランスフェクション緩衝液をＤＭＥＭ(上記のよう
に追加した)と交換し、細胞を３日間増殖させた。
クション トランスフェクションの１日前に、２９３細胞を２つの
１００cm2培養皿(Falcon #1005)に皿あたり１ｘ１０6細
胞の密度で蒔いた。細胞を、５％ＣＯ2の加湿した３７
℃のインキュベーター中、１０％ウシ胎児血清[Hyclon
e; Ogden, UT]と５０mg／mlゲンタマイシン(GIBCO)を追
加したＤＭＥＭ[ダルベッコの改良イーグル培地；GIBC
O, Grand Island, N.Y.]に蒔き、増殖させた。精製した
pＨＤＣＰＦ ＤＮＡ(約２０μg)を、担体ＤＮＡの全く
存在しないリン酸カルシウム トランスフェクション緩
衝液[Wiglerら, P.N.A.S. 76 (1979)を参照]に加えた。
トランスフェクションを３７℃で４時間進行させ、次い
でトランスフェクション緩衝液をＤＭＥＭ(上記のよう
に追加した)と交換し、細胞を３日間増殖させた。
【００３４】Ｃ．細胞の溶解 トランスフェクションした培養物を洗浄緩衝液[１４０m
Ｍ ＮaＣl、５mＭ ＫＣl、２mＭ ＥＤＴＡ、２５mＭ Ｈ
ＥＰＥＳ (pＨ７.４)]で１回洗浄し、洗浄緩衝液(１０m
l)を加えてこすり落とすことによって培養皿から採取し
た。この細胞(約１ｘ１０7)を円錐試験管に入れ、遠心
した。１mＭフェニルメタンスルホニルフルオリド、１
００μＭロイペプチンおよび１００μＭペプスタチンＡ
を追加した洗浄緩衝液(１ml)をペレットに加え、出力設
定１で強化マイクロチップを備えたプローブ・ソニケー
ター(Ｗ-３８５型；Heat Systems Ultrasonics)を用い
て細胞を溶解した。４５秒間隔で１５秒間の超音波処理
を６回繰り返した。次いで、トランスフェクションした
２９３の溶菌液のcＰＬＡ2活性を実施例１のようにして
検定した。このような溶菌液の１つで得られた結果を図
５に示す。この図では、cＰＬＡ2活性を溶菌液のタンパ
ク質含有量に対してプロットしている。トランスフェク
ションしていない細胞(その他の点では同じ方法で処理
した)をネガティブ対照として用いた。このグラフは、
トランスフェクションされた細胞がネガティブ対照より
も高いcＰＬＡ2活性を有することを明瞭に示している。
この酵素活性の増加は、プラスミドpＨＤＣＰＦＳがcＰ
ＬＡ2を成功裏に発現しうることを示すものである。
Ｍ ＮaＣl、５mＭ ＫＣl、２mＭ ＥＤＴＡ、２５mＭ Ｈ
ＥＰＥＳ (pＨ７.４)]で１回洗浄し、洗浄緩衝液(１０m
l)を加えてこすり落とすことによって培養皿から採取し
た。この細胞(約１ｘ１０7)を円錐試験管に入れ、遠心
した。１mＭフェニルメタンスルホニルフルオリド、１
００μＭロイペプチンおよび１００μＭペプスタチンＡ
を追加した洗浄緩衝液(１ml)をペレットに加え、出力設
定１で強化マイクロチップを備えたプローブ・ソニケー
ター(Ｗ-３８５型；Heat Systems Ultrasonics)を用い
て細胞を溶解した。４５秒間隔で１５秒間の超音波処理
を６回繰り返した。次いで、トランスフェクションした
２９３の溶菌液のcＰＬＡ2活性を実施例１のようにして
検定した。このような溶菌液の１つで得られた結果を図
５に示す。この図では、cＰＬＡ2活性を溶菌液のタンパ
ク質含有量に対してプロットしている。トランスフェク
ションしていない細胞(その他の点では同じ方法で処理
した)をネガティブ対照として用いた。このグラフは、
トランスフェクションされた細胞がネガティブ対照より
も高いcＰＬＡ2活性を有することを明瞭に示している。
この酵素活性の増加は、プラスミドpＨＤＣＰＦＳがcＰ
ＬＡ2を成功裏に発現しうることを示すものである。
【００３５】実施例４ cＰＬＡ2の安定な真核細胞発現 cＰＬＡ2の安定な発現をヒト胚腎セルライン２９３およ
びＡＶ１２ハムスターセルラインで達成した。このＡＶ
１２セルラインはＡＴＣＣの永久保存物であり、受託番
号ＣＲＬ ９５９５のもとで入手でき、また、２９３セ
ルラインもＡＴＣＣの永久保存物であり、受託番号ＣＲ
Ｌ １５７３のもとで入手できる。cＰＬＡ2をコードし
ている遺伝子を含有するプラスミドは実施例３のＡに記
載したようにして調製した。プラスミドＤＮＡを初めに
制限酵素ＦspＩによる消化によって直線化し、エタノー
ルで沈澱させたことを除き、実施例３のＢに記載したよ
うにして両哺乳動物セルラインをpＨＤＣＰＦＳでトラ
ンスフェクションした。トランスフェクションの後、両
セルラインを別個に培養プレートに蒔き、ＤＭＥＭ中で
３日間増殖させた。次いで、培地を選択培地(上記のよ
うに追加したＤＭＥＭに２００μg／mlのハイグロマイ
シンを加える)に交換し、直線化したプラスミドＤＮＡ
を取込まなかった細胞のすべてを死滅させた。５日後
に、最初に蒔いた細胞の大部分が培養プレートから自然
に分離し、培地を毎週交換することによって除去した
(ＡＶ１２細胞については毎週２回)。しかし、両セルラ
インからコロニーが成長した。プラスチック製ピペット
の先端を用いてこれらのコロニーを２４ウェルのトレイ
(Costar Inc.)に移した。実施例１および３に記載した
ようにしてトランスフェクションしたセルラインを増殖
させ、検定した。この結果を図６〜図８に示した。図６
および図７は８種類の形質転換したＡＶ１２セルライン
の結果を示すものであり、図８は１種類の形質転換した
２９３セルラインの結果を示すものである。ネガティブ
対照は同様に処理した未形質転換セルラインである。こ
れらの結果は、本発明のベクターによる形質転換によっ
てcＰＬＡ2を発現する安定なセルラインが得られたこと
を明瞭に示している。現在までに４８の形質転換ＡＶ１
２および６つの形質転換２９３セルラインを検定した
が、そのすべてが対照のレベル以上のcＰＬＡ2を発現し
た。
びＡＶ１２ハムスターセルラインで達成した。このＡＶ
１２セルラインはＡＴＣＣの永久保存物であり、受託番
号ＣＲＬ ９５９５のもとで入手でき、また、２９３セ
ルラインもＡＴＣＣの永久保存物であり、受託番号ＣＲ
Ｌ １５７３のもとで入手できる。cＰＬＡ2をコードし
ている遺伝子を含有するプラスミドは実施例３のＡに記
載したようにして調製した。プラスミドＤＮＡを初めに
制限酵素ＦspＩによる消化によって直線化し、エタノー
ルで沈澱させたことを除き、実施例３のＢに記載したよ
うにして両哺乳動物セルラインをpＨＤＣＰＦＳでトラ
ンスフェクションした。トランスフェクションの後、両
セルラインを別個に培養プレートに蒔き、ＤＭＥＭ中で
３日間増殖させた。次いで、培地を選択培地(上記のよ
うに追加したＤＭＥＭに２００μg／mlのハイグロマイ
シンを加える)に交換し、直線化したプラスミドＤＮＡ
を取込まなかった細胞のすべてを死滅させた。５日後
に、最初に蒔いた細胞の大部分が培養プレートから自然
に分離し、培地を毎週交換することによって除去した
(ＡＶ１２細胞については毎週２回)。しかし、両セルラ
インからコロニーが成長した。プラスチック製ピペット
の先端を用いてこれらのコロニーを２４ウェルのトレイ
(Costar Inc.)に移した。実施例１および３に記載した
ようにしてトランスフェクションしたセルラインを増殖
させ、検定した。この結果を図６〜図８に示した。図６
および図７は８種類の形質転換したＡＶ１２セルライン
の結果を示すものであり、図８は１種類の形質転換した
２９３セルラインの結果を示すものである。ネガティブ
対照は同様に処理した未形質転換セルラインである。こ
れらの結果は、本発明のベクターによる形質転換によっ
てcＰＬＡ2を発現する安定なセルラインが得られたこと
を明瞭に示している。現在までに４８の形質転換ＡＶ１
２および６つの形質転換２９３セルラインを検定した
が、そのすべてが対照のレベル以上のcＰＬＡ2を発現し
た。
【００３６】実施例５ ウエスタンブロット分析 天然のcＰＬＡ2(米国特許出願番号０７／５７３,５１３
に記載)と本発明のＤＮＡ配列のいずれかを用いて得た
組換えcＰＬＡ2の間の免疫学的および電気泳動的な等価
性を、ウエスタンブロット分析によって確かめた。使用
した試料および方法を以下に説明する。試料１ ：大腸菌Ｋ１２ ｘ 大腸菌ＢのハイブリッドＲＲ
１／pＥＣＰＬＡ２２細胞(実施例２に記載)を、Ｏ.Ｄ.
600が１.０になるまで増殖させた。この細胞(１ml)を遠
心し、培地を除去した。このペレットを泳動緩衝液[２
％ ＳＤＳ、３０％グリセロール、０.１％ブロモフェノ
ールブルー(Sigma)、６Ｍ尿素、および１０％ ２-メル
カプトエタノールを含有する０.１２５Ｍトリス／ＨＣl
(pＨ６.８)](２５０μl)に溶解した。試料２ ：cＰＬＡ2をコードしているプラスミドpＥＣＰ
ＬＡ２２を含まない大腸菌Ｋ１２ ｘ 大腸菌Ｂのハイブ
リッドＲＲ１細胞を、実施例１に記載したようにして増
殖させ、処理した。試料３ ：米国特許出願番号０７／５７３,５１３に記載
したようにしてヒト単芽球様セルラインＵ９３７から単
離した天然のcＰＬＡ2(５００ng)を泳動緩衝液(３０μ
l)と混合した。
に記載)と本発明のＤＮＡ配列のいずれかを用いて得た
組換えcＰＬＡ2の間の免疫学的および電気泳動的な等価
性を、ウエスタンブロット分析によって確かめた。使用
した試料および方法を以下に説明する。試料１ ：大腸菌Ｋ１２ ｘ 大腸菌ＢのハイブリッドＲＲ
１／pＥＣＰＬＡ２２細胞(実施例２に記載)を、Ｏ.Ｄ.
600が１.０になるまで増殖させた。この細胞(１ml)を遠
心し、培地を除去した。このペレットを泳動緩衝液[２
％ ＳＤＳ、３０％グリセロール、０.１％ブロモフェノ
ールブルー(Sigma)、６Ｍ尿素、および１０％ ２-メル
カプトエタノールを含有する０.１２５Ｍトリス／ＨＣl
(pＨ６.８)](２５０μl)に溶解した。試料２ ：cＰＬＡ2をコードしているプラスミドpＥＣＰ
ＬＡ２２を含まない大腸菌Ｋ１２ ｘ 大腸菌Ｂのハイブ
リッドＲＲ１細胞を、実施例１に記載したようにして増
殖させ、処理した。試料３ ：米国特許出願番号０７／５７３,５１３に記載
したようにしてヒト単芽球様セルラインＵ９３７から単
離した天然のcＰＬＡ2(５００ng)を泳動緩衝液(３０μ
l)と混合した。
【００３７】すべての試料を１００℃で５分間加熱し、
各試料(３０μl)を１０％ ＳＤＳポリアクリルアミドゲ
ル(１６０ｘ１４０ｘ１.５mm)の別レーンにおいて泳動
させた。染料がゲルの底に達するまで５０mＡでゲルを
泳動させた。ＢioＲad Ｔransblot装置を用い、２０mＭ
ＣＡＰＳ緩衝液(pＨ１１；Sigma, C-2632)中、２５０m
Ａで２時間泳動させて、タンパク質をＰroＢlottTMメン
ブラン(Applied Biosystems)に移動させた。タンパク質
が移動した後に、フィルターを取り、これを振動台上の
ＴＢＳＴ[０.１５Ｍ ＮaＣl、０.１％ Ｔween ２０、５
０mＭ トリス／ＨＣl(pＨ８.０)]中、室温で５分間洗浄
した(３回)。次いで、このブロットを、５％脱脂粉乳(C
arnation)を含むＴＢＳ[０.１５Ｍ ＮaＣl、５０mＭ ト
リス／ＨＣl(pＨ８.０)]中で３時間ブロックし、次いで
もう一度ＴＢＳ＋３％ウシ血清アルブミン中で３時間ブ
ロックした。次に、このブロットをＴＢＳＴ(１００ml)
中で５分間洗浄した(３回)。cＰＬＡ2に特異的なモノク
ローナル抗体は米国特許出願番号０７／６６３,３３５
に記載されている。これら抗体の１つ(３.１)を、本実
施例のcＰＬＡ2のブロットをプローブするための１次抗
体として用いた。０.５mg／mlの濃度の１次抗体を、Ｔ
ＢＳＴ＋０.０２％アジ化ナトリウム中、１：５７０に
希釈した。タンパク質を含むブロットをこの１次抗体溶
液中において４℃で一晩インキュベートし、次いで先に
記したように洗浄した。次いで、このブロットを、ＴＢ
ＳＴ中に１：５０００で希釈した免疫アフィニティー精
製ウサギ抗-マウスＩgＧ抗体[Jackson ImmunoResearch,
Cat.#315-005-045]の溶液中において室温で６時間イン
キュベートすることによって、２次抗体と反応させた。
次に、このブロットを上記のように洗浄し、続いて西洋
ワサビペルオキシダーゼにコンジュゲート化させたヤギ
抗-ウサギＩgＧ[Pel-freeze, Cat.#721307-1]の１：５
００希釈液(ＴＢＳＴ)中において４℃で一晩インキュベ
ートした。このブロットを上記のように洗浄し、３％過
酸化水素(３００μl)を含む４−クロロナフトール(メタ
ノール中３mg／ml)(８ml)；０.１Ｍリン酸緩衝液(pＨ
６)(４２ml)の溶液中において室温で６０分間発色させ
た。このウエスタンブロット分析の結果を図９に示す。
試料１および３中の染色されたバンドは、Ｕ９３７セル
ライン中に見い出される天然のcＰＬＡ2が、ＳＤＳゲル
泳動させたときには、組換え法によって製造したcＰＬ
Ａ2(本発明の特許請求されたＤＮＡ配列のいずれかによ
ってコードされている)と同じ移動度を有することを示
している。ネガティブ対照である試料２は、本発明のベ
クターを含有しないとcＰＬＡ2が発現されないことを示
している。
各試料(３０μl)を１０％ ＳＤＳポリアクリルアミドゲ
ル(１６０ｘ１４０ｘ１.５mm)の別レーンにおいて泳動
させた。染料がゲルの底に達するまで５０mＡでゲルを
泳動させた。ＢioＲad Ｔransblot装置を用い、２０mＭ
ＣＡＰＳ緩衝液(pＨ１１；Sigma, C-2632)中、２５０m
Ａで２時間泳動させて、タンパク質をＰroＢlottTMメン
ブラン(Applied Biosystems)に移動させた。タンパク質
が移動した後に、フィルターを取り、これを振動台上の
ＴＢＳＴ[０.１５Ｍ ＮaＣl、０.１％ Ｔween ２０、５
０mＭ トリス／ＨＣl(pＨ８.０)]中、室温で５分間洗浄
した(３回)。次いで、このブロットを、５％脱脂粉乳(C
arnation)を含むＴＢＳ[０.１５Ｍ ＮaＣl、５０mＭ ト
リス／ＨＣl(pＨ８.０)]中で３時間ブロックし、次いで
もう一度ＴＢＳ＋３％ウシ血清アルブミン中で３時間ブ
ロックした。次に、このブロットをＴＢＳＴ(１００ml)
中で５分間洗浄した(３回)。cＰＬＡ2に特異的なモノク
ローナル抗体は米国特許出願番号０７／６６３,３３５
に記載されている。これら抗体の１つ(３.１)を、本実
施例のcＰＬＡ2のブロットをプローブするための１次抗
体として用いた。０.５mg／mlの濃度の１次抗体を、Ｔ
ＢＳＴ＋０.０２％アジ化ナトリウム中、１：５７０に
希釈した。タンパク質を含むブロットをこの１次抗体溶
液中において４℃で一晩インキュベートし、次いで先に
記したように洗浄した。次いで、このブロットを、ＴＢ
ＳＴ中に１：５０００で希釈した免疫アフィニティー精
製ウサギ抗-マウスＩgＧ抗体[Jackson ImmunoResearch,
Cat.#315-005-045]の溶液中において室温で６時間イン
キュベートすることによって、２次抗体と反応させた。
次に、このブロットを上記のように洗浄し、続いて西洋
ワサビペルオキシダーゼにコンジュゲート化させたヤギ
抗-ウサギＩgＧ[Pel-freeze, Cat.#721307-1]の１：５
００希釈液(ＴＢＳＴ)中において４℃で一晩インキュベ
ートした。このブロットを上記のように洗浄し、３％過
酸化水素(３００μl)を含む４−クロロナフトール(メタ
ノール中３mg／ml)(８ml)；０.１Ｍリン酸緩衝液(pＨ
６)(４２ml)の溶液中において室温で６０分間発色させ
た。このウエスタンブロット分析の結果を図９に示す。
試料１および３中の染色されたバンドは、Ｕ９３７セル
ライン中に見い出される天然のcＰＬＡ2が、ＳＤＳゲル
泳動させたときには、組換え法によって製造したcＰＬ
Ａ2(本発明の特許請求されたＤＮＡ配列のいずれかによ
ってコードされている)と同じ移動度を有することを示
している。ネガティブ対照である試料２は、本発明のベ
クターを含有しないとcＰＬＡ2が発現されないことを示
している。
【図１】 pＨＤＣＰＦの制限部位および機能地図を示
す模式図である。
す模式図である。
【図２】 pＨＤＣＰＦＳの制限部位および機能地図を
示す模式図である。
示す模式図である。
【図３】 pＥＣＰＬＡ２１の制限部位および機能地図
を示す模式図である。
を示す模式図である。
【図４】 形質転換および未形質転換の大腸菌細胞にお
いて見い出された酵素活性とタンパク質含量の関係を示
すグラフである。
いて見い出された酵素活性とタンパク質含量の関係を示
すグラフである。
【図５】 ベクターpＨＤＣＰＦＳで形質転換した２９
３細胞の培養物を用いて一時的な発現実験を行なった結
果を示すグラフである。
３細胞の培養物を用いて一時的な発現実験を行なった結
果を示すグラフである。
【図６】 pＨＤＣＰＦＳで形質転換したＡＶ１２ハム
スターセルラインのcＰＬＡ2活性を示すグラフである。
スターセルラインのcＰＬＡ2活性を示すグラフである。
【図７】 pＨＤＣＰＦＳで形質転換したＡＶ１２ハム
スターセルラインのcＰＬＡ2活性を示すグラフである。
スターセルラインのcＰＬＡ2活性を示すグラフである。
【図８】 pＨＤＣＰＦＳで形質転換した２９３ヒト腎
セルラインのcＰＬＡ2活性を示すグラフである。
セルラインのcＰＬＡ2活性を示すグラフである。
【図９】 pＥＣＰＬＡ２２で形質転換した大腸菌の培
養物(レーン１)におけるcＰＬＡ2の発現を、未形質転換
の大腸菌培養物(レーン２)およびヒト単芽球様セルライ
ンから単離した天然のcＰＬＡ2(レーン３)と比較する免
疫ブロットの結果を示す模式図である。
養物(レーン１)におけるcＰＬＡ2の発現を、未形質転換
の大腸菌培養物(レーン２)およびヒト単芽球様セルライ
ンから単離した天然のcＰＬＡ2(レーン３)と比較する免
疫ブロットの結果を示す模式図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ｃ１２Ｎ 9/16 Ｄ 7823−4Ｂ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 ジヨー・アン・ホスキンズ アメリカ合衆国46256インデイアナ州イン デイアナポリス、ターン・コート8229番 (72)発明者 ルース・マリア・クレイマー アメリカ合衆国46208インデイアナ州イン デイアナポリス、ガバナーズ・ロード3740 番 (72)発明者 ジヨン・デイビツド・シヤープ アメリカ合衆国46226インデイアナ州イン デイアナポリス、ダニエル・ドライブ5304 番 (72)発明者 ドナルド・リー・ホワイト アメリカ合衆国46202インデイアナ州イン デイアナポリス、ナンバー102、インデイ アナ・アベニユー430番
Claims (4)
- 【請求項１】 以下に示すアミノ酸配列： 【化１】 【化２】 【化３】 【化４】 を有するタンパク質(細胞質ゾルホスホリパーゼＡ2)を
コードしている単離されたＤＮＡ配列を含有する遺伝
子。 - 【請求項２】 ＤＮＡ配列が以下に示すＤＮＡ配列： 【化５】 【化６】 【化７】 【化８】 【化９】 である請求項１に記載の遺伝子。
- 【請求項３】 受託番号Ｎo.１８７７４のもとでノーザ
ン・リージョナル・リサーチ・ラボラトリーズ(ＮＲＲ
Ｌ)に寄託されている大腸菌Ｋ１２ ＤＨ５α／pＥＣＰ
ＬＡ２１、受託番号Ｎo.１８７７５のもとでＮＲＲＬに
寄託されている大腸菌Ｋ１２と大腸菌Ｂのハイブリッド
ＲＲ１／pＥＣＰＬＡ２２、受託番号Ｎo.１８７７２の
もとでＮＲＲＬに寄託されている大腸菌Ｋ１２ ＤＨ５
α／pＨＤＣＰＦ、および受託番号Ｎo.１８７７３のも
とでＮＲＲＬに寄託されている大腸菌Ｋ１２ ＤＨ５α
／pＨＤＣＰＦＳである、cＰＬＡ2をコードしている宿
主細胞。 - 【請求項４】 (a)請求項３に記載の宿主細胞を適当な
増殖培地で培養して請求項１に記載のタンパク質を産生
させ； (b)該タンパク質を単離し； (c)該単離したタンパク質を、該タンパク質の酵素活性
を阻害しうると推測される化合物と接触させ；そして (d)該タンパク質の酵素活性が該化合物によって阻害さ
れるか否かを測定する； ことからなる、請求項３に記載の宿主細胞を用いて薬物
をスクリーニングする方法。
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| JPH0829103B2 JPH0829103B2 (ja) | 1996-03-27 |
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| US20040001106A1 (en) * | 2002-06-26 | 2004-01-01 | John Deutscher | System and process for creating an interactive presentation employing multi-media components |
| DE60222185T2 (de) * | 2002-12-02 | 2008-06-12 | Council Of Scientific And Industrial Research | Verfahren zur Prävention und/oder Behandlung von Asthma mit Parabromophenacyl Bromide |
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- 1992-04-10 JP JP4090788A patent/JPH0829103B2/ja not_active Expired - Fee Related
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-
1993
- 1993-04-12 US US08/046,508 patent/US5328842A/en not_active Expired - Fee Related
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