JPH0499797A - 新規ペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 皮栗上■利且公団 本発明は、オピオイド活性を有する新規ペプチドに関す
る。

本発明のペプチドは、鎮痛剤、麻酔剤等として利用する
ことができる。

従来■肢止 従来から、ペプチド化合物が鎮痛作用あるいは麻酔作用
を有することは広く知られている。βエンドルフィン、
エンケファリン、グイノルフィンなどはその代表的なも
のの一つである。近年食品由来のペプチドや、蛋白質の
加水分解ペプチドに種々の生理活性が存在することが知
られてきており、多くのペプチドが発表されている。

本発明者らは血清アルブミンから派生するペプチドを研
究する過程において、血清アルダ、ミンのアミノ酸配列
の一部を構成するペプチド（牛およびブタ血清アルブミ
ンの３９９〜４０４に相当）が強いオピオイド活性を有
することを見出し、本発明を完成するに至った。

日　く”　しよ゛と　るｉ 従って、本発明は強いオピオイド活性を有する新規ペプ
チドを提供することを課題とする。

ｉｎ′　　るための 本発明のペプチドを得るためには、生血清アルブミンな
どの当該配列を含む蛋白質の酸素加水分解物からこれを
単離するか、または化学合成により得ることができる。

特に合成にあたっては、市販のペプチドシンセサイザー
等を用いて節便に合成することができる。化学合成にお
いては以下の方法で実施可能である。

合成装置として、バイオサーチ社製のＳＡＭ２ペプチド
合成装置を用い、ペプチドの担体としての樹脂からの脱
離と保護基の除去は、１０％アニソールを含む無水フン
化水素中で、Ｏ′ｃの温度条件下に１時間撹拌すること
により行う。

上記フン化水素を留去した後、樹脂をエーテルで洗浄し
、３０％酢酸によりペプチドを抽出する。

抽出により得られたペプチドは、３０％酢酸で平衡化し
たバイオゲルＰ−２カラム（２，６Ｘ８０ｃｍ）を用い
てゲル濾過した後、オクタデシルシリル（ＯＤＳ）カラ
ム（Ｃｏｓｍｏｓｉｌ　５Ｃ＋ｓ、２Ｘ２５ｃｉ１１）
による逆相高速液体クロマトグラフィにより精製する。

目的とする本ペプチドは、０．１％トリフルオロ酢酸を
含むアセトニトリルの直線的濃度勾配による展開の際に
、３３％アセトニトリルの濃度でカラムから溶出する。

また、牛またはブタ血清アルブミンを酵素加水分解によ
り調製する場合には以下の方法で入手することができる
。市販の生血清アルブミンをペプシンを用いて酵素加水
分解し、加熱により酵素を失活させた後、遠心を行い上
清を得る。この上清を上述したカラムと同し条件で）Ｉ
ＰＬｃ処理に付する。

オピオイド活性は３３％アセトニトリルの濃度で溶出さ
れる。この両分をさらにフェニル力、ラムおよびシアノ
プロピルカラムによるＨＰＬＣで精製することにより純
粋なペプチドが得みれる。このペプチドはＴｙｒ−Ｇ　
１　ｙ−Ｐｈｅ−Ｇ　１２　ｎ−Ａｓｎ−八１ａの配列
を有する。

このようにして得られたペプチドが上記配列を有するこ
とはプロティンシーケンサ−による配列分析、アミノ酸
組成を確認することで、特定することができる。

本ペプチドの塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩な
どがある。

上述した方法で得られたペプチドはオピオイド活性を有
しており、この活性は次のようにして確認される。オピ
オイドレセプターには、μ、に、σ。

δの４レセプターが存在しているが本ペプチドでは、μ
レセプターに対しては弱い作用しか示さず、δレセプタ
ーには強い作用を示す。

■　μレセプターに対する反応 測定方法： 体重３００〜３５０ｇのモルモットより抽出した回腸か
ら紹走筋神経叢標本を調製し、該標本の一端を糸を介し
て等長性トランスジューサに接続し、他端を内容積２−
のマグナス管の底に固定した。

マグナス管乙こはタレブスーリンゲル液を満し、３７°
Ｃの温度に保ち、０□／Ｃｏ□混合ガス（９５：５）を
通気した。マグナス管内の電極には１０秒に１回の割合
で電気刺激（１０ｖ、０．５ｍ５ｅｃ）を与え、筋収縮
の張力を電気的に記録した。収縮を５０％抑制するオピ
オイド物質の濃度をＩＣ５゜とじて測定する。本ペプチ
ドはＩｃｓ。・２３０μ門であった。

■　δレセプターに対する反応 マウス輪精管を用いた測定方法により測定する。

２０週齢のゴ性ＪＣＩ？マウスの輸精管をモルモント回
腸の場合と同様にマグナス管に懸し、硫酸マグネシウム
を含まないタレブスリンゲル液中で電気刺激による収縮
を測定した。

本ペプチドはＩＣ２゜、８．５μ門であった。尚本ペプ
チドはδレセプターＬこ選択性が高く、強い麻酔作用を
示すエンケファリン類と同様の活性が期待てきる。

以下に実施例を示し、さらに本発明の詳細な説明する。

実施例１　（生血清アルブミンより本ペプチドの調製） 牛血清アルブミンをＨＣＩ！、にてｐ）１２とし、１０
■／雁の条件でベプンンを２００μｇ／−となるよう添
加し、３７°Ｃで５時間の反応を行う。次いでｐＨをＮ
ａ０ｆｌにより中性に調整し次いで１００°Ｃに１０分
間保持して酵素を失活させた。その後、遠心分離にまり
上清を得て、この上清をＨＰＬＣに付した。ＨＰＬＣは
Ｃｏｓｍｏｓ　ｉ　１５ｃ、ｓカラム（２５０Ｘ　２０
ｍ＋ｎ、ナカライテスク製）を用い、Ｏ〜６０％アセト
ニトリル濃度勾配（０，１χ　トリフルオロ酢酸含有）
で１％／分の直線濃度勾配条件下で１０戚／分の流速で
溶出した。目的とするペプチドは、第１図にりで示した
両分中に溶出された、この画分を集め、ついでＣｏｓ＋
ｗｏｓｉｌ　ｓｐｈカラム（２５０Ｘ４．６ｍ）を装置
した肝ＬＣに付し、同一濃度勾配条件でｌｄ／分の流速
で溶出させた。

第２図に汐で示す位置に本発明ペプチドが溶出された。

この画分を集め、さらにＣｏｓｍｏｓｉｌ　５　ＣＮカ
ラム（４，６Ｘ　２５０ｍｍ）にて同様に精製した。第
３図番ころで示す位置にペプチドは溶出された。得られ
たペプチドをペプチドシーケンサ−により分析したとこ
ろＴｙｒ−Ｇ　ｉ　ｙ−ｐｈｅ−Ｇ　１　ｕ−Ａｓｎ−
＾ｌａの配列を有していた。又ペプチドのアミノ酸組成
比をアミノ酸分析計により分析したところ、Ａ　１　ａ
：Ａｓｐ：Ｇ　ｆ２　ｕ：Ｇ　７！ｙ：Ｐｈｅ：Ｔｙｒ
が各等モルずつ検出され、理論値に一致した。さらに本
ペプチドをシリカゲル薄層クロマトグラフィを行った。

展開溶媒としてｎブタノール：酢酸：ピリジン：水＝１
５＝３；１０　：　１２を使用し展開させたところＩｆ
ｆ値は０．４３を示した。

実施例２（化学合成による調製） ＳＡＭ２ペプチド合成装置（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ社製）
により、同装置のプロトコールに従って合成した。

即ち１ｇ当り０．３ｓｓｏｊ！のｔ−Ｂｏｃ−Ａ　ｎ　
ａを結合したアシルオキシメチル樹脂２ｇをペプチド合
成装置の反応容器にセントし、４５χ（ｖ／ν）トリフ
ルオロ酢酸、２．５χ（ｖ／ν）アニソール、５２．５
χ（ｖ／ν）ジクロロメタンを含むデブロック液と２０
分間接触させＬ−Ｂｏｃ基を除いた。ジクロロメタンに
よる洗浄の後、１０％（ｖ／ν）ジイソプロピルエチル
アミンを含むジクロロメタンにて樹脂を中和し、ジクロ
ロメタンにより洗浄した。その後４．Ｏｍｍｏ　ｌのｔ
−Ｂｏｃ−Ａｓｎおよび４．０ｍｍｏ　ｉのジイソプロ
ピルカルボジイミド、（それぞれ理論当量の６．７倍）
を含む２０〆のジクロロメタン、ジメチルフォルムアミ
ド混合液中で２時間室温にて反応せしめた。ジメチルフ
ォルムアミドおよびジクロロメタンにて順次洗浄した後
０．４ＭＮ−アセチルイミダゾールを含むジメチルフォ
ルムアミド中で未反応のα−アミノ基をアセチル化した
。この樹脂をジクロロメタンにて洗浄した後、上記と同
様にデブロッキングを行い、以下同様にＣ末端側からｔ
−Ｂｏｃ−Ｇ　ｌ　ｎ、　ｔ−Ｂｏｃ−Ｐｈｅ、　ｔ−
Ｂｏｃ−Ｇ　１２　ｙｔ−Ｂｏｃ−Ｔｙｒ（Ｃ１２２−
８２１）を順次結合せしめ、ｔ−Ｂｏｃ−Ｔｙｒ（ＣＩ
２　ｚ−Ｂｚ　ｊ！　）−Ｇ　１　ｙ−Ｐｈｅ−Ｇ　１
　ｎ−Ａｓｎ−Ａ　Ｉ２　ａ樹脂を得た。

この樹脂を１０％アニソールを含む無水フッ化水素中で
１時間０°Ｃにて反応させた後、フッ化水素の留去およ
びエーテルによる洗浄を行った。得られたペプチドおよ
び樹脂の混合物から３０％酢酸にてペプチドを抽出し凍
結乾燥によって約２００■の粗ペプチドを得た。

粗ペプチドを０．１′１）リフルオロ酢酸に熔解した後
、オクタデシルシラン（００５）カラム（Ｃｏｓｍｏｓ
　ｉ　ｌ　＋５Ｃ＋＋ｔ、２５０ｘ２０ａｍナカライテ
スク社製）を接続した高速液体クロマトグラフ（？ｌ６
００型、日本ウォータース社製）により、０．１χのト
リフルオロ酢酸を含むアセトニトリルの直線的濃度勾配
（０〜５０％１５０分、１０ｄ／分にて展開した。目的
とするペプチドはアセトニトリル濃度的３３％にて溶出
された。

このようにして得られた物質がＴｙｒ−Ｇ　１　ｙ−Ｐ
ｈｅ−Ｇ　ｌ　ｎＡｓｎ−八１２ａであることはアミノ
酸分析Ｔｙｒ：Ｇ　Ｉ！　ｙ：Ｐｈｅ：Ｇｆｕ：Ａｓｐ
：Ａｆａ＝１：１：１：１：１およびプロテインンケン
サ（アブライドハイオンステムズ製４７７Ａ）により確
認、された。

光凱幻四果 本発明の実施により、オピオイド活性を有しδレセプタ
ー選択性の高い新規ペプチドが提供される。本ペプチド
は麻酔剤、鎮痛剤として有用である。

【図面の簡単な説明】

第１図は酵素分解を付した生血清アルブミンのＣｏｓｍ
ｏｓｉｌ　５Ｃ＋ｅカラムによるＨＰＬＣパターンを示
す。 ４部の両分に目的とする本ペプチドが含有されている。 第２図は、Ｃｏｓｍｏｓｉｌ　　５Ｐｈカラムにより分
画したＩ（ＰＬＣパターンを示す。４部に目的とする本
ペプチドが溶出されている。第３区は、Ｃｏｓｍｏｓ　
ｉ　１５ＣＮカラムにより分画したＨＰＬＣパターンを
示す。 （へ）部に目的とする本ペプチドが溶出される。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 下記式で示されるペプチド又はその塩、 Ｈ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ａｌａ
   −ＯＨ