JPH0493655A - ホスファチジルコリンの定量方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、ホスファチジルコリン（以下ＰＣト略称する
）の迅速かつより正確な定量方法に関する。

〔従来の技術〕

リン脂質は「レシチン」の名称で知られている生物界に
広く分布する生体成分であって、ホスファチジルコリン
（ＰＣ）、ホスファアチジルエタノールアミン（ＰＥ）
、ホスファチジルイノシトール（Ｐ１）　、ホスファチ
ジルセリン（ＰＳ）、リソホスファチジルコリン（ＬＰ
Ｇ）などの総称であるが、この「レシチン」は化学的な
意味ではｐｃを指すものである。

このＰＣは天然に存在する界面活性作用を示す物質であ
り、動物、植物、酵母、カビ類に広く分布しており、こ
れらの供給源から比較的安価で大量に供給可能ないわゆ
るバイオサーファクタントの１つである。そしてその乳
化作用、分散作用、湿潤作用などの界面活性作用を利用
して、パン類、ケーキ類、チョコレート、マーカリン、
ショートニング、クリーム、キャンデイ、インスタント
ココア、インスタントスープ、チューインガム、アイス
クリーム、めん類などの食品の製造、石油製品、医薬品
、化粧品、飼料などの調製のような多くの用途に利用さ
れている。

これらのＰＣの用途の拡大と高度化に伴なってＰＣをよ
り高純度で製造することへの要求が高まりつつある。例
えば、ドラッグデリバリシステム（ＤＤＳ）のための医
薬品製造とか注射薬製造の場合においては、その純度が
可及的に高いものであることが必要である。そのために
はＰＣの製造工程の管理に信頼できるＰＣの純度検定手
段の導入が必要となる。

これまでに多くの研究者によってリン脂質組成分析方法
の提案がなされているが、研究目的に沿った個別の課題
解決のために工夫されたものが多く、汎用性に欠ける欠
点があった。このため番二より汎用性のある分析方法の
開発を目的として二次元薄層クロマトグラフィー（ＴＬ
Ｃ）によるリン脂質の定量分析法が提案された（渡辺睦
人ほかによる油化学第３５巻１２号（１９８６年）第２
４〜３０頁）。この方法は従来法とは異なり、分析工程
をやや簡略化しているが、未だ測定に時間と手数を要し
、工程管理のだめの分析法としては不適当である他に、
用いる吸着材中に残留するリン脂質のための誤差を伴う
欠点があった。また、変動係数（ＣＶ）が約７％であり
、再現性は未だ満足すべきものではなかった。

またリン脂質の定量分析法として迅速な測定を可能とす
る高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いる方
法の提案もいくつかなされている。この方法の１つにに
、　Ａｉｚｅｌｍｉｉｌｌｅｒの提案した方法（Ｆｅｔ
ｔｅ、　５ｅｉｆｅｎ、　Ａｎｓｔｒｉｃｈｍｉｔｔｅ
ｌ。

８６　Ｎｏ、　８　、３２２〜３２５（１９８４））が
ある。この方法は検出器としてＵＶディテクターを用い
るもので感度が良くきわめてシャープなピークが得られ
る。しかしながら、リン脂質中に存在する脂肪酸部分の
二重結合に検出器は敏感に反応し、ＰＣが二重結合を有
するものか、または飽和のものかで分析結果に差異が生
ずる欠点がある。すなわち、例えば卵黄由来のＰＣと、
大豆由来のＰＣとでは分析結果が異なる。従って、この
方法も汎用性のある測定方法とはなしがたい。

さらに同様の高速液体クロマトグラフィーを検出器とし
てＲ１ディテクター（示差屈折率検出器）を用いて行う
方法もＪ、Ｓ、　　Ｒｈｅｅらによって提案されティる
（Ｊ、Ａ、Ｏ，Ｃ，Ｓ、　　ｖｏｌ　　５９．　Ｎｏ、
２９８〜９９　（Ｆｅｂ、　１９８２））　、しかしな
がらこの方法では、シリカゲルカラムを吸着材として用
い、この吸着材に通常用いられるクロロホルム／メタノ
ール／アセテート／水（＝　１４／１４／　ｌ　／　ｌ
　）系の溶媒を溶離液として用いるものでこの溶離液は
Ｒ１を検出器とする場合感度が低いことからこの方法を
実用的に使用することはできない。

〔発明が解決しようとする課題〕

従って、ＰＣの商業生産における工程管理や、製品とし
てのＰＣの純度の検定や、製品または原材料中のＰＣの
含有量の定量、検定などのために簡便でありかつ正確で
あると共にその分析操作において迅速性があり、またＰ
Ｃに含まれる脂肪酸部分の二重結合の有無にかかわらず
分析結果１こ変動のない、すなわち汎用性のある分析測
定方法の開発が強く求められている。

〔課題を解決するための手段〕

そこで本発明者らは簡便で迅速性があり、かつ正確な測
定結果の得られる測定方法の開発について鋭意研究を重
ねた結果次に述べる新規なＰＣの定量分析方法を見出し
て本発明を完成したのである。

すなわち、本発明は、ＰＣを含有する試料を、シリカゲ
ルを固定相とし、ヘキサン／イソブロピルアルコール／
水の混合溶媒を移動相とする高速液体クロマトグラフィ
ーに付し、溶離液を示差屈折率検出器すなわちＲ１検出
器によって測定することからなるＰＣを含有する試料中
のＰＣの定量方法に関する。

更に具体的には本発明は上記した高速液体クロマトグラ
フィーにおいて、ヘキサン／イソプロピルアルコール／
水＝０．５〜２／２〜８１０．５〜２の組成割合、殊に
好ましくはヘキサン／イソプロピルアルコール／水−１
／４／１の組成割合の混合溶媒を移動相とすることを特
徴とするものである。

そして本発明にあってはＰＣを含有する試料中のＰＣの
定量のために、上記したように固定相および移動相を特
定の組み合わせとし、またＰＣの検出手段にＲ１検出器
を用いたがためにきわめて迅速かつ正確に試料中のＰＣ
量を定量することができるようになったのである。

ところでＰＣを含有する試料の高速液体クロマトグラフ
ィーにおいて移動相にｎ−ヘキサン／イソプロピルアル
コール／水−１／４／１（７）ｆｉ合物が用いられるこ
とは上記した先行技術文献に開示されたところであるが
、この先行技術文献において上記溶媒混合物が用いられ
る理由は、この文献において用いたＰＣの検出手段がＵ
Ｖ検出器であり、そして上記溶媒混合物が２１０ｎｍ近
傍の紫外領域の波長の光の吸収を示さない溶媒を選択し
て使用したものであるという事実に基づくもので、この
場合における考慮しうる溶媒系は水、アルコールおよび
炭化水素しかなく、そして上記溶媒混合物がＵＶ検出器
用の慣用の移動相、つまり溶離液であったのである。そ
して上。

記の溶媒混合物には水が含まれており、この混合物を移
動相としてシリカゲルを固定相とするクロマトグラフィ
ーに用いることは水がシリカゲルの表面に薄層状に吸着
されてシリカゲルの本来の分離機能を阻害するものと考
えられるので、吸着分離溶出原理からすればかかる移動
相と固定相との組み合わせはきわめて特殊な例であると
いうことができる。

一方溶離液中の目的成分の検出をＲ１検出器で行なう場
合には一般的に移動相に有機溶媒の混合比率の高いもの
は用いられていない。

このような技術的背景からすれば、ＰＣを含有する試料
中のＰＣの定量に当って、シリカゲルを固定相とし、そ
して通常ＵＶ検出器を用いる場合の慣用の移動相であっ
てしかもシリカゲルを固定相とする場合にはむしろ不適
当なものであると考えられるヘキサン／イソプロピルア
ルコール／水の混合溶媒を用い、しかして溶離液中のＰ
Ｃの検出に有機溶媒の混合比率が高いとの理由で不適当
であると考えられるＲ１検出器を用いることによって、
きわめて正確で、かつ迅速に試料中のＰＣをＰＣ中の脂
肪酸部分の不飽和基の有無にかかわりなく定量しうろこ
とが見出されたことはきわめて驚くべきことで、かかる
固定相と移動相と検出器を組み合わせてＰＣの定量に用
い得ることは予想しえないことであった。

本発明において使用しうる固定相のシリカゲルは高速液
体クロマトグラフィーの固定相として使用しうるもので
あればいかなるものであってもよく、そしてこれらはカ
ラムに充填するための再充填用のシリカゲルであっても
良いし、またはすてにカラムに充填されたものとして市
販されていて入手しうるものであってもよい。

例えば、これらのシリカゲルの具体例としては、Ｌｉｃ
ｈｒｏｓｏｒｂ　Ｓｉ　６０　（Ｅ、Ｎｅｒｃｋ社製）
　、Ｎｕｃｌｅｏｓｉ１５０　（Ｍ、　Ｎａｇｅ１社製
）　、ＴＳＫ　ｇｅｌ　　５ｉｌｉｃａ−６０（東ソー
社製）が、またシリカゲル充填カラムの具体例としては
、ＨｉｂａｒＯ（Ｐｒｅ−ｐａｃｋｅｄ　Ｃｏｌｕｍｎ
Ｌｉｃｈｒｏｓｏｒｂ　Ｓｉ　６０）が挙げられる。

移動相のヘキサン／イソグロビルアルコール／水の混合
溶媒は、好ましくはその組成が容積比で０．５〜２／２
〜８１０．５〜２である混合物、殊に好ましくは１／４
／１の混合物である。ヘキサンとしては、画業で公知の
ｎ−ヘキサン、ｉ−ヘキサン、シクロヘキサン等を用い
ることができる。

Ｒ１検出器は利用しうる任意のものであってよい。そし
てこれらの具体例としては、５ｈｏｄｅｘ１’ｉ’ｌ　
　５Ｅ−５１型（昭和電工（株）製）　、１１２＋−８
０１２型（東ソー（株）製）　、４１０型示差屈折計（
Ｗａｔｅｒｓ（株）製）　、Ｌ−３３００型示差屈折計
（日立（株）製）、８３０−Ｒ１（１３本分光（株）製
）等が挙げられる。

本方法は標準的な高速液体クロマトグラフィーの操作に
よって行ないうるもので、例えば第十−改正日本薬局方
の〔Ｂ〕一般試験法３、液体クロマトグラフ法の項に記
載の操作によって寅行される。

本発明方法による試料中のＰＣの定量に当っては、はじ
めに濃度が既知の標品について本発明方法に従って高速
クロマトグラフィーを行ない、Ｒ１検出器によって得ら
れるクロマトグラムに基づき検量線を作成する。次いで
ＰＣの含有量を定量したいと考える試料について同一の
条件下に高速クロマトグラフィーを行ない、得られた結
果をさきに作成した検量線と対比してＰＣの含有量を決
定する。

本発明の方法によれば、試料中のＰＣがきわめて迅速に
、かつ、ＰＣ中の脂肪酸部分の不飽和結合の有無にかか
わらず、ＴＬＣによる定量分析方法と同一の精度で分析
、定量することができた。

以下に本発明の方法を実施例によって更に詳細に説明す
る。

実施例 １）試料 この実施例においては、次の試料１−１４を用いてＰＣ
純度の測定を行なった。

試料Ｎ０９１　　　　　　　　シグマ社製試薬試料ＮＯ
，２日清製粉社製標準品 試料Ｎｏ、３〜Ｎｏ、　６およ　粗大豆レシチンより日
清製粉にびＫＮＮｏ、９〜Ｎｏ、ｌＯおいて精製調製し
たもの試料Ｎ０１７　　　　　　　　ルーカスマイヤー
社製エビクロン２００ 試料Ｎｏ、ｌｌ　　　　　　　　シグマ社製試薬試料Ｎ
ｏ、１２　　　　　　　　試料Ｎｏ、１１と試料Ｎｏ、
１３とを混合したもの 試料Ｎｏ、１３　　　　　　　　シグマ社製試薬試料Ｊ
ｉｏ、１４　　　　　　　　和光紬薬工業社製試薬なお
、上記試料のうち試料Ｎｏ、　１１〜Ｎｏ、１４は卵黄
由来のｐｃである。

２）高速液体クロマトグラフィー条件 この実施例では上記した試料の夫々について次の条件で
高速液体クロマトグラフィーを行ないＰＣ純度を測定し
た。

（イ）測定条件 ポンプ：　モデル６００　（Ｗａｔｅｒｓ）カラム：　
　Ｌｉｃｈｒｏｓｏｒｂ　５ｉ−６０（１０ｕｍ）４．
６ｍｍ　Ｘ　２５０ｍｍ 流量：Ｉｒｎ０１分 インチグレーター：モデル７０００Ａ　（Ｓｉｃ　Ｊａ
ｐａｎ）オートサンプラー：　ＷＩＳＰ　７１０Ｂ　（
Ｗａｔｅｒｓ）注入量＝２０μＣ 上記の溶媒は関東化学社製のＨＰＬＣ用のものを混合後
、超音波をかけながらアスピレータ−で減圧にして脱気
して使用した。

（ロ）検量線 試料Ｎｏ、２約２５０１を正確に秤量し、上記溶離液で
溶解して５０ｍＱの容積の溶液を得た。これを５ｔ−ｘ
ｏｏとする。５ｔ−１００の９ｍＱを１０＋ｎＱのメス
フラスコにとり、溶離液で１ＯＬｌＩＱとする。これを
５ｔ−９０とする。５ｔ−１００の８ｍＱをＬＯｒｎＱ
のメスフラスコにとり、溶離液で１０ｍＱとする。これ
を５ｔ−８０とする。５ｔ−１００の７冨αを１０＋ｎ
（２のメスフラスコにとり、溶離液で１０ｍｆ２とする
。これを５ｔ−７０とする。

５ｔ−１００の６ｍ１２をｌＯ！ＩＱのメスフラスコに
とり、溶離液で１０１１１１２とする。これを５ｔ−６
０とする。

この５ｔ−１００〜５ｔ−６０の各々について３回ずつ
２０μＱの量で上記カラムに注入し、３つの測定値を得
、これを平均した。

上記した５ｔ−１００〜５ｔ−６０の各々の注入量をＹ
ｌそれに対するクロマトグラム上のピークの測定面積値
をＸとして最小二乗法で処理し回帰式を求めて検量線と
した。

なお検量線は溶離液を作りかえる毎に毎回作成しｔ；。

３）検体の調製および定量 上記した試料の各々について約５０ｍｇを正確に秤量し
溶離液で溶解してＩＱ＋＋＋１２の容積の溶液として検
体とした。同一の試料について二度上記の検体の調製操
作を繰り返して検体を二種類調製し、各々の検体につい
て２度ずつ２０μＱの量でカラムに注入し、２つずつの
平均値をさらに平均したもので試料の純度を求めた。

なお、検量線の作成に用いた試料Ｎｏ、２は凍式により
シグマ社の大豆白米ＰＣ（試料Ｎｏ、１）を基準にした
値を算出し、純度値として用いた。

なお式中、 ａＸ＋ｂ：検量線の回帰式 Ｘ　：検体の面積値（インチグレーターより）ｆ　：二
次標準品（試料Ｎ０．２）に対する純度の比４）結果 （イ）検量線 試料Ｎ００２についての検体５ｔ−１００−’５ｔ−６
０の夫夫についての濃度およびその２０μＱ中のＰＣ含
有量は次の第１表に、また上記の測定の結果得られｔ；
ピークについての面積値は次の第２表に示される。

Ｃ，Ｖ、　、変動係数 第 表 第 ２表 上記した第１表および第２表の結果から第１図の検量線
が得られ、この場合の回帰式はＹ　＝　３．６３８４ｘ
　１０−’Ｘ　＋　２．５４３４で表わされ、相関係数
γ＝　０．９９９６７である。

（ロ）試料Ｎｏ、２の試料Ｎｏ、　ｌに対する換算係数
ここで上記測定に用いた試料Ｎｏ、２と試料Ｎｏ、　１
　（シグマ社の高純度ＰＣ二大豆由来のＰ’Ｃで純度９
９％表示のもの）との比較を行なった。

試料ＮＯ，２を基準物質として試料Ｎｏ、ｌとの純度の
比較を行なった。

試料Ｎｏ、ｌの試料について３回サンプリングして各々
２回ずつカラムに注入して得られる測定値の平均による
Ｒ１による純度は９７．７６％であった。

この試料Ｎｏ、ｌについてＵＶによる純度測定の結果は
９６．６７％となった。

（ハ）　　ＴＬＣ法とＨＰＬＣ−Ｒ１法およびＨＰＬＣ
−ＵＶ法の測定結果の比較 上記しＩ；試料Ｎｏ、　ｌ　〜Ｎｏ、１４について、そ
のｐｃ含有量を夫々ＴＬＣ法、ＨＰＬＣ−Ｒ１法および
ＨＰＬＣ−ＵＶ法によって測定した。

第２図は縦軸にＨＰＬＣ−Ｒ１法で得られた結果の値を
、横軸にＴＬＣ法で得られた結果の値をプロットして示
し、第３図は縦軸に）ＩＰＬＣ−ＵＶ法で得られた結果
の値を、横軸にＴＬＣ−Ｐ法で得られた結果の値をプロ
ットしたものである。

この２つの図面から、ＨＰＬＣ−Ｒｌ法とＴＬＣ法とで
は、ＰＣが大豆由来か卵黄由来かにかかわらず相関性の
高い結果が得られるが、ＨＰＬＣ−ＵＶ法とＴＬＣ法と
ではＰＣの由来によって結果に大きな差があることが分
る。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例の第１表および第２表からのデータに基
づいて作成された検量線を示す。 第２図は試料Ｎｏ、２〜Ｎｏ−１４について行なったＨ
ＰＬＣ−Ｒ１およびＴＬＣによるＰＣ含有量（％）につ
いての測定値の相関関係を示すもので、図中、・は大豆
由来のＰＣ，ムは卵黄由来のＰＣを示す。 第３図は試料Ｎ０．２〜Ｎｏ、１４について行なったＨ
ＰＬＣ−ＵＶおよびＴＬＣによるｐｃ含有量（％）につ
いての測定値の相関関係を示すもので、図中、Ｏは大豆
由来のＰＣ１△は卵黄由来のＰＣを示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）ホスファチジルコリンを含有する試料を、シリカゲ
   ルを固定相とし、ヘキサン／イソプロピルアルコール／
   水の混合溶媒を移動相とする高速液体クロマトグラフィ
   ーに付し、溶離液を示差屈折率検出器によって測定する
   ことからなる、ホスファチジルコリンを含有する試料中
   のホスファチジルコリンの定量方法。 ２）移動相がヘキサン／イソプロピルアルコール／水＝
   ０．５〜２／２〜８／０．５〜２の混合溶媒である請求
   項１に記載の方法。