JPH0490850A - 表面を化学的に活性化した微多孔性支持体 - Google Patents
表面を化学的に活性化した微多孔性支持体Info
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Landscapes
- Solid-Sorbent Or Filter-Aiding Compositions (AREA)
- Compositions Of Macromolecular Compounds (AREA)
- Addition Polymer Or Copolymer, Post-Treatments, Or Chemical Modifications (AREA)
- Treatment Of Liquids With Adsorbents In General (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
[産業上の利用分野コ
本発明は吸着分離法に関するものであり、さらに詳しく
述べればアフィニティ分離用支持体に関するものである
。
述べればアフィニティ分離用支持体に関するものである
。
[従来の技術]
生体関連物質を分離精製する方法としては、従来、沈殿
による分離(塩析など)、各種クロマトグラフィ、膜分
離および電気泳動などが用いられてきた。近年アフィニ
ティクロマトグラフイやアフィニティ膜など、酵素−基
質、抗原−抗体などの生理活性物質問に働くパイオアフ
イニテイを利用した高度精製分離技術が注目され、バイ
オテクノロジーで生産された生理活性物質などを効率的
に分離する技術としてその進歩、普及が期待されている
。アフィニテイ分離とは微多孔性の支持体の表面に化学
的に活性な官能基を導入し、これによって分離対象物質
とアフィニティをもつ物質(アフィニティリガンド)を
結合させ、これと分離対象物質とを接触させてリガンド
に吸着させた後、不要な物質を溶媒で洗浄し、pHやイ
オン強度などの条件を変化させて溶出させ、目的とする
分離対象物質を分離精製する技術である。
による分離(塩析など)、各種クロマトグラフィ、膜分
離および電気泳動などが用いられてきた。近年アフィニ
ティクロマトグラフイやアフィニティ膜など、酵素−基
質、抗原−抗体などの生理活性物質問に働くパイオアフ
イニテイを利用した高度精製分離技術が注目され、バイ
オテクノロジーで生産された生理活性物質などを効率的
に分離する技術としてその進歩、普及が期待されている
。アフィニテイ分離とは微多孔性の支持体の表面に化学
的に活性な官能基を導入し、これによって分離対象物質
とアフィニティをもつ物質(アフィニティリガンド)を
結合させ、これと分離対象物質とを接触させてリガンド
に吸着させた後、不要な物質を溶媒で洗浄し、pHやイ
オン強度などの条件を変化させて溶出させ、目的とする
分離対象物質を分離精製する技術である。
このアフィニティ分離に用いられる支持体に要求される
特性として通常の目的に対しては、(イ)親水性である
こと、(ロ)多孔性で表面積が太きいこと、(ハ)蛋白
質の非特異的吸着が少ないこと、(ニ)表面の官能基密
度が大きいこと、(ホ)十分な機械的強度、(へ)耐化
学薬品性(ジオキサン、アセトン、メタノール、エタノ
ールなどの他、ある程度の酸、塩基に耐えること)を挙
げることができる。従来使用されているアフィニティク
ロマトグラフィ用支持体には架橋アガロース、シリカビ
ーズ、ポリアクリルアミド、架橋デキストランなどがあ
る。しかしながらこれらは強度が十分でないこと、蛋白
質の非特異的吸着が大きいこと、多孔性が低いこと、高
価であること、などの欠点を有している。
特性として通常の目的に対しては、(イ)親水性である
こと、(ロ)多孔性で表面積が太きいこと、(ハ)蛋白
質の非特異的吸着が少ないこと、(ニ)表面の官能基密
度が大きいこと、(ホ)十分な機械的強度、(へ)耐化
学薬品性(ジオキサン、アセトン、メタノール、エタノ
ールなどの他、ある程度の酸、塩基に耐えること)を挙
げることができる。従来使用されているアフィニティク
ロマトグラフィ用支持体には架橋アガロース、シリカビ
ーズ、ポリアクリルアミド、架橋デキストランなどがあ
る。しかしながらこれらは強度が十分でないこと、蛋白
質の非特異的吸着が大きいこと、多孔性が低いこと、高
価であること、などの欠点を有している。
アフィニティ膜用支持体にはナイロン66多孔質膜表面
に親木性モノマーをグラフトしたもの(特開昭64−2
6656) 、ポリぶつ化ビニリデン多孔質膜表面で親
水性モノマーをラジカル重合させたもの(USP 46
18533 ) 、セルロース繊維に親水性ポリマーを
結合後、繊維同士を架橋したもの(USP 46631
63 ) 、ナイロン6多孔質膜表面を塩化スルフリル
と反応後、ジアミンと反応させたもの(特許公表公報昭
62−500596 )などがある。しかしながら特開
昭64−26656の発明はガンマ線を使用するため製
造設備および製造方法の制約が強く、経済的に不利であ
り、さらに膜の孔径制御が困難であるという欠点を有し
ている。また、USP 46]8533の方法は細孔内
でラジカル重合を行うため孔径制御が難しいという欠点
があり、USP 4663163の発明は繊維をシート
状に加工した物であるため剥離しゃすく孔径変化が起こ
りやすいきいう問題がある。
に親木性モノマーをグラフトしたもの(特開昭64−2
6656) 、ポリぶつ化ビニリデン多孔質膜表面で親
水性モノマーをラジカル重合させたもの(USP 46
18533 ) 、セルロース繊維に親水性ポリマーを
結合後、繊維同士を架橋したもの(USP 46631
63 ) 、ナイロン6多孔質膜表面を塩化スルフリル
と反応後、ジアミンと反応させたもの(特許公表公報昭
62−500596 )などがある。しかしながら特開
昭64−26656の発明はガンマ線を使用するため製
造設備および製造方法の制約が強く、経済的に不利であ
り、さらに膜の孔径制御が困難であるという欠点を有し
ている。また、USP 46]8533の方法は細孔内
でラジカル重合を行うため孔径制御が難しいという欠点
があり、USP 4663163の発明は繊維をシート
状に加工した物であるため剥離しゃすく孔径変化が起こ
りやすいきいう問題がある。
また、特許公表公報昭62−500596の発明は塩化
スルフリルとの反応時にナイロンの分子量の大幅低下が
起こる、という欠点を有している。
スルフリルとの反応時にナイロンの分子量の大幅低下が
起こる、という欠点を有している。
[発明が解決しようとする課題]
すなわち、本発明の目的は従来提案され、使用を試みら
れてきたアフィニティ分離用支持体の有する欠点を解決
もしくは改善した新規なアフィニティ分離用支持体を提
供しようとするものである。
れてきたアフィニティ分離用支持体の有する欠点を解決
もしくは改善した新規なアフィニティ分離用支持体を提
供しようとするものである。
[課題を解決するための手段]
上記の目的を達成するため本発明は下記の構成を有する
。すなわち、 「アクリロニトリルを含む高分子物質からなる微多孔性
基材をアミドキシム化して得られる微多孔性支持体の表
面に、求核性基をもつ分子と反応容易な活性基を共有結
合させたことを特徴とする、表面を化学的に活性化した
微多孔性物質。」本発明におけるアクリロニトリルを含
む高分子物質(以下、アクリロニトリル系高分子物質と
称することがある)とはアクリロニトリル60モル%以
上からなる共重合体あるいは単独重合体をいう。
。すなわち、 「アクリロニトリルを含む高分子物質からなる微多孔性
基材をアミドキシム化して得られる微多孔性支持体の表
面に、求核性基をもつ分子と反応容易な活性基を共有結
合させたことを特徴とする、表面を化学的に活性化した
微多孔性物質。」本発明におけるアクリロニトリルを含
む高分子物質(以下、アクリロニトリル系高分子物質と
称することがある)とはアクリロニトリル60モル%以
上からなる共重合体あるいは単独重合体をいう。
アクリロニトリルと共重合体を構成するコモノマーにつ
いてはアクリロニトリルと共重合可能な種々の公知のモ
ノマーを使用することができる。すなわち例えばアクリ
ルアミド、メタクリルアミド、N−ビニル−2−ピロリ
ドン、アクリル酸エステル、メタクリル酸エステル、ス
チレン、酢酸ビニル、塩化ビニル、マレイン酸、フマル
酸、アクリル酸、メタクリル酸、メタリルスルホン酸ナ
トリウム、p−ビニルベンゼンスルホン酸、p−ビニル
ベンゼンカルボン酸、p−ビニルベンゼンホウ酸などを
使用することができる。さらにアクリロニトリル系高分
子物質としては、これらの共重合体と単独重合体の混合
物、あるいは2種類以上の共重合体の混合物であっても
よい。
いてはアクリロニトリルと共重合可能な種々の公知のモ
ノマーを使用することができる。すなわち例えばアクリ
ルアミド、メタクリルアミド、N−ビニル−2−ピロリ
ドン、アクリル酸エステル、メタクリル酸エステル、ス
チレン、酢酸ビニル、塩化ビニル、マレイン酸、フマル
酸、アクリル酸、メタクリル酸、メタリルスルホン酸ナ
トリウム、p−ビニルベンゼンスルホン酸、p−ビニル
ベンゼンカルボン酸、p−ビニルベンゼンホウ酸などを
使用することができる。さらにアクリロニトリル系高分
子物質としては、これらの共重合体と単独重合体の混合
物、あるいは2種類以上の共重合体の混合物であっても
よい。
本発明で用いる微多孔性基材は粒子状であっても膜状で
あってもよくさらに中空糸状、管状などであっても好ま
しく使用することができる。さらにそれが他の多孔性支
持体との複合体の形状であってもよい。微多孔性基材の
製造法については特に制約はなく、従来公知の方法で製
造することができる。たとえば膜状物の場合を例示すれ
ば、5〜30重量%の濃度のアクリロニトリル系高分子
物質のジメチルスルホキシド溶液を不織布などの支持体
上に平膜状に流延し、凝固液に浸漬する。十分に凝固さ
せた後、溶媒を水に置換する。凝固液としては水、ある
いは水とジメチルスルホキシドの混合物を用いることが
好ましい。該高分子物質溶液を支持体上に流延後、溶媒
を蒸発させてから凝固剤溶液に浸漬してもよい。一般に
は溶媒を蒸発させる時間は0〜60分、温度は06C〜
溶媒の沸点の範囲で行われることが好ましい。また、該
高分子物質溶液を従来公知の乾湿式系紡糸法で中空糸膜
の形状の多孔性基材とする方法も、分離方法と目的に応
じては好ましい方法である。
あってもよくさらに中空糸状、管状などであっても好ま
しく使用することができる。さらにそれが他の多孔性支
持体との複合体の形状であってもよい。微多孔性基材の
製造法については特に制約はなく、従来公知の方法で製
造することができる。たとえば膜状物の場合を例示すれ
ば、5〜30重量%の濃度のアクリロニトリル系高分子
物質のジメチルスルホキシド溶液を不織布などの支持体
上に平膜状に流延し、凝固液に浸漬する。十分に凝固さ
せた後、溶媒を水に置換する。凝固液としては水、ある
いは水とジメチルスルホキシドの混合物を用いることが
好ましい。該高分子物質溶液を支持体上に流延後、溶媒
を蒸発させてから凝固剤溶液に浸漬してもよい。一般に
は溶媒を蒸発させる時間は0〜60分、温度は06C〜
溶媒の沸点の範囲で行われることが好ましい。また、該
高分子物質溶液を従来公知の乾湿式系紡糸法で中空糸膜
の形状の多孔性基材とする方法も、分離方法と目的に応
じては好ましい方法である。
粒子状微多孔性基材については、例えばモノフィラメン
ト状または中空糸状微多孔性基材をビーズ状に切断する
方法や、アクリロニトリル系高分子物質(平均分子量5
〜20万、濃度2〜15%)のジメチルスルホキシド溶
液を、水とジメチルスルホキシドの混合溶媒(ジメチル
スルホキシド濃度40〜80%)中によく攪拌しながら
加え、生じた微多孔性の小片を粉砕することなどにより
製造できる。
ト状または中空糸状微多孔性基材をビーズ状に切断する
方法や、アクリロニトリル系高分子物質(平均分子量5
〜20万、濃度2〜15%)のジメチルスルホキシド溶
液を、水とジメチルスルホキシドの混合溶媒(ジメチル
スルホキシド濃度40〜80%)中によく攪拌しながら
加え、生じた微多孔性の小片を粉砕することなどにより
製造できる。
これらの微多孔性基材を製造するときの種々の条件、す
なわち高分子物質の分子量、共重合モノマーの種類、組
成、溶媒の種類、溶液の濃度、製膜温度、溶媒蒸発時間
、凝固温度などは本発明の支持体の性能に影響を与える
ので目的と目標性能を考慮して適当な条件を選択する。
なわち高分子物質の分子量、共重合モノマーの種類、組
成、溶媒の種類、溶液の濃度、製膜温度、溶媒蒸発時間
、凝固温度などは本発明の支持体の性能に影響を与える
ので目的と目標性能を考慮して適当な条件を選択する。
微多孔性基材は膜状物の場合は平均孔径は0.001〜
100μmであり、機械的強度を考慮すると0゜02〜
1mmの膜厚を有するものが好ましい。機械的強度とは
通常の使用条件の加圧下で変形をおこさないことであり
、また粒子状の微多孔性基材の場合には平均孔径o、o
oi〜100μm1粒子直径が10μm〜2Mの範囲の
ものが好ましく用いられ、通常の使用条件下で変形や崩
壊をおこさないものがこのましい。微多孔性基材の強度
には製造条件の多くが影響するが、なかでも高分子物質
溶液の濃度が高ければ強度は増し、また、分子量のより
高い高分子物質を用いることによっても強度を増すこと
ができる。
100μmであり、機械的強度を考慮すると0゜02〜
1mmの膜厚を有するものが好ましい。機械的強度とは
通常の使用条件の加圧下で変形をおこさないことであり
、また粒子状の微多孔性基材の場合には平均孔径o、o
oi〜100μm1粒子直径が10μm〜2Mの範囲の
ものが好ましく用いられ、通常の使用条件下で変形や崩
壊をおこさないものがこのましい。微多孔性基材の強度
には製造条件の多くが影響するが、なかでも高分子物質
溶液の濃度が高ければ強度は増し、また、分子量のより
高い高分子物質を用いることによっても強度を増すこと
ができる。
次に上述の方法で製造したアクリロニトリル系微多孔性
基材をヒドロキシルアミンと反応させ、アミドキシム化
した微多孔性支持体を製造する。
基材をヒドロキシルアミンと反応させ、アミドキシム化
した微多孔性支持体を製造する。
ヒドロキシルアミン溶液には水の他、メタノール、エタ
ノールなどの溶媒が使用可能であるが、工業的に製造す
る方法としては水溶液系が好ましい。
ノールなどの溶媒が使用可能であるが、工業的に製造す
る方法としては水溶液系が好ましい。
また、アミドキシム化率の高い微多孔性支持体を得る目
的ではメタノールを溶媒として用いる方法が好ましい。
的ではメタノールを溶媒として用いる方法が好ましい。
ヒドロキシルアミンの濃度は0.01〜10mol/I
、さらに好ましくは0.1〜1 mol/lが好適で
あるが、微多孔性基材の構造や反応溶媒などの違いによ
って最適範囲は変わるので、厳密に規定するのは困難で
ある。ヒドロキシルアミン源としてヒドロキシルアミン
の塩酸塩を用いる場合には、該塩を溶媒に溶解させた後
、ヒドロキシルアミンを遊離させるためにアルカリを添
加したものを反応液として用いる。反応温度は40〜8
0℃、さらに好ましくは50〜70℃の範囲が好適であ
る。80℃を超える温度では基材の収縮が起こって孔径
の変化が起こり易く、40℃未満の温度では反応の進行
が遅いという問題がある。反応時間については30分〜
5時間が適当である。アミドキシム化は、アクリロニト
リル単位に対して40〜80モル%、特に好ましくは6
5〜75モル%程度まで進行させるのが望ましい。それ
未満では反応が不十分で発明の効果が乏しくなり、それ
を超えると得られる支持体の強度が損なわれる傾向にあ
る。
、さらに好ましくは0.1〜1 mol/lが好適で
あるが、微多孔性基材の構造や反応溶媒などの違いによ
って最適範囲は変わるので、厳密に規定するのは困難で
ある。ヒドロキシルアミン源としてヒドロキシルアミン
の塩酸塩を用いる場合には、該塩を溶媒に溶解させた後
、ヒドロキシルアミンを遊離させるためにアルカリを添
加したものを反応液として用いる。反応温度は40〜8
0℃、さらに好ましくは50〜70℃の範囲が好適であ
る。80℃を超える温度では基材の収縮が起こって孔径
の変化が起こり易く、40℃未満の温度では反応の進行
が遅いという問題がある。反応時間については30分〜
5時間が適当である。アミドキシム化は、アクリロニト
リル単位に対して40〜80モル%、特に好ましくは6
5〜75モル%程度まで進行させるのが望ましい。それ
未満では反応が不十分で発明の効果が乏しくなり、それ
を超えると得られる支持体の強度が損なわれる傾向にあ
る。
一般にアミドキシム化率が高くなると親水性が増大する
が、強度は低下するという傾向がある。
が、強度は低下するという傾向がある。
親水性は蛋白質の吸着を減少させ、分離精製に伴う蛋白
質の損失率を低減する効果があるが、機械的強度の保持
と相反するという問題がある。
質の損失率を低減する効果があるが、機械的強度の保持
と相反するという問題がある。
本発明で得られるアミドキシム化微多孔性支持体は通常
の使用条件下で十分な機械的強度をもち、その表面は、
水に対する表面接触角は15〜20度(ポリアクリロニ
トリル製微多孔性基材の場合45〜50度)で十分な親
水性を有している。また、牛胎児血清溶液を用いた透過
実験の結果から得られた、吸着による蛋白質の損失率は
8%であり、蛋白質の回収率向上のためにはこれが10
%未満であることが望ましいとされているので、これは
十分に低い値であるといえる。
の使用条件下で十分な機械的強度をもち、その表面は、
水に対する表面接触角は15〜20度(ポリアクリロニ
トリル製微多孔性基材の場合45〜50度)で十分な親
水性を有している。また、牛胎児血清溶液を用いた透過
実験の結果から得られた、吸着による蛋白質の損失率は
8%であり、蛋白質の回収率向上のためにはこれが10
%未満であることが望ましいとされているので、これは
十分に低い値であるといえる。
このようにして得たアミドキシム化ポリアクリロニトリ
ル系微多孔性支持体の表面には求核性基と反応容易な活
性基を導入する。この場合の反応容易とはO〜50℃程
度の温度、約72時間以内の時間で20〜100%の反
応率を与えるものである。いくつかの例を挙げれば、エ
ポキシ基、ジアゾニウム誘導体、ブロモアセチル誘導体
などの他、スクシンイミドエステル、ベンゾトリアゾー
ルエステル、スルホンエステルなどの活性エステル基な
どである。これらは水酸基、アミノ基、チオール基など
の求核性基と反応し、これらの求核性基を有するアフィ
ニティリガンドを微多孔性支持体上に固定化することが
できる。このうちエポキシ基は反応後の結合が安定なエ
ーテル結合であり、製造コストの点で有利なものである
が、反応にアルカリ性の条件(pH=9〜13)が必要
であり、かつ時間がかかることが欠点となっている。ま
た、ジアゾニウム誘導体は反応性が高く、非常に不安定
な化合物であり、保管の難しさの点で問題がある。
ル系微多孔性支持体の表面には求核性基と反応容易な活
性基を導入する。この場合の反応容易とはO〜50℃程
度の温度、約72時間以内の時間で20〜100%の反
応率を与えるものである。いくつかの例を挙げれば、エ
ポキシ基、ジアゾニウム誘導体、ブロモアセチル誘導体
などの他、スクシンイミドエステル、ベンゾトリアゾー
ルエステル、スルホンエステルなどの活性エステル基な
どである。これらは水酸基、アミノ基、チオール基など
の求核性基と反応し、これらの求核性基を有するアフィ
ニティリガンドを微多孔性支持体上に固定化することが
できる。このうちエポキシ基は反応後の結合が安定なエ
ーテル結合であり、製造コストの点で有利なものである
が、反応にアルカリ性の条件(pH=9〜13)が必要
であり、かつ時間がかかることが欠点となっている。ま
た、ジアゾニウム誘導体は反応性が高く、非常に不安定
な化合物であり、保管の難しさの点で問題がある。
ブロモアセチル誘導体はアミノ基、イミダゾール基およ
びフェノール性水酸基などに対して適当な反応性をもつ
ものであるが、反応時間の長さと原料コストが高いとい
う欠点がある。活性エステル基は00C〜室温下、水を
溶媒として中性の穏やかな条件でアフィニティリガンド
と短い反応時間で結合反応を行えることが特長である。
びフェノール性水酸基などに対して適当な反応性をもつ
ものであるが、反応時間の長さと原料コストが高いとい
う欠点がある。活性エステル基は00C〜室温下、水を
溶媒として中性の穏やかな条件でアフィニティリガンド
と短い反応時間で結合反応を行えることが特長である。
アフィニティ分離ではりガントに蛋白質を選ぶことが多
い。
い。
蛋白質は高温での長時間の処理や酸、塩基によって失活
する場合があり、活性エステル基は失活を防ぎ易いとい
う好ましい特徴をもつものといえる。
する場合があり、活性エステル基は失活を防ぎ易いとい
う好ましい特徴をもつものといえる。
保存法も凍結乾燥した状態または中性緩衝液中、氷温以
下で保存すれば良く、本発明に用いる活性基として特に
好適なものといえる。
下で保存すれば良く、本発明に用いる活性基として特に
好適なものといえる。
上述の活性基はアミドキシム化した微多孔性支持体に直
接結合してもよいが、1〜20個分の分子長の炭化水素
基、または1〜)O個程度のヘテロ原子を含む炭化水素
基、すなわちスペーサー基を介しても良い。これは微多
孔性支持体とアフィニティリガンドとの間に間隙をもた
せることによって分離対象物質とりガントとの間の立体
障害を軽減し、吸着効率を上げる効果をもつものである
。スペーサー基の導入に当たっては、アミドキシム基と
反応性をもつ化合物のうち、高分子化したアミドキシム
化合物とも反応可能な多官能性の物質が使用できる。例
を挙げれば、アジピン酸クロライドやトリメシン酸クロ
ライドなどのジまたはトリカルボン酸クロライド、トリ
クロロ−s−トリアジン、エピクロロヒドリンや1.4
−ブタンジオールジグリシジルエーテルなどのエポキシ
化合物、ジイソシアネートなどのものが考えられる。こ
れらの物質の官能基のうちの一方は微多孔性支持体のア
ミドキシム基と結合させ、残りはアフィニティリガンド
中に含まれる水酸基やアミノ基などの求核性基と直接結
合させるか、またはそのままでは結合容易でない場合に
はそれに上述の活性基を導入してアフィニティリガンド
中の求核性基と結合させる。
接結合してもよいが、1〜20個分の分子長の炭化水素
基、または1〜)O個程度のヘテロ原子を含む炭化水素
基、すなわちスペーサー基を介しても良い。これは微多
孔性支持体とアフィニティリガンドとの間に間隙をもた
せることによって分離対象物質とりガントとの間の立体
障害を軽減し、吸着効率を上げる効果をもつものである
。スペーサー基の導入に当たっては、アミドキシム基と
反応性をもつ化合物のうち、高分子化したアミドキシム
化合物とも反応可能な多官能性の物質が使用できる。例
を挙げれば、アジピン酸クロライドやトリメシン酸クロ
ライドなどのジまたはトリカルボン酸クロライド、トリ
クロロ−s−トリアジン、エピクロロヒドリンや1.4
−ブタンジオールジグリシジルエーテルなどのエポキシ
化合物、ジイソシアネートなどのものが考えられる。こ
れらの物質の官能基のうちの一方は微多孔性支持体のア
ミドキシム基と結合させ、残りはアフィニティリガンド
中に含まれる水酸基やアミノ基などの求核性基と直接結
合させるか、またはそのままでは結合容易でない場合に
はそれに上述の活性基を導入してアフィニティリガンド
中の求核性基と結合させる。
活性基導入の方法は活性基の種類によって異なるが、エ
ポキシ基の場合は微多孔性支持体上にスペーサー基末端
として水酸基またはアミノ基を導入し、アルカリ性条件
下でエビクロロヒドリンや種々のビスエポキシドを反応
させる。また、ジアゾニウム誘導体は微多孔性支持体上
にアミノ基を導入後、p−ニトロベンゾイルアジドを作
用させ、これを亜ニチオン酸ナトリウムなどで還元した
のち、亜硝酸で処理することによって調製することがで
きる。ブロモアセチル誘導体は、たとえばN−ヒドキシ
スクシンイミドとブロモ酢酸をジシクロへキシルカルボ
ジイミド存在下で縮合させ、0−ブロモアセチル−N−
ヒドロキシスクシンイミドを合成し、これを表面にアミ
ノ基を導入した微多孔性支持体と反応させることで調製
することができる。活性エステル調製の方法としては微
多孔性支持体表面にカルボキシル基を導入後、カルボジ
イミド存在下でN−ヒドロキシスクシンイミドを縮合さ
せる方法(スクシンイミドエステル)や、微多孔性支持
体表面に水酸基を導入後、トレシルクロライドを反応さ
せる方法(スルポンエステル)などがある。
ポキシ基の場合は微多孔性支持体上にスペーサー基末端
として水酸基またはアミノ基を導入し、アルカリ性条件
下でエビクロロヒドリンや種々のビスエポキシドを反応
させる。また、ジアゾニウム誘導体は微多孔性支持体上
にアミノ基を導入後、p−ニトロベンゾイルアジドを作
用させ、これを亜ニチオン酸ナトリウムなどで還元した
のち、亜硝酸で処理することによって調製することがで
きる。ブロモアセチル誘導体は、たとえばN−ヒドキシ
スクシンイミドとブロモ酢酸をジシクロへキシルカルボ
ジイミド存在下で縮合させ、0−ブロモアセチル−N−
ヒドロキシスクシンイミドを合成し、これを表面にアミ
ノ基を導入した微多孔性支持体と反応させることで調製
することができる。活性エステル調製の方法としては微
多孔性支持体表面にカルボキシル基を導入後、カルボジ
イミド存在下でN−ヒドロキシスクシンイミドを縮合さ
せる方法(スクシンイミドエステル)や、微多孔性支持
体表面に水酸基を導入後、トレシルクロライドを反応さ
せる方法(スルポンエステル)などがある。
化学的に活性化した後の微多孔性支持体には、分離精製
すべき目的物質に応じて抗原、抗体、酵素、基質、レク
チン、アミノ酸や、蛋白質と特異的親和性をもつ色素類
などさまざまなアフィニティリガンドを固定化すること
ができる。たとえばレクチンは糖に対する特異的結合性
をもった蛋白質であるがこれをリガンドとして用いるこ
とにより種々の糖蛋白質、多糖類、糖脂質を精製するこ
とができる。なかでもコンカナバリンA(ConA)は
もっともよく用いられるリガンドでこれを用いた精製例
としてはインターフェロンやオボアルブミン、ペルオキ
シダーゼなどの酵素などがある。ほかにも目的に応じて
ヒマレクチン、インゲンマメレクチンなどが使用可能で
ある。また、色素リガンドの例としてはトリアジン系の
色素であるチバクロンブルーがある。これはアルブミン
やインターフェロンの他、アデニリル基を含むコファク
ター(NAD 、NADP+を含む)を要求子 する様々な酵素の精製に使用することができる。
すべき目的物質に応じて抗原、抗体、酵素、基質、レク
チン、アミノ酸や、蛋白質と特異的親和性をもつ色素類
などさまざまなアフィニティリガンドを固定化すること
ができる。たとえばレクチンは糖に対する特異的結合性
をもった蛋白質であるがこれをリガンドとして用いるこ
とにより種々の糖蛋白質、多糖類、糖脂質を精製するこ
とができる。なかでもコンカナバリンA(ConA)は
もっともよく用いられるリガンドでこれを用いた精製例
としてはインターフェロンやオボアルブミン、ペルオキ
シダーゼなどの酵素などがある。ほかにも目的に応じて
ヒマレクチン、インゲンマメレクチンなどが使用可能で
ある。また、色素リガンドの例としてはトリアジン系の
色素であるチバクロンブルーがある。これはアルブミン
やインターフェロンの他、アデニリル基を含むコファク
ター(NAD 、NADP+を含む)を要求子 する様々な酵素の精製に使用することができる。
[実施例]
実施例1
ヒドロキシルアミン塩酸塩30gを約700m1のメタ
ノールに溶解し、これに84gのナトリウムメチラート
の28,0重量%メタノール溶液を加えた後、生じた塩
化ナトリウムを濾過した。
ノールに溶解し、これに84gのナトリウムメチラート
の28,0重量%メタノール溶液を加えた後、生じた塩
化ナトリウムを濾過した。
上記の方法で調製した0、 43mol/lのヒドロキ
シルアミンメタノール溶液を60°Cに加熱後、細孔内
の溶媒をメタノールに置換した微多孔性基材を浸漬して
2時間反応させた。反応後の微多孔性基材はメタノール
で十分に洗浄した。なお微多孔性基材にはアクリロニト
リル93.9モル%、アクリル酸メチル5.8モル%、
メタリルスルホン酸ナトリウム0.3モル%の組成の高
分子物質を前記の方法で湿式製膜した微多孔性膜を用い
た。
シルアミンメタノール溶液を60°Cに加熱後、細孔内
の溶媒をメタノールに置換した微多孔性基材を浸漬して
2時間反応させた。反応後の微多孔性基材はメタノール
で十分に洗浄した。なお微多孔性基材にはアクリロニト
リル93.9モル%、アクリル酸メチル5.8モル%、
メタリルスルホン酸ナトリウム0.3モル%の組成の高
分子物質を前記の方法で湿式製膜した微多孔性膜を用い
た。
反応後の微多孔性膜のIRスペクトルにおいては224
0cm−’付近のニトリル基の吸収が大きく減退し、か
わって1640〜1680cm−1の炭素−窒素2重結
合の・吸収が現れていた。反応後の膜の元素分析の結果
とIRスペクトルの吸収強度を比較検討することによっ
て、上記の反応条件では高分子物質中の全ニトリル基の
75〜85%がアミドキシム化されることがわかった。
0cm−’付近のニトリル基の吸収が大きく減退し、か
わって1640〜1680cm−1の炭素−窒素2重結
合の・吸収が現れていた。反応後の膜の元素分析の結果
とIRスペクトルの吸収強度を比較検討することによっ
て、上記の反応条件では高分子物質中の全ニトリル基の
75〜85%がアミドキシム化されることがわかった。
得られたアミドキシム化微多孔性膜がどの程度の蛋白質
吸着性を示すか検討したところ、蛋白性の損失率で8%
と低い値が得られた。
吸着性を示すか検討したところ、蛋白性の損失率で8%
と低い値が得られた。
測定は以下の要領で行った。10部の牛胎児血清と90
部のリン酸緩衝生理食塩水(P B S)からなる試験
溶液を用いて微多孔性膜の濾過試験を行い、その物質収
支から蛋白質の微多孔性膜への非特異的吸着を蛋白質の
損失率として下式により算出した。
部のリン酸緩衝生理食塩水(P B S)からなる試験
溶液を用いて微多孔性膜の濾過試験を行い、その物質収
支から蛋白質の微多孔性膜への非特異的吸着を蛋白質の
損失率として下式により算出した。
吸着による蛋白質の損失率(%)
×100
濾過試験は有効膜面積38alの微多孔性膜を容量20
0m1の■外濾過セルに装着し、試験溶液の濾過を攪拌
丁、操作圧力1 kg/alのもとで行った。100
mlの濾液を採取した後、濃縮液をセルより取り除き、
200 mlのPBSにて洗浄を2回行った。各液中に
含まれる蛋白質量をバイオラッド社のプロティンアッセ
イ液を用いて行った。
0m1の■外濾過セルに装着し、試験溶液の濾過を攪拌
丁、操作圧力1 kg/alのもとで行った。100
mlの濾液を採取した後、濃縮液をセルより取り除き、
200 mlのPBSにて洗浄を2回行った。各液中に
含まれる蛋白質量をバイオラッド社のプロティンアッセ
イ液を用いて行った。
0.2Mのトリメンン酸クロライドのヘキサン溶液を調
製した。メタノール、エタノール、ヘキサンの順に浸漬
して細孔内の溶媒をあらかじめヘキサンに置換しておい
たアミドキシム化した微多孔性支持体を上記のトリメシ
ン酸クロライド溶液中に1時間浸漬して反応させた。反
応後の微多孔性支持体はヘキサンで軽く洗浄した後、表
面のアシルク口ライ−ド基をカルボキシル基に加水分解
するため、1重量%の水を含むヘキサン−アセトンの3
:2(体積比)混合溶媒中に浸漬した。
製した。メタノール、エタノール、ヘキサンの順に浸漬
して細孔内の溶媒をあらかじめヘキサンに置換しておい
たアミドキシム化した微多孔性支持体を上記のトリメシ
ン酸クロライド溶液中に1時間浸漬して反応させた。反
応後の微多孔性支持体はヘキサンで軽く洗浄した後、表
面のアシルク口ライ−ド基をカルボキシル基に加水分解
するため、1重量%の水を含むヘキサン−アセトンの3
:2(体積比)混合溶媒中に浸漬した。
反応後の微多孔性基材のIRスペクトルでは芳香族の6
50〜750cm−’の吸収が現れ、反応の進行が確認
された。
50〜750cm−’の吸収が現れ、反応の進行が確認
された。
150n+Iのジオキサン中に2.2gのN−ヒドロキ
シスクシンイミドを溶解し、これにあらかじめ細孔内の
溶媒をジオキサンに置換しておいた、カルボキシル化し
た微多孔性支持体を浸漬後、ジオキサン5.0mlに溶
かしたジシクロへキシルカルボジイミド3.3gを加え
た(N−ヒドロキシスクシンイミド、ジシクロへキシル
カルボジイミドとも最終濃度は0、 Imol/I)。
シスクシンイミドを溶解し、これにあらかじめ細孔内の
溶媒をジオキサンに置換しておいた、カルボキシル化し
た微多孔性支持体を浸漬後、ジオキサン5.0mlに溶
かしたジシクロへキシルカルボジイミド3.3gを加え
た(N−ヒドロキシスクシンイミド、ジシクロへキシル
カルボジイミドとも最終濃度は0、 Imol/I)。
室温下でゆるやかに1時間攪拌して反応させた。反応後
の支持体は洗液中にN−ヒドロキシスクシンイミドの2
55 n mの吸収が見られなくなるまでジオキサンで
よく洗浄した。
の支持体は洗液中にN−ヒドロキシスクシンイミドの2
55 n mの吸収が見られなくなるまでジオキサンで
よく洗浄した。
該支持体を、塩酸を加えてpH=8に調節した1 mo
l/lのエタノールアミン水溶液中に浸漬して室温下で
一晩放置して反応させた。反応液中に放出されたN−ヒ
ドロキシスクシンイミド量をUVスペクトルの255n
11の吸光度から定量することで、支持体に導入された
スクシンイミドエステル基量を測定したところ、膜の面
積1 cm2あたりl×10’+nolのスクシンイミ
ドエステル基が導入されていることがわかった。
l/lのエタノールアミン水溶液中に浸漬して室温下で
一晩放置して反応させた。反応液中に放出されたN−ヒ
ドロキシスクシンイミド量をUVスペクトルの255n
11の吸光度から定量することで、支持体に導入された
スクシンイミドエステル基量を測定したところ、膜の面
積1 cm2あたりl×10’+nolのスクシンイミ
ドエステル基が導入されていることがわかった。
アフィニティリガンドとしてコンカナバリンA(Con
A、糖蛋白質と結合能をもつ蛋白質)を選び、リン酸緩
衝生理食塩水(P B S)を用いて該リガンドの3m
g/mlの溶液を調製した。スクシンイミドエステル化
した微多孔性支持体(膜面積42cII12)をPBS
で洗浄後、上記のConA溶液10m1中に浸漬し、5
℃で一晩放置して反応させた。
A、糖蛋白質と結合能をもつ蛋白質)を選び、リン酸緩
衝生理食塩水(P B S)を用いて該リガンドの3m
g/mlの溶液を調製した。スクシンイミドエステル化
した微多孔性支持体(膜面積42cII12)をPBS
で洗浄後、上記のConA溶液10m1中に浸漬し、5
℃で一晩放置して反応させた。
反応後の支持体はPBSを用いて洗浄した。反応前後の
ConA溶液および洗浄液中に含まれるConA量を定
量することで微多孔性支持体に固定化されたConAの
量を定量した。その結果、膜面積IC112あたり16
2μgのConAが固定化されたことがわかった。
ConA溶液および洗浄液中に含まれるConA量を定
量することで微多孔性支持体に固定化されたConAの
量を定量した。その結果、膜面積IC112あたり16
2μgのConAが固定化されたことがわかった。
ConA固定化後の微多孔性支持体は残存のスクシンイ
ミドエステル基を不活性化するために、塩酸を加えてp
H=8に調節したl mol/lのエタノールアミン水
溶液中に浸漬して室温下で一晩放置して反応させた。
ミドエステル基を不活性化するために、塩酸を加えてp
H=8に調節したl mol/lのエタノールアミン水
溶液中に浸漬して室温下で一晩放置して反応させた。
実施例2
アフィニティリガンドとしてトリアジン系色素リガンド
、チバクロンブルーF3GA (血清アルブミンやヌク
レオチド依存性酵素などに対して結合能をもつ)を選び
、その 0.2%溶液を2%食塩水(pH=11)を用
いて調製した。前もって細孔内の溶媒を水に置換した実
施例1で合成したアミドキシム化した支持体を上記の溶
液中に浸漬し、室温下で90時間放置して反応させた。
、チバクロンブルーF3GA (血清アルブミンやヌク
レオチド依存性酵素などに対して結合能をもつ)を選び
、その 0.2%溶液を2%食塩水(pH=11)を用
いて調製した。前もって細孔内の溶媒を水に置換した実
施例1で合成したアミドキシム化した支持体を上記の溶
液中に浸漬し、室温下で90時間放置して反応させた。
反応後の微多孔性支持体は十分に水洗して吸着した未反
応のチバクロンブルーを除去した。
応のチバクロンブルーを除去した。
結合したチバクロンブルーの量は反応前後の溶液中に含
まれるチバクロンブルーの量をUVスペクトルによって
測定することで定量した。上記の条件では膜1 cm2
あたり0.65mgが結合することがわかった。
まれるチバクロンブルーの量をUVスペクトルによって
測定することで定量した。上記の条件では膜1 cm2
あたり0.65mgが結合することがわかった。
[発明の効果]
本発明によりアクリロニトリル系微多孔性基材をアミド
キシム化した微多孔性支持体表面に、水酸基、アミノ基
など、求核性をもつ分子と反応容易な活性基を導入した
微多孔性支持体を提供することができる。これは表面が
親水性で、かつ蛋白質の非特異的吸着が少ないものであ
り、アフィニティ分離のためのリガンドを固定化した担
体を得るために有用なものである。また、本発明の微多
孔性支持体を用いて得たリガンドを固定化した担体によ
って、有用な物質を高効率で分離精製できる。
キシム化した微多孔性支持体表面に、水酸基、アミノ基
など、求核性をもつ分子と反応容易な活性基を導入した
微多孔性支持体を提供することができる。これは表面が
親水性で、かつ蛋白質の非特異的吸着が少ないものであ
り、アフィニティ分離のためのリガンドを固定化した担
体を得るために有用なものである。また、本発明の微多
孔性支持体を用いて得たリガンドを固定化した担体によ
って、有用な物質を高効率で分離精製できる。
Claims (2)
- (1)アクリロニトリルを含む高分子物質からなる微多
孔性基材をアミドキシム化して得られる微多孔性支持体
に、求核性基をもつ分子と反応容易な活性基を共有結合
させたことを特徴とする、表面を化学的に活性化した微
多孔性支持体。 - (2)請求項(1)記載の活性基を、1〜20個分の分
子長の炭化水素基、または1〜10個程度のヘテロ原子
を含む炭化水素基を介して微多孔性支持体と結合させた
ことを特徴とする、表面を化学的に活性化した微多孔性
支持体。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2206471A JPH0490850A (ja) | 1990-08-02 | 1990-08-02 | 表面を化学的に活性化した微多孔性支持体 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2206471A JPH0490850A (ja) | 1990-08-02 | 1990-08-02 | 表面を化学的に活性化した微多孔性支持体 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH0490850A true JPH0490850A (ja) | 1992-03-24 |
Family
ID=16523928
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2206471A Pending JPH0490850A (ja) | 1990-08-02 | 1990-08-02 | 表面を化学的に活性化した微多孔性支持体 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPH0490850A (ja) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2005345379A (ja) * | 2004-06-04 | 2005-12-15 | Gl Sciences Inc | アフィニティクロマトグラフィ用デバイス及びその製法 |
JP2007524804A (ja) * | 2003-01-22 | 2007-08-30 | セレネックス, インコーポレイテッド | アルキル連結ヌクレオチド組成物 |
-
1990
- 1990-08-02 JP JP2206471A patent/JPH0490850A/ja active Pending
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2007524804A (ja) * | 2003-01-22 | 2007-08-30 | セレネックス, インコーポレイテッド | アルキル連結ヌクレオチド組成物 |
JP2005345379A (ja) * | 2004-06-04 | 2005-12-15 | Gl Sciences Inc | アフィニティクロマトグラフィ用デバイス及びその製法 |
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