JPH0474670B2 - - Google Patents

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JPH0474670B2
JPH0474670B2 JP57048163A JP4816382A JPH0474670B2 JP H0474670 B2 JPH0474670 B2 JP H0474670B2 JP 57048163 A JP57048163 A JP 57048163A JP 4816382 A JP4816382 A JP 4816382A JP H0474670 B2 JPH0474670 B2 JP H0474670B2
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apoprotein
serum
hdl
plasma
apoa
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JP57048163A
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JPS58166263A (ja
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    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/96Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood or serum control standard

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  • Analytical Chemistry (AREA)
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  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は高比重リポ蛋白(以下HDLと略す)
から遊離したアポ蛋白A−(以下遊離アポA−
と言う)とHDL顆粒表面に存在するアポ蛋白
A−(以下HDL・アポA−と言う)の分離
法即ちHDL・アポ蛋白A−濃度測定用標準品
に関するものである。
アポ蛋白は脂質と蛋白質成分より構成されてお
り、その蛋白質はアポ蛋白と呼ばれている。アポ
蛋白には多くの種類があるが、アポ蛋白A−は
これらアポ蛋白の中で血清又は血漿中でその濃度
が最も高いことが知られている。アポ蛋白A−
は主としてHDL顆粒表面に存在し、HDLの可溶
化に重要な働きをしているほか、レシチンコレス
テロールアシルトランスフエラーゼの活性化作用
を有している。
最近、アポ蛋白の測定が注目されてきており、
特にアポ蛋白A−及びA−の測定は脂質代謝
異常の鑑別また慢性肝炎及び肝硬変の重症度の判
定に有効であることが知られている。
アポ蛋白A−Iの測定法には免疫学的測定法と
して一元放射状免疫拡散法(以下SRID法と略
す)、免疫電気泳動法、オクタロニー法、ラジオ
イムノアツセイ法、エンザイムノアツセイ法、電
気化学的性質を利用した等電点電気泳動法、SDS
ゲル電気泳動法等が使用されている。特にSRID
法、免疫電気泳動法は測定感度にすぐれ且つ操作
の簡便さから日常検査に適した測定法として普及
が期待されている。しかし、これらの方法を使用
する場合標準品として精製したアポ蛋白A−を
用いるが、精製アポ蛋白A−は繁雑な操作と特
殊な装置を使用し脱脂操作を行なう等手間がか
る。しかも脱脂操作が行なわれているので、血清
又は血漿中のアポ蛋白とは挙動が異なることが予
想され好ましくない。一方正常新鮮血清又は血漿
を100%として順次希釈し検量線を作成する方法
があるが、新鮮な血清又は血漿を使用しないと二
重の沈降線あるいは不鮮明な沈降線を生じる。こ
の原因は採取した血清又は血漿中のアポ蛋白A−
が時間の経過と伴にHDL・アポA−と遊離
アポA−に分離し混在してくるためである。こ
の様な血清又は血漿を標準品として使用すると正
確な測定値が得られにくい。従つてこれらの現象
を避けるには新鮮血清又は血漿を標準品として使
用する必要がある。しかし測定毎に正常新鮮血清
又は血漿を標準品として使用することは通常不可
能である。
なぜならば検査室に集まる血清又は血漿は異常
もしくは異常と思われるものがほとんどであるた
め、標準品として使用するには好ましくない。そ
こで新鮮血清又は血漿と同等に正確に測定し得る
標準品即ち、二重の沈降線あるいは不鮮明な沈降
線を生じない標準血清が要望されていた。
本発明者は二重の沈降線あるいは不鮮明な沈降
線を生じる原因となつている遊離アポA−を除
去するため超遠心分離法あるいはゲルロ過法等
種々試みたが除去し得なかつた。しかし、さらに
鋭意研究を進めた結果HDL・アポA−及び遊
離アポA−は抗アポ蛋白A−抗体に対する親
和性に明らかに差があることを見出し、HDL・
アポA−及び遊離アポA−を選択的に分離し
得る方法を完成した。
すなわち、本発明は、抗アポ蛋白A−抗体を
不溶性樹脂に固定化し平衡化した後、高比重リポ
蛋白を含む血清、血漿又は血液を該不溶性樹脂に
接触させ、遊離したアポ蛋白A−を吸着除去す
ることを特徴とするアポ蛋白A−標準品の調製
法を提供するものである。
次に本発明について詳細に説明する。
先ず胎盤後血または有効期限切れの輸血用血液
を比重1.20に調整した後、遠心分離を行ない上部
画分を捕集する。次いで上部画分は脱塩操作を行
なう。
一方、セフアローズ4B(フアルマシア社発売)
にアポ蛋白特異抗体を固定化させた抗アポ蛋白A
−抗体カラムを調製し、緩衝液で平衡化しカラ
ムに充填しておく。
該カラムに脱塩操作を行なつた後のアポ蛋白A
−を含む画分を浸透させ緩衝液で流出させると
最初に目的物であるHDL・アポ蛋白A−を含
む画分が流出して来る。この画分に安定化剤を加
え凍結乾燥することによりHDL・アポ蛋白A−
濃度測定用標準血清が得られる。
なお、抗アポ蛋白A−抗体カラムは以下の方
法で調製できる。
例えば単離精製したアポ蛋白A−を動物(山
羊、家兎等)に免疫して得られた抗血清をそのま
ま次の操作に使用してもよいが、好ましくは得ら
れた抗血清からさらに抗アポ蛋白A−特異抗体
を得、次の操作に使用するのがよい。特異抗体を
得る方法としてはアポ蛋白A−抗原を、セフア
ロース4B等の不溶性樹脂に固定化させカラムに
充填し、緩衝液で平衡化させた後、該カラムに抗
血清を浸透させた後常法の手段で処理すれば抗ア
ポ蛋白A−特異抗体が得られる。この特異抗体
を活性化させた不溶性樹脂例えばセフアロース
4Bに接触させればセフアロース4Bに特異抗体が
固定化される。
次に参考例、実施例で本発明を説明する。
参考例 抗アポ蛋白A−抗体カラム セフアロース4B3gを2モル炭酸カリウム5ml
に懸濁し、氷冷後1mlのアセトニトリルに2gの
臭化シアンを溶解した溶液0.25mlを加え数分間撹
拌した後グラスフイルター(3G)でロ過し、残
渣を10倍量の蒸留水、0.1モル炭酸水素ナトリウ
ムで洗浄する。得られた残渣は抗アポ蛋白A−
抗体30mgを0.1モル炭酸水素ナトリウム7mlに溶
解したものに加え、4℃以下で16時間反応させ
る。反応後ロ過し残渣を蒸留水で洗浄後0.02%ア
ジ化ナトリウムを含む0.5モル塩化ナトリウムに
懸濁させ、4℃以下で保存する。
実施例 胎盤後血1に乾燥した臭化カリウム291.6gを
加え混合した後、4℃で44000rpm,48時間遠心
分離した。分離後遠心管上部画分を捕集し、脱脂
綿を用いて不溶物をロ別した。ロ別後0.2モルシ
ヨ糖−塩化ナトリウム溶液に平衡化したセフアデ
ツクスG−25(フアルマシア社発売)を充填した
カラムに浸透させ同溶液で流出させた。流出液は
各5mlに分画し連続的に蛋白成分を分析しアポ蛋
白A−を含む画分を得た。次いでこの画分をま
とめ0.2モルシヨ糖−塩化ナトリウム溶液に平衡
化した抗アポ蛋白A−抗体カラムに浸透させ同
溶液にて流出させた。流出液は各7mlに分画し、
各分画中の遊離アポ蛋白A−IとHDL・アポ蛋
白A−Iの組成比を、遊離およびHDL・アポ蛋
白A−Iと反応する抗血清を用いたロケツト免疫
電気泳動法で連続的に分析し、遊離アポ蛋白A−
Iが含まれていない画分(抗体カラムからの初期
流出画分)既ちHDL・アポA−を含む画分を
捕集した。
得られたHDL・アポA−を含む画分をバイ
アルビンに0.5mlずつ分注し凍結乾燥し血中アポ
蛋白A−濃度測定標準血清を得た。
この標準血清1バイアルに対し生理食塩液0.5
mlに溶解し、標準血清試料とした。
正常人新鮮血清及び4℃で7日間放置した正常
人の血清をそれぞれ生理食塩液にて10倍に希釈し
試料とした。
標準血清試料及び試料をSRID法用に調製した
抗アポ蛋白A−抗血清を含むアガロース板上に
各5μl添加し室温にて48時間水平台上で静置し沈
降線を比較観察した。標準血清及び新鮮血清では
一本の鮮明な沈降線を得たが、4℃で7日間放置
した血清では二重の沈降線を得た。

Claims (1)

    【特許請求の範囲】
  1. 1 抗アポ蛋白A−抗体を不溶性樹脂に固定化
    し平衡化した後、高比重リポ蛋白を含む血清、血
    漿又は血液を該不溶性樹脂に接触させ、遊離した
    アポ蛋白A−を吸着除去することを特徴とする
    HDL・アポ蛋白A−標準品の調製法。
JP4816382A 1982-03-27 1982-03-27 アポ蛋白a−i標準品の調製法 Granted JPS58166263A (ja)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP4816382A JPS58166263A (ja) 1982-03-27 1982-03-27 アポ蛋白a−i標準品の調製法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP4816382A JPS58166263A (ja) 1982-03-27 1982-03-27 アポ蛋白a−i標準品の調製法

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Publication Number Publication Date
JPS58166263A JPS58166263A (ja) 1983-10-01
JPH0474670B2 true JPH0474670B2 (ja) 1992-11-26

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JP4816382A Granted JPS58166263A (ja) 1982-03-27 1982-03-27 アポ蛋白a−i標準品の調製法

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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JPH0688614B2 (ja) * 1992-07-13 1994-11-09 静男 佐藤 多重構造よりなる紙製保護体及びその製造装置

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JPS58166263A (ja) 1983-10-01

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