JPH04507093A - 繊維芽細胞成長因子の複合体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 の　ム 及］ヱソＬ東 本発明は、細胞の増殖を阻害する組成物に関しており、より詳細には細胞毒性物 質に結合させた繊維芽細胞成長因子に関する。

特定の細胞型の成長および増殖を促進し得る因子を同定および特徴づけるための 多くの研究がなされてきた。この２５年間、多数のこのようなマイトジェン因子 が単離されてきた。

多くのこれらの成長因子は、当初予想されていたような高い特異性をもつよりは むしろ、多機能性で、広範囲の細胞型に影響を及ぼすと現在認められている。さ らに、一群の同類成長因子がなんらかの活性を共有している。

広範囲の活性を有すると現在知られている、一群の成長因子が繊維芽細胞成長因 子（ＦＧＦ）である。塩基性ＦＧＦは、分子量が約１６ｋＤで、酸および温度に 感受性であり、高い等電点を有するタンパク質である。構造的に関連するタンパ ク質である酸性ＦＧＦは酸性の等電点を有する。ＦＧＦは広範囲の間充繊細胞、 内分泌細胞および神経細胞に対してマイトジェン効果を示す。側副枝血管新生お よび脈管形成におけるこれらの因子の促進効果に対して特に関心がもたれている 。

このようなマイトジェン効果は、ＦＧＦが、例えば創傷治癒、神経再生および軟 骨修復の治療薬になる可能性を有するため、相当な関心を引き起こしてきた。

塩基性ＦＧＦに応答する細胞は、その細胞表面膜上に特異的なレセプターを持つ ことが示されてきた。レセプタータンパク質は、細胞型によって分子量１１０〜 １５０ｋＤの一本鎖のポリペプチドのようである。このタンパク質が高い親和性 で（Ｋｄ−１０〜８０９Ｍ）塩基性ＦＧＦと結合し、１細胞当たり２．０００〜 ８０，０００個のレセプター数が存在する。このレセプターは、レクチンとりガ ントアフィニティークロマトグラフィーとの組合せを用いて、ネズミの脳から精 製され得るし、チロシンキナーゼ活性と関連している（Ｉｍａ＋１ｕｒａら、Ｂ ｉｏｃｂｅｔ　Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒａｓ、Ｃｏ＋ｅｍ、１５５：５８３−５９０ 　（１９８８）；　ＨｕａｎｇおよびＨｕａｎｇ、Ｊ、　Ｂｆｏｌ、　Ｃｈｅｔ ２６１：９５６８−９５７１　（１９８６）、両者は本明細書に参考文献として 援用されている）。

乳児ハムスターの肝臓細胞（ＢＨＫ）には、分子量が約１１０および１３０ｋＤ の２種の塩基性ＦＧＦレセプターが報告されている（　ＮｅｕｆａｌｄおよびＧ ａ５ｐｏｄａｒｏｖｉｃｚ、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２６０：１３８６ ０−１３８６８　（１９８５）；　ＮｅｕｆｅｌｄおよびＧａ５ｐｏｄａｒｏｖ ｉｃｚ。

Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈａｔ　２６１：５６３１−５６３７　（１９８６）、両 者は本明細書に参考文献として援用されている）。両方のレセプタータンパク質 は塩基性ＦＧＦおよび酸性ＦＧＦと結合するが、大きいレセプターの方が塩基性 ＦＧＦに優先的に結合し、一方小さいレセプターが酸性ＦＧＦに対して多少高い 親和性を有するようである。

有用な増殖効果をもつ可能性に加え、塩基性ＦＧＦにょって誘発されたマイトジ ェン刺激は、いくつかの例において有害であり得る。例えば、細胞増殖および脈 管形成が腫瘍の成長においては不可欠な要素である。塩基性ＦＧＦは、例えば、 腫瘍発生、アテローム性動脈硬化症、慢性関節リウマチ、増殖性糖尿病網膜症お よび糖尿病の他の合併症において、病態生理学的な役割を果たすと考えられる。

すなわち、特定の病理学的症状においては、塩基性ＦＧＦの有害なマイトジェン 効果を阻害する必要がある。本発明はこの要求を満たし、そして関連の利点をも 提供する。

１胛旦！１ 本発明は、塩基性ＦＧＦあるいはＦＧＦレセプターと反応する他のポリペプチド 、および細胞毒性物質を含有する複合体を提供する。一つの実施態様において、 細胞毒性物質は、例えばサポリンのようなリポソーム不活性化タンパク質（ＲＩ Ｐ）である。しかし他の細胞毒性物質も有効に用いられ得る。細胞毒性物質が化 学結合によって塩基性ＦＧＦに結合し得るし、あるいは組換えＤＮＡの技術によ って組成物がキメラとして調製され得る。両者において、複合体分子は、その複 合体の塩基性ＦＧＦ分子のレセプター結合エピトープが残っていてＦＧＦレセプ ターに認識され得るように、設計され、生産される。

複合体は、ＦＧＦレセプターを有する細胞を特異的に標的し、その細胞の増殖を 阻害するか、あるいは死滅させることによって、ＦＧＦに起因する病態生理学的 症状の治療に用いられ得る。このような病態生理学的症状は、例えば、腫瘍発生 、アテローム性動脈硬化症、デコブニイトラン拘縮、増殖性糖尿病網膜症のよう な糖尿病のある種の合併症、および慢性関節リウマチなどを含む。治療は、例え ば生理的に許容され得る賦形剤中の治療上有効な量のＦＧＦ複合体の投与によっ て行われる。さらに、この複合体は、ＦＧＦレセプターを有する細胞に細胞毒性 物質を標的し、そしてこれらの細胞の増殖を阻害するのに用いられ得る。ヘパリ ン固定化カラムによる複合体の精製方法も提供される。

歿１旦！！二二里 図１　ハ、本複合体混合物のヘパリンセファロースクロマトグラフィーを示す。

図２は、塩基性ＦＧＦ／ＳＡＰ複合体のＲＩＰおよび結合活性を示す。活性はセ ルフリータンバク質合成の阻害アッセイにおける単独のＳＡＰの活性と比較しく パネルＡ、）（ＳＡＰ■、塩基性ＦＧＦ−ＳＡＦＥ）、そしてレセプターの結合 活性はＢＨＫを用いるラジオレセプターアッセイにおける塩基性ＦＧＦと比較し た（パネルＢ）（塩基性ＦＧＦロ、塩基性ＦＧＦ−９ＡＰ・）。各点は３回繰り 返しの実験の平均値である。標ｓｉ差は１０％より小さかった。

図３は、ＢＨＫ細胞の増殖における塩基性ＦＧＦ／ＳＡＰの影響を示す。細胞数 は培地の対照（１９０，０００±１５゜０００）に対する割合としてめた。１（ Ｍ”Ｍのマイトトキシンでの細胞数は９，５２７±９８０である。金側において Ｎ＝３である。（塩基性ＦＧＦ−３ＡＰ・、ＳＡＰ■、塩基性ＦＧＦロ、塩基性 ＦＧＦ＋５ＡＰＯ）。

図４は、細胞毒性に対する外部の塩基性ＦＧＦおよびＮＧＦの影響を示す。塩基 性ＦＧＦ−３ＡＰは１０”Ｍの塩基性基性ＦＧＦとプレインキニベーション、Ｄ ：１０倍過剰量の遊離塩基性ＦＧＦＳ　Ｅ：　ｉｏｏ倍過剰量の遊離塩基性Ｆ　 Ｇ　Ｆ。

Ｆ：１０００倍過剰量の遊離塩基性ＦＧＦ；　Ｇ：当モルの遊離ＮＧＦとインキ ユベーション、Ｈ：　ｉ　０倍過剰モル、■＝１００倍過剰モル、Ｊ：　１００ ０倍過剰モル。

図５は、塩基性ＦＧＦ−ＳＡＰの毒性とＦＧＦレセプター数との関係を示す。各 細胞系を塩基性ＦＧＦ−３ＡＰに４８あるいは７２時間接した後測定した。細胞 数を測定し、細胞数を５０％に減少した濃度を各々の細胞系のレセプター数に対 してプロットした。レセプター数を前出のＭｏ５ｃａｔａｌ　ｌ　ｉらの方法に よりめた。

図６は、実施例ＩＶに記述されている、デュブユイトラン細胞に対する塩基性Ｆ ＧＦ−’ＳＡＰの影響を示す。

１豆二二監１にユ 本発明は、塩基性ＦＧＦあるいはＦＧＦレセプターと反応する他のポリペプチド および細胞毒性物質を含有する複合体を提供する。この組成物はＦＧＦレセプタ ーを有する細胞の成長および増殖を阻害するのに有効である。この組成物は、塩 基性ＦＧＦのマイトジェン効果が有害である場合、例えば、腫瘍性脈管形成、ア テローム性動脈硬化症、および増殖性網膜症のような糖尿病の増殖性合併症にお いて、その効果を抑制するのに用いられ得る。

本明細書に用いられる用語ｒＦｃＦ」とは、塩基性ＦＧＦ（ｂＦＧＦ）および酸 性ＦＧＦ　（ａＦＧＦ）の両者、およびＦＧＦレセプターどの結合によって塩基 性ＦＧＦのマイトジェン活性を示す他のタンパク質を表している。例えば、Ｅｓ ｅｈらが記述した分子量が約１６ｋＤであり、ｐｌが約９．６である塩基性ＦＧ Ｆペプチドである。他のＦＧＦタンパク質は、伸長したアミノ末端をもつ他の型 の塩基性Ｆ　Ｇ　ＦＳａ　Ｆ　Ｇ　Ｆ。

ｈｓｔ、１ｎｔ−２およびＦＧＦ−５が含まれる。（Ｂａｉｒｄら。

Ｂｒ１ｔ、　Ｍｅｄ、　Ｂｕｌｌ　４５：４３ｇ−４５２（１９８９＞参照）。

これら全ては、中胚葉細胞由来のおよび神経堤由来の正常な二倍体細胞において マイトジェン活性を示す。このようなｒＦＧＦマイトジェン活性」のテストは、 ウシの大動脈内皮培養細胞の増殖を促進する能力を測定するものであって、本明 細書に参考文献として援用されているＧｏｓｐｏｄａｒｏｖｉｃｚら、Ｊ、　Ｂ ｉｏｌ、　Ｃｈａｔ　２５７：１２２６６−１２２７８　（１９ｇ２）；　Ｇｏ ｓｐｏｄａｒｏｖｉｃｚら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｅｔ、　ＵＳ Ａ　７３：４１２０−４１２４　（１９７５）に記述されている。用語ＦＧＦと は、哺乳類宿主に検出されるアミノ酸配列をもつタンパク質および改変された配 列の両者を意味する。この改変配列は、ＦＧＦレセプターとの結合によってマイ トジェン活性をなおも示すものであって、アミノ酸の置換、欠失、挿入あるいは 付加を有する。塩基性ＦＧＦおよび酸性ＦＧＦの精製した調製物には、数種のマ イトジェン分子型が含まれていることがしばしば観察される。異なる動物種のＦ ＧＦの間、および同種の生物個体からのＦＧＦの間にもアミノ酸の相違が起こり 得ると考えられる。この用語は、自然源から単離されたタンパク質、および化学 合成あるいは組換え手段により合成的に作成されるタンパク質の両者を表すこと を意図する。

ウシの下垂体組織由来の、模範的な哺乳類の塩基性ＦＧＦのアミノ酸配列が本明 細書に参考文献として援用されているＥｓｅｈら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａ ｄ、Ｓｅｔ、ＵＳＡ　８２：６５０？−６５１１（１９８５）によって提供され ている。本明細書に用いられる用語「塩基性ＦＧＦＪとは、前出のＥｓｃｈに記 述された塩基性ＦＧＦと、実質的に同じアミノ酸配列およびマイトジェン活性を 有するタンパク質あるいはポリペプチドを表す。ヒトａ　Ｆ　Ｇ　Ｆ　（Ｊａｙ ｅら、５ｃｉｅｎｃｅ　２３３：５４１−５４５　（１９８６）およびウシ（Ａ ｂｒａｈａｍら、５ｃｉｅｎｃｅ　２３３：５４５−５４８　（１９８６）、ヒ ト（Ａｂｒａｈａｍら、ＥＭＢＯＪ、５：２５２３−２５２８　（１９１！６） ｓ　Ａｂｒａｈａｍら、Ｑｕａｎｔ、Ｂｔｏｌ、５１：６５７−６６８　（１９ ８６）、およびラット（Ｓｈｉｍａｓａｋｉら、Ｂｉｏｃｈｅ＋ｍ、旧ｏｐｈｙ ｓ、　Ｒａｓ、Ｃｏｍｍｕｎ、１９８８　ＨＫｕｒｏｋａｖａら、Ｎｕｃｌｅｉ ｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、１６：５２０１（１９８８））の塩基性ＦＧＦをコー ドするＤＮＡがクローン化され、配列が決定された。その結果、タンパク質配列 決定により検出されるタンパク質と一致するタンパク質の存在が予想される。

本明細書に用いられる用ｒＭ　ｒ　Ｆ　Ｇ　Ｆレセプター」とは、塩基性ＦＧＦ と結合し、それを細胞内に輸送し得るレセプターを表す。これらのレセプターに は、前記の１ｍａ■ｕ　ｒａ、および前記のＭｏ５ｃａｔｅｌ　ｌ　ｉの記述し たレセプターが含まれている。本明細書に用いられる用ＥＮ　ｒ　Ｆ　ｃ　Ｆレ セプターと反応するポリペプチド」とは、ＦＧＦレセプターと結合し、その結合 によって細胞内に輸送され得る任意のポリペプチドを示す。

塩基性ＦＧＦはＡｍ　ｇ　ｅ　ｎ　（Ｔｈｏｕｓａｎｄ　０ａｋｓ、ＣＡ）など より市販されている。塩基性ＦＧＦは哺乳類の様々な組織から得られる。例えば 、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＲ−ＨＰＬＣ）、ヘパリンセフ１０−ス アフイニテイークロマトグラフイーおよび陽イオン交換ＨＰＬＣおよびＲＲ−Ｈ ＰＬＣを用いる塩基性ＦＧＦの精製方法が、この明細書に参考文献として援用さ れている米国特許第４，７８５．０７９号に、およびＧｏｓｐｏｄａｒｏｗｉｃ ｚ、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｅｔ、　８１：６９６３−６９８ ７　（１８８４）およびＧｏｓｐｏｄａｒｏｖｉｃｚ、Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｍ 、　１４７：１０６−１１９（１９Ｂ？）にも記述されている。それに加え、塩 基性ＦＧＦが化学的あるいは組換え方法より合成され得る。酵母および影虹■に おける組換えタンパク質の発現が、この明細書に参考文献として援用されている Ｂａｒｒら、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｔ　２６３：１６４７１−１６４７８　（ １９１１８）に記述されている。

ＦＧＦ−細胞毒性物質の複合体が固定化ヘパリンのカラムで精製され得る。適切 なカラムにはヘパリンセファロースおよびヘパリンアガロースが含まれる。吸着 した複合体がＮａＣ１のような塩の濃度勾配で、１および３Ｍの間の濃度で溶出 され得る。

本発明の一面では、塩基性ＦＧＦは、ＦＧＦレセプターを出現する細胞に、特異 的に細胞毒性物質が標的するように、細胞毒性物質に結合させられる。本明細書 に用いられる細胞毒性物質とは、細胞の機能を阻害し得る分子を示す。この用語 は細胞内に輸送した時のみに毒性を示す物質を含み、および細胞表面で毒性を示 す物質をも含む。タンパク質を阻害する物質を含む、様々な細胞毒性物質が用い られる。本発明の一面において、ＦＧＦはリポソーム不活性化タンパク質（ＲＩ Ｆ）、例えばサボリン−５（ＳＡＰ）あるいは他＋７）Ｓ　ＡＰ誘導体に連結さ れている。ＳＡＰは植物７　ｏｆ　ｆ　Ｉ　ｃ　ｉ　ｎ　ａＵｌの種子から４１ Ｍされた有力なＲＩＰである（Ｓｔｉｒｐａら、Ｂｌｏｃｈａｍ　Ｊ、　２１６ ：６１７−６２５　（１９８３）参照）。他の適切な細胞毒性物質には、リシン 、リシンＡ鎖、ゲロニン、ジブテリアトキシン、ジブテリアトキシンＡ鎖および Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓエキントキシンが含まれるが、しかしこれらに限定され ない。本発明の他の面では、細胞毒性物質は薬剤である。このような薬剤の例は 、ダウノマイシン（ダウノルビシンおよびドキソルビシンを含む）のようなアン トラサイクリンおよびメトトレキセートおよびそれらのアナローブである。その 他は当業者に公知である。

ＦＧＦは、当業者に公知の方法、例えば、５ＰＤＰのような反応性スルフヒドリ ル基を含有する分子による誘導体化、あるいはグルタルアルデヒドあるいはカル ボジイミドのような架橋剤によって、タンパク質細胞毒性物質に複合させられ得 る。一つの実施態様において、細胞毒性物質はＮ−スクシンイミジル−３（２− ピリジルジチオ）プロピオン酸塩のような反応性スルフヒドリル基含有物質によ って誘導体化される。その後、誘導体化された細胞毒性物質にＦＧＦを添加して 、混合する。このＦＧＦ複合体をカラムにかけ未反応物から分離し得る。あるい は、ＦＧＦは、ｃｆｓ−アコニット酸方法（ＳｈｅｎおよびＲ１５ｅｒ、ＢＢＲ Ｃ１０２：１０４８　（１９８１）、本明細書に参考文献として援用されている ）より、糖分子を介して、１４ブロモドキソルビシンのような薬剤と複合させら れ得る。

他方、キメラのＦＧＦ複合体が組換え方法で調製され得る。

このような方法はＩ　Ｌ−２あるいはＴＧＦα複合体に応用され、本明細書に参 考文献として援用されているＣｈａｕｄｈａｒｙら。

Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＩＪｓＡ　８４：４５３８− ４５４２　（１９１１？＞およびり。

ｒｂａｒｍａｎ−Ｇａｌｓｋｊら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｅｆ、Ｕ ＳＡ　８５：１９２２−１９２６　（１９８８）に提供されている。本明細書に 参考文献として援用されているＭａｎｆａｔｆｓら、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ ｌｏｎｆｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒ ｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　（１９Ｂ２＞も参照。

ＦＧＦおよび細胞毒性物質を含有する複合体は、ＦＧＦによる様々な病態生理学 的症状の治療に有用である。本明細書に用いられている用Ｍ　ｒ　Ｆ　Ｇ　Ｆに よる病態生理学的症状」とは、塩基性ＦＧＦマイトジェン刺激に敏感である細胞 の増殖に特徴づけられるあるいはそれが原因となる有害な状態を示す。塩基性Ｆ ＧＦによる病態生理学的症状は、膿瘍、アテローム性動脈硬化症、慢性関節リウ マチ、デエプユイトラン拘縮および増殖性網膜症のような糖尿病のある種の合併 症が含まれるが、これらに制限されていない。

ＦＧＦ−細胞毒性物質の複合体は細胞死を引き起こすために、ＦＧＦレセプター を出現する細胞に細胞毒性物質が標的するのに用いられ得る。驚くことに、図５ に示されているように、細胞当たりのＦＧＦレセプター数は細胞が５０％死滅す るための投与量（ＥＤｓａ）と直接的な関係がある。さらに、非常に高いレセプ ター数をもつ細胞、例えばＢＨＫ細胞においては、ＥＤ５．が塩基性ＦＧＦ’の レセプターに対する親和定数に一致している（ＢＨＫ細胞では両者が２５ｐＭで ある）。

このような意外な結果は、ＳＡＰのような大きい分子であっても細胞毒性物質の 存在が塩基性ＦＧＦ活性を減少しないことを示唆する。その上、これらの結果は 、大量の塩基性ＦＧＦレセプターを出現するこれらの細胞が特に複合体に感受性 であることを示唆している。

ＦＧＦによる病態生理学的症状を治療するために、治療上有効な量のＦＧＦ−細 胞毒性物質の複合体が生理学的に許容され得る賦形剤と一緒に投与される。生理 学的に許容され得る賦形剤の例にはＰＢＳおよび食塩水が含まれる。

本発明を以下の実施例につき説明するが、これらに制限されない。

案ＩＬＬ ＦＧＦとサポリンとの複合 １５４個のアミノ酸の配列に相当する組換え塩基性ＦＧＦ（Ａｂｒａｈａｍら、 Ｑｕａｎｔ、　Ｂｉｏｌ、　Ｓｌ：６５７−６６８　（１９８６）、本明細書に 参考として援用されている）がＦａｒｍｉｔａｌｌａ　Ｃａｒｌｏ　Ｅｒｂａか ら得られた。サポリンー６は、Ｌａｐｐｉら。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｗｌ１１２９：９３４− ９４２　（１９８５）　（本明細書に参考文献として援用されている）によって 改良された前出の５ｔｔｒｐｅらの方法より精製された。要するに、ｎ匹ル圧国 ｏｆｆｔｃｉｎａｌｉｓの種子を０．１４Ｍ　ＮａＣ１を含む５ｍＭリン酸ナト リウム緩衝溶液、ｐＨ７，２（８ｍｌ／ｇ）中で粉砕して抽出した。４℃で−・ 晩攪拌した後、抽出物をガーゼで濾過して、２８０００ｇで３０分間遠心した。

沈澱および浮遊の脂肪から上清を分離し、それを「粗抽出物」と呼ぶ。

粗抽出物を５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝溶液、ｐＨ６，５に透析し、２８０００ ｇで３０分間遠心した後、ＣＭセルロースカラム（ＣＭ　５２　ＨＷｈａｔｍａ ｎ、　Ｍａｉｄｓｔｏｎｅ、Ｗｅｎｔ、　Ｕ、に、）にかけた。カラムを洗浄し た後、同緩衝溶液の０〜０．３Ｍ　Ｎａ、　ＣＩ濃度勾配で溶出した。この試料 を水に透析した後、５０ｍＭ　ホウ酸ナトリウムｐ　Ｈ９、５，０，１５６Ｍ塩 化ナトリウムで平衡化したＦＰＬＣのＭｏｎｏ　Ｓカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ 、、Ｌｌｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）でりＯ？トゲラフイーを行った。タンパ ク質を２０分間の０．１５６Ｍ〜０．１８６Ｍの塩化ナトリウムの濃度勾配で溶 出した。ピークの所を回収して得られた試料をさらにＭｉｌｌｉ−Ｑの水（Ｍｔ 　１ｌｌｐｏｒｅ、Ｂｅｄｆｏｒｄ。

ＭＡ）に充分に透析した。乾燥した試料の一部を計量し、水で１　ｍ　ｇ　／　 ｍ　１濃度に溶解した。紫外線スペクトルを記録したところ、２７７ｎｍの最大 吸収波長で１％吸収係数が６．４であった。２８０ｎｍではＥ　２１１ａが６． ０であった。ＢＳＡを標準物として用いたＬｏｗｒｙ法（Ｌｏｖｒｙら、Ｊ、　 Ｂｉｏｌ、　Ｃｈａｔ１９３：２６５−２７５　（１９５１））によるタンパク 質の定量は１．０７ｍｇ／　ｍ　１の結果が得られた。

製造業者の説明書に従って、ＳＡＰをＮ−スクシンイミジル−３（２−ピリジル ジチオ）プロピオン酸塩（ＳＰＤＰ；Ｐｈａｒｍａｃｔａ　Ｆｉｎｅ　Ｃｈｅｍ ｉｃａｌｓ、　Ｐｔｓｃａｔａｗａｙ、　ＮＪ）で誘導体化した。要するに、Ｓ ＡＰをＮａ　Ｃ１（０，１Ｍ）を含むリン酸ナトリウム緩衝溶液（０，１Ｍ、ｐ Ｈ７，５）で溶解したく２．７ｍ　ｇ　／　ｍ　Ｌ　）。攪拌しながら、エタノ ールで溶解された１、２５モル過剰の５ＰＤＰを滴下してから、時々攪拌しなが ら２３℃、３０分反応させた。過剰の試薬および低分子の反応生成物をゲル濾過 で除去した。塩基性Ｆ　Ｇ　Ｆ　（２ｍ　ｇ　／　ｍ　ｌ　）を加え、誘導体化 したサポリン（６ｍｇ／ｒｎＬ　０．１Ｍリン酸ナトリウム、０．１Ｍ塩化ナト リウム、ｐＨ７，５中）と室温で２時間混合した。０．１Ｍヨウドアセトアミド を３５μＬ添加して反応を停止した。さらに３０分静置した後、反応混合物を３ ０ｍ１に希釈し、ヘパリンセファロース（Ｐｂａｒｍａｃｉａ）カラム（０，５ ｘ　５．５　ｃ　ｍ）にかけた。吸着したタンパク質を０．６Ｍ、ＩＭおよび２ ＭのＮａＣｌを含む１０ｍＭのＴＲｌ５．ｐＨ７，４の段階的濃度勾配で溶出し 、ＩＭと２Ｍの間に溶出した試料を集めた。集めた試料を水に透析した後、Ｍｏ ｎｏ　Ｓ　５１５　ＮａＣ１陽イオン交換カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）　（緩 衝溶液Ａ：５０ｍＭホウ酸ナトリウム、ｐＨ８゜０、緩衝溶液Ｂ：　０．５Ｍ　 ＮａＣ１を含む緩衝溶液Ａ）でクロマトグラフィーを行い、最終精製した。Ｐｈ ａ　ｓ　ｔＧｅ　１（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）電気泳動した後、複合体を含有する 画分を銀染色で検出し、分析のために適切な画分を集めた。

ゲル電気泳動で複合体の合成を評価し、反応混合物中に塩基性ＦＧＦが検出され なくなるまで反応させた。へ７？リンセフアロースのクロマトグラフィー（図１ ）を行い、続（λて各ピーク画分を電気泳動分析した結果、ＳＡＰはへ）（リン セファロースに吸着しないが、複合体は吸着したことが分かった。

少雪の複合体のみが１．０ＭのＮａＣ１でのカラム洗浄中に溶出された。主な生 成物が２Ｍでの洗浄の時に溶出され、当モル量のＳＡＰおよび塩基性ＦＧＦ　（ Ｍｒ　４０．０００）を含有していた。しかし、推定した分子量が６８．０００ を越えた（Ｍｒ＞　６８，０００）複合体も一部存在した。これは１分子のサポ リンに２分子の塩基性ＦＧＦが複合した結果であると推定される。

ウサギで作成した配列特異的抗血清を用いて５ＡＰ−塩基性Ｆ　Ｇ　Ｆの複合体 の明確な同定を達成した。１〜２４位のアミノ酸を含有する塩基性ＦＧＦ断片を ９９０型・くブチド合成機（Ｂｅｃｌｖａｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｂｒｅ ａ、ＣＡ）を用（Ａでイヒ学合成し、抗原として用いた。ウェスタンプロット分 析より、様々な分子量を有する複合体型の全てがＦＧＦおよびＳ　Ａ、　Ｐの両 方をもっていることが分かった。抗血清はペプチドの中央部分を認識し、精製し たウシ塩基性ＦＧＦおよび組換えヒト塩基性ＦＧＦと当モルで交差反応する。

電気泳動後のドデシル硫酸ナトリウム含有ポリアクリルアミドゲル中のサンプル をニトロセルロース膜上に電気プロットし、空気乾燥した。この膜をＴＲｌ５緩 衝生理食塩水に浸し、１０分間振盪した後、溶液を吸引して除去した。この膜を ５％無脂肪乳（ＮＦＭ）含有ＴＢＳに浸し、１０分間振盪した後、溶液を吸引し て除去した。ＮＦＭ／ＴＢＳ中１／１００中漬／１０００濃 ＧＦ抗血清のいずれかを添加して一晩振とうした。溶液を吸引して除去した。こ の膜をＴＢＳに浸し、１０分間振盪してから溶液を吸引して除去した。この膜を ０．０５％ＮＰ４０／ＴＢＳに浸し、１分間振った後、溶液を吸引して除去した 。

最終ＴＢＳおよびＮＰ４０／ＴＢＳ洗浄を２回行った。ＮＦＭ／Ｔ　Ｂ　Ｓ中に １／２０００の希釈した、セイヨウワサビベルオキシナーゼで標識した抗ＸｇＧ を加え、膜を２時間振とうした。ＴＢＳおよびＮＰ４０／ＴＢＳの洗浄を繰り返 した。

２０ｍＬメタノール中の６０ｍｇの４−クロロ−１−ナフトルおよび１　０　０ ｍＬ再蒸留水および１０μＬ３０％Ｈ２０を含む溶液（新しく混合し，たもの） に膜を置き、溶液を膜に加えて現像させた。溶液を吸引して除去し、そして水で すすいで反応を停止させ、膜を乾燥した。

大玉１狸工」− Ｆ　Ｇ　Ｆ／Ｓ　Ａ　Ｐ複合体の活性 Ｍｏ５ｅａｔｅｌｌｉら、Ｊ、Ｃａ１ｌ　Ｐｈｙｓｉｏｌ、１３１：１２３−１ ３０　（１９８７）　（本明細書に参考文献として援用されている）の方法を用 いて、複合体の塩基性ＦＧＦレセプターの認識能力を調べた。要するに、細胞を 半集密的になるまで培養した。その細胞を、Ｆ−１２，１４ｍＭ　ＮａＨＣＯｓ 、２５ｍＭ　ＨＥＰＥＳおよび０．２％ゼラチンを含む３００μＬの緩衝溶液中 に、様々な濃度の塩基性ＦＧＦあるいは複合体の存在下で、１０μＬの放射性ヨ ウ素化した塩基性ＦＧＦと、４°Ｃで、２時間インキコベートした。次に、細胞 を０．５ｍＬＪン酸緩衝生理食塩水溶液で３回、２Ｍ　ＮａＣ１を含むＰＢＳで ２回洗浄した。

高親和性のレセプターとの結合は０．５％トリトンＸ−１００含有ＰＢＳ　（ｐ Ｈ８，１）で可溶化した膜の画分を測定してめた。

５ｉｅｈｎら、　Ｂｌｏｏｄ　７２ニア５６−７６５　（Ｌ９Ｈ）　（本明細書 に参考文献として援用されている）に記載のタンパク質合成のインビトロアッセ イより、ＳＡＰタンパク質のタンパク質合成阻害活性を、塩基性ＦＧＦ／ＳＡＰ の複合体のタンパク質合成阻害活性と比較した。乳児ハムスターの肝臓繊維芽細 胞（ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ６２８１）を用いて細胞毒性活性を調べた。

Ｂ）ｆＫ細胞を２４ウエルのプレートに、５０００細胞／ｍｌの濃度でプレート し、３７℃、５％Ｃ０２中で一晩インキュベートした。翌朝、５％ＦＣ３含有の 、ＨＥＰＥＳ緩衝ＤＭＥＭとＦ−１２培地との（１：　１）溶液をウェルから吸 引して、培地のみで、または複合体、塩基性ＦＧＦあるいはサボリンを含む培地 で培地交換した。２日後、細胞を２回洗浄して、トリプシン処理した。細胞数を Ｃｏｕｌｔｅｒ粒子カウンター　（Ｃｏｕｌｔｅｒ　Ｅｌｅｃｔｒｏｎｔｃｓ、 Ｈｉａｌｅａｈ、ＦＬ）でめた。

図２Ａに示されているように、タンパク質合成の阻害のイ／ｈ’ｌ−０７１セイ で調べた際、複合体はサポリンの活性を保持する。複合体は、予想された通り、 活性が遊離のＳＡＰの活性より少し低い（約２倍）。これは、複合体化する以前 のＳＡＰの誘導体化レベルが低いこと（０，８モル５ＰＤＰ１モル）、および結 合した塩基性ＦＧＦの存在により起こり得る立体障害から説明できる。これに対 して、塩基性ＦＧＦにおける放射性レセプターアッセイから得られた結果（図２ Ｂ）から、塩基性ＦＧＦ／ＳＡＰが結合アッセイにおいて、塩基性ＦＧＦよりわ ずかに高い活性を持たないにしろ、同程度の能力を持つことが分かった。すなわ ち、塩基性ＦＧＦの遊離スルフヒドリル基がＳＡＰとの架橋に関わることは、レ セプターを認識する能力を妨げるのではないと思われる。むしろ、この反応が塩 基性ＦＧＦを安定化し得る。

塩基性ＦＧＦ／ＳＡＰはＢＨＫ細胞に対する有能な細胞毒性要因である（図３） 。ＳＡＰはテストンた最高量（１０−”塩基性ＦＧＦは増殖に対してわずかな阻 害効果を有する。塩基性ＦＧＦとＳＡＰとの混合物はテストした最高濃度の時の みわずかに毒性を有する。細胞毒性物質のＩ　Ｄｓｓ　（２５ｐＭ）は、増殖ア ッセイにおける塩基性ＦＧＦの能力（１５ｐＭ）とよく一致している。複合体の 有糸分裂阻害活性がレセプター特異的であることを確立するために、細胞毒性物 質の特異性を競合実験で調べた。細胞毒性物質で細胞を処理する前に、ＢＨＫ細 胞を様々なレベルの塩基性ＦＧＦあるいは神経成長因子（ＮＧＦ）と１時間ブレ インキュベートした。図４に示されているように、増加した塩基性ＦＧＦ量の存 在下で、その増加量に伴う細胞毒性の阻害が見られる。それに対して、１０００ 倍過剰量のＮＦＣは効果がない。

Ｋ血血上上土 ウサギ　における　七　の Ｅｌｖａｘ（エチレン−酢酸ビニル共重合体樹脂、Ｄｕｐｏｎｔ。

ｆｉｌｍｆｎｇｔｏｎ、ＤＢ）ベレットを以下の通りに作製する。約６０ｍｇの 洗浄、乾燥したＥｌｖａＸを５００μＬの塩化メチレンに溶解した。これを５０ μｇの乾燥した塩基性ＦＧＦに加えた。これを５μＬずつドライアイスで凍らせ たスライドガラスの上に滴下した。ベレットを一晩冷凍庫に放置してから、デシ ケータ−中で乾燥した。

ニューシーラント白ウサギにＩｎｎｏｖａｒ　Ｙｅｔ：　１ｍ　Ｌ　／　ｋ　ｇ を麻酔した。ウサギの目の角膜を切開して、へらあるいは鉗子でポケットを開い た。ポケットに１個のベレットを入れた。両目にベレットを入れた。生理食塩水 で目を洗い、モしてゲンタミシンを１ｍｌ筋肉注射した。ウサギを５日間放置し て、脈管形成を観察した。５日後、各々の左目を、２０μＬの０，２５％ＢＳＡ 中の１００ｎＨの、実施例Ｉで調製された塩基性ＦＧＦ−ＳＡＰで処理した。右 目を２ｏμＬの０，２５％ＢＳＡ単独で処理した。１日２回、ウサギの角膜の上 に、目薬のように溶液を滴下して処理した。動物を処理する人はサンプルの内容 を知らせなかった。１０日後、処理の内容を知らない分析者が動物の角膜におけ る脈管形成を顕微鏡で分析して評価した。脈管形成を、＋＋＋が最高脈管形成、 そして−が脈管形成がない、として判断した。

結果を表１に示した。表から、塩基性ＦＧＦ−３ＡＰで処理した角膜では、脈管 形成が対照に比べ、著しく減少したことが分かった。

表」− 監惣　昼旦　Ｌ豆 ９９５　＋　− ９９７＋＋＋　＋ ９９８　＋＋＋　＋ ９９９　＋＋　− に１匹エヱ デコブユイトラン細胞におけるＦＧＦ−３ＡＰの効果手の動きに変化をもたらす 疾病、デ１プコイトラン拘縮であると診断された成人患者の手を手術して除去し た組織から得られた細胞を、−次培養をした。これらの細胞は、１細胞当たり！ 、０．ＱＯＯおよび１５．０００の間の塩基性ＦＧＦしセブターがある。

これらの細胞を２４ウエルの培養器で、ｌウェル当たり１ｏ、ｏ　ｏ　ｏ細胞の 濃度で、ＨＥＰＥＳ緩衝の１０％ＦＣ３を含むＤＭＥＭ中で、−晩増殖させた。

翌朝、培地を除去し、１０″８から１０−１２モルの濃度範囲の塩基性ＦＧＦ− ８ＡＰの複合体を含む培地で置換した。対照には、培地のみで処理したウェル、 同程度の濃度の塩基性ＦＧＦのみで処理したウェル、サポリンのみで処理したウ ェル、および複合体としてではない塩基性ＦＧＦとサボリンとで処理したウェル が含まれる。

細胞を７２時間インキュペター内で培養した。インキニベシ冒ン終了後、細胞を 洗浄し、トリプシンで移した後、Ｃｏｕｌ　ｔｅｒセルカウンターの上で細胞数 を数えた。培地対照中の細胞数を、処理したウェル（上記に述べられた）の細胞 数と比較した。これらの細胞致死アッセイの結果が図６に示されている。図から 、デュブユイトラン細胞が塩基性ＦＧＦ−３ＡＰに対して感受性であるこたが分 かった。同様の結果が他の３細胞サンプルから得られた。

本発明は、必然的に好まれる実施態様を援用して述べられたが、本発明の真意か ら外れることなくに様々な改変が行われ得ると解釈されるべきである。従って、 本発明は以下の請求の範囲によってのみ制限される。

ＦＩＧ、　Ｉ ＪＬＩケ゛峯号 濃Ａ　（ｐＭ） ジ驚戊　（ｎＭ） ＦＩＧ、　Ｂ ＥＸ　Ａ　（ｎＭ） ＦＩＧ、　４ ＦＩＧ、　５ しＣアク−牡 ＦＩＧ、６ Ｉ浅　（ｎＭ） 国際調査報告 ｔｍｍｎｍ、ｅｌ　Ａｅ、、、ｅｌ１．。ＰＣＴ／ＵＳ　９０１０２２Ｂ９．− ９ゆａａｌ　Ａｌｅｈｌｊｌｌ。、Ｎ、　ＰＣＴ／ＬＩＳ９０１０２２８９国際 調査報告 ＵＳ　９００２２８９ ＳＡ　３６Ｂ６Ｂ

Claims (22)

【特許請求の範囲】
1. １．細胞毒性物質およびＦＧＦレセプターと反応するポリペプチドを含有する、 複合体。
2. ２．前記ＦＧＦレセプターと反応するポリペプチドが、塩基性ＦＧＦである、請 求項１に記載の複合体。
3. ３．前記ＦＧＦレセプターと反応するポリペプチドが、酸性ＦＧＦ、ｈｓｔ、ｉ ｎｔ−２およびＦＧＦ−５でなる群から選択される、請求項１に記載の複合体。
4. ４．前記細胞毒性物質が、リボソーム不活性化タンパク質である、請求項１に記 載の複合体。
5. ５．前記細胞毒性物質が、サポリンである、請求項４に記載の複合体。
6. ６．前記細胞毒性物質が、メトトレキセートおよびダウノマイシンでなる群から 選択される、請求項１に記載の複合体。
7. ７．ＦＧＦレセプターを有する細胞を細胞毒性物質で標的する方法であって、該 細胞毒性物質をＦＧＦレセプターと反応するポリペプチドと複合させる工程、お よび該複合体を該細胞に与える工程を包含する、方法。
8. ８．前記ＦＧＦレセプターと反応するポリペプチドが、塩基性ＦＧＦである、請 求項７に記載の方法。
9. ９．前記ＦＧＦレセプターと反応するポリペプチドが、ａＦＧＦである、請求項 ７に記載の方法。
10. １０．前記細胞毒性物質が、リボソーム不活性化タンパク質である、請求項７に 記載の方法。
11. １１．前記細胞毒性物質が、サポリンである、請求項７に記載の方法。
12. １２．前記細胞毒性物質が、メトトレキセートあるいはそのアナログおよびダウ ノマイシンのようなアントラサイクリンでなる群から選択される、請求項７に記 載の方法。
13. １３．ＦＧＦによる病態生理学的症状を処置する方法であって、細胞毒性物質と 結合したＦＧＦの治療上有効量を投与する工程を包含する、方法。
14. １４．前記ＦＧＦによる病態生理学的症状が、腫瘍、アテローム性動脈硬化症、 慢性関節リウマチおよび増殖性糖尿病網膜症でなる群から選択される、請求項１ ３に記載の方法。
15. １５．前記ＦＧＦレセプターと反応するポリペプチドが、塩基性ＦＧＦである、 請求項１３に記載の方法。
16. １６．前記ＦＧＦレセプターと反応するポリペプチドが、ａＦＧＦである、請求 項１３に記載の方法。
17. １７．前記細胞毒性物質が、リボソーム不活性化タンパク質である、請求項１３ に記載の方法。
18. １８．前記細胞毒性物質が、サポリンである、請求項１３に記載の方法。
19. １９．前記細胞毒性物質が、メトトレキセートおよびダウノマイシンでなる群か ら選択される、請求項１３に記載の方法。
20. ２０．ＦＧＦレセプターを有する細胞の増殖を阻害する方法であって、ＦＧＦお よび細胞毒性物質を含有する複合体を該細胞に投与する工程を包含する、方法。
21. ２１．請求項１に記載の複合体および生理学的許容され得る賦形剤を含有する、 薬剤。
22. ２２．成長因子および細胞毒性物質を含む複合体の精製方法であって、 ＦＧＦ−複合体を含有するサンプルを固定化ヘパリンカラムにかける工程； 該カラムを塩濃度勾配で溶出する工程；および１Ｍおよび３Ｍの間の塩濃度勾配 で溶出された試料を集める工程、 を包含する、方法。