JP2891306B2 - 繊維芽細胞成長因子の複合体 - Google Patents

繊維芽細胞成長因子の複合体

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JP2891306B2 JP2507528A JP50752890A JP2891306B2 JP 2891306 B2 JP2891306 B2 JP 2891306B2 JP 2507528 A JP2507528 A JP 2507528A JP 50752890 A JP50752890 A JP 50752890A JP 2891306 B2 JP2891306 B2 JP 2891306B2
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Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 本発明は、細胞の増殖を阻害する組成物に関してお
り、より詳細には細胞毒性物質に結合させた繊維芽細胞
成長因子に関する。
特定の細胞型の成長および増殖を促進し得る因子を同
定および特徴づけるための多くの研究がなされてきた。
この25年間、多数のこのようなマイトジェン因子が単離
されてきた。多くのこれらの成長因子は、当初予想され
ていたような高い特異性をもつよりはむしろ、多機能性
で、広範囲の細胞型に影響を及ぼすと現在認められてい
る。さらに、一群の同類成長因子がなんらかの活性を共
有している。
広範囲の活性を有すると現在知られている、一群の成
長因子が繊維芽細胞成長因子（FGF）である。塩基性FGF
は、分子量が約16kDで、酸および温度に感受性であり、
高い等電点を有するタンパク質である。構造的に関連す
るタンパク質である酸性FGFは酸性の等電点を有する。F
GFは広範囲の間充織細胞、内分泌細胞および神経細胞に
対してマイトジェン効果を示す。側副枝血管新生および
脈管形成におけるこれらの因子の促進効果に対して特に
関心がもたれている。このようなマイトジェン効果は、
FGFが、例えば創傷治癒、神経再生および軟骨修復の治
療薬になる可能性を有するため、適当な関心を引き起こ
してきた。
塩基性FGFに応答する細胞は、その細胞表面膜上に特
異的なレセプターを持つことが示されてきた。レセプタ
ータンパク質は、細胞型によって分子量110〜150kDの一
本鎖のポリペプチドのようである。このタンパク質が高
い親和性で（Kd＝10〜80pM）塩基性FGFと結合し、１細
胞当たり2,000〜80,000個のレセプター数が存在する。
このレセプターは、レクチンとリガンドアフィニティー
クロマトグラフィーとの組合せを用いて、ネズミの脳か
ら精製され得るし、チロシンキナーゼ活性と関連してい
る（Imamuraら,Biochem.Biophys.Res.Comm.155:583−59
0（1988）;HuangおよびHuang,J.Biol.Chem.261:9568−9
571（1986）、両者は本明細書に参考文献として援用さ
れている）。
乳児ハムスターの肝臓細胞（BHK）には、分子量が約1
10および130kDの２種の塩基性FGFレセプターが報告され
ている（NeufeldおよびGaspodarowicz,J.Biol.Chem.26
0:13860−13868（1985）;NeufeldおよびGaspodarowicz,
J.Biol.Chem.260:5631−5637（1986）、両者は本明細書
に参照文献として援用されている）。両者のレセプター
タンパク質は塩基性FGFおよび酸性FGFと結合するが、大
きいレセプターの方が塩基性FGFに優先的に結合し、一
方小さいレセプターが酸性FGFに対して多少高い親和性
を有するようである。
有用な増殖効果をもつ可能性に加え、塩基性FGFによ
って誘発されたマイトジェン刺激は、いくつかの例にお
いて有害であり得る。例えば、細胞増殖および脈管形成
が腫瘍の成長においては不可欠な要素である。塩基性FG
Fは、例えば、腫瘍発生、アテローム性動脈硬化症、慢
性関節リウマチ、増殖性糖尿病網膜症および糖尿病の他
の合併症において、病態生理学的な役割を果たすと考え
られる。
すなわち、特定の病理学的症状においては、塩基性FG
Fの有害なマイトジェン効果を阻害する必要がある。本
発明はこの要求を満たし、そして関連の利点をも提供す
る。
発明の要旨 本発明は、塩基性FGFあるいはFGFレセプターと反応す
る他のポリペプチド、および細胞毒性物質を含有する複
合体を提供する。一つの実施態様において、細胞毒性物
質は、例えばサポリンのようなリボソーム不活性化タン
パク質（RIP）である。しかし他の細胞毒性物質も有効
に用いられ得る。細胞毒性物質が化学結合によって塩基
性FGFに結合し得るし、あるいは組換えDNAの技術によっ
て組成物がキメラとして調製され得る。両者において、
複合体分子は、その複合体の塩基性FGF分子のレセプタ
ー結合エピトープが残っていてFGFレセプターに確認さ
れ得るように、設計され、生産される。
複合体は、FGFレセプターを有する細胞を特異的に標
的し、その細胞の増殖を阻害するか、あるいは死滅させ
ることによって、FGFに起因する病態生理学的症状の治
療に用いられ得る。このような病態生理学的症状は、例
えば、腫瘍発生、アテローム性動脈硬化症、デュプュイ
トラン拘縮、増殖性糖尿病網膜症のような糖尿病のある
種の合併症、および慢性関節リウマチなどを含む。治療
は、例えば生理的に許容され得る賦形剤中の治療上有効
な量のFGF複合体の投与によって行われる。さらに、こ
の複合体は、FGFレセプターを有する細胞に細胞毒性物
質を標的し、そしてこれらの細胞の増殖を阻害するのに
用いられ得る。ヘパリン固定化カラムによる複合体の精
製方法も提供される。
図面の簡単な説明 図１は、本複合体混合物のヘパリンセファロースクロ
マトグラフィーを示す。
図２は、塩基性FGF/SAP複合体のRIPおよび結合活性を
示す。活性はセルフリータンパク質合成の阻害アッセイ
における単独のSAPの活性と比較し（パネルＡ）（SAP
■，塩基性FGF−SAP●）、そしてレセプターの結合活性
はBHKを用いるラジオレセプターアッセイにおける塩基
性FGFと比較した（パネルＢ）（塩基性FGF□，塩基性FG
F−SAP●）。各点は３回繰り返しの実験の平均値であ
る。標準偏差は10％より小さかった。
図３は、BHK細胞の増殖における塩基性FGF/SAPの影響
を示す。細胞数は培地の対照（190,000±15,000）に対
する割合として求めた。10-8Mのマイトトキシンでの細
胞数は9,527±980である。全例においてＮ＝３である。
（塩基性FGF−SAP●,SAP■，塩基性FGF□，塩基性FGF＋
SAP○）。
図４は、細胞毒性に対する外部の塩基性FGFおよびNGF
の影響を示す。塩基性FGF−SAPは10-10Mの塩基性FGF−S
AP濃度が用いられ、そしてC:当モルの遊離塩基性FGFと
プレインキュベーション、D:10倍過剰量の遊離塩基性FG
F、E:100倍過剰量の遊離塩基性FGF、F:1000倍過剰量の
遊離塩基性FGF;G:当モルの遊離NGFとインキュベーショ
ン、H:10倍過剰モル、I:100倍過剰モル、J:1000倍過剰
モル。
図５は、塩基性FGF−SAPの毒性とFGFレセプター数と
の関係を示す。各細胞系を塩基性FGF−SAPに48あるいは
72時間接した後測定した。細胞数を測定し、細胞数を50
％に減少した濃度を各々の細胞系のレセプター数に対し
てプロットした。レセプター数を前出のMoscatelliらの
方法により求めた。
図６は、実施例IVに記述されている、デュプュイトラ
ン細胞に対する塩基性FGF−SAPの影響を示す。
発明の詳細な説明 本発明は、塩基性FGFあるいはFGFレセプターと反応す
る他のポリペプチドおよび細胞毒性物質を含有する複合
体を提供する。この組成物はFGFレセプターを有する細
胞の成長および増殖を阻害するのに有効である。この組
成物は、塩基性FGFのマイトジェン効果が有害である場
合、例えば、腫瘍性脈管形成、アテローム性動脈硬化
症、および増殖性網膜症のような糖尿病の増殖性合併症
において、その効果を抑制するのに用いられ得る。
本明細書に用いられる用語「FGF」とは、塩基性FGF
（bFGF）および酸性FGF（aFGF）の両者、およびFGFレセ
プターとの結合によって塩基性FGFのマイトジェン活性
を示す他のタンパク質を表している。例えば、Eschらが
記述した分子量が約16kDであり、pIが約9.6である塩基
性FGFペプチドである。他のFGFタンパク質は、伸長した
アミノ末端をもつ他の型の塩基性FGF、aFGF、hst、int
−２およびFGF−５が含まれる。（Bairdら,Brit.Med.Bu
ll 45:438−452（1989）参照）。これら全ては、中胚葉
細胞由来のおよび神経堤由来の正常な二倍体細胞におい
てマイトジェン活性を示す。このような「FGFマイトジ
ェン活性」のテストは、ウシの大動脈内皮培養細胞の増
殖を促進する能力を測定するものであって、本明細書に
参考文献として援用されているGospodarowiczら,J.Bio
l.Chem.257:12266−12278（1982）;Gospodarowiczら,Pr
oc.Natl.Acad.Sci.USA 73:4120−4124（1976）に記述さ
れている。用語FGFとは、哺乳類宿主に検出されるアミ
ノ酸配列をもつタンパク質および改変された配列の両者
を意味する。この改変配列は、FGFレセプターとの結合
によってマイトジェン活性をなおも示すものであって、
アミノ酸の置換、欠失、挿入あるいは付加を有する。塩
基性FGFおよび酸性FGFの精製した調製物には、数種のマ
イトジェン分子型が含まれていることがしばしば観察さ
れる。異なる動物種のFGFの間、および同種の生物個体
からのFGFの間にもアミノ酸の相違が起こり得ると考え
られる。この用語は、自然源から単離されたタンパク
質、および化学合成あるいは組換え手段により合成的に
作成されるタンパク質の両者を表すことを意図する。
ウシの下垂体組織由来の、模範的な哺乳類の塩基性FG
Fのアミノ酸配列が本明細書に参考文献として援用され
ているEschら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:6507−6511
（1985）によって提供されている。本明細書に用いられ
る用語「塩基性FGF」とは、前出のEschに記述された塩
基性FGFと、実質的に同じアミノ酸配列およびマイトジ
ェン活性を有するタンパク質あるいはポリペプチドを表
す。ヒトaFGF（Jayeら,Science 233:541−545（1986）
およびウシ（Abrahamら,Science 233:545−548（198
6）、ヒト（Abrahamら,EMBO J.5:2523−2528（1986）;A
brahamら,Quant.Biol.51:657−668（1986）、およびラ
ット（Shimasakiら,Biochem.Biophys.Res.Commun.1988;
Kurokawaら,Nucleic Acids Res.16:5201（1988））の塩
基性FGFをコードするDNAがクローン化され、配列が決定
された。その結果、タンパク質配列決定により検出され
るタンパク質と一致するタンパク質の存在が予想され
る。
本明細書に用いられる用語「FGFレセプター」とは、
塩基性FGFと結合し、それを細胞内に輸送し得るレセプ
ターを表す。これらのレセプターには、前記のImamur
a、および前記のMoscatelliの記述したレセプターが含
まれている。本明細書に用いられる用語「FGFレセプタ
ーと反応するポリペプチド」とは、FGFレセプターと結
合し、その結合によって細胞内に輸送され得る任意のポ
リペプチドを示す。
塩基性FGFはAmgen（Thousand Oaks,CA）などより市販
されている。塩基性FGFは哺乳類の様々な組織から得ら
れる。例えば、逆相高速液体クロマトグラフィー（RR−
HPLC）、ヘパリンセファロースアファニティークロマト
グラフィーおよび陽イオン交換HPLCおよびRR−HPLCを用
いる塩基性FGFの精製方法が、この明細書に参考文献と
して援用されている米国特許第4,785,079号に、およびG
ospodarowicz,Proc.Natl.Acad.Sci.81:6963−6967（198
4）およびGospodarowicz,Meth.Enzym.147:106−119（19
87）にも記述されている。それに加え、塩基性FGFが化
学的あるいは組換え方法より合成され得る。酵母および
Ｅ．coliにおける組換えタンパク質の発現が、この明細
書に参考文献として援用されているBarrら,J.Biol.Che
m.263:16471−16478（1988）に記述されている。
FGF−細胞毒性物質の複合体が固定化ヘパリンのカラ
ムで精製され得る。適切なカラムにはヘパリンセファロ
ースおよびヘパリンアガロースが含まれる。吸着した複
合体がNaClのような塩の濃度勾配で、１および3Mの間の
濃度で溶出され得る。
本発明の一面では、塩基性FGFは、FGFレセプターを出
現する細胞に、特異的に細胞毒性物質が標的するよう
に、細胞毒性物質に結合させられる。本明細書に用いら
れる細胞毒性物質とは、細胞の機能を阻害し得る分子を
示す。この用語は細胞内に輸送した時のみに毒性を示す
物質を含み、および細胞表面で毒性を示す物質をも含
む。タンパク質を阻害する物質を含む、様々な細胞毒性
物質が用いられる。本発明の一面において、FGFはリボ
ソーム不活性化タンパク質（RIP）、例えばサポニン−
６（SAP）あるいは他のSAP誘導体に連結されている。SA
Pは植物Saponaria officinalisの種子から単離された
有力なRIPである（Stirpeら,Biochem J.216:617−625
（1983）参照）。他の適切な細胞毒性物質には、リシ
ン、リシンＡ鎖、ゲロニン、ジプテリアトキシン、ジプ
テリアトキシンＡ鎖およびPseudomonasエキソトキシン
が含まれるが、しかしこれらに限定されない。本発明の
他の面では、細胞毒性物質は薬剤である。このような薬
剤の例は、ダウノマイシン（ダウノルビシンおよびドキ
ソルビシンを含む）のようなアントラサイクリンおよび
メトトレキセートおよびそれらのアナローグである。そ
の他は当業者に公知である。
FGFは、当業者に公知の方法、例えば、SPDPのような
反応性スルフヒドリル基を含有する分子による誘導体
化、あるいはグルタルアルデヒドあるいはカルボジイミ
ドのような架橋剤によって、タンパク質細胞毒性物質に
複合させられ得る。一つの実施態様において、細胞毒性
物質はＮ−スクシンイミジル−３（２−ピリジルジチ
オ）プロピオン酸塩のような反応性スルフヒドリル基含
有物質によって誘導体化される。その後、誘導体化され
た細胞毒性物質にFGFを添加して、混合する。このFGF複
合体をカラムにかけ未反応物から分離し得る。あるい
は、FGFは、cis−アコニット酸方法（ShenおよびRiser,
BBRC 102:1048（1981）、本明細書に参考文献として援
用されている）より、糖分子を介して、14ブロモドキソ
ルビシンのような薬剤と複合させられ得る。
他方、キメラのFGF複合体が組換え方法で調製され得
る。このような方法はIL−２あるいはTGFα複合体に応
用され、本明細書に参考文献として援用されているChau
dharyら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:4538−4542（198
7）およびLorberman−Galskiら,Proc.Natl.Acad.Sci.US
A 85:1922−1926（1988）に供給されている。本明細書
に参考文献として援用されているManiatisら,Molecular
Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor La
boratory（1982）も参照。
FGFおよび細胞毒性物質を含有する複合体は、FGFによ
る様々な病態生理学的症状の治療に有用である。本明細
書に用いられている用語「FGFによる病態生理学的症
状」とは、塩基性FGFマイトジェン刺激に敏感である細
胞の増殖に特徴づけられるあるいはそれが原因となる有
害な状態を示す。塩基性FGFによる病態生理学的症状
は、腫瘍、アテローム性動脈硬化症、慢性関節リウマ
チ、デュプュイトラン拘縮および増殖製網膜症のような
糖尿病のある種の合併症が含まれるが、これらに制限さ
れていない。
FGF−細胞毒性物質の複合体は細胞死を引き起こすた
めに、FGFレセプターを出現する細胞に細胞毒性物質が
標的するのに用いられ得る。驚くことに、図５に示され
ているように、細胞当たりのFGFレセプター数は細胞が5
0％死滅するための投与量（ED50）と直接的な関係があ
る。さらに、非常に高いレセプター数をもつ細胞、例え
ばBHK細胞においては、ED50が塩基性FGFのレセプターに
対する親和定数に一致している（BHK細胞では両者が25p
Mである）。このような意外な結果は、SAPのような大き
い分子であっても細胞毒性物質の存在が塩基性FGF活性
を減少しないことを示唆する。その上、これらの結果
は、大量の塩基性FGFレセプターを出現するこれらの細
胞が特に複合体に感受性であることを示唆している。
FGFによる病態生理学的症状を治療するために、治療
上有効な量のFGF−細胞毒性物質の複合体が生理学的に
許容され得る賦形剤と一緒に投与される。生理学的に許
容され得る賦形剤の例にはPBSおよび食塩水が含まれ
る。
本発明を以下の実施例につき説明するが、これらに制
限されない。
実施例Ｉ FGFとサポリンとの複合 154個のアミノ酸の配列に相当する組換え塩基性FGF
（Abrahamら,Quant.Biol.51:657−668（1968）、本明細
書に参考として援用されている）がFarmitalia Carlo
Erbaから得られた。サポリン−６は、Lappiら,Bioche
m.Biophys.Res.Comm 129:934−942（1985）（本明細書
に参考文献として援用されている）によって改良された
前出のStirpeらの方法より精製された。要するに、Sapo
naria officinalisの種子を0.14M NaClを含む5mMリン
酸ナトリウム緩衝溶液、pH7.2（8ml/g）中で粉砕して抽
出した。４℃で一晩撹拌した後、抽出物をガーゼで濾過
して、28000gで30分間遠心した。沈澱および浮遊の脂肪
から上清を分離し、それを「粗抽出物」と呼ぶ。
粗抽出物を5mMリン酸ナトリウム緩衝溶液、pH6.5に透
析し、28000gで30分間遠心した後、CMセルロースカラム
（CM52;Whatman,Maidstone,Kent,U.K.）にかけた。カラ
ムを洗浄した後、同緩衝溶液の０〜0.3M NaCl濃度勾配
で溶出した。この試料を水に透析した後、5mMホウ酸ナ
トリウムpH9.5、0.156M塩化ナトリウムで平衡化したFPL
CのMono Ｓカラム（Pharmacia,Uppsala,Sweden）でク
ロマトグラフィーを行った。タンパク質を20分間の0.15
6M〜0.186Mの塩化ナトリウムの濃度勾配で溶出した。ピ
ークの所を回収して得られた試料をさらにMilli−Ｑの
水（Millipore,Bedford,MA）に充分に透析した。乾燥し
た試料の一部を計量し、水で1mg/ml濃度に溶解した。紫
外線スペクトルを記録したところ、277nmの最大吸収波
長で１％吸収係数が6.4であった。280nmではE280が6.0
であった。BSAを標準物として用いたLowry法（Lowryら,
J.Biol.Chem.193:265−275（1951））によるタンパク質
の定量は1.07mg/mlの結果が得られた。
製造業者の説明書に従って、SAPをＮ−スクシンイミ
ジル−３（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸塩（SPD
P;Pharmacia Fine Chemicals,Piscataway,NJ）で誘導体
化した。要するに、SAPをNaCl（0.1M）を含むリン酸ナ
トリウム緩衝溶液（0.1M,pH7.5）で溶解した（2.7mg/m
L）。撹拌しながら、エタノールで溶解された1.25モル
過剰のSPDPを滴下してから、時々撹拌しながら23℃、30
分反応させた。過剰の試薬および低分子の反応生成物を
ゲル濾過で除去した。塩基性FGF（2mg/ml）を加え、誘
導体化したサポリン（6mg/ml、0.1Mリン酸ナトリウム、
0.1M塩化ナトリウム、pH7.5中）と室温で２時間混合し
た。0.1Mヨウドアセトアミドを35μＬ添加して反応を停
止した。さらに30分静置した後、反応混合物を30mlに希
釈し、ヘパリンセファロース（Pharmacia）カラム（0.5
x5.5cm）にかけた。吸着したタンパク質を0.6M、1Mおよ
び2MのNaClを含む10mMのTRIS、pH7.4の段階的濃度勾配
で溶出し、1Mと2Mの間に溶出した試料を集めた。集めた
試料を水に透析した後、Mono Ｓ 5/5 NaCl陽イオン
交換カラム（Pharmacia）（緩衝溶液A:50mMホウ酸ナト
リウム、pH8.0、緩衝溶液B:0.5M NaClを含む緩衝溶液
Ａ）でクロマトグラフィーを行い、最終精製した。Phas
tGel（Pharmacia）電気泳動した後、複合体を含有する
画分を銀染色で検出し、分析のために適切な画文を集め
た。
ゲル電気泳動で複合体の合成を評価し、反応混合物中
に塩基性FGFが検出されなくなるまで反応させた。ヘパ
リンセファロースのクロマトグラフィー（図１）を行
い、続いて各ピーク画分を電気泳動分析した結果、SAP
はヘパリンセファロースに吸着しないが、複合体は吸着
したことが分かった。少量の複合体のみが1.0MのNaClで
のカラム洗浄中に溶出された。主な生成物が2Mでの洗浄
の時に溶出され、当モル量のSAPおよび塩基性FGF（Mr4
0,000）を含有していた。しかし、推定した分子量が68,
000を越えた（Mr＞68,000）複合体も一部存在した。こ
れは１分子のサポニンに２分子の塩基性FGFが複合した
結果であると推定される。
ウサギで作成した配列特異的抗血清を用いてSAP−塩
基性FGFの複合体の明確な同定を達成した。１〜24位の
アミノ酸を含有する塩基性FGF断片を990型ペプチド合成
機（Beckman Instruments,Brea,CA）を用いて化学合成
し、抗原として用いた。ウェスタンブロット分析より、
様々な分子量を有する複合体型の全てがFGFおよびSAPの
両方をもっていることが分かった。抗血清はペプチドの
中央部分を認識し、精製したウシ塩基性FGFおよび組換
えヒト塩基性FGFと当モルで交差反応する。
電気泳動後のドデシル硫酸ナトリウム含有ポリアクリ
ルアミドゲル中のサンプルをニトロセルロース膜上に電
気ブロットし、空気乾燥した。この膜をTRIS緩衝生理食
塩水に浸し、10分間振盪した後、溶液を吸引して除去し
た。この膜を５％無脂肪乳（NFM）含有TBSに浸し、10分
間振盪した後、溶液を吸引して除去した。NFM/TBS中1/1
000濃度の一次抗体、抗SAP抗血清あるいは抗塩基性FGF
抗血清のいずれかを添加して一晩振とうした。溶液を吸
引して除去した。この膜をTBSに浸し、10分間震盪して
から溶液を吸引して除去した。この膜を0.05％NP40/TBS
に浸し、１分間振った後、溶液を吸引して除去した。最
終TBSおよびNP40/TBS洗浄を２回行った。NFM/TBS中に1/
2000の希釈した、セイヨウワサビペルオキシナーゼで標
識した抗IgGを加え、膜を２時間振とうした。TBSおよび
NP40/TBSの洗浄を繰り返した。20mLメタノール中の60mg
の４−クロロ−１−ナフトルおよび100mL再蒸留水およ
び10μL30％H2Oを含む溶液（新しく混合したもの）に膜
を置き、溶液を膜に加えて現像させた。溶液を吸引して
除去し、そして水ですすいで反応を停止させ、膜を乾燥
した。
実施例II FGF/SAP複合体の活性 Moscatelliら,J.Cell Physiol.131:123−130（1987）
（本明細書に参考文献として援用されている）の方法を
用いて、複合体の塩基性FGFレセプターの認識能力を調
べた。要するに、細胞を半集密的になるまで培養した。
その細胞を、Ｆ−12、14mM NaHCO3、25mM HEPESおよ
び0.2％ゼラチンを含む300μＬの緩衝溶液中に、様々な
濃度の塩基性FGFあるいは複合体の存在下で、10μＬの
放射性ヨウ素化した塩基性FGFと、４℃で、２時間イン
キュベートした。次に、細胞を0.5mLリン酸緩衝生理食
塩水溶液で３回、2M NaClを含むPBSで２回洗浄した。
高親和性のレセプターとの結合は0.5％トリトンＸ−100
含有PBS（pH8.1）で可溶化した膜の画分を測定して求め
た。
Siehnら,Blood 72:756−765（1988）（本明細書に参
考文献として援用されている）に記載のタンパク質合成
のインビトロアッセイより、SAPタンパク質のタンパク
質合成阻害活性を、塩基性FGF/SAPの複合体のタンパク
質合成阻害活性と比較した。乳児ハムスターの肝臓繊維
芽細胞（ATCC受託番号CRL6281）を用いて細胞毒性物質
を調べた。BHK細胞を24ウェルのプレートに、5000細胞/
mlの濃度でプレートし、37℃、５％CO2中で一晩インキ
ュベートした。翌朝、５％FCS含有の、HEPES緩衝DMEMと
Ｆ−12培地との（1:1）溶液をウェルから吸引して、培
地のみで、または複合体、塩基性FGFあるいはサポリン
を含む培地で培地交換した。２日後、細胞を２回洗浄し
て、トリプシン処理した。細胞数をCoulter粒子カウン
ター（Coulter Electronics,Hialeah,FL）で求めた。
図2Aに示されているように、タンパク質合成の阻害の
インビトロアッセイで調べた際、複合体はサポリンの活
性を保持する。複合体は、予想された通り、活性が遊離
のSAPの活性より少し低い（約２倍）。これは、複合体
化する以前のSAPの誘導体化レベルが低いこと（0.8モル
SPDP/モル）、および結合した塩基性FGFの存在により起
こり得る立体障害から説明できる。これに対して、塩基
性FGFにおける放射性レセプターアッセイから得られた
結果（図2B）から、塩基性FGF/SAPが結合アッセイにお
いて、塩基性FGFよりわずかに高い活性を持たないにし
ろ、同程度の能力を持つことが分かった。すなわち、塩
基性FGFの遊離スルフヒドリル基がSAPとの架橋に関わる
ことは、レセプターを認識する能力を妨げるのではない
と思われる。むしろ、この反応が塩基性FGFを安定化し
得る。
塩基性FGF/SAPはBHK細胞に対する有能な細胞毒性要因
である（図３）。SAPはテストした最高量（10-8M）でも
これらの細胞に対して毒性ではない。そして単独の塩基
性FGFは増殖に対してわずかな阻害効果を有する。塩基
性FGFとSAPとの混合物はテストした最高濃度の時のみわ
ずかに毒性を有する。細胞毒性物質のID50（25pM）は、
増殖アッセイにおける塩基性FGFの能力（15pM）とよく
一致している。複合体の有糸分裂阻害活性がレセプター
特異的であることを確立するために、細胞毒性物質の特
異性を競合実験で調べた。細胞毒性物質で細胞を処理す
る前に、BHK細胞を様々なレベルの塩基性FGFあるいは神
経成長因子（NGF）と１時間プレインキュベートした。
図４に示されているように、増加した塩基性FGF量の存
在下で、その増加量に伴う細胞毒性の阻害が見られる。
それに対して、1000倍過剰量のNFGは効果がない。
実施例III ウサギ角膜における脈管形成の阻害 Elvax（エチレン−酢酸ビニル共重合体樹脂、Dupont,
Wilmington,DE）ペレットを以下の通りに作製する。約6
0mgの洗浄、乾燥したElvaxを500μＬの塩化メチレンに
溶解した。これを50μｇの乾燥した塩基性FGFに加え
た。これを５μＬずつドライアイスで凍らせたスライド
ガラスの上に滴下した。ペレットを一晩冷凍庫に放置し
てから、デシケーター中で乾燥した。
ニュージーランド白ウサギにInnovar Vet:1mL/kgを
麻酔した。ウサギの目の角膜を切開して、へらあるいは
鉗子でポケットを開いた。ポケットに１個のペレットを
入れた。両目にペレットを入れた。生理食塩水で目を洗
い、そしてゲンタミシンを1ml筋肉注射した。ウサギを
５日間放置して、脈管形成を観察した。５日後、各々の
左目を、20μＬの0.25％BSA中の100ngの、実施例Ｉで調
製された塩基性FGF−SAPで処理した。右目を20μＬの0.
25％BSA単独で処理した。１日２回、ウサギの角膜の上
に、目薬のように溶液を滴下して処理した。動物を処理
する人はサンプルの内容を知らせなかった。10日後、処
理の内容を知らない分析者が動物の角膜における脈管形
成を顕微鏡で分析して評価した。脈管形成を、＋＋＋が
最高脈管形成、そして−が脈管形成がない、として判断
した。
結果を表Ｉに示した。表から、塩基性FGF−SAPで処理
した角膜では、脈管形成が対照に比べ、著しく減少した
ことが分かった。 表Ｉ 動物 右目 左目 995 ＋ − 997 ＋＋＋ ＋ 998 ＋＋＋ ＋ 999 ＋＋ − 実施例IV デュプュイトラン細胞におけるFGF−SAPの効果 手の動きに変化をもたらす疾病、デュプュイトラン拘
縮であると診断された成人患者の手を手術して除去した
組織から得られた細胞を、一次培養した。これらの細胞
は、１細胞当たり10,000および15,000の間の塩基性FGF
レセプターがある。
これらの細胞を24ウェルの培養器で、１ウェル当たり
10,000細胞の濃度で、HEPES緩衝の10％FCSを含むDMEM中
で、一晩増殖させた。翌朝、培地を除去し、10-8から10
-12モルの濃度範囲の塩基性FGF−SAPの複合体を含む培
地で置換した。対照には、培地のみで処理したウェル、
同程度の濃度の塩基性FGFのみで処理したウェル、サポ
リンのみで処理したウェル、および複合体としてではな
い塩基性FGFとサポリンとで処理したウェルが含まれ
る。細胞を72時間インキュベター内で培養した。インキ
ュベション終了後、細胞を洗浄し、トリプシンで移した
後、Coulterセルカウンターの上で細胞数を数えた。培
地対照中の細胞数を、処理したウェル（上記に述べられ
た）の細胞数と比較した。これらの細胞致死アッセイの
結果が図６に示されている。図から、デュプュイトラン
細胞が塩基性FGF−SAPに対して感受性であるこたが分か
った。同様の結果が他の３細胞サンプルから得られた。
本発明は、必然的に好まれる実施態様を援用して述べ
られたが、本発明の真意から外れることなくに様々な改
変が行われ得ると解釈されるべきである。従って、本発
明は以下の請求の範囲によってのみ制限される。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/50 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＢＬ (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C07K 14/50 G01N 33/50 A61K 38/22,45/00 ＣＡ（ＳＴＮ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＢＩＯＴＥＣＨＡＢＳ（ＳＴＮ)

Claims (15)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】細胞毒性物質およびFGFレセプターと反応
    するポリペプチドを含む複合体。
  2. 【請求項２】前記FGFレセプターと反応するポリペプチ
    ドが塩基性FGFである、請求項１記載の複合体。
  3. 【請求項３】前記FGFレセプターと反応するポリペプチ
    ドが、酸性FGF、hst−２、int−２およびFGF−５からな
    る群より選択される、請求項１記載の複合体。
  4. 【請求項４】前記細胞毒性物質がリボソーム不活性化タ
    ンパク質である、請求項１−３のいずれかに記載の複合
    体。
  5. 【請求項５】前記細胞毒性物質がサポリンである、請求
    項４記載の複合体。
  6. 【請求項６】FGFレセプターを有する細胞を細胞毒性物
    質でインビトロで標的する方法であって、前記細胞毒性
    物質をFGFレセプターと反応するポリペプチドと複合体
    化させ、そして前記複合体を前記細胞に与えることを含
    む方法。
  7. 【請求項７】前記FGFレセプターと反応するポリペプチ
    ドが塩基性FGFである、請求項６記載の方法。
  8. 【請求項８】前記細胞毒性物質がリボソーム不活性化タ
    ンパク質である、請求項６または７に記載の方法。
  9. 【請求項９】前記細胞毒性物質がサポリンである、請求
    項６または７に記載の方法。
  10. 【請求項１０】FGF媒介性病態生理学的症状を処置する
    ための医薬組成物であって、細胞毒性物質に複合体化さ
    れたFGFを含む組成物。
  11. 【請求項１１】前記FGF媒介性病態生理学的症状が、腫
    瘍、慢性関節リウマチおよび増殖性糖尿病網膜症からな
    る群より選択される、請求項10記載の組成物。
  12. 【請求項１２】前記FGFが塩基性FGFである、請求項10ま
    たは11に記載の組成物。
  13. 【請求項１３】前記細胞毒性物質がリボソーム不活性化
    タンパク質である、請求項10−12のいずれかに記載の組
    成物。
  14. 【請求項１４】前記細胞毒性物質がサポリンである、請
    求項10−12のいずれかに記載の組成物。
  15. 【請求項１５】細胞の増殖を阻害するための医薬組成物
    であって、FGFおよび細胞毒性物質を含む複合体を含む
    組成物。
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