JPH04506899A - 微生物試験用装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 微生惣試貝厘笠１ 本発明は、微生物試験用の、例えば一つ又はそれ以上の抗生物質に対する微生物 感受性を検定するための装置に関する。

寒天平板上の微生物増殖の阻害域を測定することにより抗生物質感受性を試験す ることは公知である。この公知の方法では、寒天、又はその他の栄養培地をペト リ皿のような容器に注ぎ入れ、ついで固化させて、寒天の途切れのない平板を作 る。次に、寒天の表面に試験する微生物を接種し、抗生物質をそれぞれ滲み込ま せた紙製円板をその表面に当てる。寒天の表面を水平に保ちながら、微生物増殖 阻害域が発現するまで寒天平板を培養する。培養の過程で、抗生物質が培地全体 に拡散することにより、紙製円板上の抗生物質の量の関数である濃度勾配が培地 中に生ずる。阻害域は、抗生物質が微生物増殖を防止するのに十分な濃度で存在 する領域に生ずる。微生物の増殖は培地中又は培地上に混濁を生みだすが、これ らの領域では、培地は清澄のままである。

抗生物質感受性を試験するための慣用方法では、この域サイズを測定し、公知の 感受性及び耐性株に関して得られたサイズと比較し、域サイズ限界を設定して生 体を”感受性”、“耐性”、又は“中間“と分類できる。

しかしながら、１種類以上の試験を同−寒天平板上で実施する場合、別々の試験 間で干渉が起きる。不便な大型寒天平板を用いない限り、別々の試験の抗生物質 は異なる紙製円板から同一領域へと拡散し、その結果、重複した阻害域を生ずる 。直径９ｃｍの標準ペトリ皿上で好都合に試験し得るのは６種類の抗生物質に過 ぎない。

この方法の更なる欠点は、結果が得られる前に、測定と、比較又は計算の必要が あることである。このような余分の操作は時間を浪費し、エラーにつながり、オ ペレーターが危険な病原体と接触する危険が増大する。

最近用いられている抗生物質感受性を試験する別の方法は、薬剤存在下で増殖す る培養物の電導度又はインピーダンス、あるいはこのような培養物中に生ずる濁 り度の測定を含む。次に、これらの値をすでに分類されている培養物のものと比 較する。また、これらの方法も、通常、高価な装置で連続的に読み取ることを必 要とするある量の計算と比較を必要とする。

このような方法は、異なる濃度又は組み合わせの抗生物質を含有する培地の多様 性に関する試験を包含してもよく、かくして、準備に時間がかかり、エラーが起 こりやすい。

本発明によれば、使用に先立ち液体寒天又はその他の栄養分ゲルが供給される共 通領域と連絡する多数の溝を有する、多数の微生物学的試験を実施するための装 置であって、前記溝に？ｅって被検物質の濃度勾配を形成するように前記被検物 質を適用する決められた点から前記溝に沿って拡散させた場合に、前記寒天上の 微生物の増殖に及ぼす被検物質の効力を直接肉眼で測定できるようにするために 前記溝に隣接して印が設けられていることを特徴とする装置が提供される。

本装置が、微生物増殖の阻害又は活性化の域の測定を要するあらゆる種類の検定 又は試験に用い得ることは明らかである。したがって、被検物質は増殖を阻害す る（例えば抗生物質）か、又は促進する（例えばビタミン）かのいずれであって もよい。検定に用いるためには、試料中の抗生物質の濃度は、例えば、未知濃度 の既知量の溶液によって生じた阻害域を抗生物質の既知量の標準溶液によって、 あるいはこれらの容量および濃度から脱水した固体によって生じたものと比較す ることにより、測定し得る。

好ましい態様においては、溝は平行で、一端又は両端で共通領域と連絡する。そ の共通領域は、その各端で平行溝と連絡し、そのことによって、感受性中断点の 値を測定するために、例えば抗生物質の２つの異なる濃度で、多数の試験を実施 可能にする。必要ならば、その共通領域はオープンサイドであってもよく、その 場合は、着脱可能なカバーで上記の試験領域を密閉し、上記の共通領域が最も高 くなるように装置を傾けた後に液体寒天を装置に供給することができる。

その他の構造、例えば中央の共通領域から放射状に伸びる溝も実行可能である。

試験中の物質（単数又は複数の）は、例えば表面にその物質が含浸されている紙 製円板を当てるような慣用的方法を用いて溝に適用し得る。しかしながら、好ま しい形態の装置は、例えば被検物質（単数又は複数の）が含浸された担体を置く ことによって、溝への被検物質の適用を容易にするための手段を有する。

このような好ましい一形態の装置においては、多溝は窪穴を形成する凹部分を有 する。試験領域の中央に配置されるのが便利である窪穴は、任意の便利な形状又 は大きさのものであり得るが、しかしそれらは好ましくは試験中の物質が含浸さ れている円板又は他の担体を保持するために取りつけられる手段を備えている。

このような手段は、例えば担体を捕捉し得る張り出しリム、リップ、又は突起、 あるいは担体を突き刺す窪穴の底からの突起、例えば担体中に好適に配置される 開口部に位置するように設計された円錐栓である。粘着性手段によって窪穴中に 担体を保持することも可能である。

この形態の装置を用いる場合、慣用的方法を用いて既知量の被検物質を円板に適 用し得る。次に、溶けた培地を装置に供給する前に、円板を窪穴に挿入する。

被検物質又は標準試料を保持する検定用の円板又は他の担体を、例えばプラスチ ックのフィルム又は酒中に前記装置を密封包装する前に、装置に挿入するのが好 ましい。次に全装置を、例えばＸ線又はガンマ線照射によって滅菌し、使用する 必要が生じるまで滅菌状態で保存する。

本発明の別の態様では、１穴は被検物質用の担体を備えていない。その代わり、 前記のカバープレート又は別個の１穴形成部材は、１穴と一列に並び、装置に栄 養分培地が供給されたときに、そこに空所を残しておく平頭角錐又は円錐形態の 突起部分を有する。カバープレート又は１穴形成部材を取りはずして、各１穴の 空所にマイクロピペット等で被検物質の溶液を満たす。

あるいは、被検物質アプリケーターは、栄養分培地中に予め形成される１穴と一 直線に並ぶように寸法を合わせて作られた、例えば櫛の歯に似た突起を有してい てもよい。

各歯は、毛管現象によって標準容量の液体を引き上げるように設計された例えば 内腔又は溝孔の形態の入口を備えている。ついで、アプリケーターは標準濃度の 被検物質の溜め池から供給され、決められた容量をそれぞれの１穴に移すために 用いられる。

別の態様では、１つまたは複数の被検物質は、前記溝と交差して配置される担体 ストリップから適用されるが、それら手段は、ストリップを決められた位置に配 置するために、例えばラグ、突起、溝または溝孔によって与えられる。

前記共通領域を通って被検物質が拡散できないよう、そしてまた大きな阻害域が 形成できるように、各溝内の中心点に被験物質を適用するのが好ましい。

阻害域又は活性化域の大きさは、前記溝に隣接して設けられた印を点検して肉眼 で概算し得る。装置それ自体に印をつけた固定スケールを設けるのが好ましい。

多溝は、例えば試験中の抗生物質に対する微生物の感受性を装置から直接読み取 れるように目盛り付けすることができる。したがって、慣用的方法と比べて、本 装置は一旦目盛り付けすれば、いかなる測定、計算又は比較も必要ではない。

また、印は、単数又は複数の被検物質が適用された担体、例えば紙又は他のシー ト材の上に設けてもよい。

一般に、本装置は透明又は半透明の材料、例えばガラス又は合成樹脂で作られ、 そのため、試験結果に対しては光透過性である。

図を参照しながら本発明を説明するが、図は例に過ぎない。

第１図は、本発明の一態様の部分透視図を示す。

第２図は、所定の位置にカバー（８）をつけた第１図の装置の横断面を示す。横 断面は第１図のＸ−Ｘ線を通る面である。

第３図は、第１図に示す１穴（１）の一つを通る横断面を示す。この断面はＹ− Ｙ線を通る。

第４図、５、及び６は、本発明の別の３つの態様の部分透視図を示す。

第７図は、第６図の態様とともに用いるための被検物質担体の透視図である。

第８図は、第５図の装置とともに用いるための１穴形成部材の透視図であり；そ して 第９図は、第５図の装置とともに用いるための被検物質アプリケーターの透視図 である。

第１図の装置は、共通領域（３）及び（４）と連絡する平行な溝の形で複数の試 験領域（２）を有する。各試験領域には、多溝の底部の上に１穴（１）及び目盛 り（７）か設けられている。この目盛りは、また隔壁（５）の表面上にあっても よい。被検物質は壁（５）で分離され、収納壁（６）は装置内に栄養培地（図示 しない）を確保する。装置はガラス又は合成樹脂から成形される。

第２図に示すカバー（８）は、平らな下側の面を有し、コンテナ及び隔壁の上面 に直接接触して位置する。装置は脇がおいていて、連絡溝（４）は、カバーが所 定の位置にある場合に液体寒天を装置に供給できるように、カバーで覆われてい ない。カバーには、空気が装置から抜けられるように、壁（５）と−直線に並ん だ狭い溝が設けられていてもよい。この形態の装置を用いると、空気を含むこと なく、各試験領域は隔壁及び収納壁の高さまで完全に満される。

第３図の横断面に示す１穴は、突起（１０）で保持される紙（又はその他の多孔 質）円板を収容する。所望により、１穴の閉鎖は円板（９）によって実施し、そ して壁（１３）を省いてもよい。

第４図に示す装置は、４つの収納壁全てを有する。液体寒天を共通領域（３）に 供給した後は、設置時に寒天の深さが均一になるように、装置を水平に保たねば ならない。

第５図に示す装置は、多数の異なる方法で被検物質を供給することができる。あ る態様では、被検物質が寒天表面に適用される。紙製ストリップ（図示しない） に先ず被験物質を含浸し、次に試験域に対して直角に装置と交差して置く。突起 （１１）によって紙を所定の位置に保持する。

被検物質が紙を通って拡散するのを防ぐために、被検物質を含有する領域を、Ｐ ＶＣ又はシリコーン又はその他の好適な化合物のような非浸透性物質が含浸され た疎水性領域で分離してもよい。

ラグ（１２）は、正確に造形され、含浸されたストリップだけが本装置に使用で きるように、紙製ストリ・ンプの好適に造形された末端部分と共に作用するべく 配置する。例えば主要な種類の異なる病原体−例えばダラム陽性菌、グラム陰性 菌、又は泌尿器科系の細菌に対して抗生物質を試験するために、多数の種類の装 置が提供されるように意図される。各装置は、関連する微生物を試験するために 好適な抗生物質が含浸された特異形状の紙製ストリップを収容するよう設計する ことができるし、”感受性”、”耐性”、又は゛中間”の等級となり得るように 、あるいは算出できる最低阻害濃度（ＭＩＣ値）であり得るように、適切な阻置 載サイズを印づけてもよい。

特定の薬剤に関しては、任意の特定域の大きさに対応するＭＩＣ値は、標準管希 釈法によって得られるＩｏｇｘＭ　Ｉ　Ｃのプロットの回帰線分析から導かれ、 それに対して域直径（ミリメートル）は、多数（数百）の異なる細菌培養に関し て実施される等価な条件下における寒天拡散法により導かれる。このような回帰 線データは普通に用いられる多数の抗生物質に関してすでに存在し、標準試験の 実施のための円板薬剤効力の決定の基礎を構成している。また、装置それ自体は 、同時に実施されたＭＩＣ値に適合する域直径をめるために用いることができる 。

微生物学的検定の実施のための好ましい態様では、第５図に示すタイプのプレー トに検定微生物を含有する溶けた寒天が供給され、ついで切頭角錐形の”歯”を 有する１穴形成”櫛”　（第８図）を、櫛の”歯”が、ラグ（１１，第５図）の 間に正確に１穴構成体の突起を位置させることによって溝の中央部分に挿入され 、突起の幅がラグ間スペースの大きさであるように、プレートの中に挿入する。

寒天が設置された時に、１穴構成体を注意して除去する。

除去を容易にするために、１穴を形成する突起は平頭角錐形又は平頭円錐形のも のがよい。

このように形成された各１穴に、次に、大多数の１穴で好適に等級化された濃度 列を構成するために、試験中の抗生物質又はその他の物質の標準容量の溶液を供 給する。１特表平４−５０６８９９　（４） つ又はそれ以上の１穴を、抗生物質については未知濃度である試験試料用に残し ておく。

プレートを培養した後、各既知濃度に対する阻害域の大きさをプレートから直接 読み取り、これらを、ｌｏｇ濃度濃度囲域直径準曲線をプロットするために用い る。未知溶液の濃度は、その域直径を標準曲線中に書き入れることによって得ら れる。

また、未知溶液の域直径を直接読み取り、これを未知溶液に最も近い標準濃度の 域直径と直接比較することは非常に簡単である。適切な等級化列（例えばゲンタ マイシンに関しては２ｍｇ／Ｉの濃度差）の標準液を用いるこのような概算によ り、はとんどの臨床投薬養生の監視のための血清濃度の適切な評価が与えられる だろう。

薬剤標準液の濃度勾配列を確定する簡便法は、毛管櫛（第９図）によって成し遂 げられる。この櫛には、毛管吸収によっである標準容量の液体を吸い込むような 寸法の溝孔が各”歯”　（１４）の中心にある。このような櫛は、適当な標準濃 度の溜め液から供給され、直接使用される（すでに供給された標準容量の希釈液 を有するプレート１穴のそれぞれの中に櫛を吊すことによって）、または、将来 用いるために櫛は脱水され、保存（適当な条件下で）される。

ビタミン、例えば試料中の葉酸の検定のために、同様の方法を用い得るが、但し ビタミン供給源の濃度に対する域サイズに関連しては、ビタミン供給源に最も近 い領域にのみ増殖が認められる。

毛管櫛の歯は、円形又は矩形にできるが、基礎的な考えとしては各管腔は同容量 の液体を吸い上げるべきである。

毛管櫛に代わるものとしては吸収紙櫛が考えられるが、しかしこれは不浸透性の 疎水性突起を有する。各歯は、窪穴中の標準容量の好適な液に浸漬した場合に必 要濃度の薬剤が定着するようなある吸着された量の脱水活性剤を含有する。

本方法の別の適用においては、第５図のラグ（１１，１２）は設計から省いても よく、薬剤を保持する紙製ストリップは第７図に示すような紙製型板を用いて、 第６図に示すタイプのプレートの中央に置いてもよい。この型板では、域サイズ を測定するために、十字につながるストリップ（Ｉ４）に目盛り（工５）が印刷 されている。この適用における上記の十字ストリップは耐水性であって、壁（５ ）の上面に置く。

後者の両態様において、単数又は複数の被検物質のための担体は、プレートの寒 天領域全体を覆う蓋の下面から下に延びる適切な長さの突起によって溝中の寒天 と接触して保持される。

域の縁を一層明瞭にするために、かつ早い時期にそうするために、指示薬を、プ レートに迅速に浸水させ、過剰量を除去することにより溶液として適用してもよ い。域外の細胞層を染色し、阻害域は未染色のままにする。これは、全ての増殖 細菌細胞が酸化還元力を低下させるので、適切な酸化還元指示薬の使用によって 達成できる。あるいは、蛍光染料を用いるか、又は任意のその他の好適な手段を 用いてもよい。

域サイズからＭＩＣ値を読み取るために、蓋上に印刷された転写の形でノモグラ フが設けられてもよい。

上記の適用は全て、不透明度差を検出することができる光学的スキャナーの使用 により、容易に自動化し得るし、また信号を処理して各薬剤に対する微生物の感 受性の分類、ＭＩＣ値、臨床使用に必要な投与量、及び処置経費を出すことがで きる；全で、好適なコンピューターソフトウェアによって制御され、ユーザーの 需要に最も適したハードコピー形式でプリントされる。さらに、蓄積されたデー タは、いつでもコンピューター分析して、地域コミユニティ−内の、そしてその 他の供給源からのデータと組み合わせることによって国家的状況の、薬剤耐性株 の疫学的進歩をもたらし得る。

特異な試験も自動的に同定されれば、さらに便利である。

これは、同様にスキャニングしたパネル上のバーコードストリップによって達成 される。そのパネルは該当する患者及び検体データと合致させてもよい。

第６図に示すタイプの装置は、多数のさらに異なる方法で用い得る。例えば、そ れはファージによる細菌の類型化を容易にするために用いることができる。この 目的のためには、紙の十字ストリップは、溝、好ましくは多溝の半分のみの中の 寒天表面と接触し、他の半分は正常な増殖の対照とするように設計される。使用 する場合、紙の各半片には、その半片当たり１フア一ジ株を用いて、１つの類型 決めに用いられる数を含む乾燥ファージ粒子を植えつける。

次にファージ型板を接種プレート上に押１一つけ、次いで除去して、ファージプ ラーク（溶菌斑）のその後の形成を明らかにするためにプレートを培養する。類 型決め内での正及び負の効力のパターンがファージの型を決定する。

別の態様において、その生化学的反応に基づいた細菌種の同定のためのシステム を我々は設計した。微生物によって修飾された培養基を、ファージによる類型化 に用いるものと同様に紙型板上で乾燥する。各培養基領域を疎水性バリアによっ て次のものから単離し、培養基を保持する半片は一旦ストリップを適用した接種 寒天表面に接触した状態で放置する。培養基は寒天溝に沿って拡散し、増殖中の 微生物によって転換される。可能な場合には、ストリップはさらに、微生物によ って作られた変化の性質を直接的に示す指示薬を含有する；例えば、Ａｎｄｒａ ｄｅ指示薬を含有するラクトース培養基は酸性生成物質の形成を伴うラクトース の発酵時にピンクに変わるだろう。腸内細菌の成員を同定するための試験は、以 下の培養基を包含するニゲルコース、ラクトース、マンニトール、ソルビトール 、イノシトール、メリビオース、サッカロース、ラムノース、アラビノース、ア ミグダリン、アルギニン、オルニチン、リシン、クエン酸ナトリウム、尿素、及 びトリプトファン。増殖中の細菌の代謝から得られるその他の変化は、増殖期間 後に試験ストリップに試薬を添加することによって試験できる。このような試験 は、インドール産性を示すためのＫｏｖａｃｓ試薬、アセトイン産性に関するα −ナフトール及び水酸化カルシウム、シトクロムオキシダーゼの存在を示すため のテトラメチル−ｐ−フェニレンジアミン、硝酸塩還元を示すためのＧｒｅｉｓ ｓ試薬、カタラーゼを示すための過酸化水素の添加等を含み得る。

種々の適用において、溝（２）に必要な寸法を確定することができた。紙製スト リップ法による感受性試験に関しては、単−薬剤及び標準株の微生物に関して標 準方法によって域サイズを測定するために実験を実施した。寒天ストリップ上の 同−微生物及び同一薬剤円板により同−域サイズを生じるのに必要な条件を次に 確定する。−例として、３０＋ｎｃｇのセフラジン円板及び大腸菌Ｅｓｃｈｅｒ ｉｃｈｉａ　ｃｏｌｔＮＣＴＣ１０４１８によるｌ５ｏ−ｓｅｎｓｉｔｅｓｔ寒 天（Ｏｘｏｉｄ）を用いた標準法は、１８ｍｍの直径を示した。同バッチの円板 を用いて、同−寒天上ではあるが、しかし種々の幅及び深さのストリップで、同 程度に接種した同一微生物により得られた域直径を測定した。

挿入により、同サイズ域を生じる寒天ストリップ拡散に関するパラメーターを提 示することができた。これらを以下に示す二幅７ｍｍ、深さ５．４　ｍｍ、又は 幅１０ｍｍ、深さ４．１ｍｍ０寒天ストリツプ（溝）拡散に関する等価なサイズ の域を示す装置を用いることは、”耐性”、”中間”、及び”感受性”分類を決 定するためにすでに確定された基準を直接適用し得ることを意味する。同様の実 験は、米国における使用のための臨床実験室基準に関する国家委員会（ｔｈｅＮ ａｔｉｏｎａｌ　Ｃｏｒｎｍｉｔｔｅｅ　ｆｏｒ　Ｃ１１ｎｉｃａｌ　Ｌａｂｏ ｒａｔｏｒｙ　５ｔａｎｄａｒｄｓｆｏｒ　ｕｓｅ　ｉｎ　ｔｈｅ　Ｕｎｉｔｅ ｄ　５ｔａｔｅｓ）によって与えられているように、Ｋｉｒｂｙ−Ｂａｕｅｒ法 に関して確定された基準を利用するための装置に関するパラメーターを測定する ために行なうことができる。

第１図 第２図 第３図 第４図 第５図 第６図 国際調査報告 国際調査報告

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. １．使用に先立ち液体寒天又はその他の栄養分ゲルが供給される共通領域と連絡 する多数の溝を有する、多数の微生物学的試験を実施するための装置であって、 前記溝に沿って被検物質の濃度勾配を形成するように前記被検物質を、適用する 決められた点から前記溝に沿って拡散させた場合に、前記寒天上の微生物の増殖 に及ぼす被検物質の効力を直接肉眼で測定できるようにするために前記溝に隣接 して印が設けられていることを特徴とする装置。
2. ２．前記溝が平行であり、かつ、両端で共通領域と連絡する請求項１に記載の装 置。
3. ３．単数又は複数の被検物質が吸収される担体を配置するための手段を包含する 請求項１又は２に記載の装置。
4. ４．前記溝と交差して配置される吸収ストリップを決められた位置に配置するた めの手段を包含し、単数又は複数の被検物質が上記ストリップ上に担持されてい る請求項３に記載の装置。
5. ５．各溝が窪穴を形成する凹部分を含み、その窪穴は、試験中の物質が含浸され た吸収円板又はその他の担体を保持するために取りつけられる手段を備えている 請求項３に記載の装置。
6. ６．配列して用いるための被検物質又は標準試料を支持する前記円板又はその他 の担体が、前記装置を密封包装及び滅菌する前に前記装置に挿入されている請求 項５に記載の装置。
7. ７．前記寒天又はその他の栄養分ゲルを流し込む突起を有する着脱可能な窪穴形 成部材が組み合わされている請求項１又は２に記載の装置。
8. ８．前記寒天又はその他の栄養分ゲル中に予め形成された窪穴と一列になるよう に設計された突起を有する被検物質アプリケーターと組み合わされ、各突起には 毛管現象によってある標準容量の液体を吸い上げるように設計された入口が設け られている請求項７に記載の装置。
9. ９．前記印が、装置上の固定目盛りの上に設けられている前記請求項のいずれか に記載の装置。
10. １０．前記印が、単数又は複数の被検物質が適用された吸収シート材の担体の上 に設けられている請求項１〜４のいずれかに記載の装置。
11. １１．前記印が、与えられた抗生物質に関して“感受性”及び“耐性”のグレー ド評価に対応する顕著な阻害域限界で特徴づけられる前記請求項のいずれかに記 載の装置。