JPH04506450A - 相補性ポリヌクレオチド配列のハイブリッド形成の安定化 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ポリヌクレオチド　のバイブ言−′メ　の本発明は、第１のＤＮＡまたはＲＮＡ 　（即ち、ポリデオキシリボヌクレオチドまたはポリリボヌクレオチドの）ポリ ヌクレオチド配列と、これと相補性の第２の標的ポリヌクレオチド配列とのハイ ブリッド形成を安定化する方法に関する。

また本発明は、本発明方法の実施に有用な、ＤＮＡまたはＲＮＡポリヌクレオチ ド配列とペプチド配列との結合からなる新規な結合体にも関する。

最後に、本発明は、この方法および新規な結合体の、核酸プローブとしての診断 分野における応用、および遺伝子発現を阻止または阻害する薬剤として治療分野 での応用に関する。

相補性ポリヌクレオチド配列と対になる能力を有するＤＮＡまたはＲＮＡポリヌ クレオチド配列を、これらの配列をラベルしてプローブとして診断目的に、また は遺伝子が外因性（ウィルス、寄生性または細菌のＤＮＡまたはＲＮＡ）　、内 因性（メソセンジャーＲＮＡの翻訳の阻害）にかかわらず、遺伝子の発現を選択 的に阻止するための薬剤として治療目的に使用することは現在よく知られている 。

しかし、対形成、即ち２つの相補性配列間のハイブリッド形成の安定化が必要な ことにより、ある困難が生じる。主に次の５つの理由により生じる、上記分子の 利用の際の大きな困難はいうまでもない。

ｌ）低い浸透効率、 ２）保護されていない分子の短命さ、 ３）保護された誘導体の不安定さ、 ４）ある誘導体（α型）の特異性の低下による親和性の獲得、５）リボゾーム結 合部位における阻害の代わりにＲＮアーゼによる分解（可能な場合）によりほと んど引き起こされる、ｍ　ＲＮ　Ａ　Ｑ現の阻害。

これらの困難を克服するためには、高い特異性を得るのに十分長いが、該分子の 内部折りたたみによる２次構造の出現を避けるのに長すぎない配列を使うという 制限がある。

ポリヌクレオチドにアクリジンのような挿入性の薬剤を結合することが提案され た。最後に、ヌクレオチドが天然にはないα型（αａｎｏ＊ｅｒｉｃ）構造とし て存在するポリヌクレオチドの使用がつい最近提案された。これらのα型配列は 、天然のβ型（βａｎｏｓｅｒｉｃ）構造を有する相補性配列と平行でより安定 な形で対をつくる。実際には、相補性β型ポリヌクレオチド配列は逆平行の形で 対をつくる。それにもかかわらず、標的の配列に対合する際誤りが生じ、分子の 特異性の低下につながる。

従って、本発明の目的は、前述した現状の技術の欠点を軽減して、相補性ＤＮＡ 又はＲＮＡ配列のハイブリッド形成を安定化することである。

実際、本発明の主題は、α型又はβ型構造を有する、修飾されたもしくはされな い、第１のＤＮＡ又はＲＮＡポリヌクレオチド配列と、これと相補性の第２の標 的ＤＮＡまたはＲＮＡ配列とのハイブリッド形成を安定化する方法であり、ペプ チドを用い、前記第１および第２のヌクレオチド配列により形成された二重のハ イブリッドらせん上で、このらせんの主溝内で前記ペプチドがヘアピン構造をと ることにより複合体を形成することを特徴とする。

ペプチドは上記第１の配列に固定されていてもされてなくてもよい。

本発明のある態様では、ペプチドが第１の配列に固定されている。

ルメートル（Ｌｅｍａｉｔｒｅ）らは浸透性を増すためポリリシンペプチドをオ リゴヌクレオチドに結合させた（ＰＮＡＳ、　１９８７．８４：　６４８−６５ ２）、このペプチドはハイブリッドの安定化には何ら役割を果たさなかった。さ らに、ポリリシンは非常に細胞毒性が強い。

本発明の第１の態様では、ペプチドのアミノ酸鎖は以下を含む。

−必要ならペプチドの第１のヌクレオチドへの固定部位から、第１の配列のヌク レオチド塩基列とそれぞれｌ対ｌの相互作用を示す第１のアミノ酸列、および− 第２の配列のヌクレオチド塩基列とそれぞれｌ対ｌの相互作用を示す、第１と同 数の第２アミノ酸列。

但し、第１および第２のアミノ酸列は、第１および第２配列の塩基と相互に作用 しないｌまたは複数の７４ノ酸から構成された、いわゆるヒンジ配列によって結 合され、 従って、第１のアミノ酸列が、第２のアミノ酸列と協同的に相互作用し、ペプチ ドと、第１および第２配列のハイブリッド複合体により形成された二重鎖らせん との間に生じる協同的相互作用により、ペプチドが二重らせんの主溝に入り込み 、ヒンジ領域により第１および第２のヌクレオチド配列の間のヘアピン構造をと る。

本発明は遺伝コードの起源について出願人によりなされた研究の成果によるもの である。

本発明によれば、ペプチドはヘアピン構造をとり、図１から３に示されるような 構造をとることにより、二重鎖ヌクレオチドらせんの主溝中にすべり込む０図容 体として、他方はＨと称される水素供与体として、２個の水素結合を供給するも のである（プロリンを除き）、ペプチドのチッ素はこのモデルでは四面体構造を もつ。

Ｅ（電子）はシトシンの０４位のＮＨ，と、又はその他の塩基中ではアデニンの ０６位のＮＨ，と相互に作用し、Ｈはチミン又はウラシルの０４と、又はその他 の塩基の中ではグアニンの０６と相互に作用することが示される。遊離の状態の ままのＥ又はＨ部位は、ペプチドの逆平行部分の同じく遊離のＥ又はＨと相互に 作用する。

式ＮＨ−ＨＣＲ−Ｃｏ中のＬ系のアミノ酸のＲ基はアミノ酸のアミド側から、主 溝中に露出した塩基Ｂ！の表面の残部と相互に作用する。

この種の協同的相互作用では、例えばＧ−Ｔ、Ｃ−Ａ、Ｇ−Ａ又はＴ−Ｃのよう な不適切なヌクレオチドの対は複合体全体の安定化を妨げる。

本発明によれば、ペプチドヘアピンの２個の分岐量の協同的アミノ酸−アミノ酸 相互作用は、第１と第２の配列のハイブリッド形成の安定化過程の原因である。

ペプチドと二重らせんとの間の強い相互作用はＰＨ、イオン強度及びある種の塩 の存在の一定条件下では、性質がプロテアーゼ様及びヌクレアーゼ様の２重の活 性の出現につながる。事実、標的がＲＮＡであると、リボースの２゛位のＯＨが ペプチドカルボニルの６十炭ｆを攻撃することが可能である。この攻撃の結果、 標的ＲＮＡ及びペプチドの開裂が生じる。この種の作用は、治療用薬剤としての ペプチド−ポリヌクレオチド結合体の応用の分野で特に−味深い。

上述の！８１の！！！樺において、ペプチドは第１の配列に一重典有結合により 結合していてもよく、従って第１の配列の、ペプチド−ポリヌクレオチド結合体 が次の式に対応してもよい。

ＡＡ、−−−−−−−＾Ａｌ１−Ｎ＋−−−−−−−Ｎｎ　（１）　″□式中、 ｎは１〜２００、通常４′〜５０、好ましくは１０２ｍは２ｎ＋ｐ。

ｐはｌ及びｌより大きい整数、例えば約２０であり、ＡＡｉ　はアミノ酸を表わ し、 Ｎはヌクレオチドを表わす。

相補配列ＮＺ−−−−Ｎｌｐ、ｎとのハイブリッド形成により、ハイブリッド複 合体は次の構造をとる。

点線“・・・・・・１はアミノ酸と塩基との相互作用、及び２つのペプチド鎖の 相互作用を示す。

（ＡＡｉ）ｐはヒンジ領域を示し、例えばＰ個の同じ又は真なるアミノ酸である 。

上記に示した構造（１）はまた、ペプチドがオリゴヌクレオチド配列に結合せず に生じることもある。

上記例においては、 ・配列ＮＩ−Ｎｔ−−−−−Ｎｎは５’−３’方向に相当し、Ｎ　＋　’　−Ｎ 　ｔｏ−−−−Ｎｎは３゛−５“方向に相当する。

・アミノ酸ｔｌＡＡ＋　−ＡＡ４−−−−−ＡＡｍ　（１−ｍ）はＡ　Ａ　＋で は遊離Ｎ　Ｈを末端に、ＡＡｍでは！！ＪＩＣＯＯＨ末端に相当し、アミノ＠Ａ Ａｘは（Ｎ　Ｈｔ　）　Ａ　Ａ　ｘ　（ＣＯＯＨ）に対応することを８味する。

可能であれば、ペプチドとオリゴヌクレオチドの間の結合は、所望によすｔ　Ｉ Ｊゴヌクレオチドの５゛末端に加えられる、トリアゾール化ウラノル又はチミン をオリゴヌクレオチド上に有するヌクレオチドと、所望によりによりペプチドの Ｃ末端に加えられるリノンペプチドとの間に以下のような方法により、初めに形 成されるのが好ましい。

】）チミン又はウラシルのオキソ基を、４位の炭嵩上でトリア／−ル基に置き換 える、 ２）　トリアゾール基を、上記リジンの鎖の末端のＮ　Ｈｚを介して上記リジン で、従ってペプチドで置換する。

最後に、固定の後、トリアゾール化チミン又はウラシルはそれぞれメチルシトシ ン又は官能化シトシンとなり、オリゴヌクレオチドはそれぞれメチルシトシン又 はシトシンによりペプチドに結合する。

第１配列、即ちプローブ配列（Ａ）と、第２配列、即ち標的配列（Ｂ）の間のヘ アピンループ（０は次のように表すことができる。

上記第・ｌ及び第２配列はそれぞれプローブ及び標的配列の一部を構成するだけ の場合もある、即ち、ハイブリッド複合体は以下のように示される。

後者の場合では、第］の配列の、ペプチド−ポリヌクレオチド結合体は次のよう に表わされる。

式中、ｐは１〜１００、通常５〜２５、ｎは０−１００、通常０−２０、 ｍは３〜４００、通常ｌＯ〜１ｌＯ１好ましくは約２０、（ｐ＝１の場合、上式 は式（１）となる）別の態様によると、ペプチドは以下を含む。

−第１配列のヌクレオチド塩基列とそれぞれＸ対１の相互作用を示す第１のアミ ノ酸列、 一第２配列のヌクレオチド塩基列とそれぞれｌ対ｌの相互作用を示す第２のアミ ノ酸列、および −第１配列のヌクレオチド塩基列とそれぞれ１対１の相互作用を示す第３のアミ ノ酸列。

但し、一方で第１および第２のアミノ酸列、および他方で第２および第３のアミ ノ酸列が、同じまたは異なったヒンジ配列で結合し、この配列は具体的には前記 第１および第２の配列の塩基と相互作用をしない１または複数のアミノ酸から構 成され、 塩基により前記第２のアミノ酸列と相互作用するヌクレオチド配列が、塩基によ り前記１および第３のアミノ酸列と相互作用するヌクレオチド配列に相補性性の 配列を構成し、 従って、第１および第３のアミノ酸列が協同して、第２のアミノ酸列と相互作用 し、 ペプチドと、第１および！２２配のハイブリ、ド複合体により形成される二重鎖 らせんとの間に生じる協同的相互作用により、ペプチドが二重らせんの主溝に入 り込み、ヒンジ領域により第１および第２のヌクレオチド配列の間にヘアピン構 造をとる。

本発明のこの態様によると、ハイブリッド形成複合体は以下のように示すこと１ は第１のアミノ酸列を、 ３は第２のアミノ酸列を、 ２は１と３の間の第１の一連の”ヒンジ”アミノ酸を、５は本発明のこの態様に おける第３のアミノ酸列を、４は３と５の間の°ヒンジ”アミノ酸を表わす。

（＾）及び（８）はそれぞれ第１及び第２の配列を示す。

上の構造（４）　はペプチドが第１の配列に必ずしも結合していなくても起こり うる。

本発明のまた別の１３樟によれば、前述したように、ペプチドは２個の結合によ り、即ち、ポリペプチドの各末端により第１配列のポリヌクレオチド上で第１の 配列に結合しうる。

この場合の複合体は次のように表わされる。

Ｎ’１−　Ｎ’２　Ｎ’、　−Ｎ’Ｐ＋Ｉ　Ｎ’２Ｐ（ＡＡｉ）ｘ　Ｉｉいｈゆ る”ヒンジ”配列、例えばＸ個の１ヒンジ９アミノ酸を表し、 （ＡＡｊ）ｙ　１１０Ｍ１６　”ヒンジ”配列、例えばｙ個の”ヒンジ”アミ／ ７９をミノ酸を表す。

一般に、第１配列のヌクレオチドは、アデニン、グアニン、チミン、シトシン、 ウラシル、ならびにイノシン、２．６−ジアミツプリン、６−アミノ−８−ブロ モプリンなどのその他すべてのプリン塩基、または５−ブロモウラシルや５・− ヨードウラシルのようなピリミジンから選ばれた塩基を有する。

従って、プローブのオリゴヌクレオチド配列は末端シトシンを有するのが有利で ある。

さらに、ウラシルとシトシンが示す形状の類似により、アミノ酸とウラシルとの 間の相互作用を避けることが好ましく、従って標的配列は最も可能性の少ないウ ラシルを含むように選択されるのが好ましく、また、プローブ配列は最も可能性 の少ないアデニンを有するのが好ましい。

ペプチドは好ましくはＡ形のヌクレオチドらせんと複合するが、Ｂらせんとの相 互作用もまた予想できる。

ペプチドを構成する種々のアミノ酸は、上記のように、関連する核酸配列のヌク レオチド上に互いに続く塩基の性質に基づいて選択される。

塩基がチミンの場合、アミノ酸は好ましくは強い疎水性でなければならない。

従って、アミノ酸は中でもし一フェニルアラニン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイ シン、Ｌ−バリン、し−アラニン及びし−メチオニンから選ばれる。より好まし くは、Ｌ−ロイシン、Ｌ−インロイシン及びＬ−バリンの中から選ばれる。

Ｌ−セリン、Ｌ−）レオニン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−グルタ ミン、Ｌ−リシンまたはＬ−アルギニンのような親水性アミノ酸は避ける。

塩基がウラシルの場合、アミノ酸はいわゆる両性、即ち両親媒性でなければなら ず、これは溶媒効果を示さず、あまり疎水性でもあまり親水性でもない、または 、酸性アミノ酸であることを意味する。

塩基がウラシルの場合、次のアミノ酸が挙げられる。し−アラニン、Ｌ−アスパ ラギン酸、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−セリン、し−システィン、Ｌ−）レオニン。

中でも、Ｌ−アラニン、Ｌ−セリン、及びＬ−トレオニンが好ましい。

Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、し−アスパラギン、し−グルタミン、Ｌ−リ ジン、及びし−アルギニンはさける。

塩基がシトシンの場合、両性、即ち両親媒性アミノ酸が選択され、これは溶媒効 果を示さず、あまり疎水性でも親水性でもないアミノ酸を意味する。

具体的には、Ｌ−アラニン、Ｌ−セリン、Ｌ−システィン、Ｌ−トレオニン、Ｌ −チロシン、Ｌ−ヒスチジンが挙げられるが、中でもし一アラニン、し−セリン 、Ｌ−）レオニンを用いるのが好ましい。

塩基がアデニン又はグアニンの場合、親水性アミノ酸が用いられる。具体的には 、Ｌ−チロシン、し−ヒスチジン、し−アスパラギン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−リ シン、し−アルギニン、し−アスパラギン酸、し−グルタミン酸、Ｌ−セリン、 し−ソステイン、グリシン及びＬ−）レオニンが例示される。

より正確には、塩基がアデニンの場合、高電荷の強い親水性のアミノ酸、特にＬ −アスパラギン、Ｌ−グルタミン又はし−リジンが好ましく用いられる。　塩基 がグアニンの場合、小さい親水性アミノ酸が用いられ、Ｌ−アルギニン及びＬ− リシンの他、好ましくはＬ−セリン及びＬ−ンステインが用いられる。

従って塩基がアデニンの場合、し−ロイシン、し−イソロイシン、Ｌ−バリン、 Ｌ−フェニルアラニン及びＬ−アラニンのような疎水性アミノ酸は避ける。

塩基がグアニンの場合、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−インロイシ ン、Ｌ−バリン、Ｌ−アラニンのような疎水性アミノ酸は避ける。

塩基が別のピリミジンの場合、アミノ酸は中でもチミン、ウラシル又はシトシン に対して推奨されるアミノ酸の中から好ましくは選ばれる。

塩基が他のプリンの場合、アミノ酸は中でもアデニン又はグアニンに対して推奨 されるアミノ酸の中から好ましくは選ばれる。

らせんに対するペプチドの親和性を高めるため、またはペプチドに新規な性質を 与えるため、その他の非天然のアミノ酸を用いてもよい。

ある種のアミノａＩｌｌＩは正確な二重鎖ＤＮＡ又はＲＮＡ配列と安定な相互作 用を与えない、特に次の鎖はできるかぎり避ける。

ＡＡｘ−Ｇｌｕ　−Ｃｙｓ　−ＡＡ、ＡＡｘ−Ｇｉｎ　−Ｃｙｓ　−ＡＡ。

ＡＡｘ−Ａｓｐ　−Ｔｒｐ　−ＡＡ、ＡＡ、　−Ｇｌｕ　−Ｔｒｐ　−ＡＡ。

んＡ、　−Ｔｒｐ　−Ａｓｐ　−ＡＡ、ＡＡｘ−Ｔｒｐ　−Ｇｌｕ　−ＡＡ。

ＡＡｘ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−ＡＡｚＡＡｘ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−ＡＡ。

ＡＡ、ｘ−Ｇｌｙ　−Ａｓｐ　−ＡＡ、ＡＡｘ−Ｇｌｙ　−Ａｓｎ　−ＡＡｚＡ Ａｘ−Ｇｌｕ　−Ｇｌｙ　−ＡＡ、ＡＡｘ−Ｇｌｎ　−Ｇｌｙ　−ＡＡｚＡＡｘ −Ｇｌｙ　−Ｇｌｕ　−ＡＡ２ＡＡｘ−Ｇｌｙ　−Ｇｌｎ−ん〜ＡＡｘ　−Ｇｌ ｕ−ηｗ−ｋＡ、ＡＡｘ−Ａｓｐ−５ｅｒ−ＡＡ。

ＡＡｘ及びＡＡｚは次式て示される慣例通り上流及び下流の′ｒミノ着を表わす 。

（ＮＨＪ−ＡＡｘ−−−−−−−ＡＡｚ（−ＣＯＯＨ）ヘアピンのループは好ま しくは２．３又は４個のアミノ酸からなる。それらはグリシン、Ｌ−アスパラギ ン及びＬ−グルタミンの中から選ばれるのが好ましい。

最も広義には、本発明の主題は、α型又はβ型構造を有する、修飾された又はさ れないＤＮＡまたはＲＮＡポリヌクレオチド配列と、相補ＤＮＡ又はＲＮＡ配列 と前記ポリヌクレオチド配列より形成されるハイブリッド二重らせんの主溝にお いてペプチドがヘアピン又は二重ヘアピン構造をとるようにアミノ酸が選択され たペプチドとからなる結合体である。

詳細には、このペプチドを構成するアミノ酸は、前述の対応性の原則を考慮して 、ポリヌクレオチド配列を構成するヌクレオチドの性質に関連して選択される。

このポリヌクレオチド配列は第１のＤＮＡ又はＲＮＡ配列に相当し、ペプチドは ポリヌクレオチドに共有結合し、もしくはしていない。

本発明の主題はまた、次の一般式（１）によって結合している、本発明方法に用 いられるペプチド−ポリヌクレオチド結合体である。

式中、通常１００＞ｐ≧１、通常　２５〉ｐ≧５１０Ｇ＞ｎ≧０、通常　２５〉 ｎ≧３０４００　＞　ｍ≧３、通常１００　＞　ｍ≧１０−＾＾、−−−−−− −　Ａ　Ａ−はペプチドを表わし、−Ｎ　、−−−−−−−Ｎｐ＋ｎはポリヌク レオチドを表わす。

アミノａｌＡＡは、詳しくはヌクレオチド塩基と相互作用しないｌまたは複数の アミノ酸からなる、いわゆる°ヒンジ”配列により、ポリヌクレオチド二重らせ んの主溝において、第１及び第２の配列の間でペプチドがヘアピン構造をとるよ うに、前述の対応性の原理を考慮して、ポリヌクレオチドを構成するヌクレオチ 、ドＮの性質に関連して選ばれる。　１式Ｉて示すように１．ペプチドは、ポリ ヌクレオ・チドに固定され、それはａ、ずしもポリヌクレオチドの末端の１つの 位置である必要はない、しかし、ポリヌクレオチドのいずれかの末Ｏａ＆：おい て固定が生じるのが好ましく、そｐ場合上記式１でｐ＝１である。　、　１７． ・１，４ アミノ酸は、好ましくは、一方では第１及び、第・２の配列のヌクレオチドに関 して、他方ではペプチド鎖の隣接アミノ酸に関して、・前述した対応性の原則に 従わなけれ−ｆならない０１．し　、、　、　４　、す、すべてのアミノ酸が、 ；れうの規１りに従う必要な４？６例えば、３０％の割合であればよい。

さらに、ペプチドは、式■において表わされる好適態様とは真なり、必ずしも末 端アミノ酸を介してポリヌクレオチドに固定される必要はない。

また、ヒンジは必ずしもアミノ＃鎖からなる必要はなく、非ペプチドの化学基で あってもよい。

本発明の主題はまた、一般式Ｈに対応することを特徴とする、本発明方法におい て有用なペプチド−ポリヌクレオチド結合体である。

式中、 Ａ　Ａ　、−−−−−−−Ａ　Ａ−はペプチドのｍ個のアミノ酸を示し、Ｎ、− −−−−−−Ｎｐ＋ｎはｐ　＋　ｎ個のヌクレオチドの第１配列を示し、１００ ＞ｐ≧１、通常２５〉ｐ≧５． １００＞ｎ≧１、通常２５〉ｎ≧０、　．４００、＞ｍ≧・３、通常１１０＞ｍ ≧ＩＯ１好ましくは約２０．ＪアミノｆｌＡ　Ａ　ｌ−、、−ＡＡｍは、ペプチ ドが内部に２個Ｑヒンノ構造によ５り昼型ヘアピン構造をとるよう、前述の対応 の規則に従って選択されるー　。

この結合体において、ＡＡ−は、ＡＡＪ、のＣＯ，ＯＨと塩基のＮＨｆｆｉとρ 閏のアミド結合によってＮ、４．に結合していて・もよい、、ざ・ら・ド、ＡＡ 、がグルタミン酸又はアスパラギン酸である場合、ＡＡ、はＡ　Ａ　＋のＣＱＯ Ｈと塩基のＮＨ，ｆｆｉと９間のアミド結合により−Ｎ、に結合してもよい、そ の他、例えば２個のＣ・ＯＯＨ官能基を含有する化学基（ヘミスクシニル基のよ うな）等からなる化学的結合基によってＡＡ、のＮ１−１ｇを塩基のＮＨ！、と 結合することもできる。この結合基の各Ｃ０ＯＨ官能基は、それぞれアミノ酸及 び塩基の、Ｎ　Ｈを官能基、と７．ミド結合を形成する。

しかし、ペプチドとポリヌクレオチドの間の結合は、好ましくは、前述のように リシンとトリアゾール化ウラツル又はチミンとの間に生じる。従ってこの場合、 ＡＡｍとＡＡ、はりシンを表わし、Ｎ９．１及びＮ、はメチルシトシン又はシト シンをそれぞれ表わす。

本発明結合体の好適態様では、結合体は一般式ＩＩＩにより示される。

式中、 ｍは３から４００の間の整数。

Ｒは、修飾されていてもよい天然の７ミノａＩＩ鎮及び修飾されていてもよい非 天然のアミノｆｌ！ｔＪｌから選ばれる。

ＺはＯＨ基、ポリヌクレオチド、保護分子、又は例えばジニトロフェノール、ビ オチン、フルオレセイン等の分子標識から選ばれる。

χはＨ基、ポリヌクレオチド、保護分子、又は例えばジニトロフェノール、ビオ チン、フルオレセイン等の分子標識からｉｌハれる。

ＹはＲがリシン、アスパラギン酸又はグルタミン酸鎖である場合に存在し、その 場合、Ｙはポリヌクレオチド、保護分子、又は例えばジニトロフェノール、ビオ チン、フルオレセインのような分子標識を表わし、これらの要素はＲのＮ　Ｈを 又はＣ０ＯＨ基に固定される。

Ｘ、Ｙ及びＺのうちの１つのみが前記第１の配列に相当するポリヌクレオチドで ある。

ポリヌクレオチドを表わすＸ、Ｙ及びＺの間の互換性は、ポリヌクレオチドをペ プチドに固定する３つの可能性を示唆する。固定は、塩基のＮＨ，上にペプチド Ｃ０ＯＨ基を介して、又はオリゴヌクレオチドの塩基上にペプチドのＮＨ，基を 介して、具体的には前記のようにオリゴヌクレオチドのトリアゾール化ウラツル 又はチミン上にペプチドのりシン鎖の末端にあるＮＨｆｆｉ基を介して行われる 。

ペプチドはまた、その他次に述べる方法の１つにより、オリゴヌクレオチド上の 反応性部位の１つまたはその修飾された部位の１つによってオリゴヌクレオチド に結合してもよい。

ペプチド−オリゴヌクレオチド複合体の合成は当分野で既知であり、一方ではパ ルバラ・チｘ　（Ｂａｒｂａｒａ　Ｃｈｕ）（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅ ５ｅａｒｃｈ＋　１９８３．旦：　６５１３−６５２９）に記載の方法、他方で はルメートル（Ｌｅｍａｉｔｒｅ）等（仏閣特許Ｎｏ、　２５８２６５３）によ り再び取り上げされたダナグプタ（ＤａｎｎａｇｕｐＬａ）等（欧州特許出願公 開公報１５４８８４）に記載の方法によることができる。

例えば、結合は次のような反応性部位上になされる。

ＲＮＡである場合リボースの２°ＯＨ基、ＲＮＡまたはＤＮＡである場合リボー スの３’ＯＨ基、リボースの５’ＯＨ基、 ３′リン酸エステルのＯＨ基、 ５°リン酸エステルのＯＨ基、 アデニンＣ６のＮＨ，基、 グアニンＣ２のＮＨ，基、 シトシンＣ４のＮＨ，基。

これらのＮＨ，基は、例えばアミド結合によりペプチドのカルボキシル基に固定 される。

パルバラ・チュによる方法はペプチドの末端アミノ酸のＮＨｔ基を、５′　リン 酸エステルのＯＨ基と結合させることからなる。

ルメートル等の方法は、２°及び３゛炭素上に２個のアルデヒド基を導入するこ とにより、ＲＮＡのリボース環を修飾することからなり、こうして得られた化合 物をＮＨＩ基上でポリヌクレオチドにより還元アルキル化すると、チノ稟へテロ 原子を有するヘテロ環の形での環化を経て結合が生じる。

ペプチドの合成は既知であり、遺伝子工学技術やメリフィールド（Ｍｅｒｒｉｆ ｉｅｌｄ）に従って固体担体上で又は液相において化学工学技術を用いる標準方 法によ、）て実施できる。

オリゴヌクレオチドの合成も既知であり、化学工学技術または遺伝子工学技術を 用いる標準方法によって実施できる。

従って、本発明の主題は、ペプチドとポリヌクレオチドの間の結合が、ペプチド のりシンとポリヌクレオチドのメチルシトシン又はシトシンとの間に生じ、リシ ン鎮の末端にあるＮＨｔがそれぞれメチルシトシン又はシトシンの４位の炭素に 結合していることを特徴とする結合体でもある。

さらに、本発明の主題は本発明による結合体の製造方法であり、出発ポリヌクレ オチドの４位において、チミンまたはトリアゾール化ウラツルのトリアゾール基 を、リシン鎮の末端にあるＮＨ８基を介してペプチドに置換することによりペプ チドをポリヌクレオチドに結合することを特徴とする。

最後に、本発明の主題は本発明の方法および結合体の応用である。

これは、本方法又は結合体を生物のＤＮＡ中の構造又はｉｑｍ遺伝子を阻止また は阻止を解除するのに用いる場合の治療またはバイオチクノロノーの応用であっ てもよい。

また、本方法又は結合体を、メツセンジャーＲＮＡのスプライシング過程を阻害 するのに加え、メツセンジャーＲＮＡ１７）ＩＩ訳の阻害または阻害の解除に用 いる場合の治療又はバイオテクノロジーの応用であってもよい。

本方法または結合体の応用は、診断用プローブとしての応用でもよく、この場合 Ｘ又はＺは分子Ｉ！ｌ＠を表わす。

バイオテクノロジーの応用はまた、本方法または結合体を、核物質の絹製の手段 として用いることからなっていてもよい。

細胞の遺伝物質は、その影態にかかわらず、特に形質転換された植物の分野での 応用において、この細胞が例えばアンチセンス分子及びそれをその標的上で安定 化するペプチドを産生ずるように、ペプチドとオリゴヌクレオチドとの間に共有 結合が必ずしも存在しなくても補給される。

これに対し、ヒトの治療用途に対しては、ペプチドがオリゴヌクレオチドに結合 することが必要である。

本発明の他の特性及び利点を図面を参考に、以下の実施例によりさらに説明する 。

図１では、２個のアミノ酸の２１１の−ＮＨ基が示され、それら自身協同して、 ハイブリッド形成されたＴ−Ａ塩基対と主溝において相互に作用する。

図２では、２ｍのアミノ酸の２個の：ＮＨ基が示され、それら自身協同して、ハ イブリッド形成されたＣ−Ｇ塩基対と主溝において相互に作用する。

図３は本発明によりペプチドをとり込むハイブリッド複合体の相互作用を表わす 。

寒Ａ■１：　および　。

図１および２において、（１）　は塩基のリボース環への固定部位を示す。

図１よび２において、２個の各アミノ酸のペプチド結合（２ａおよび２ｂ）の各 窒素は、１つは電子に由来してｒＢ、と称された水素受容体として、他方はＨと 称された水素供与体として、２つの水素結合の供給源となることが分かる。

アミノ酸のＮＨ基の窒素は別のアミノ酸のＮＨ基の水素と相互に作用する。同様 に、この別のアミノ酸の窒素上の電子は、アデニンの０６位のＮＨｔＣ図１）ま たはシトシンの０４位のＮＨｔ　（図２）と相互に作用する。最初のアミノ酸の 窒素上の水素はチミンの０４（図１）またはグアニンの０６（図２）と相互に作 用する。

図３に示すＬ系のアミノ酸のＲ基はアミノ酸のアミド側から主導に露出した塩基 表面の残部と相互に作用する。

図３において、Ｂ、およびＢ、は第１の配列の２個のヌクレオチド塩基を表し、 Ｂ′、およびＢ’ｚはＢ１およびＢｔに相補性の第２の配列のヌクレオチド塩基 を表す。

Ｂ１は例えばチミンであってもよく、その場合Ｂ’＋　はアデニンを示す、３１ 体的にはこれらの２個の塩基は、図１に示すようにチミンの０４とアデニンの０ ６位のＮＨ，を介して相互に作用する。

Ｂｔは例えばグアニンであってもよく、その場合８’ｔはシトシンを示す、具体 的にはこれらの２ｍの塩基は、図２に示すようにチミンの０６とシトシンの０４ 位のＮＨ，を介して相互に作用する。

１１轟Ｉ：ペプチド−オリゴヌクレオチド　一体抗寄生虫薬、詳しくはトリパノ ゾーマ症に対する薬剤のための本発明の具体例を以下に示す０分子はこの寄生虫 のすべてのｍＲＮＡの５゛末端に加えられた３５ヌクレオチドの一致した配列の 一部に対するものである：５°　ＡＡＣＧＣＴ　ＡＴＴ　ＡＴＴ　ＡＧＡ　ＡＣ Ａ　ＧＴＴ　ＴＣＴ　ＧＴＡ　ＣＴＡ　ＴＡＴ　ＴＧ　３’ 上記配列はＤＮＡ配列に相当する。

ペプチド−オリゴヌクレオチド結合体およびハイブリッド形成複合体の例を以下 に示す、標的配列は上記配列のＲＮＡ１ｉ訳物に相当する。

Ａ　−Ａ　−Ｃ−Ｇ　−Ｃ−Ｕ　−Ａ　−Ｕ　−Ｕ　−Ａ　−Ｕ　−ｅｔｃ、　 ３’上述のトリパノゾーマ症に対する抗寄生虫薬の応用に加え、本発明の結合体 は、リースマニア症に対する抗寄生虫活性、ＨＩＶｌ、ＨＩＶ２、ヘルペス等の 場合の抗ウィルス活性、または層やＭ核等に対する抗＄ｌ菌活性ζおいζも使用 できる。

ｍＲＮＡ翻訳の阻害への応用は以下のような場合が考えられるニーＨ１受容体（ ａ瘍） 一レニン（動脈高血圧） 一アンギオテンシン（動脈高血圧） 標的配列がＲＮＡであるこの種の応用は、二重ハイブリッドＤＮＡ−ＲＮＡらせ んが、Ａらせんの主溝を考慮するとペプチドがより容易に複合するＡ型をとるの で、特に重要である。

大簾例１：ペプチドに　したオリゴヌクレオチドの貫■優！員 ピリジンを水素化カルシウム上で２時間還流させて蒸留し、パラトルエンスルホ ン酸クロライドと共に還流させ、次いで再蒸留した。

■）　のためのトリアゾール化チミンの　゛　（ホスホトリエステル）Ｈ，Ｌ、 　Ｓｕｎｇ　：　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅａｒｃｈ　（１９８１）氾６ １３９およびＪ、　Ｏｒｇ、　Ｃｈｅｗ。

（１９８２）　４７４３６２３に記載の方法による）次の化合物を使用した＊　 Ｍ、　Ｊ、　Ｇａ１ｔ　（”Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　５ｙｎＬｈｅｓ ｉｓ　：　ａ　ｐｒａｃｔｉｃａｌ　ａｐｐｒｏａｃｈ”　１９８５＋ｒＲＬ　 Ｐｒｅｓｓ）により記載の方法で製造した４ｇの５゛−０−ジメトキシトリチル −３’　−０−（２−クロロフェニル−β−シアノエチルホスフェート）−２゜ −デオキシチミジン（−ＤＭＴｒ　Ｔｐｃｅ）　（ＭＷ＝７８７．５　、５．０ ７ｍ５＋ｏｌ）　、２．５　ｇのＯ−クロロフェニル−ジクロロホスフェート（ ＭＷ＝２４５．３３．１０．１麟−０１）、および１４ｇの１．２．４−　）リ アゾール（ＭＷ＝６９．０７．２０．３＋ｎｏｌ）この溶液を篇水ピリジン９１ 中で１０℃で５分間、次いで室温で１週間攪拌した。

この混合物を４５ｍ１の水で希釈し、脱酸したＣＩＩｔＣＩ□７５−１で２回抽 出した。

混合した有機相を２％ＮａＨＣＯｘ水溶液で洗浄し、次いでＮａｚＳＯａで乾燥 し、濾過し、減圧下で蒸発させた。

析出物を２ｍｌのＣＩｌ、Ｃ１，でフラスコ中に再Ｓ濁し、ついで１００　ｍｌ の石油エーテルを急速に加えた。これを静置し、次いで使用したエーテルを除去 し、生成物の分離を妨げるかもしれない微量のピリジンをすべて除去するために 、清浄なエーテル１００膳ｌを添加した。

生成物をｃｏ、ｃ＋、に充填したメルク９３８５または７７３４シリカカラム上 でクロマトグラフィーにかけた。

先づ１００％ＣｆｈＣＩｇで、次いでＣ１ｌよＣＩｔ＋１％メタノール、ＣＣ１ １ｇＣ１＋　２％メタノール、ＣＨｘＣ１！”　３％メタノール、ＣＨｌＣｌｚ 　＋　４％メタノール、最後にＣＩＬｔＣＩ　ｚ　＋　５％メタノールで溶出を 行った。

カラム溶出物の検査を、メルク６０Ｆ２５４シリカ板（０，２ｍ５）を用いた薄 層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）で行った。トリアゾールの利点は３６６１−て 蛍光を発し、それを容易に追跡しうろことである。

完全に純粋な生成物を得るため、３６６ｎ−で蛍光性のカラム溶出液を再びカラ ムを通した。５％メタノールの用いた４番目のカラムの後に単一のスポットが得 ら第１工程：オリゴ（ｎ−１）のアプライドバイオシステムズ装置への結合、カ ートリッジを機械から除去し空にした。

ビーズを小フリフトに置いた。

ＤＭＴｒ　Ｔｐｃｅをトリエチルアミン、ピリジンおよび水（ＴＰＳｌ　１／３ ／１）の混合物で２０分間脱シアノエチル化した。

次いで３’０１（）リアゾール化チミンを、通常のヌクレオチドと同様に、無水 ピリジン中“で２時間かけて、１−（２，４，６−トリイソプロビルーベンゼン スクホニル）−３−ニトロ−１，２，４−トリアゾール（ＴＰＮＳＴ）　５００ μｍｏ１を用いて５”ＯＨオリゴに結合した。

遊離のまま残った５゛基は室温において３０分間無水酢酸のピリジン溶液（１０ ％Ｖ／Ｖ）でブロックした。

ピリジン、次＆’　テｃＨｇｃＩ　ｔ−ＣＨＪＨ（９０：　ＩＯＶ／Ｖ）　？’ 数回洗浄を行った。

５゛末端をＣＩｌ、Ｃ＋、中の２％ベンゼンスルホン酸で脱トリチル化した。

脱トリチル化が完了するまで操作を繰り返した。

オリゴヌクレオチドをピリジンで数回洗浄した。

３）　合　のためのトリアゾール　チミンの製゛　（ホスホアミダイト）（Ｔ、 　Ｒ，ＷｅｂｂおよびＭ、　Ｄ、　Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ　ｓ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　 Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、　１９８６．１４：　７６６P に記載の方法による） １．４ｇの１．２．４−　）リアゾール（％　６９．０７．２０．３ｓｓｏｌ） を３０−１のアセトニトリＡ／ニ添加した。

この混合物を水浴中で冷却した。

蒸留オキシ塩化リン（ＰＯＣｂ）５００μＩ　（５，４ｓｓｏｌ）をゆっくり加 え、激しく攪拌した、白色の沈殿物が生じた。

ついで、トリエチルアミン３■ｌ　（２１，７ｓｓｏｌ）を滴下した。

反応混合物を水浴中で３０分間攪拌した。

アプライドバイオシステムズ製の５゛−０−ジメトキシトリチル−３°−０−（ ２−クロロフェニル−β−シアノエチル−Ｎ、Ｎ’−ジイソプロピルホスホアミ ダイト）−２゛−デオキシチミジン（ＭＷ＝７９３．６５．１．２６ｇｍｏｌ） 　１　ｇををアセトニトリル５−１に溶解したものを添加した。

この混合物を室温で３０分間攪拌した。

これを４８時間インキュベートした。

反応を炭酸水嵩ナトリウム溶液で停止させた。

水相をジクロロメタンで数回抽出し、硫酸ナトリウム上で乾燥し、濾過し、つい で蒸発乾固した。

４−（１，２，４−）リアゾール小イル）−５°−０−ジメトキシトリチル−３ ’　−０−（２−クロロフェ゛ニルーβ−シアノエチル−Ｎ、Ｎ’−ジイソプロ ピルホスホアミダイト）−２゛−デオキシチミジンを極少量のジクロロメタンに 溶解し、７０℃で石油エーテルで再沈殿させた。

４）　飾ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドへの　＾（自ＤＭＴｒ　Ｔｐｃｅを 通常のヌクレオチドと同様、樹脂上に固定されたオリゴヌクレオチドの５゛末端 に結合した。

５）さズエエｑ里１ 種々のペプチドを標準方法によりアプライドバイオンステムズ合成機を用む１て 固相上で合成した。これらを緩衝液ＡおよびＢの密度勾配を用いてＨＰＬＣで精 製した（緩衝液Ａ　：　１００μＨ酢酸アンモニウム、Ｂ：２０％の１００μ台 酢酸アンモニウムおよび８０％のアセトニトリル）、生成物を分析するのに使用 するカラムζよ１１ｓ３　Ｃ１８またはヌクレオシルμＣ１Ｂ型の逆相基体を有 する。オリゴヌクレオチドに結合させようとするペプチドを保護なしに供給し、 Ｎ末端をアセチル化し、Ｃ末端をアミド化した ６）ペプチド：オリゴヌクレオ±上益査止鬼盟盪ペプチドを、トリアゾールの置 換反応によりＣ末端りシン鎮の末端に位置するＮＨｆを介してヌクレオチドに結 合した。

ビーズ上に固定したオリゴヌクレオチドおよびペプチドを１：３〜１：１０の割 合で室温において４８〜７２時間かけてピリジン５００ｐｌ中に添加した。

ビーズをピリジンで４．５回洗浄し、乾燥した。

ペプチド−オリゴヌクレオチド結合体をビーズから放し、ヌクレオチドを５６℃ で５時間かけて２５％アンモニア溶液で脱保護した。

遠心分１１＆、上清を除去し乾燥した。

水に再懸濁した生成物を緩衝液ＡおよびＢの密度勾配を用いてＩＩＰＬＣでｎ’ ｌ／Ｉした。

主要ピーク　（ペプチドＮｏ、　１　として１３％で溶出）は少量の酸加水分解 により特性を決定した。アミノ酸分析によりペプチドがオリゴヌクレオチドに実 際に固定されていることが確認された。

オリゴヌクレオチドの存在を２５０ｎ−におけるｕｖ分九九分析確認した。結合 率は８０〜９５％であった。精製度は２０％であった。

ｗ、［１，’：ペプチドの固定化の後、トリアゾール化チミンは官能化メチルシ トシン羞！立輿定 ペプチドのオリゴヌクレオチドＡらせんに対する安定化効果は、複合体の融解温 度の向上により検出した。測定はｐ１１７．４で６６％エタノールおよび６．５ −ｍｏｌ　リン酸ナトリウムを含む溶液中で行った。

以下の配列が関べられた。

１）オリゴヌクレオチド−ペプチド１ Ａｃａ　ｔｙｌ−ＮＨ−Ａｓｎ−Ｔｈｒｄｏ−Ａｒｇ−５ｅｒ−Ａｒｇ−Ａｌａ −Ａｌａ−Ａｌａ−＾ｒｇ−Ａｌａ−５ａｒ−５ｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−＾１ａ −＾１ａ−Ａｒｇ−Ａｌａ−５ｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−相補性オリゴヌクレオチ ド　・　５’　ＧＧＣＧＣＣＣＧＡＡＣＡＧ　３゜対晒オリゴヌクレオチドｌ　 ｂｉｓ：　３”　ＣＣＧＣＣＧＧＣＴＴＧＴＧ　５’相補性オリゴヌクレオチド ｌ　：　５’ＧＧＣＧＣＣ，ＣＧ八へＣＡＧ　３゜２）　Ａｃｅｔｙｌ−ＮＨ− Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−５ｅｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒｅ ｏ−Ａｒｇ−５ｅｒ−５ｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−５ｅｒ−Ｐｈｅ−Ｖａ　ｌ−５ ＠ｒ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ａｌａ　−５ｅｒ−５ａｒ−５ａｒ−５＠ｒ−Ｌｙｓ− ＣＯＮＨ２！ ３’ＣＣＴＴＧＴｒＣＧＧＧＧＴ　Ｃｍａ　５’相補性オリゴヌクレオチド　： 　５’ＧＧＡＡＣＡＡにＣＣＣＣＡＧ　３’対照オリゴヌクレオチドｌ　ｂｉｓ ：　３”　ＣＣＴＴＣＴＴＣＧＧＣ；ＧＴＣ５’相補性オリゴヌクレオチドｌ： ５°　ＧＧＡＡＣ八ＡＧＣへＣＣＡＧ　３゜３）オリゴヌクレオチド３に固定さ れていない自己相補性ペプチドペプチド３Ｈ−Ａｒｑ−Ｇ　１ｎ−Ａｌ　ａ　− Ｓｌ！　ｔ　−Ｌａ　ｕ−Ａｌａ−Ａｒｑ−Ｇｉｎ−Ａｌａ　−Ｓｅ　ｒ　−Ｌ ａ　ｕ　−Ａ　ｌ　ａ@−ｏＨ ＯＨ−Ａｌａ−Ｌａｕ−５ｅｒ−Ａ　Ｌａ−Ｇ　ｉｎ　−Ａｒｑ−Ａ　ｌ　ａ− Ｌａｕ−５ｅｒ　−Ａ　ｌ　ａ−Ｇ　ｌ　ｎ　−Ａｒｑ　−g 相補性オリゴヌクレオチド３：　３’ＧＡＣＣ；ＴＣＣ，ＡＣＧＴＣ５’５°　 ＣＴＧＣＡＧＣＴＧＣＡＧ　３’４）オリゴヌクレオチド４に固定されていない 自己相補性ペプチドペプチド４Ｈ−ｊｄａ−Ｌａｕ−Ａｌａ−５ｅｒ−Ｌｙｓ− ５ｅｒ−八１ａ−Ｌａｕ−Ａｌａ−５ａｒ−Ｌｙｓ−５ｅｒ−ＯＨＯＨ−５＠ｒ −Ｌｙｓ−５ａｒ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−５ｅｒ−Ｌｙｓ−５ｅｒ−へ１ａ −Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｈ自己相補性オリゴヌクレオチド：　３’　ＣＴＣＧＡＧＣ ＴＣＧＡＧ　５゜５’ＧＡＧＣＴＣＧＡＧＣＴＣ３’ このように、最後の寞験において、ペプチドのない場合は融解温度は３２℃にす ぎないが、ペプチドを有する場合は融解温度が４８℃に向上し、強いハイブリッ ド形成を示唆している。

、−、−、−，１，−−−１ｈ−＋１．、−１＝−ｌ１ａｆｉｃ〒／ｒ＋＞ｑｎ ／ｎｌｌ１６８−一一一一〜−一−１４，Ｍ〒／ｌ’ｏＱｎ／ｎｎ１Ｇ。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）αまたはβ型構造をもつ、修飾されたあるいはされない第１のＤＮＡまた はＲＮＡポリヌクレオチド配列と、この第１のＤＮＡまたはＲＮＡ配列に相補性 てある第２の標的配列とのハイブリッド形成を安定化する方法であうて、ペプチ ドが、前記第１および第２のヌクレオチド配列により形成されたハイブリッドの 二重らせんと複合体を形成し、該二重らせんの主溝中にヘアピン構造をとること を特徴とするとする方法。 （２）ペプチドが第１の配列に共有結合で固定されている、請求項１記載の方法 。 （３）ペプチドのアミノ酸鎖が以下を含むことを特徴とする請求項１または２記 載の方法。 −必要ならペプチドの第１のヌクレオチドヘの固定部位から、第１の配列のヌク レオチド塩基列とそれぞれ１対１の相互作用を示す第１のアミノ酸列、および− 第２の配列のヌクレオチド塩基列とそれぞれ１対１の相互作用を示す、第１のア ミノ酸列と同数のアミノ酸からなる第２のアミノ酸列。 但し、第１および第２のアミノ酸列がヒンジ配列によって結合され、このヒンジ 配列は具体的には第１および第２配列の塩基と相互に作用しない１または複数の アミノ酸から構成され、 従って、第１のアミノ酸列が、第２のアミノ酸列と協同的に相互作用し、ペプチ ドと、第１および第２配列のハイブリッド複合体により形成された二重鎖らせん との間に生じる協同的相互作用により、ペプチドが二重らせんの主溝に入り込み 、ヒンジ領域により第１および第２のヌクレオチド配列の間にヘアピン構造をと る。 （４）ペプチドのアミノ酸鎖が以下を含むことを特徴とする請求項１または２記 載の方法。 −第１配列のヌクレオチド塩基列とそれぞれ１対１の相互作用を示す第１のアミ ノ酸列、 −第２配列のヌクレオチド塩基列とそれぞれ１対１の相互作用を示す第２のアミ ノ酸列、および −第１配列のヌクレオチド塩基列とそれぞれ１対１の相互作用を示す第３のアミ ノ酸列。 但し、一方で第１と第２のアミノ酸列が、および他方で第２と第３のアミノ酸列 が、それぞれ同じまたは異なったヒンジ配列て結合し、この配列は具体的には前 記第１および第２の配列の塩基と相互作用をしない１または複数のアミノ酸から 構成され、 塩基により前記第２のアミノ酸列と相互作用するヌクレオチド配列が、塩基によ り前記１および第３のアミノ酸列と相互作用するヌクレオチド配列に相補性の配 列を構成し、 従って、第１および第３のアミノ酸列が、第２のアミノ酸列と協同的に相互作用 し、 ペプチドと、第１および第２配列のハイブリッド複合体により形成される二重鎖 らせんとの間に生じる協同的相互作用により、ペプチドが二重らせんの主溝に入 り込み、ヒンジ領域により第１および第２のヌクレオチド配列の間に二重のヘア ピン構造をとる。 （５）第１配列のヌクレオチドがアデニン、グアニン，チミン，シトシン、ウラ シル、イノシン、２，６−ジアミノプリン、６−アミノ−８−ブロモブリン、５ −ブロモウラシル、５−ヨードウラシルから選ばれた塩基を含む請求項１〜４の いずれかに記載の方法。 （６）第１または第２配列のうちの１つの塩基がチミンである場合、対応するア ミノ酸が疎水性アミノ酸である、請求項３〜５のいずれかに記載の方法。 （７）アミノ酸がＬ−フェニルアラニン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ −バリン、Ｌ−アラニン、Ｌ−メチオニン、好ましくはＬ−ロイシン、Ｌ−イソ ロイシン、Ｌ−バリンから選ばれる、請求項６記載の方法。 （８）塩基がウラシルの場合、アミノ酸が両親媒性または酸性アミノ酸である請 求項３〜７のいずれかに記載の方法。 （９）アミノ酸がＬ−アラニン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ− セリン、Ｌ−システイン、Ｌ−トレオニン、好ましくはＬ−アラニン、Ｌ−セリ ン、Ｌ−トレオニンから選ばれる請求項８記載の方法。 Ｌ（１０）塩基がシトシンの場合、アミノ酸が両親媒性アミノ酸から選ばれる請 求項３〜９のいずれかに記載の方法。 （ｌ１）アミノ酸がＬ−アラニン、Ｌ−セリン、Ｌ−システイン、１．トレオニ ン、Ｌ−チロシン、Ｌ−ヒスチジンから、好ましくはＬ−アラニン、Ｌ−セリン 、Ｌ−トレオニンから選ばれる請求項１０記載の方法。 （１２）塩基がアデニンまたはグアニンであり、対応するアミノ酸が親水性アミ ノ酸から選ばれる請求項３〜１１のいずれかに記載の方法。 （１３）アミノ酸がＬ−チロシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−グ ル外ミン、Ｌ−リシン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン 酸、Ｌ−セリン、グリシン、Ｌ−トレオニンから選ばれる請求項１２記載の方法 。 （１４）塩基がアデニンの場合、対応するアミノ酸が高荷電性で非常に親水性の 強いアミノ酸の中から、特にＬ−アスパラギン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−リシンお よびＬ−アルギニンから過ばれ、塩基がグアニンの場合、対応するアミノ酸が小 さく、親水性のアミノ酸、好ましくはＬ−セリン、Ｌ−システイン、Ｌ−アルギ ニンおよびＬ−リシンの中から選ばれることを特徴とする、請求項３〜１３のい ずれかに記載の方法。 （１５）ペプチドが以下に示す配列が生じないようなアミノ酸鎖からなることを 特徴とする請求３〜１３のいずれかに記載の方法。 ＡＡｘ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−ＡＡｚ　ＡＡｘ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ−ＡＡｚ　ＡＡｘ− Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−ＡＡｚＡＡｘ−Ｃｙｓ−Ｇｌｎ−ＡＡｚ　ＡＡｘ−Ａｓｐ−Ｃ ｙｓ−ＡＡｚ　ＡＡｘ−Ａｓｎ−Ｃｙｓ−ＡＡｚＡＡｘ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ−ＡＡ ｚ　ＡＡｘ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ−ＡＡｚＡＡｘ−Ｔｒｐ−Ａｓｐ−ＡＡｚ　ＡＡｘ −Ｔｒｐ−Ｇｌｎ−ＡＡｚＡＡｘ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−ＡＡｚ　ＡＡｘ−Ｃｌｕ− Ｔｒｐ−ＡＡｚＡＡｘ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−ＡＡｚ　ＡＡｘ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ａ ＡｚＡＡｘ−Ｇ１ｙ−Ａｓｐ−ＡＡｚ　ＡＡｘ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−ＡＡｚＡＡｘ −Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−ＡＡｚ　ＡＡｘ−Ｇｈ−Ｇｌｙ−ＡＡｚＡＡｘ−Ｇｌｙ−Ｇ ｌｎ−ＡＡｚ　ＡＡｘ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−ＡＡｚＡＡｘ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−ＡＡ ｚ　ＡＡｘ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−ＡＡｚＡＡｘ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−ＡＡｚ　ＡＡｘ −Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−ＡＡｚＡＡｘ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−ＡＡｚ　ＡＡｘ−Ａｓｐ− Ｓｅｒ−ＡＡｚＡＡｘ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−ＡＡｚ　ＡＡｘ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ａ ＡｚＡＡｘおよびＡＡｚは慣用の記載方法、（ＮＨｚ）−ＡＡｘ……ＡＡｚ（− ＣＯＯＨ）により、上流および下流のアミノ酸を表す。 （１６）ヒンジアミノ酸がグリシン、Ｌ−アスパラギンおよびＬ−グルタミンか ら選ばれることを特徴とする請求項３〜１５のいずれかに記載の方法。 （１７）αまたはβ型構造をもち、修飾されたまたはされないＤＮＡまたはＲＮ Ａポリヌクレオチド配列と、相補性ＤＮＡまたはＲＮＡ配列を有するポリヌクレ オチド配列により形成されるハイブリノドの二重らせんの主溝中に、ペプチドが ヘアピンまたは二重ヘアピン構造をとるようにアミノ酸が選民されたペプチドと からなる結合体。 （１８）ペプチドを構成するアミノ酸が、請求項３〜１５に示した対応性の原則 を考慮して、ポリヌクレオチド配列を構成するヌクレオチドの性質に関連して選 ばれ、ポリヌクレオチド配列が第１のＤＮＡまたはＲＮＡ配列に相当し、ペプチ ドがこのポリヌクレオチドに共有結合して、あるいはしていない請求項１７記載 の結合体。 （１９）下記−般式Ｉに相当することを特徴とする、請求項２、３および５〜１ ５のいずれかに記載の方法において有用なペプチドーポリヌクレオチド結合体。 ▲数式、化学式、表等があります▼（Ｉ）式中、−般に１００＞ｐ≧Ｉ １００＞ｎ≧０ ４００＞ｍ≧３ ＡＡ１……ＡＡｍはペプチドのアミノ酸を表し、Ｎｉ……Ｎｐｉｎはポリヌクレ オチドのｎ＋ｐ個のヌクレオチドを表し、アミノ酸ＡＡ１……ＡＡｍは請求項２ および４〜１５に従って選ばれる。 （２０）下記−般式ＩＩに相当することを特徴とする、請求項３および４〜１６ のいずれかに記載の方法において有用なペプチドーポリヌクレオチド結合体。 ▲数式、化学式、表等があります▼ 式中、ＡＡ１……ＡＡｍはペプチドのアミノ酸を表し、Ｎｉ……Ｎｐｉｎはｎ＋ ｐ個のヌクレオチドの第１配列を表す。 １００＞ｐ≧１ １００＞ｎ≧１ ４００＞ｍ≧３ アミノ酸ＡＡ１……ＡＡｍは請求項２および３〜９に従って選ばれる。 （２１）一般式ＩＩＩに相当することを特徴とする請求項１９記載の結合体。 ▲数式、化学式、表等があります▼（ＩＩＩ）式中、ｍは３〜１００の整数、 Ｒは修飾されていてもよい天然のアミノ酸鎖、および修飾されていてもよい非天 然のアミノ酸鎖から選ばれ、 ＺはＯＨ基、ポリヌクレオチド、保護用分子、および分子標識、例えば具体的に はにはジニトロフェノール、ビオチン、フルオレセインから選ばれ、Ｘは、Ｈ、 ポリヌクレオチド、保護用分子、またはマーカー分子標識、例えば具体的にはジ ニトロフェノール、ビオチン、フルオレセインから選ばれ、ＹはＲがリシン、ア スパラギン酸またはグルタミン酸の鎖である場合にのみ存在し、その場合はポリ ヌクレオチド、保護用分子、または分子標識、特にジニトロブユソール、ビオチ ン、フルオレセインを表し、これら要素は、ＲのＮＨ２またはＣＯＯＨ基に固定 され、Ｘ、ＹおよびＺの中の１つのみが前記第１の配列に相当するポリヌクレオ チドである。 （２２）ペプチドとポリヌクレオチド間の結合がペプチドのリシンとポリヌクレ オチドのメチルシトシンまたはシトシン間にあり、リシン鎖の末端にあるＮＨ２ はそれぞれメチルシトシンまたはシトシンの４位の炭素に結合していることを特 徴とする、請求項１９〜２１のいずれかに記載の結合体。 （２３）出発ポリヌクレオチドの４位のトリアゾール化ウラシルまたはチミンの トリアゾール基を、リシン鎖の末端にあるＮＨ２を介してペプチドにより置換す ることにより、ペプチドをポリヌクレオチドに結合させることを特徴とする請求 項２２に記載の結合体の製造方法。 （２４）請求項１９〜２２のいずれかに記載の結合体からなることを特徴とする 、生物のＤＮＡ中の構造または制御遺伝子の阻止あるいは阻止の解除に有用な化 合物。 （２５）請求項１９〜２２のいずれかに記載の結合体からなることを特徴とする 、メッセンジャ−ＲＮＡの翻訳またはスプライシングを阻害または阻害の解除に 有用な化合物。 （２６）医薬用の、請求項１９〜２２のいずれかに記載の結合体。 （２７）分子標識に結合した、請求項１９〜２２のいずれかに記載の結合体から なることを特徴とする診断用プローブ。