JPH04506449A

JPH04506449A - ドーパミンリセプター及び遺伝子

Info

Publication number: JPH04506449A
Application number: JP2501298A
Authority: JP
Inventors: シベリ，オリビアー; ブンゾウ，ジェームス　アール; グランディ，デービッド　ケイ; マチダ，カーチス　エイ
Original assignee: オレゴン州
Priority date: 1988-11-18
Filing date: 1989-11-20
Publication date: 1992-11-12
Anticipated expiration: 2015-03-13
Also published as: JP3430332B2; ES2104599T3; ATE154636T1; EP0447483B1; JP3018045B2; EP0447483A4; JP4122403B2; DE68928137D1; DE68928137T2; JP2000083690A; EP0447483A1; WO1990005780A1; JPH11285400A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

１９、多細胞生物からの請求項１６の細胞。２０、哺乳類細胞である請求項１９の細胞。２１、請求項１６の細胞を培養することを含むドパミンレセプターの生物学的活性を有するポリペプチドの製造法。２２、請求項１日の細胞を培養することを含むドパミンレセプターの生物学的活性を有するポリペプチドの製造法。２３、神経伝達レセプターをコードする配列とハイブリダイズする配列の存在について核酸サンプルをプローブする方法であって、前記サンプルをハムスターβ ｚＡＲの１．３ｋｂ　ＨｉｎｄｎＩフラグメントとハイブリダイズするか、または前記フラグメントとハイブリクイズするプローブとハイブリクイズすることを含む前記方法。２４、　哺乳’ｌｌＤ＊　ドパミンレセプターである請求項２９の実質上純粋２５７１’ｌ；（７）ＤＮ”Ａ配列またはそれとハイブリダイズする配列によってコードされた請求項２４のレセプター。２６、前記哺乳類はヒトである請求項２４のレセプター。２７、請求項２４のドパミンレセプターから少なくとも１個のアミノ酸が置換、挿入または除去されている実質上純粋な哺乳類ドパミンＤ２レセプター。２日、ドパミンレセプターの生物学的活性を有するミュータントである請求項２７のドパミンレセプター。２９、　ｇｉｌｔ乳類Ｄ２　ドパミンレセプターの生物学的活性を有する実質上純粋なポリペプチド。３０、ヒトドパミンレセプターのフラグメントである請求項２９のポリペプチド。３１、哺乳類Ｄ２　ドパミンレセプターの抗原決定基を規定するアミノ酸配列を有する前記レセプターのフラグメント。３２、前記レセプターの３番目細胞質ループから選ばれた請求項３１のフラグメント。３３、　Ｉｉ乳類Ｄ２　ドパミンレセプターを結合し得る抗体。３４、請求項３３のモノクローナル抗体。３５、ドパミンレセプターを結合し得るフラグメントである請求項３３の抗体のフラグメント。３６、Ｆａｂフラグメントである請求項３５の抗体フラグメント。３７、前記哺乳類はヒトである請求項３３の抗体。３８、標識されている請求項３３のフラグメント。３９、哺乳＊　Ｄ２　ドパミンレセプターの生物学的活性を存するポリペプチドまたはその生物学的に活性なフラグメントもしくは変種、その抗体もしくは抗体フラグメント、または請求項１の核酸配列と、薬剤学的に許容し得る担体とを含む組成物。４０、前記哺乳類はヒトである請求項３９の組成物。４１、　ｌＩ＊乳類Ｄ２ドパミンレセプターの生物学的活性を存するポリペプチドを特徴とする請求項１の単離したＤＮＡ配列をある座に配置するかまたは該座において発現させるか、またはそのようなポリペプチドを実質上純粋な形において該座に配置することを含む、ある座において哺乳！Ｉ　Ｄ　ｚ　ドパミンレセプター活性を増加させる方法。４２、哺乳類Ｄ２　ドパミンレセプターに対する条件または物質の効果を決定する方法であって、そのようなドパミンレセプターを前記条件または物質へ曝露することよりなり、その際前記ドパミンレセプターとして請求項２９のポリペプチドを使用することを含む改良。４３、＠乳類Ｄ２　ドパミンレセプターに対する親和性について、または哺乳１ｆＤ、ドパミンレセプターへ結合するりガントによってトリガされるレスポンスを修正もしくは開始するその能力について化合物をスクリーニングすることを含む請求項４２の方法。４４、アミノ酸番号２−１３，１８２−１９２，２６４−２７７．２８７−２９８または４０４−４１４を含む、第１図の部分的配列を結合する請求項３３の抗体。４５、請求項５３の核酸配列がある座においてそのクロモソーム中に集積され、それにより該配列は哺乳ＩＩ　ｏ　ｚ　ドパミンレセプター遺伝子として活性である遺伝子組換非ヒト哺乳類。４６、サンプルの少なくとも一成分をドパミンレセプターに独自に関連した核酸もしくはアミノ酸配列へ曝露することを含む、サンプルのドパミンレセプター関連性質を決定する方法。４７、前記サンプルはヒトからのものであり、そしてドパミンレセプターに関連した病的状態が診断または特徴化される請求項４６の方法。４８、前記病気は分裂症である請求項４７の方法。４９、請求項１６の細胞内の発現によって調製された、哺乳類Ｄ２　ドパミンレセプターの生物学的活性を有するポリペプチド。５０、請求項１７の細胞内の発現によって調製された、哺乳類Ｄ２　ドパミンレセプターの生物学的活性を存するポリペプチド。５１、請求項５のＤＮＡを含むベクターで形質転換された細胞内の発現によって調製された、哺乳類Ｄ２　ドパミンレセプターの生物学的活性を有するポリペプチド。５２、請求項５４の組成物を投与することを含む、哺乳１！　Ｄ　ｚ　ドパミンレセプター活性を変調する方法。５３、実質上純粋な形の哺乳ＮＤ２　ドパミンレセプター遺伝子またはその生物学的に活性なフラグメント。５４、哺乳１［Ｄ、ドパミンレセプターの生物学的活性を有するポリペプチドまたはその生物学的に活性なフラグメントもしくは変種、または請求項５３の核酸配列と、薬剤学的に許容し得る担体を含んでいる組成物。明細書 ′−パミン１セ　−　− １里坐皇ｌ　−・本発明は哺乳類からのドーバミンリセブター及びそれに対応する遺伝子に関する。特に、本発明はＤ！ドーパミンリセプター遺伝子の単離、配列及び／又はクローニング、変換細胞によるＤ２　ドーパミンリセプターの合成及びドーパミンリセプターをコードするＤＮＡの同定及びクローニングにより可能となる新規の産物の製造及び使用に関する。ドーパミンリセブターは一般に非常に多くの神経学的及び他の異常−例えば運動異常、精神分裂、薬物依存、パーキンソン氏病、トウレット症候群、晩発性運動障害及びその他多く−に関与している、その結果、、ドーパミンリセプターは多くの薬理学的及び生化学的研究の対象となってきた。一般に、ドーパミンリセブターは、薬理学的及び生化学的特徴に基づいてり、及びＤｔのサブタイプに分類される（１．２）、Ｄｚドーパミンリセプターは病理生理学及び上記の異常に関連づけられてきた。加えて、Ｄ、ドーパミンリセプターは第２のメツセンジャー系を調節するためにグアニジンヌクレオチド結合蛋白質と相互作用することが知られている（６．７）。ドーパミンリセプター及びその遺伝子の存在及び性質の解明について力点がおかれていたにも拘わらず、同定、単離、およびクローニングはこれまでなしえなかった。Ｇリセブターと結合する類縁のりセプターが、−次アミノ酸配列においてがなりの類似性を示し７個の推定上の膜横断領域（８）よりなると予測される構造形態を呈するということが知られているにもかかわらずそうであった。セロトニンリセプターに関しては、例えば、Ｊｕｌｆｕｓ　ｅｔ　ａｌ、、５ｃｉｅｎｃｅ、２４１　：５５８　（１９８８）を参照のこと。主！夏監！本発明は成功裏に人類を含む哺乳類のＤＩ　ドーバミンリセプター遺伝子配列を同定し、単離し、クローン化しコード化されたドーパミンリセプターを製造した。対応するポリペプチドが合成された。遺伝子とポリペプチド双方の配列が決定された０本発明はまた、多（の新規で有用な核酸、細胞ライン、ベクター、及びポリペプチド及びとりわけ医薬品、並びにそれらを使用する方法を提供する。このように、本発明はＤＮＡ配列−その同定された部分は構造遺伝子であり哺乳ＩＤ、ドーパミンリセブターの生物学的活性を有するポリペプチドをコードしている−の単層に関する。特にそれは、哺乳Ｉ　ＤＩ　ドーパミンリセブターをコードするＤＮＡ配列にハイブリッドされる単離されたＤＮＡ配列に関する。それはまた、特に哺乳類のドーパミンリセプターの生物学的活性を有するポリペプチド、特に哺乳ｌ！Ｄ！　ドーパミンリセプター、をもコードするそのような配列のフラグメント、変種及び突然変異体に関する。好ましくは、ヒトのドーパミンリセブターである。他に好ましくは、その配列は図１に示したようにラットのＤ８　ドーパミンリセプターである。無給、本発明の核酸はまた、前記の相補的ストランド、並びにコドンの変性による異なった配列及び前記の配列とハイブリッドした配列をも含むものである。他に好ましくは、本発明は好ましくは放射性又はビオチン標識等の検出し得る部分で標識した、オリゴヌクレオチドのプローブとして有用な核酸配列及びフラグメントを含む。例えば、そのようなプローブは、Ｄつ　ドーパミンリセプターの生物学的活性を存するポリペプチドをコードするＤＮＡと又はそれに関連した例えば、Ｄｚ　ドーバミンリセブター遺伝子若しくはそのイントロンの制御を提供するＤＮＡ等のＤＮＡとハイブリッドさせることができる。本発明のＤＮＡはまたベクターの部分であることもできる。本発明はまた、本発明のベクターで形質転換される細胞及びこれらの細胞をポリペプチド−例えばＤ２　ドーバミンリセブターの生物学的活性を有するもの−を製造するために培養する方法をも含む。好ましくは、該細胞はそのような方法に用いる場合には哺乳類起源のものである。本発明はまた、前記の核酸配列によりコードされるポリペプチド、特に単離された哺乳類のドーパミンリセプターー好ましくはヒト起源のもの−に関する０本発明は更に、かかるリセブターの突然変異体又は変種、好ましくはりセプターから１又はより多くのアミノ酸が置換され、挿入され及び／又は除去されたもの、特にドーバミンリセプターの生物学的活性を保持している突然変異体にも関する、本発明はまた、抗体であって、好ましくは標識され、そして最も好ましくはモノクロ□−ナルであり、ドーパミンリセプターー好ましくはヒトのものである−のアミノ酸配列に結合することができるもの又はかかる抗体のフラグメントにも関する。本発明は、上記の種々の産物の−、及び、典型的には、薬剤学的に許容し傅る担体を含んでなる組成物に関し、並びに広範囲の効用のある結果を達成するためにこれらの産物を使用する方法にも関する。厘　ｏ−咀本発明の種々の他の目的、態様及び付随する利点は、添付の図面と連結して考慮され一層よ（理解されるときに一層完全に認識されるであろう０図において、図１は、ＲＧ　Ｂ　ｔ　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａのための核酸配列及びそれから導かれるラットのＤＩ　ドーパミンリセプターのアミノ酸配列を示す、該核酸配列は、長い開環読み取りフレームの第１のメチオニンに始まる番号を付与されている。ヌクレオチド番号は、各行の右手末端におけるヌクレオチド配列の下に現れている。導かれるアミノ酸配列はヌクレオチド配列の上に示されている。二重下線は、５゛非翻訳＊ＩＪｉ！における小さい開環読み取りフレームを表す、仮定されるＮ−結合グリコシル化部位は、アスタリスクにより示されている。推定されるプロティンキナーゼＡリン酸化部位にはその上に線を引いである、イントロンの繋ぎ接合は矢印で示されている。ポリＡアデニル化部位は下線が施されている。図２は、ラットＤ２　ドーパミンリセブター、ハムスターβ２−アドレナリンリセブター、ヒトα８−アドレナリンリセプター、ヒトＣ，−２１（セロトニンｌａ）リセプター、ブタの五支カリンＭリセブター及び牛のサブスタンスにリセブターのアミノ酸配列の並びを示す、実線で囲み陰を付けたアミノ酸は、ＤＩ　ドーパミンリセブタ−と比較したとき少なくとも２つの他の配列において同一である残基を示している。推定される膜横断ドメインはメインはローマ数字で標識した括弧で示されている。変化しうる第３の細胞質ループ内の及びＣ末端における残基の数は括弧に入れである。図３は、ラットの脳及び下垂体におけるＲＧＢ−２）ランスクリプトのＮｏｔｈｅｒｎプロット分析を示す、各レーンは２０膜ｇの全ＲＮＡｆ含ｆする。　右（７）ｆｉ字！、ｔ、ＲＮＡサイＸ［ｊｉ　（ＢＲＬ）　で測定した分子量を示す、Ａ：真球、Ｂ：海馬、Ｃ：小脳、Ｄ二ロ部皮質、Ｅ：前部皮質、Ｆ：視床、Ｇ：視床下部、Ｈ：Ｗｉ’ｌ、Ｉ：扁桃体、Ｊ：中脳、Ｋ：中隔、Ｌ：後部基底神経節、Ｍ：前部基底神経節、Ｎ：下垂体神経性中葉、０：下垂体前葉図４は、Ｌ −ＲＧＢ２Ｚｅｍ−１細胞からの膜に対する３Ｈ−スピペロンの結合を示す。ａ）ｌ　：　Ｌ−ＲＧＢ２Ｚｅｍ−１細胞及びラット線条体から調製された膜に対する３Ｈ−スピペロンの特異的結合を飽和等層線。４つの独立した実験からの結果を示す。２：データのスカッチャード分析。ｂ）Ｌ−ＲＧＢ２Ｚｅｍ−１膜を用いた競合曲線、Ｌ−ＲＧＢ２Ｚｅｍ−１細胞からの膜における３Ｈ−スピペロンの特異的結合の薬物による阻害をめるための代表的な曲線を示す。各薬物は３回試験した。ｃ）Ｌ−ＲＧＢ２Ｚｅｍ−１及びラット線条体に対するＫｉの表、結果は、種々の濃度の非標識薬物で０．５ＨＭの３Ｈ−スビペロンを阻害した３つの実験の幾何平均である。いくつかの薬物にあっては、ラット線条体組織における阻害曲線は、２つのクラスの結合部位の存在を想定することによって最もよく当てはまった。阻害剤に対する高い又は低い親和性を有する結合部位の比率は括弧に示した。ｌＯ乃至２５％の特異的結合を示す結合部位クラスについてのＫｉ値は、放射性リガンドがＫｄ値１ｎＭでセロトニンリセブターに結合しているという仮定のもとに算定した。図５は、（ａ）図１に示したアミノ酸配列び疎水性プロット、及び（ｂ）β２− アドレナリンリセブターのアミノ酸配列の疎水性プロットを示す、膜横断領域はローマ数字で印を付しである。図６は、図１に示した核酸配列の２４７７塩基ＥｃｏＲ１フラグメントの計算された制限地図である。図６は、ヒトＤ２　ドーパミンリセプターの部分的配列を示し、示された中央のアミノ酸配列は正しいものである。図８は、ＬＺＲＩ及びＬＺＲ２細胞に対する特異的な〔１Ｈ〕スビペロン結合の飽和分析を示す、結果は、示しであるように、対照成長培養液または硫酸亜鉛を加えた培養液においてＬＺＲＩ及びＬＺＲ２細胞を成長させた代表的な実験からのものである。データは、特異的に結合した放射性リガンドを遊離の放射性リガンドの補正した濃度で割った値を、特異的に結合した放射性リガンドに対してプロットしたものである。亜鉛処理のためには、成長培養液に１゜ＯμＭの硫酸亜鉛を１６時間加えた。対照細胞と亜鉛処理細胞の双方を、次いで洗浄しそして集める前に対照培養液で１日間成長させた。示した実験においては、対照のＬＺＲＩ細胞又は亜鉛で処理しは、それぞれ８７６及び９１４　ｆｍｏ　１膜ｍｇ蛋白質であった。対照の又は亜鉛処理したＬＲＺ２細胞のＢｍａ　ｘ値は、それぞれ３８５及び５９３膜ｍｏｌ／ｍｇ蛋白質であった。図９は、アゴニストによる放射性リガンドの結合の阻害を示す。結果は、競合薬物の不存在下での特異的結合のパーセントとして表した特異的結合を、競合薬物の濃度の対数に対してプロットしたものである。膜は、次に記述するようにしてＬＲＺＩ細胞から調製した。Ａ、アゴニストによる〔３Ｈ〕スビペロンの結合の阻害をめるために一回の実験からの曲線が示されている。各薬物は２回試験した。この実験においては、遊離の〔３Ｈ〕スピロペリド一ル濃度は２３０膜Ｍ、（”Ｈ）スピロペリドールのＫｎ値は６０膜Ｍであった。この実験においては、Ｋ、値及びＨｉｌｌ係数は、ブロモクリプチンについてはそれぞれ５ＨＭ及び１．０５、（−）３−ＰＰＰについては７９０ｍＭ及び０．８９、キンピロールについては８膜Ｍ及び１．　Ｏ，（±）３−ＰＰＰに対しては３１ｔｔＭ及び１．　０５、ＬＹ１８１９９０に対しては０．３ｍＭ及び０．７２であったＢ、　（”Ｈ）スピロペリドールの結合ＯＤＡによる阻害に対するＧＴＰ及びＮａＣ１の効果を測定した４つの独立した実験のうち１つの結果を示す、ＭＨ）スピロペリドールの濃度は３２３から４９８１）Ｍであった。この実験においては、放射性リガンドの濃度は３２３膜Ｍであった。白丸は０．１ｍＭのＧＴＰ及び１２０ｍＭのＮａＣ１の存在下でＯＤＡによる阻害を表し、黒丸は（１，ＴＰ及びＮａＣ１の添加なしの場合の阻害を表す、この実験でのＩＣ，。値及びＨｉｌｌ係数は、ＧＴＰ及びＮａＣ１の不存在下ではそれぞれ２９膜Ｍ及び０．６５、存在下ではそれぞれ１１５膜Ｍ及び１．０３であった。図１０は、ＬＺＲＩＩＩＩ胞におけるアデニレートサイクラーゼ活性の阻害を示す。アゴニストが、ＬＺＲＩ細胞から調製した膜におけるアデニレートサイクラーゼ活性の阻害をめるために試験された。各定置において５０乃至１１００ｕの蛋白質が使用された。結果を、１０膜Ｍのフォルスコリン存在下での全活性に対するパーセントとして表し、（”Ｐ）ｃＡＭＰ／ｍｇ蛋白質／分として示す、少なくとも各３回試験された６種の薬物について代表的な容量−作用曲線を示す、データは、酵素活性を薬物濃度の対数に対してプロットしたものである。阻害が何らみられないから、（−）３−ＰＰＰのデータについては曲線をプロットしていない。この図に示した実験においては、基準の及びフォルスコリンにより刺激された活性は、それぞれ約、０．８乃至１．　５及び８．５乃至１５．８膜ｍｏｌ／ｍｇ蛋白質／分であった。図１１は、ＤＡ感受性アデニレートサイクラーゼの阻害を示す。結果は３つの実験の平均上ＳＥであり、１０膜Ｍのフォルスコリン存在下における全活性のパーセントとしてプロットしである。フォルスコリン（ＦＳＫ）は、示されているように、１０膜Ｍのドーパミン（ＤＡ）又はＤＡ及びｌＯμＭの（ ÷）−ブタクラモール（ＢＵＴ）と共に、示した全ての実験において存在している。細胞のいくつかは、酵素活性の測定のために集める前に、百日咳トキシン（ＰＴ）で処理した。対照の基準活性及びＰＴ−処理細胞の活性は、それぞれ１．２±０．０７及び１゜６±０．１５膜ｍｏｌ／ｍｇ蛋白質／分であった。対照細胞における全フォルスコリン刺激活性（ＦＳＸ）は１１．９±１．０膜ｍｏｌ／ｍｇ蛋白質／分であった。対平均に対してしたｔ−検定によると、対照細胞におけるＦＳＫとの比較は（＊）ｐ＜０．０５゜図１２は、百日咳トキシン処理によるドーパミン阻害の逆転を示す。膜アデニレートサイクラーゼ活性について下に掲げたデータは、平均（ｘ）と標準誤差（Ｓ、Ｅ、　）及び％阻害（％Ｉｎｈ、）を示す。％阻害は方程式　ＬＯＯＸ　（１ −（Ｓ−Ｂ／ｒ＝Ｂｌ’、）　〕がら算出した。ここにおいて、Ｂ、Ｓ及び■はそれぞれ、基準活性、刺激剤（Ｓ）又は阻害剤（Ｉ）の存在下での活性を示し、Ｂ＋　は阻害剤の存在下での基準活性を示す。結果は、対照と、百日咳トキシン（＋Ｐ、　Ｔ、として示した）で前処理（１６時間、５０Ｈｇ／ｍ１）した細胞における、平行測定から得られた。（Ａ）　アデニレートサイクラーゼ。　アデニレートサイクラーゼ測定用の膜は短時間１０μＭのフォルスコリン（ＦＳＫ）又は１００μＭのドーパミン（ＤＡ）に曝し、アデニレートサイクラーゼ活性は、ｐｍｏｌ／ｍｇ蛋白質／分で表現した。（旦）　細胞内ｃＡＭＰ、　細胞を短時間■■Ｐ　（２００ｎＭ）及びドーパミン（１μＭ）で処理し、ｃＡＭＰ蓄積量（ｐｍｏｌ／シャーレとして表現）を細胞抽出液にて測定した。（旦）　細胞外ｃＡＭＰ、同じ細胞のシャーレからの培養液サンプルよりｃ　Ａ　Ｍ　Ｐを測定しｐｍｏ　１／シヤーレで表した。図１３は、特異的ドーパミンＤよりセプタ−ｍＲＮＡの表現及びＱ　Ｈａ　Ｚ　Ｒフ転換細胞における結合を示す。（Ａ）　ＧＨ，Ｃ，細胞の全ＲＮＡ　（２０５ｇ／レーン）のＮ。ｔｈｅｒｎプロット分析。　Ｙ軸はＲＮＡ分子量標準（ｋｂ）の移動を示す。（Ｂ　）　（１’　）　Ｇ　Ｈ４Ｚ”Ｒ１細゛胞より調製された膜への３Ｈ−スピペロンの特異的結合が、飽和分析により特徴づけられた（実（施例゛２「実験手順」を参照）。４つの独立した実験から得られたデータを、特異的に結合した放射性リガンド（縦座標）を補正した、遊離の放射性リガンド濃度（全量引く全結合量）に対してプロット・しである、この実験ににおける算出されたＫｎ及びＢｍａ　ｘ値は、６０ＨＭ及び１１６５ｆｍｏｌ／ｍｇ蛋白質であった。　・（Ｂ）（２）　特異的結合／遊離（Ｙ軸）を３Ｈ−スビベロンの特異的結合濃度（Ｙ軸）に対してプロットしたスキヤシチャード法によるデータの変換。（旦）ドーパミンによる特異的３Ｈ−スビペロン結合の変位二〇ＴＰ／ＮａＣ１の効果。ＧＨ，ＺＲ？細胞膜を、１００　μＭＧＴＰ／１２０ｍＭＮａＣ１の不存在下（○）又は存在下（・）にて、３Ｈ−スピペロン（０，４７ＨＭ）及び示した濃度のドーパミン（Ｙ軸）と共にインキュベートした。結果は４つの実験のうちの１つである。示した実験におけるドーパミンについて算出されたＩＣｓ。及びＨｉｌｌ係数値は、ＧＴＰ／ＮａＣ１の不存在下では１６ＨＭ及び０．６１、Ｃ；ＴＰ／ＮａＣ１の存在下では５６ＨＭ及び０．　８５であった。図１４は、ＧＨ，ＺＲ，細胞における、ドーパミンによるｃＡＭＰの蓄積阻害及びＰＲＬの放出を示す。インキュベーシツンは、実施例２の「実験手順」に記述したように、３つ行った。（Ａ）　ドーパミンによる細胞外ｃＡＭＰ蓄積の阻害。　ＧＨ，Ｃ１及びＧＨ，ＺＲ，ＩＩＩ胞の平行なシャーレを、種々の濃度のＶＩＰ、ドーパミン（Ｄ）並びに２５０ｎＭ、１０ＨＭ及び５ＨＭの（−）−スルピリド（−５）をそれぞれ加えてインキュベートした。無処理対照は「Ｃ」で表す。培養液は集められ、ｃＡＭＰを測定し、ｐｍｏｌ／シャーレ（ｆｉｔ座標）で表した。（Ｂ）ＧＨ４ＺＲｔ細胞におけるドーパミンによる細胞内ｃＡＭＰの蓄積阻害。　細胞抽出液につきｃＡＭＰを測定し、縦座標に表した。薬物濃度は、（Ａ）におけると同様に、（＋）−スルピリドを除いて５μＭであった。（Ｃ）ＧＨ，ＺＲ，細胞における刺激されたＰＲＬ放出のドーパミンによる阻害。　示した処理の後、培養液サンプルにつきＰＲＬ（縦座標）を測定した。ＶＩＰ、Ｔ）ＩＲ、ドーパミン（Ｄ）及び（−）−スルピリド（−５）の濃度はそれぞれ２００ｎＭ、２００ｎＭ、１１００ｎ及び２ＨＭであった。図１５は、ＧＨ，ＺＲ？細胞における基準の及びＶＩＰ刺激ｃＡＭＰ蓄積のドーパミン阻害の容量−作用関係を示す。（八）示した各濃度のドーパミンの存在下における、細胞内（・）及び細胞外（０）蓄積。　ドーパミンの不存在下において、基準のｃＡＭＰレベルは２２±６ μｍｏｌ／シャーレ（細胞内）及び１２．４±０．６μｍｏｌ／シャーレ（細胞外）であった。ドーパミン作用のＥＣ３，は４．９ＨＭ（細胞内）及び８．５ＨＭ（細胞外）であった。（Ｂ）各濃度のドーパミンの存在下における、細胞内（・）及び細胞外（０）蓄積、ＶＩＰ　（２５０ｎＭ）−刺激での細胞内及び細胞外ｃＡＭＰレベル（ドーパミンの不存在下において）は、それぞれ１４５±２．８μｍｏ１／シャーレ及び１４６±２．８μｍｏｌ／シャーレ、であす基準ｃＡＭＰレヘルは、それぞれ３５±１．６μｍｏ　Ｉ／シャーレ及び１５±０．２μｍｏｌ／シャーレであった。ドーパミン阻害のＥＣ，。は５．５ＨＭ（細胞内）及び５．８ＨＭ（ｉｌｌ胞外）であった。図１６は、ＶＩＰ−刺激ｃＡＭＰ蓄積のドーパミンによる阻害の特異的阻止を示している。ＯＨ，ＺＲ，細胞を、２５０ｎＭのＶＩＰ及び１１００ｎのドーパミン、並びに示した濃度の種々のドーパミンアンタゴニストの存在下に、ＦＡＴ培養液（実施例２の「方法」参照）中でインキュベートし、細胞外ｃＡＭＰレベルを測定した。最大ｃＡＭＰレベルのパーセントを示した濃度のドーパミンアンタゴニストの対数に対してプロットしてデータとした。３つの定量の標準誤差は８％未満であった。基準の及びＶＩＰ−刺激ｃＡＭＰレベル（ドーパミン及びアンタゴニストの不存在下にて）は２５゜８±１．６μｍｏ１／シャーレ及び２１４ ±１４ｐｍｏｌ／シャーレであった。ドーパミン作用のアンタゴニストについてのＩＣｓ。及び推定Ｋｉ（ｄｉは：スビペ０７　０．５６ＨＭ及び３０ＨＭ；　（＋）−ブタクラモール　４．５ＨＭ及び０．　２　ｎＭ　；　（−）　−スフ１／ピリド　３８ＨＭ及び１．８ＨＭ；　５ＣＨ２３３９０＞１ＨＭ；（−）− ブタクラモール　＞１０ＨＭであった。推定に、値は方程式　ＫＩ　ＩＣｓ。／（１＋（値ＤＡ）／ＥＣ，。））で算出された。ここにおいて、（ＤＡ）は１１００ｎ及びドーパミンのＥＣ，。は６ＨＭである。スピペロン、（＋）−ブタクラモール及び（−）−スルピリドのみ、基準ｃＡＭＰレベルを変化させなかった。図１７は、ドーパミンアンタゴニストによるアデニレートサイクラーゼの阻害を示す。アデニレートサイクラーゼ活性の阻害は１０ＨＭのフォルスコリンの存在下で測定した。全活性のパーセントとして表した酵素活性の３つ測定の平均を薬物濃度の対数に対してプロットしてデータとした。基準アデニレートサイクラーゼ活性の平均は４．６±０．２ｐｍｏ１７ｍｇ蛋白質／分であり、全フォルスコリン刺激活性は６３．８±０．２ｐｍｏｌ／ｍｇ蛋白質／分であった。示した実験におけるＥＣ，。値及び最大阻害は、ドーパミンについてはそれぞれ７９ｎＭ及び５７％１．キンビロールについては２００ｎＭ及び４９％、ブロモクリプチンにおいては５ｎＭ及び２３％、そして（＋）−３−ＰＰＰにおいては６００μ Ｍ及び４０％であった。図１８は、ヒト下垂体ドーパミンＤ２リセプターｃＤＮＡの核酸配列を示す。導かれるアミノ酸配列は、該ヒトｃＤＮＡＯ上に示しである。下記はクローン化したラッ）ｃＤＮＡ（文献９、実施例３）の核酸及びアミノ酸の配列であり、これら二つのクローン間で相違している。番号１−Ｖｌｌの箱で囲んだ領域は、推定される膜横断領域を表す。三角はエキラン／イントロン繋ぎ接合を、ピリオドは１対の失われた塩基対を、アスタリスクは可能性のあるＮ−結合グリコシル化部位を示し、及び、プロティンキナ−ゼムリン酸の標的には下線を付しである。ポリアデニル化記号には二重下線を付しである。図１９は、Ｌ−ｈ　Ｐ　ｉ　ｔ　Ｄｚ　Ｚ　ｅｍＭへの〔３Ｈ〕　トムペリトンの結合の競合曲線を示す。該放射性リガンドは、１ｎＭの濃度で使用され、特異的結合はｌｕＭの（＋）ブタクラモールを用いて決定した。データは３つの実験のうち１つを示しである。図２０は、ヒトゲノムＤＮＡの５ｏｕｔｈｅｒｎプロツトを示す、エキソン７を含んでいるゲノムＢａｍＨＩ　１．６−ｋｂフラグメントは、λＨＤ２Ｇ１から調製されプローブとして使用される（特異的活性、２ｘｌＯ＠ｃｐｍ）、ＤＡＮは、ＢａｍＨＩ（レ−ｙ１）、Ｂｇｌｌｌ　（レーア２）、ＢａｍＨＩ／Ｂｇｌ　ＩＩ　（レーア３）及びＨｉｎｄＩＩＩ（レーン４）で消化した。図２１は、ヒトドーパミンＤ２リセプター遺伝子及び下垂体ｃＤＮＡの概念的表現である。（ａ）２つの重複するゲノム相、λｈＤ２ｃ１及びλｈＤ２Ｇ２；　Ａ、ＡｐａＬＩ；　Ｂ、ＢａｍＨＩ；　Ｂｇ、Ｂｇｌｌｌ；Ｈ，ＨｉｎｄｌＩｆの制限地図。（ｂ）ヒト遺伝子ローカスＤＲＤ２の図。　箱によって示されたエクソンに番号が付されている。実線の箱はコードしている配列を示し、開いた箱は翻訳されない配列を示す。ゲノムの配列決定の戦略が遺伝上にも拡張される。これらの領域は一定のスケールでは描かれていない。ＤＮＡ配列（＋はセンス配列を、−はアンチセンス配列を示す）は、各梯子を下から上へと矢印によって示された方向へと読まれる（右を指して、５″から３°へそして左を指して、３゛から５′へと）。８７−ｂＰエキソンは５番である。イントロンのサイズは５ｏｕｔｈｅｒｎブロツテイングと制限地図により決定され、一つの例外を除いて１０パーセント以内の正確さを有している：　すなわち、イントロン１は２０パ一セント以内の正確さである。（Ｃ）ヒト下垂体ｃＤＮＡの構造。　エキラン／イントロン繋ぎ接合が三角形により示されている。膜横断領域をコードしている領（ＴＡＧ）は、ポリアデニル化信号配列（ＡＡＴＡＡＡＡ）として示されている。図２２は、Ｌ−ｈＰｉｔＤ２Ｚｅｍ、Ｌ−ＲＧＢ２Ｚｅｍｌ及びラント線条体の１０．。値（ｎＭ）の比較を示している。図２３は、ヒトドーパミンＤ２リセブター遺伝子におけるエキラン／イントロン接合を示している。考察本発明は、Ｇ蛋白質に結合するりセブターをコードする遺伝子ファミリー各々間の核酸配列の類似性を独特な方法で利用したものである。ハイブリッド形成プローブとして独特なハム°スターβ２−アドレナリンリセブタ−（β！ＡＲ）遺伝子を使用することにより、ラットのＤ２ドーパミンリセブターをコードしているｃＤＮＡが同定され単離された。該リセプターは、３つの基準のもとに特徴づけられる＝　１）Ｇ蛋白質結合受容体のファミリーのメンバーであることが明らかである誘導アミノ酸配列、２）Ｄ２　ドーバミンリセブターに知られているのと平行した対応するｍＲＮＡの組織分布、及び、３）該ｃＤＮＡで形質転換されたＬｔｋ−細胞の薬理学的な性質。ラットのゲノムライブラリーは、ハムスターのβ、ＡＲ遺伝子のコード領域の大部分を含むｎ１ｃｋ＝翻訳１．３ｋｂ　ＨｉｎｄＩ２フラグメントによって緩和なハイブリッド化の条件下でスクリーンされた。ハムスターβｚＡＲリセブター遺伝子は、部分的なハムスター肺λｇｔ　１０ゲノムＤＮＡライブラリー（サイズ分画された（５−７ｋｂ）ＥｃｏＲＩ消化ＤＮＡ）から、Ｄｉｘｏｎ等（９）の配列から設計された２つのオリゴヌクレオチドプローブ（３０−ｍｅｒ、ＴＣＴＧＣＴＴＴＣＡＡＴＣＣＣＣＴＣＡＴＣＴＡＣＴＧＴｅＧＧ；　４０−ｍｅｒ、ＣＴＡＴＣＴＴＣＴＧＧＡＧＣＴＧＣＣＴＴＴＴＧＧ、ＣＣＡＣＣＴＧＧＡＡＧＡＣＣＣＴ）によってクローン化される。その遺伝子のコード配列の大部分を含むハムスターβ、ＡＲ遺伝子の１．３ｋｂ　Ｈｉｎｄｌｌｌフラグメントは、ｎ１ｃｋ翻訳によって標識され、市販のファージＥＭＢＬ３におけるラットゲノムＤＮＡライブラリーを探索するのに使用される。該ライブラリーは、コロニープラークスクリーンフィルター（ＮＥＮ）に移され、次のハイブリッド化条件下を用いて２２ｐ標識プローブでスクリーンされる：２５％ホルムアミド、５ＸＳＳＣ，５ＸＤｅｎｈａｒｄｔｓ、０．１％ピロリン酸ナトリウム、１％ＳＤＳ及びサケ精子ＤＮＡ　（１００ｔ１ｇ／ｍｌ）、３７℃。フィルターは２×ＳＣＣで及び０．１％ＳＤＳで５５°Ｃにて洗浄した。これらの条件を用いると数種のクローンがハムスタープローブにハイブリッド化することが見出された。ＲＧＢ−２と呼ばれる一つのクローンは、５ｏｕｔｈｅｒｎプロツト分析においてハムスターβ、ＡＲプローブとハイブリッドとなる０、８ｋｂ　ＥｃｏＥＩ　−Ｐｓｔｌフラグメントを有することが見出された。このフラグメントは配列決定され、ハムスターβ、ＡＲの膜横断領域Ｖｌｌの核酸配列に高度の同一性（４０塩基中３２）を有する核酸鎖を有することが示された。可能な読み取りフレームの一つは、ハムスターβ２ＡＲの膜横断領域ＶＩ及びＶＩＩのアミノ酸配列に有意な類似性を示した。このゲノムフラグメント内に、３′イントロン繋ぎ部位（１０）及び４００ｂｐの推定されるイントロン配列がある。０．８ｋｂ　ＥｃｏＲＩ−Ｐｓｔｌフラグメント（ｎｉｃｋｉ訳）が、５０％のホルムアミドを使用する以外は上記と同し／’Ｓイブリッド化条件で、λｇｔｌｏ中のラット脳ｃ　ＤＮＡライブラリーを探索するのに用いられた。フィルターの洗浄は０，２ｘＳＳＣ及び０．１％ＤＳＤにて６５°Ｃで行った。これらの高度に厳しいノ＼イブリッド化条件のもとで、サイズ約２．５ｋｂの２つの明らかなりローンが、５００，０００クローンのライブラリーの中から同定された、両方の鎖から、シーケネース（Ｕ、Ｓ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ　１）を用いたＳａｎｇｅｒジデオキシチェーン決定法により、ＤＮＡ配列が得られた（２６）。配列と制限分析とが、これら２つのクローンが単一のクローンのレプリカであり、プローブとして使用されたゲノムフラグメントの配列を含むものであることを示した。う・ノドの脳から単離されたｍＲＮＡのＮｏｒｔｈｅｒｎプロット分析においてＲＯＢ−２ｃＤＮＡが使用されたときには、約２．５ｋｂの帯が検出された。この発見は、ＲＧＢ−２クローンが殆ど完全な長さのものであることを示すものであった。図１は、ＲＧＢ−２ｃＤＮＡの２４４５塩基の核酸配列を示す。４１５アミノ酸蛋白質（相対的分子量（Ｍｒ＝４７０６４））のｃＤＮＡコードにおける最長の開いた読み取りフレームはまた、該図に示されている。この分子量は、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により決定されたＤ２リセプターのグリコジル化型につむ１て報告されている（１１）のと近似している．推定開始部位から３６塩基上流にあるフレーム内ジペプチドがＲＧＢ−、２　ｃＤＮＡの５゛非翻訳領域に見出される。小さな開いた読み取りフレームがβｚ　Ａ　Ｒ　ｍ　Ｒ　Ｎ　Ａの５゛非翻訳配列に認められる（９）。ＲＧＢ−２　ｃＤＮＡから導かれる蛋白質の数種の構造的特徴が、それがＧ蛋白質結合リセプターのファミリーに属することを示している。蛋白質配列の疎水性プロット（図５）が、７つの膜横断領域（８）を表し得る７本の疎水性アミノ酸の鎖の存在を示している。更に、ＲＧＢ−２の一次アミノ酸配列は、他のＧ蛋白質結合リセブターと高度の類似性を示して゛いる（図２）。最大のアミノ酸同一性は推定される膜横断領域の内部に集まっている。これらの領域の内部において、ＲＧＢ−２蛋白質は、ヒトα２−アドレナリンリセプタ−（１２）とは５０％、ヒトＧ−２１リセブター（１３）とは４２％、ハムスターβ．ＡＲーアドレナリンリセブター（９）とは３８％、ブタＭ．リセプター（１４）とは２７％、及びウシｓｕｂｓｔａｎｃｅ　Ｋ−リセブタ−（１５）とは２５％、の同一性を有している。第３に、ＲＧＢ−２は、Ｇｉ白白質結合リブブタ−ファミリーのメンバーに共通ないくつかの構造的特徴を有している。信号配列を有しないＮ末端にＮ結合グリコジル化のための３個の一致配列がある。膜横断領域ＩＩに見出されるＡｓｐ８０は、全ての知られているＧ蛋白質結合リセプターにおいて保たれている．膜横断領域ＩＩＩには、ＡｓｐＨ４があり、それには陽イオン性アミン頻に結合するりセブターにのみ見出されるＡｓｐ残基が対応する（１６）。リン酸化が、リセプター機能を制御する手段として提案されてきた（１７）、プロティンキナーゼＡによるリン酸化の潜在的部位は、第３の細胞質ループにあるＳｅｔ２２８に存在する。ロドプシンとβーアドレナリンリセブターのＣ末端部分には、リセプターキナーゼ類の潜在的基質である多くのＳｅｒ及びＴｈｒ残基が見出される（１８）、これに対し、ＲＧＢ−２の短いＣ末端はＳｅｒ及びＴｈｒ残基を有しない。しかし、α２−アドレナリンリセプターの場合のように、ＲＧＢ−２はリン酸化基質として役立ち得る第３の細胞質ループに多くのＳｅｒ及びＴｈｒ残基（２２残基）を有する。ＲＧＢ−２は、膜横断領域ＶとＶｌとの間に、短いＣ末端（１４アミノ酸）を伴った大きな細胞質ループ（１３５アミノ酸）を含む。この構造組織は、β２−アドレナリンリセブターやＭ２ムスカリンリセプターのようなＧＩ　（阻害的Ｇ，蛋白質）によって結合される他のりセプターに近似している。アドレナリンリセプター及びムスカリンリセプターのファミリーとは異なり、ＲＣ；Ｂ−２遺伝子は、膜横断領域ＶＩに位置するコード配列に少なくとも１つのイントロンを有する。ＲＧＢ−２の同定に向けた最初の段階として、ＲＧＢ−２ｍＲＮＡの組織分布がＮｏｒｔｈｅｒｎプロット分析で試験された（図３）。雄性のＳｐｒａｇｕｅ　Ｄａｗｌｅｙラットから脳組織が切り取られ、Ｃｈｉｒｇｗｉｎ等（２７）及びＵｌｌｒｉｃｈ等（２８）に従ってＲＮＡが単離された。Ｎｏｒｔｈｅｒｎプロ・ントには、ＲＮＡはグリオキサール及びＤＭＳＯを用いて変性し、そして１．２％アガロースゲル上で展開した。電気泳動の後、ＲＮＡはナイロン膜上にブｏ　７トしくＮ−Ｂｏｎｄ，Ａｍｅｒｓｈａｍ）、８０° Ｃで２時間焼付けた。膜は、５０％ホルムアミド、０．２％ＰＶＰ（Ｍ、Ｗ．４０，０００）、０．２％ｆ　ｉｃｏｌ　（Ｍ；　Ｗ．４００，０００）、ＰＨ７．５の０．０５％トリス、ＩＭのＮａＣ１、０．１％ＰＰｉ，１％ＳＤＳ及び変性サケ精子ＤＮＡ　（１００ｕｇ／ｍｌ）中で４２°Ｃにて１６時間、前ハイブリッド化した。ＲＧＢ−２の１、６ｋｂ　ＢａｍＨＩ−ＢｇｌＩＩフラグメントでこのクローンのコード領域を含むものから製したランダムに標識した３ｚＰ− 標識フラグメント（１−２　１０”　ｄｐｍ／μｇ）が、４２°Ｃで終夜該フィルターを探索するために、上記で得たハイブリッド化溶液中で１０’ｄｐｍ／ｍｌの濃度で使用された。プロ・ノドは２ｘ　ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳで６５° ＣＩＯ分間にて２回、０．５ｘＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳにて室温１５分間にて２回、そして０．ＩＸＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳにて６５°Ｃ１５分間にて１回、洗浄した。プロットは増感スクリーンを有するＸ線フィルムに一７０°Ｃにて終夜曝した。ＲＧＢ−２のｍＲＮＡは、ラット脳の種々の領域で異なったレベルに表現されるが、基底神経節が最も高い濃度を示す。更に、ＲＧＢ−２のｍＲＮＡは、ラットの下垂体神経性中葉に高濃度に見出され、この腺の前葉には少ない程度にした見出されない。ＲＧＢ−２のｍＲＮＡの表現パターンは、組織標本でのりセプターオートラジオグラフィー及び結合研究によって決定されたＤ２　ドーパミンリセブターの分布と著しく近似している。ＲＧＢ−２によりコードされるリセブターの薬理学的特徴を研究するために、ｃＤＮＡが親核細胞にて表現された。全ＲＧＢ−２ｃＤＮＡが：マウスのメタロチオネインプロモーター（２１）からの転写を開始させるユーカリオート表現ベクターｐＺｅｍ３　（２０）中にクローン化された。このプラスミドは、選択的ネオマイシンフォスフオドランスフェラーゼ遺伝子（ｐＲＳＶｎｅｏ）と共に、標準Ｃａ　Ｐ　Ｏａ沈澱技術（２１）によりＬＬｋ−マウス繊維芽細胞ライン中に同時トランスフェクトされた。細胞は、３５０ｕｇ／ｍｌのＧ４１８中で選別された。トランスフェクト体は分離され、Ｎ。ｒｔｈｅｒｎブｏ　７Ｈ分析により、ＲＧＢ−２ｍＲＮＡの表現の有無が試験された。ＲＧＢ−２に指令されたＬ−ＲＧＢ　２　Ｚ　ｅ　ｍ　−１を表現している細胞ラインが単離された。ＲＧＢ−２ｍＲＮＡは＠Ｌｔｋ−細胞ラインには検出されなかった。ＲＧＢ−２ｍＲＮＡがＤ２　ドーバミンリセプターに期待される組織分布を示したことから、Ｄ２リガンド３Ｈ−スピペロンを用いて、Ｌ−ＲＧＢ２Ｚｅｍ−１細胞ライン、自然のＬｔｋ−細胞及びラット線条体につき薬理学的研究が行われた。膜は、細胞を４℃にて０．２５Ｍ蔗糖、ｐＨ７，４の２５ｍＭ）リス、６ｍＭ　ＭｇＣ１ｚ　、１ｍＭ　ＥＤＴＡ中でＤｏｕｎｃｅホモジナイザーで細胞をホモジナイズすることにより調製した。ホモジナイズした溶液は８００Ｘｇで１０分間遠心し、そしてベレットは前記と同様にホモジナイズし遠心した。上澄は集められ、２００゜０００Ｘｇで１時間遠心された。この遠心のペレットは、２５ｍＭのｐＨ７，４のトリス、６ｍＭの塩化マグネシウム、１ｍＭのＥＤＴＡ中で、約２５０μｇ蛋白質／ｍｌの濃度に再懸濁され、少量ずつ一７０℃にて保存された。放射性リガンドの結合測定は、２ｍ１（飽和分析）又は１ｍｌ　（阻害曲線）で各２つ行われた。液は（最終濃度として）次のものを含む：５０ｍＭのｐＨ７，４のトリス、０．９％塩化ナトリウム、０．０２５％アスコルビン酸、０．００１％牛血清アルブミン、３Ｈ−スビペロン（Ａｍｅ、ｒｓｈａｍ、９５Ｃｉ／ｍｍｏｌ）及び適当な薬物。いくつかの実験においては、１００μＭのグアノシン５“−トリフオスフェートが含まれた。（＋）−ブタクラモール（２μＭ）が、非特異的結合を明らかにするために使用された。各測定において、インキュベーションは、１５−４０μｇの蛋白質の添加により開始され、３７°Ｃで５０分間行われ、１０ｍ１の水冷洗浄用緩衝液（１０ｍＭトリス、ｐＨ７，４及び０．９％塩化ナトリウム）の添加によって停止された。サンプルは、硝子繊維フィルター（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ及び５ｃｈｕｅＪＩＮｏ、３０）にて濾過され、追加の１０ｍ１の洗浄用緩衝液にて洗浄された。フィルター上に保持された放射活性は、Ｂｅｃｋｍａｎ　ＬＳ　１７０１シンチレーシヨンカウンターを用いてカウントされた。データは、データ解析プログラムＥｎｚｆｉｔｔｅｒを用いて描く以外は、前記（２９）の通りにして解析された。得られたｒｃ、、値は、Ｃｈｅｎｇ及びＰｒｕｓｏｆｆ　（３０）の方法によりに、値へと変換された。対照Ｌｔｋ−細胞から調製された膜は、３Ｈ−スピペロンの、（＋）−ブタクラモール−又はスルピリド置換性の結合を示さなかった。Ｌ−ＲＧＢ２　Ｚｅｍ− １細胞から調製した膜への３Ｈ−スピベロンの結合は、Ｋｄ値４８ｐＭ（図４ａ）で飽和した。この値は、平行実験におけるラット線条体膜はの３Ｈ−スピベロンの結合において観察されたもの（５２μＭ）と一致する。図４ａに示した実験において、Ｌ−ＲＧＢ２Ｚｅｍ−１から調製された膜についてのＫｄ及びＢｍａｘ値は、４０μｍ及び８７６ｆｍｏｌ／ｍｇ蛋白質であり、一方、線条体膜の対応する値は３７μｍ及び５４７ｆｍｏｌ／ｍｇ蛋白質であった。結合部位の濃度は、４つの実験で測定したところでは、Ｌ−ＲＧＢ　２　Ｚ　ｅｍ　−１膜においては９４５ｆｍｏｌ／ｍｇ蛋白質及びラット線条体膜においては４５４ｆｍｏｌ／ｍｇ蛋白質であった。Ｌ−ＲＧＢ２Ｚｅｍ−１細胞からの膜への３Ｈ−スビペロンの結合は、多くの薬物により阻害され、得られたに、値は線条体膜を用いて得られたものとよく一致した（図４ｂ、４ｃ）。Ｄ２アゴニストである（＋）−ブタクラモール及びハロペリドールは、最も強い阻害剤であり、スルピリドがこれに続いた。Ｄｌ　ドーパミンアンタゴニストである５ＣＨ２３３９０及びセロトニン５ＨＴ、アンタゴニストであるケタンセリンは、３Ｈ−スビベロン結合の阻止力がずっと弱かった。結合の阻害において（＋）−ブタクラモールが（−）−ブタクラモールよりずっと強かったことから、結合は立体選択性を有するものと思われた。これらの実験においては、ドーパミンアンタゴニストの絶対的親和性と薬物の強さの序列（スビペロン〉ハロペリドール〉スルピリド＞＞（−）−ブタクラモール）は、前に公表されたＤ２　ドーパミンリセブターの値（２）とよく一致しているＬ−ＲＧＢ　２　Ｚ　ｅ　ｍ　−１膜の全ての結合データは、単一のクラスの結合部位の存在を想定することにより最も良く当てはまった。他方、ラット線条体膜への３Ｈ−スビベロンの結合の数種の薬物による阻害は、２つのクラスの結合部位の存在を想定することにより最もよく当てはまった。こうして、５ＣＨ２３３９０及びケタンセリンは、ラット線条体膜への３Ｈ−スピペロンの結合の１０ −２０％を高い親和性をもって阻害した（図４ｃ）。ラット線条体膜においては、スルピリドによる放射性リガンドの結合の阻害は、１つのクラスの結合部位により最もよく当てはまったが、（＋）−ブタクラモール置換性結合の１０−１５％は、使用した濃度のスルピリドでは阻害されなかった。ケタンセリン及び５ＣＨ２３３９０に高い親和性を有し且つスルピリドによっては置換されない結合部位は、ラット線条体膜の５ＴＨ２セロトニンリセブターへの３Ｈ〜スピペロンの結合を示しているものと思われる。５ＴＨ２リセプターへの５ＣＨ２３３９０の結合は既に記述されている（２２）。ラット線条体膜においては、Ｄ２　ドーパミンリセブターー８０乃至９０％の３Ｈ−スピペロン結合を含んでなるクラスの結合部位−についての薬物の見かけの親和性は、Ｌ−ＲＧＢ２Ｚｅｍ−１細胞から調製するされた膜への薬物の見かけの親和性と区別のつかないものであった（図４ｃ）。Ｄ２　ドーパミンリセプターの刺激の生理学的効果は、Ｇ、により仲介されるように見える。ＧＴＰによるＤ２　ドーパミンリセプターへのアゴニストの結合の阻害は、アゴニストに対して高い親和性を有するリセブターＧ、複合体のＧＴＰ −誘導性の解Ｍ（２３，２４）によるものと考えられる。３Ｈ−スピペロン結合がＫｓ値１７μｍにてＬ−ＲＧＢ　２　Ｚ　ｅｍ　−１膜において阻害されたとはいえ、このドーパミン結合は追加のＧＴＰには反応しなかった。しかしこの知見は、報告されているＬ細胞におけるＧ、の欠如（２５）と符合している。ここに提示した薬理学的データは、Ｄ２　ドーパミンリセプターの結合特性がＲＧＢ −２ｃＤＮＡを表現しているＬｔｋ−細胞において見出されたことを証明している。前述のデータは、ＲＧＢ−２ｃＤＮＡが、親核細胞にトランスフェクトされたとき、Ｄ２ドーパミン結合蛋白質の表現を指令することを示している。このｃＤＮＡに対応するｍＲＮＡがＤ２　ドーパミンリセブターの存在が知られている組織に局在していることから、そして、このｍＲＮＡがＧ蛋白質結合リセブターの全ての予期される特徴を有する蛋白質をコードすることから、ＲＧＢ−２はラットＤ２　ドーパミンリセプターのクローンである。図１に示した核酸配列は、例えばＥｃｏＲＩ部位又は他の適当な部位を用いて、広範な種類の通常のそして好ましくは市販のプラスミドに挿入することができる。図６は、図１の配列の制限地図である。この開示に基づく本発明のドーパミンリセブター遺伝子、特に哺乳ＮＤ２　ドーパミンリセブター遺伝子は、多くの通常の方法をもちいて今や日常的に製造し、単離し及び／又はクローン化することができる。例えば、ここに開示した手順は、ドーパミンリセプターＤＮＡ配列を含むライブラリーについて実質的に反復することができる。代わりに、ドーパミンリセブター遺伝子、特にヒトドーパミンＤ！リセプター遺伝子、に選択的なオリゴヌクレオチドのプローブが、例えば図１の配列及び／又は省略されたイントロンから、日常的に設計され得る。これらは、ドーパミンリセプター核酸配列を含む核酸ライブラリーをスクリーニングするのに用いることができる。該プローブ、特にそのようなプローブの複数（例えば２又は３）の全て、にハイブリッドするこれらのライブラリーにおける配列は、高い確立をもって本発明のＤＮＡ配列であろう、熱論、通常の方法を用いて図１又はそのいかなるフラグメントの配列をも合成することが可能である。本発明はまた、広範囲にわたる有用な産物の製造及び広範囲にわたる種々の有用な方法の使用を可能にし、並びにドーバミンリセプターの研究及び制御のための基礎的な道具を提供する。これら産物及び方法は、よく知られた組み換えＤＮＡ、免疫化学的な及びその他のバイオテクノロジー産業の方法を用いて、それぞれ生産され及び実施されることができる。次を参照のこと：　米国第４２７３８７５号、米国特許第４２９３６５２号、ヨーロッパ特許第０９３６１９号、Ｄａｖｉｓ　ｅｔ　ａｌ、、”Ａ　Ｍａｎｕａｌ　ｆｏｒ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ａｄｖａｎｃｅｄ　Ｂａｃｔｅｒｉａｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ”、ＣｏｌｄＳｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　（１９８０）；Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ、、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎｉ□、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔ。 ’　ｒｙ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ、Ｙ、ＨＤａｖｉｓ　ｅｔ　ａｌ、、Ｂａ５ｉｃ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏ　、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎ、Ｙ、（１９８６）；Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚ　ｍｏｌｏ　、Ｂｅｒｇｅｒ　＆　Ｋｉｍｍｅｌ　（Ｅｄｓ、）、（１９８７）。本発明は、第一に、ドーパミンＤ８リセブターの１次アミノ酸配列の全て並びにその生物学的性質を育する、精製され及び単離されたポリペプチド産物を提供する。それは次のものを含む：　リン酸化及びグリコジル化のような共有結合的修飾のための全ての部位、機能的蛋白質の２次、３次及び４次構造を決定する全ての１次アミノ酸配列、抗原性及び抗体結合部位を提供する全ての分子部分、資質、炭水化物、及び蛋白質例えばグアニンヌクレオチド結合調節蛋白質のような他の生物学的分子との非共有結合的相互作用を提供する全ての蛋白質部分、アゴニスト、部分的アゴニストおよびアンタゴニストその他のりガントへの結合部位を形成する全蛋白質部分、脱感作のような正常な生物学的活性に含まれる機能的なコンフォメーション変化のために必要な全蛋白質部分、及びこのリセプターの遺伝子のそのたの繋ぎにより生じ得る全蛋白質。これらのポリペプチドは、例えば培養した細菌、酵母又は哺乳類細胞のような、原核又は親核ホストにより、完全に慣用の形質転換又はトランスフェクション（例えば哺乳類細胞ではリン酸カルシウムによる）技術を用いて、本発明の核酸から表現させることができる。を椎動物（例えば哺乳類及び鳥類）細胞におけるそのような表現の産物は、自然の形態では関連するであろう他のヒト例えば又は夾雑物を含まないものとして得られるという点において、特に有利である。表現のための好ましいホストは、哺乳類でありこれは例えば、マウスＣ１細胞、ハムスターＣＨＯ細胞、マウスＣ１細胞、マウスＣ１細胞、マウス／ラットＮＧ１０８ −１５細胞及びマウスＡＬＴ２０細胞を含む。例えば、図１の遺伝子が市販の成長ホルモンＯＨ，細胞にトランスフェクトされると、ｃＡＭＰセカンドメツセンジャー系が調節されるのが認められた。好ましいベクターには、ｐＺｅｍ又はｐＲ３Ｖ又はワクチニアウィルス及びレトロウィルスのようなウィルスのベクターが含まれる。本発明のポリペプチドは、例えばグリコジル化及び非グリコジル化形態の双方の全ての可能な変種を含む。含まれる特定の炭水化物は、表現のために使用した哺乳類又は他の親核細胞に依存するであろう０本発明のポリペプチドはまた、先頭メチオニンアミノ酸残基を含むこともできる。更に本発明には、合成的又は他の方法で、図１のアミノ酸配列及び／又は本発明のドーバミンリセプター自身を複製した、又はこれを部分的にのみ複製した、ポリペプチドも含まれる。これら全体または部分的に複製したポリペプチドは、好ましくはまた、ドーパミンリセプター自身の生物学的及び／又は免疫学的活性を保持するであろう。更に本発明の範囲には、そのようなポリペプチドと免疫学的に反応性のあるモノクローナルまたはポリクローナル抗体（慣用の技術で生産され好ましくは標識された）をも含む。好ましい部分的ポリペプチド（フラグメント）は図２に示した疎水性膜横断領域Ｖ、Ｖｌ及びＶｌｌに位置する配列の一部を少なくとも含むものである。これらは、リガンド結合部位、特に領域Ｖ■■の位置に近似している。第３の細胞質ループもまた重要なフラグメントＳＮ域である。すなわち例えばＧ−蛋白質結合はこの領域及び領域Ｖ及びｖ■を特徴とする特定の領域リセプターに高度に選択的な抗体を得たい場合には、そのような抗体を生産するフラグメントが、膜横断領域Ｖ及びＶ２Ｏ間の高度に特徴的な領域、すなわちいずれも他のりセブターとは相同性が低いものである第３の細胞質ループ、又はＣ末端領域が選別され及び／又はこれらの領域にあるエピトープに特異的な抗体が選別されるであろう。他のりセプター／遺伝子の特異的領域は、イントロン配列、例えば上記のＲＧＢ−２の領域である。合成された特に好ましいペプチドは（図１のアミノ酸番号を参照して）：　（Ａ）２−１３　；’　（Ｂ）１Ｂ２−１９２　；（Ｃ）２６４−２７７　；　（Ｄ）２８７−２９８　；及び（Ｅ）４０４−４１４である。これらは次の原理に基づいて選別される。すなわち、大きな数のＰｒｏ残基（Ｂ／Ｃ／Ｄ）を含むペプチドの知られた抗原性、Ｎ及びＣ末端（Ａ）及び（Ｅ）のカバリッジ、リセブター反応をブロックするに効果的な細胞外領域（リセプター反応領域）に抗体を向かわせる能力（Ａ／Ｃ／Ｄ）。これらフラグメントに対する抗体、例えば完全に慣用のハイブリドーマ技術によるモノクローナル抗体、は慣用の方法で作られる。本発明はまた、ドーパミンリセブター全体又はそのフラグメントをコードするＤＮＡ配列、並びに、そのような全体又は部分的配列を含んだ表現ベクター（例えばウィルス及び環状プラスミドベクター）にも関するものである。同様に、ホスト（例えば細菌、酵母及び哺乳類）又はそのようなベクターで形質転換され又はトランスフェクトされた細胞も含まれる。そのようなベクターにある配列に対応するポリペプチドを表現させる対応した方法もまた含まれるが、それらは例えば、外因性配列の大きい規模での表現のための及び例えば成長培養液、細胞溶解液又は細胞膜分画からのポリペプチドの単離のための、適当な条件のもとて形質転換され又はトランスフェクト細胞を培養することを含んでなるものである。本発明のＤＮＡ配列はまた、ここに記述された自然の配列と異なるポリペプチドの変種、突然変異又は類縁体をコードするものをも含む。そのような相違は、自然の配列から１又はより多くのアミノ酸残基を除去することにより、そのような残基を置換することにより及び／又は自然の配列に１又はより多くのアミノ酸残基を加える添加により、誘導することができる。好ましくは、得られる修飾されたポリペプチドはドーパミンリセプターの生物学的又は免疫学的活性のうち少なくとも１つを保持するであろう。ドーパミン親和性活性に影響を及ぼしそうな突然変異は、膜横断領域Ｖ、Ｖｌ若しくはＶｌｌにおける又は第３の細胞質ループにおけるものであろう。加えて、ＤＮＡ配列はまた、ここにおいて述べられた、特に各図にて示した、他のＤＮＡ鎖のいかなる相補的な配列をも含む。すなわち、典型的にはここに述べたハイブリッド化条件下にて若しくはより激しい条件下にてここに述べたＤＮＡ配列にハイブリッドする又はそのようなりＮＡ配列のフラグメントとハイブリッドするＤＮＡ配列、及び遺伝子コードの変性によりここに示したものと異なっているＤＮＡ配列。こうして、本発明は、ドーパミンリセブターをコードし及びここに示した配列の１又はより多くのものとハイブリッドする全てのＤＮＡ配列を含む、これらには、対立変種及びここに記述した実験にて述べた種以外の哺乳類からのドーパミンリセプターが含まれる。ｃＤＮＡ又はゲノムドーパミンリセプターＤＮＡの修飾は、部位指向性の突然変異技術を含むよく知られた技術により容易に達成することができる。そのような修飾されたＤＮＡ配列は、ドーバミンリセブターの生物学的活性の保持が望まれる場合には例えば膜横断領域■、Ｖｌ若しくはＶＩＩや第３の細胞質ループではない選ばれた領域おいてなされた、除去、付加及び／又は置換を含むことができる。前述の生物学的活性及び／又は対応するＤＮＡ配列を保持しない修飾された蛋白質もまた、例えば本発明の種々の測定において、有用であろう。そのような特に好ましいものにおいては、膜横断領域Ｖ、Ｖｌ、Ｖｌｌ又は第３の細胞質ループは、配列の修飾により除去又は不活化されるであろう。グリコジル化部位の除去もまた、例えば酵母細胞におけるポリペプチドの表現のためには有用な変種である。上記のように、ドーパミンリセブターをコードするＤＮＡ配列のかなりの部分が種々の哺乳類種で保存されているということが確立されている。従って、日常的な実験を用いるのみで、熟練した当業者は、５°側、図１に示したイントロン性及び構造遺伝子配列並びに図７に示したヒト配列を含むここに示した配列の詳細に従って製造されたプローブを用いて、他のドーパミンリセプター遺伝子特にＤ！　ドーパミンリセプターの存在をめて、例えば与えられた哺乳類からのＤＮＡゲノムライブラリー又は好ましくはｃＤＮＡライブラリーを、容易にスクリーニングすることができる。プローブは好ましくは、図２に示した７つの高度に保存された膜横断領域、好ましくは領域■■及びＶｌｌ、から選ばれるであろう。そのような日常的スクリーニングは、プローブとハイブリッドするクローンを同定するであろう。これらから、ここに記述した技術を用いてドーバミンリセブターは日常的に選別されることができる。ヒトＤ２　ドーパミンリセプターに関しては、特に有用な原料としては、ｃＤＮＡには線条体、下垂体、神経芽細胞種、腎臓、胎盤細胞等が、ゲノムＤＮＡには肝臓、胎盤細胞等が含まれる。例えば赤毛ザルのような霊長類に関しては、特に有用なゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡライブラリーとしては、脳、腎臓及び胎盤細胞が含まれる。ヒトＤｚ　ドーバミンリセブター遺伝子に関しては、図７に示した部分的配列は、λｇｔｌｏ中のラット脳ｃＤＮＡの０．８ｋｂのＥｃｏＲＩ＝Ｐｓｔｌフラグメントによる探索のための上記の激しいハイブリッド化条件の下で、全長ラットｃＤＮＡ、ＲＧＢ−２であイブラリ−は、例えば上に引用した、例えばＤａｖｉｓ　ｅｔ　ａｌ、の参考文献に記載されたような、完全に慣用の方法により調製することができる。この配列又はそのフラグメントもまた、ヒトドーパミンリセブター遺伝子をめて上記の及び他の全く慣用の手順に従って、例えば上記の慣用のライブラリーをスクリーニングするために、プローブとして有用であり得る。図７の配列と図１及び２に示した配列とを比較すればわかるように、図７の部分的なヒトの配列は、図１の第２５９番のアミノ酸に始まるＲＧＢ−２と高い相同性を有している。同様に、本発明はより一般的に、最も広い意味における哺乳類Ｄ２　ドーパミンリセブター遺伝子、例えばそのような調節及び構造遺伝子を、例えば読み取りフレーム中に、単体で又は組み合わせで、含むものである。例えば、ここに論する日常的な方法を用いて、そのような遺伝子が哺乳＠ＤＮＡライブラリーからクローン化されてきたし、またそうされ得る。同様に、本発明は、生物学的に活性なそのような遺伝子のフラグメント、例えば哺乳Ｊｕｔ　ドーパミンリセブターの生物学的活性を有するポリペプチドをコードするフラグメント、又はそのようなコードするフラグメントの表現を調節するのに有用なフラグメント、又は、例えばそれとハイブリッドさせることにより、そのような遺伝子若しくはフラグメントのためのプローブとして有用なフラグメント、を含む。本発明の種々のポリペプチド及び配列は、検出マーカー物質、典型的には共有結合により、及び更に典型的には放射性標識により、又はＤＮＡの場合にはビオチンのような非同位体標識により、慣用のように標識することができる。該ポリペプチド産物（例えば標識抗体）は、種々のサンプル中のドーパミンリセブターの存在の検出及び定量のために慣用の方法で使用することができる。すなわち、該標ｇｉｌｉＤＮＡ産物は、通常のハイブリッド法（例えばＮｏｒｔｈｅｒプロット、５ｏｕｔｈｅｒｎプロツト、スポットアッセイ等）において、例えば、種々の哺乳類染色体地図におけるドーパミン遺伝子の位置をつきとめるため、標準レベルに比較してｍＲＮＡ又はリセプター濃度が異常に高い又は低いが否かを測定するため等の目的に、サンプル中の関連核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ）の存在を検出し及び定量するため、慣用の方法で使用することができる。それらはまた、やはり全く慣用の手順を用いて、例えば染色体異常を検出する等のため、例えばＲＦＬＰ分析（例えばＧｅｎｅｓ　ＩＩＩ、Ｌｅｖｉｎ、Ｊｏｈｎ　Ｗｉ　ｌｅｙ　ａｎｄ　５ｏｎｓ　（１９８７）を参照）を用いて、与えられた患者がらのＤＮＡサンプルに基づくエエｖｉｔｒｏの診断にてドーパミンリセブター遺伝子異常を同定するために、有用であろう。例えば、ドーバミンリセブターが精神分裂症に関与することが言われれいることがら、本発明の産物及び方法は、精神分裂症の患者からの核酸を例えばサイズ分画形態で特徴づけ、とりわけ患者を精神分裂症サブグループに分類し、標準ＤＮＡ分画列との比較に基づき診断する等のために、使用することができる。無論、それらはまた、ヒト又は他の哺乳類ゲノムのマツピングにおいて、随伴する遺伝子を、例えばＲＦＬＰ分析及び適用しうるときは他の異常の分析において、同定するための遺伝子マーカーとして使用することもできる。上に論じた遺伝子の特徴的領域、例えばイントロン領域、第３の細胞質ループ等は、この点特に有用であろう。本発明のポリペプチドが使用できる典型的な測定には、ＲＩＡ：ＥＬＩＳＡその他の、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ及びｉｎ　ｖｉｖｏ双方の、よく知られたイムノアッセイ技術のあらゆるものが含まれる。ドーパミンリセプターのポリペプチド配列の種々のフラグメントはまた、与えられたフラグメント内のエピトープをめて、対応するポリクローナル抗体又は好ましくはモノクローナル抗体（例えば、対応するハイブリドーマの慣用の調製及び表現により）を製造するために慣用のようにして使用することができる。抗体は、しばしば慣用のようにして、例えば放射性又は酵素的に標識されよう。好ましくは、得られるポリクローナル又はモノクローナル抗体はまた、上述のフラグメントに対してのみならず全蛋白質に対しても免疫特異的であろう。そのような抗体は、例えば、ドーパミンリセプター及び関連産物の検出及びアフィニティー精製又はクロマトグラフィーにおいて、慣用のようにして使用されよう。無論、本発明のポリペプチドは、上記のようにして細胞から慣用の手順に従って表現されたもの及びやはり慣用の手順を用いて合成したものを含む。本発明は、第１に、自然環境の成分を実質上台まない哺乳類ドーパミンリセプターの非自然的調製を可能にする。「実質上純粋な」の語はここではこの意味、すなわち実質上これらの自然の成分を含まないという意味、で用いられている０本発明はまた、上記の種々の原料より単離することのできる又は全く慣用の方法を用いて合成的に調製することのできるＤＮＡ配列を含む。更に本発明の範囲に含まれるのは、本発明のポリペプチド産物の１若しくはより多くの又は本発明の核酸配列の１若しくはより多くのものの有効量を、製薬産業においてよく知られている適当な慣用の賦形剤、補助薬及び／又は単体と混合してなる、薬剤学的組成物である。これらは、ｉｎ　ｖｉｔｒｏの使用、例えば、サンプル中のドーパミンリセブターの存在の若しくはサンプル中の遺伝子若しくは異常遺伝子の存在の検出のため、又はサンプル中のりセプター若しくはその遺伝子の濃度を高めるため、又は遺伝子治療のようなｉｎ　ｖｉｖｏでの使用（例えば欠損遺伝子若しくは遺伝子を不活化し、例えば適当なモノクローナル抗体によりそれをブロックすること）のため及び／又は新しい機能的遺伝子（例えばレトロウィルスベクターを使用して）を提供するため、または与えられた位置におけるドーバミンリセプターの濃度を高めるため、例えばアンチセンスオリゴ配列を投与することによりリセプター表現及び／又は活性を調節するために、ヒトを含む全ての哺乳類において、使用することができる。かくして、これらの組成物は、疾患状態、とりわけ上述のようなドーパミンリセプターやその遺伝子の構造、表現又は濃度の異常に関連するものを、治療するに有用であろう。与えられた患者におけ与えられた状態に対する有効な個々の投与量は、よく知られているように、患者の全身状態、体重、特定のドーパミン欠乏疾患状態の同−性及び重症度を含む通常の状態によって変化するであろう。本発明のポリペプチドはまた、薬物のような候補化合物のそれに対する親和性、例えばＤ２　ドーパミンリセブターに対する（例えばアゴニスト的又はアンタゴニスト的な）親和性、を試験するために、例えば競合的結合測定において使用することができる。そのような手順は、例えば、ここにおいて及び／又はドーバミンリセブターの自然の原料に基づく知られた慣用のプロトコールに類似の、例えば、Ｓｃｈｗａｒｃｚ　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、ｉ工（１９８０）、７７２−７７８及びＣｒｅｅｓｅｅｔ　ａｌ、、Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｊ、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、、Ｊ−６（１９７７）、３７７−３８１の方法に従って、線条体リセプター、及び他のりセプターに対するトリチル化したドーパミンアゴニスト及びアンタゴニストの結合の阻害のための知られた試験とＩｆ（）２の、全く慣用の手順を用いて行うことができる。ドーバミンリセプターへのりガントの結合によって開始される反応、例えばセカンドメツセンジャー系のｔｉｔｔｍのような細胞反応、を修正し又は開始させる能力をめて物質をスクリーニングすることも可能である。そのような分析は、本発明の核酸配列で形質転換した本発明の細胞を利用することができる。ドーパミンリセプターに対する又はドーバミンリセブター遺伝子、特にＤ２　ドーバミンリセブター、に対する本発明の抗体は、例えば放射線診断、ＭＨＩ又はポジトロン造影による、診断的造影技術にも使用することができる。放射性、バラマグネティック又はポジトロン標識は、抗体（好ましくは自然のモノクローナルな）に慣用の方法、例えばポジトロン放射、放射性核種若しくはバラマグネティック金属のためにはキレート性基の共有結合、により取りつけることができる。ＭＲＩ、放射線感受性又はポジトロン造影は、これらの試薬を用いて慣用の方法で達成することができる０例えば、Ｍａｚｉｅｒｅ　ｅｔ　ａｌ、、Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉ、、　１１，１３４９　（１９８４）を参照。適当な薬剤学的担体としては、水、生理的食塩水、ヒト血清アルブミン等が含まれる。組成物はまた、慣用のドーパミンアゴニスト、ドーパミンアンタゴニスト等の、関与する特定の疾患状態の緩和に通した他の活性成分を含むこともできる０組成物は、例えば抗体又はＤＮＡプローブ（例えば、遺伝子の相同性や異常を検出できるもの）を、例えば酵素、基質、ＤＮＡ制限フラグメント分析用材料のような検出方法に特異的な試薬と共に含有する、慣用のキットの形態で提供することができる。本発明はまた、例えば米国特許第４７３６８６６号に記載されているのに類似の、知られた方法を用いて、対応する形質転換動物、特に例えばラット、サル等のヒト以外の哺乳類、を製造するためにも有用である。そのような動物は例えば、特に商業的な研究目的に有用である。ＤＮＡ配列又は対応するｍＲＮＡはまた、例えばカエルからの卵母細胞に注入するのに慣用のようにして使用することができ、それは次いで慣用のようにして結合やセカンドメツセンジャーの解析に使用することができる。更に、１次アミノ酸配列が入手しうろこと自体、ドーパミンリセプターの２次及び３次構造についての実験的及びコンピューターモデル化と理解とを可能ならしめるものである。この３次元的情報は、例えば細胞膜、そのリガンド（結合ポケット）、関連蛋白質、メ・ンセンジャー系等との相互作用等のりセブター機能の詳細をモデル化して理解するのに基礎を提供する。そのような解析は、理性的な薬物設計を可能にし、それによって例えば新しいドーパミンリセプター調節化学薬剤がこの相互作用の詳細に従って設計されることができる。（以下余白）１、Ｃｒａａｓｅ、工、、５ｉｂｌｅｙ、Ｄ−Ｒ，，Ｈａｍｂｌｉｎ、Ｍ、Ｗ、＆　Ｌａｆｆ。Ｓ、Ｅ、　ｖ　６，４３−７１　（１９８：Ｉ）。２、５＠ｅｍａｎ、Ｐ、　ｅｖ　コ２．　２２９−３１３　（１９８０）。コ、　Ｌｅａ、Ｔ、ｅｔ　ａｌ、Ｋ妃ｉ広旦２７３．　５９−６１　（１９８４）。４、　Ｓｅａｍａｎ、Ｐ、ａｔ　ａｌ、　旦Ω裏旦ｎ９旦　２２５．　７２８− ７コ１　（１９８４）。５、Ｂａｒｎｅｓ、Ｄ、Ｍ、シム旦ｍ遣２４１，４１５＝４．１７　（１９８Ｂ）。６、Ｃｏｔｓ、Ｔ、！、、Ｆｒｅｙ、Ｅ、Ａ、、Ｇｒｅｗ＠、Ｃ，Ｗ、、＆　Ｋｅｂａｂｉａｎ、Ｊ、Ｗ。ｅｕ　、　ｕ　、１Ｂ、１：１９−１４７　（１９８コ）。７、Ｓｅｎｏｇｌｅｓ、Ｓ、Ｅ、ａｔ　ａｌ、　’　Ｃ，２６２゜４８６０−４８６７　（１９８７）。８、Ｄｏｈｌｍａｎ、　Ｈ，Ｇ、、　Ｃａｒｏｎ、　Ｍ、Ｇ、＆　Ｌｅｆ］ｃｏｗｉｔｚ、　Ｒ，，７゜”　２６．　２６５７−２６６４　（１９８７）。９、　Ｄｉｘｏｎ、Ｒ，Ａ、Ｆ、、ａｔ　ａｌ、Ｅ旦工只工旦　コ２１．　７５ −７９　（１９８６）。１０、　Ｍｏｕｎｔ、　Ｓ、Ｍ、　”　ｓ　１０．　４５９−４７２　（１９８２）。１１、　Ｇｒｉｇｏｒｉａｄｉｓ、Ｄ、Ｅ、、　Ｎ１ｚｎｉｋ、　Ｈ，Ｂ、、　Ｊａｒｖｉｅ、Ｋ、Ｒ，＆Ｓａｅｍａｎ、Ｐ、Ｌ↓坦−しＢ工２２７，２２０− ２２４　（１９８８）。１２＋Ｋｏｂｉｌｋａ、Ｂ、に、、ｅｔ　ａｌ、シム」菖！２３８，６５０−６５６　（１９８７）。ｌコ、Ｋｏｂｉｌｋａ、ａ、ｘ、、ａｔ　ａｌ、　ドｊｌ巳Ｌ

【ａ　：１２９．　７５−７９　（１９８））。１４、Ｋｕｂｏ、Ｔ、、ａｔ　ａｌ、Ｅｌ」コＬに９３２３．　４１１−４１６　（１９８６）。１５、Ｋｕｂｏ、ｙ、、ａｔ　ａｌ、ド＾立田Ｉ立　：１２９．　１３］６−８３８　（１９８６）。１６、５ｔｒａｄｅｒ、　Ｃ，Ｄ、、　ａｔ　ａｌ、Ｌ２旦ムユエＳｈ仙Ｌ２Ｇ３ｒ　１０２６７−１０２７１　（１９８Ｂ）。１７、５ｉｂｌａｙ、Ｄ、Ｒ，、Ｂａｎｏｖｉｃ、　Ｊ、Ｌ、、Ｃａｒｏｎ、　Ｍ、Ｇ、＆しｉｆｋｏｗｉｔｚ。ＲＪ、Ｑａｌ　４Ｂ、９１：ｌ−９２２（１９８７）。１Ｂ、Ｂｏｕｖｉａｒ、Ｍ、、ａｔ　ａｌ、出ル思１３３３．　３７０−３７３　（１９８Ｂ）。１９、　Ｂｏｙｓｏｎ、　Ｓ、Ｊ、、　ＭｃＧｏｎｉｇｌｅ、　Ｐ、＆　Ｍｏ１ｉｎｏｆｆ、　Ｐ、Ｂ、　、Ｌ出ム仄ｑ名ム、６，３１７７−：１１ＢＢ　（１９８６）。２０、υｈｌｅｒ、Ｍ、＆　Ｍｃ）Ｃｎｉｇｈｔ、Ｇ、Ｓ、　、’　Ｃ，２６２゜１５２０２−１５２０７　（１９８７）。２１、Ｇｏｒｍａｎ、　Ｃ，、Ｐａｄｍａｎａｂｈａｎ、　Ｒ，＆　）ｔｏｗａｒｄ、　Ｂ、）（、８ム爪岨２５、　Ｊｏｎａｓ、　Ｓ、Ｖ、Ｐ、、　ａｔ　ａｌ、　、　’　Ｕ　、　。２９、Ｎａｖａ、Ｋ、Ａ、＆　Ｍｏ１ｉｎｏｆｆ、Ｐ、Ｂ、　、　ａ　ａｃ　、３０．　１０４−１１１　（１９８６）。３０、　Ｃｈａｎｇ、　Ｙ、Ｃ，＆　Ｐｒｕｓｏｆｆ、　Ｗ、Ｈ，’ｏｃ　ｅ　ａ　ｃ　２２゜コ０９９−３１０８　（１９７３）。さらに研究することなく、以上の説明を利用して、当業者は本発明のその全範囲において利用することができるものと信しられる。それ故言及した具体例は単に例示と考えるべきであり、開示の残部の限定と考えるべきではない。以上の説明から、当業者は本発明の本質的特徴を容易に確かめることができ、そしてその精神および範囲から逸脱することなく、種々の使用および条件に適応させるため本発明の種々の変更および修飾を行うことができる。上に引用したすべての出願、特許および文献のすべては参照のためここに取入れる。一１益±一実施例１！ｈ我々は最近ラットドパミンＤ−２レセプターに対する相補的ＤＮＡをクローンし、このレセプターを発現する細胞ラインをつくることを可能にした。Ｄ−２ｃＤＮＡ　（ＲＧＢ−２）をマウスフィブロブラストＬｔｋ−細胞中にトランスフェクトすることによって細胞ライン（ＬＺＲＩ）かつ（られた。以前Ｌ−ＲＧＢ２Ｚｅｍ−１として記載された（１）ＬＺＲＩ細胞はＤ−２レセプターの高密度を発現したが、野性タイプの細胞は発現しなかった。ＲＧＢ−２ｃＤＮＡのトランスフェクションは亜鉛誘発マウスメタロチオネインプロモーターによって調節されるけれども、ＬＺＲＩから調製された膜上のＤ−２レセプターの密度は該細胞を亜鉛で処理後も増加しなかった。ＬＺＲ２と命名されたＬｔｋ−細胞から誘導された第２の細胞ラインは非誘発状態においてＤ−２レセプターの低密度を持つていたが、亜鉛による処理はレセプター密度に５０％増加を誘発した。多数のアゴニストは、発現したＤ−２レセプターに対する〔３Ｈ〕スピロペリドールの結合を競合的にそして選択的に阻害した。ＬＺＲＩ細胞においては、ドパミンはＧＴＰおよびＮａＣ１の存在したよりも不存在下において放射性リガンド結合のより強力な阻害剤であった。ドパミンは、ＬＺＲＩ細胞から調製した膜においてフォルコリン刺激アデニレートサイクラーゼ活性を２７％減少させた。ドパミンによる阻害は（＋）ブタクラモールにより、または無傷の細胞の百日咳トキシンによる前処理によってブロックされた。これらデータは、ＲＧＢ−２ｃＤＮＡはグアニンヌクレオチド結合タンパクと相互作用し、そしてアデニレートサイクラーゼ活性を阻害することができるドパミンＤ−２レセプターの発現を命令することを指示する。さらにＲＧＢ−２ｃＤＮＡは、ドパミンＤ−２レセプターの生物学的および薬理学的特徴化のための道具として有用な多数の細胞ラインをつくる手段を提供する。正論ドパミン（ＤＡ）レセプターは、機能的および薬理学的プロフィルに基いて二つのサブタイプに分けられている（２）。ＤＡ　Ｄ−２レセプターはそれらのアデニレートサイクラーゼ活性を阻害する能力によって機能的に特徴化される（３）。Ｄ−２レセプターの活性化はカルシウムチャンネルを阻害しく４．５）、カリウム伝導度を増加しく６）、そしてイノシトールフォスフェートの蓄積を阻害し得る（７．８）。ＤＡレセプターの調節および機能的特徴の研究を妨げていた一つの要因は、該レセプターを発現する細胞ラインがないことであった。プロラクチン分泌腫瘍から誘導された一つの細胞ラインが最近その中でＤＡがアデニレートサイクラーゼ活性およびプロラクチン分泌を阻害すると記載された（９）。我々は最近、β２−アドレナリンレセプターおよびグアニンヌクレオチド結合タンパクと相互作用する他のレセプターと著名な同族性を有する、ＲＧＢ−２と命名したラット脳相補ＤＮＡ　（ｃＤＮＡ）をクローンした。三系統の証拠がＲＧＢ−２ｃＤＮＡはＤＡＤ−２レセプターをコードすることを指示する。（１）このタンパクの推定アミノ酸配列はグアニンヌクレオチド結合タンパクへ結合するレセプターに典型的である７個の膜スパニング領域（１０）の存在を指示する。（２）ｃＤＮＡとハイブリダイズするメンセンジャＲＮＡの分布がＤ−２レセプターの分布と平行している。（３）ＲＧＢ−２ｃＤＮＡをＤ−２選択性リガンド〔３Ｈ〕スピロペリドールの高いアフィニティー結合を欠く細胞中へトランスフェクトする時、細胞はＤ−２レセプターの薬理学的プロフィル特徴（１）を有する放射性リガンドのための結合部位を発現する。Ｄ−２レセプターｃＤＮＡのクローニングは、レセプター活性化の効果が容易に決定できる細胞ライン中にＤＡレセプターを発現させることが可能になる。我々は、マウスＬｉｔ胞を亜鉛誘発マウスメタロチオネインプロモーターの規制のもとでＲＧＢ−２でトランスフェクトすることによって得られた細胞ラインへ〔３Ｈ〕スピロペリドールおよび他のＤ−２アンタゴニストの結合を以前記載した（１）、我々はまた、以前使用したアッセイ条件のもとでは、ＤＡのＬＺＲＩ膜への結合はＧＴＰへ応答しなかったことを報告した。我々は今や、ＲＧＢ−２ｃＤＮＡによってコードされたＤ−２レセプターはアゴニストの結合のグアニンヌクレオチド感受性およびアゴニストがアデニレートサイクラーゼ活性を阻害する能力に関して機能的であることを示す。皿Ｕ：（α−３２Ｐ〕アデノシン−５゛−トリリン酸（ＡＴＰ、１０〜５０Ｃ４／ｍｍｏ　Ｉ）および〔３Ｈ〕サイクリツクＡＴＰ　（３１，９Ｃｉ／ｍｍｏｌ）はＮｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ　（Ｂｏｓ　ｔｏｎ、ＭＡ）から購入し、〔３Ｈ〕スピロヘリドール（９５Ｃｉ／ｍｍｏｌ）はＡｍｅｒｓｈａｍ（ＡｒｌｉｎｇｔｏｎＨｅｉｇｈｔｓ、Ｉｔ）から購入した。グアノシン−５”− トリリン酸（ＧＴＰ）、ＤＡ、サイクリックＡＴＰ、３−イソブチル−１−メチルキサンチン、ＡＴＰおよびフォルコリンはＳｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ、Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から購入した。キンピロール、ＬＹ１８１９９０　（Ｌｉｌｌｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、ブロモクリプチン（Ｓａｎｄｏｚ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ）、（＋）および（−）３−ＰＰＰ（Ａｓｔｒａ）は親切な贈与品であった。トランスフエフシラン：全ＲＯＢ−２ｃＤＮＡはプラストｐＺｅｍ３　（１１）にクローンされた。ｃＤＮＡおよびベクターはベクター上のＢｇｌ　ｎ部位およびｃＤＮＡアダプター上のＳａｔ　１部位へ部分的にはめ込むことによって両立性とされた。このプラスミドはプラスミドｐＲ３Ｖｎｅｏと共にアウスＬｔｋ− 細胞中へＣａＰＯａ沈澱技術（１２）によって同時トランスフェクトされた。トランスフェクトントはＧ４１８の３５０μｇ　／　ｍ　ｌ中で選択され、単離され、ノーザンプロット分析によってＲＧＢ−２ｍＲＮＡの発現についてスクリーンされた。ＲＧＢ−２ｍＲＮＡの高い発現に基いで選択されたサブクローンＬＺＲＩは以前Ｌ−ＲＧＢ　２　Ｚｅｍ−１として一部特徴化された（１）。第２の細胞ライン、ＬＺＲ２は同じ方法で単離された。組織培養：細胞は、１５０ｍｍ直径のＦａｌｃｏｎ組織培養プレート（Ｂｅｃｋｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｌｉｎｃｏｌｎ　Ｐａｒｋ、ＮＪ）中２０，０００細胞／ｃｍ”の密度においてプレートされ、成育培地をトリプシン−ＥＤＴＡ（０，１％トリプシン。０．０２％ＥＤＴＡ、リン酸塩緩衝食塩水中）で交換するか３日目に供給することによってサブカルチャーされ、そして５日または６日目に収穫された。細胞は、５％ウシ胎児血清および５％鉄補給子ウシ血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ、Ｌｏｇａｎ、ＵＴ）を補強したＤｕｌｂｅｃｃｏ修正イーグル培地（Ｓｉｇｍａ）中、１０％ｃｏ、／９０％空気雰囲気中３７°Ｃで成育された。細胞は、成育培地を水冷低張緩衝液（１ｍＭ　Ｎａ゛−ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７，４，２ｍＭ　ＥＤＴＡ）で交換することによって溶解された。１０〜１５分間膨潤後、細胞をプレートからかき落とし、２４，０００ｘｇにおいて２０分遠心した。得られた粗膜分画をＢｒｉｎｋｍａｎｎ　Ｐｏ１ｙｔｒｏｎホモジナイザーでセツティング６において１０秒トリス等張食塩水（５０ｍＭ）リスＭＣＩ、ｐＨ７，４，０，９％ＮａＣ１）中に再懸濁し、レセプター結合実験のため一７０℃で貯蔵するか、または直ちにアデニレートサイクラーゼ実験に使用するためトリス等張食塩水に再懸濁し、２４，０００ｘｇで２０分遠心し、トリス等張食塩水に再懸濁した。レセプター結合アッセイ：膜調製物は解凍し、２４，０００ｘｇで２０分遠心し、指示した場合を除きトリス等張食塩水に再懸濁した。膜調製物の部分標本は、（最終濃度）５０ｍＭｔ−リスＨＣＩ。ｐＨ７，４，０，９％　ＮａＣ１，０，０２５アスコルビン酸、０．００１％ウシ血清アルブミン、〔３Ｈ〕スピロベリドール、および適当な薬物を含んでいるアッセイチューブへ加えた。（＋）ブタクラモール（２μＭ）は、ＫＩ、値に近い放射性リガンドの濃度においては典型的には総結合の１０％以下である非特異性結合を決定するために使用された。アッセイは、飽和分析のためには２ｍ１．阻害分析のためには１ｍｌの容積を実施された。インキュベーションはタンパク１５〜５０μｇの添加によって開始され、３７°Ｃで５０分実施され、そして各アッセイへ水冷緩衝液（１０ｍＭトリス、ｐＨ７，４，０，９％ＮａＣＩ）を加えることによって停止された。サンプルはガラス繊維フィルター（Ｓｃｈｌｉｃｈｅｒ　＆　５ｃｈｕｅｌｌ　Ｎｏ、３０）を通して濾過され、洗浄緩衝液の１０ｍ１で洗浄された。フィルターに残っている放射能をＢｅｃｋｍａｎＬＳ　１７０１シンチレーシヨンカウンターを用いてカウントした、データは、データ解析プログラムＥｎｚｆ　１ｔｔｅｒ　（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ−Ｂｉｏｓｏｆｔ）を用いて非直１ｇ回帰によって解析された。競合実験においては、Ｋ１値が実験的に決定したＩＣ，。値からＣｈｅｎｇおよびＰｒｕｓｏｆｆ法によって計算された。Ｋ１およびＫ。の平均値は幾何平均である。ＤＡの結合に対するＧＴＰおよびＮａＣ１の効果を評価するために仕組まれた実験においては、新鮮な組織が使用される。細胞が収穫され、遠心され、そしてトリスＭｇ”　（５０ｍＭ　トリス、ｐＨ７，４，４ｍＭ　ＭｇＣ１ｚ）中にＭｇ”再懸濁された。組織は再遠心前にこの緩衝液中３７°Ｃで１５分インキュベートされた。再懸濁したタンパクは、添加したＮａＣ１またはＧＴＰなしのトリスＭｇ″１か、または１２０ｍＭ　ＮａＣ１および１００μＭ　ＧＴＰを含むアンセイヘ添加された。アデニレートサイクラーゼアッセイ：　〔α”Ｐ）ＡＴＰの（３２Ｐ〕ｃＡＭＰへの変換はＳａ　ｌｏｍｏｎ　ｅｔ　ａ　１．（１４）が記載したのと実質的に同じようにして決定した。トリス等張食塩水に再懸濁した膜（５０〜１００μｇタンパク）は、５０ｍＭ　）リスＨＣＩ、ｐＨ７，４，５ｍＭ　ｃＡＭＰ、１ｍＭ　Ｓ−インブチル−１−メチルキサンチン、１ｍＭ　ＭｇＣＩｚ　、０．５ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．２５ｍＭ　ＡＴＰ、３０μＭ　ＧＴＰ、約２Ｘ１０”ｃｐｍ　（α”Ｐ）ＡＴＰ、および種々の薬物を含む０．２ｍｌのアッセイへ００１ｍ１の容積で加えられた。アッセイは２５　ｃ　ＤＮＡへ加温することにより開始され、２０分後Ｏ℃へ冷却し、次に各ア７セイヘトリクロル酢酸（３０％溶液ＩＱＯｕ１）を加えることによって停止された。〔３Ｈ〕サイクリツクＡＴＰ　（約３０，０００ｃｐｍ）を内部標準として各アッセイへ加えた。アッセイ容積を水で１ｍｌとし、チューブを２０００ｘｇで１０分遠心した。上清中のサイクリックＡＭＰは、Ｄｏｗｅｘ　ＡＧ５０Ｗ−Ｘ４および中性アルミナを含むカラム上の逐次クロマトグラフィーによって単離した。各アルミナカラムからの２ｍｌ溶離液は液体シンチレーションカウントのためＢｌｏ−３ａｆｅ　Ｉ　Ｉ　（ＲＰＩ、Ｍｏｕｎｔ　Ｐｒｏｓｐｅｃｔ、ＩＬ）１０ｍｌに溶かした。アルゴニストによるアデニレートサイクラーゼの阻害のための投与量レスポンス曲線は、プログラムＥｎｚｆｉｔｔｅｒを使用する非直線回帰により解析した。データは以下の式にあてはめた。Ｅ＝　（１００−Ｅｍａ　ｘ）／　１　＋　（Ａ／ＥＣ５ｏ）　’　＋Ｅｍａ　ｘここでＥは総刺激活性の％で表した酵素活性の量であり、Ａはアゴニストの４度、ＥＣ，。は酵素活性の５０％最高阻害を生ずるアゴニストの濃度、Ｅｍａｘはアゴニストの最高に阻害する濃度の存在下観察された酵素活性（総刺激活性の％で表す）、Ｎは傾斜計数である。ＥＣ，。値の平均値は幾何平均である。タンパク濃度はＰｅｔｅｒｓｏｎ法（１５）によって決定した。監果Ｈスピロ゛１　′−ル　Ａの　：ＬＺＲＩ細胞から調製した膜上のＤ−２レセプターの密度は〔３Ｈ］スピロペリド一ル結合の飽和分析によって決定された。ＲＧＢ−２は亜鉛誘発マウスメタロチオネインプロモーターの制御下にあるので、細胞の１００，１／Ｍ＠酸亜鉛前処理の（”ＨＥスピロペリドール結合に対する効果も決定した。結合部位の密度は、対照ＬＺＲ１細胞においては７３６±１４０ｆｍｏｌ／ｍｇタンパクであり、亜鉛で処理したＬＺＲＩ細胞では７５９士Ｌ　５５　ｆ　ｍｏ　１７ｍｇタンパクであった。ＬＺＲ２と命名した第２の細胞ラインは、Ｄ−２レセプターの低い密度（平均Ｂｍａｘ±ＳＥ、４３５±７１ｆｍ。１　／　ｍ　ｇタンパク）を持っていた。ＬＺＲＩ細胞と対照的に、ＬＺＲ２細胞の結合部位密度は亜鉛処理により、６３０±５２ｆｍｏｌ／ｍｇタンパクへ５０％増加した（ｎ＝２）。対照ＬＺＲＩおよびＬＺＲ２＄１胞のための４２ｐＭの平均Ｋｎ　ＣｐＫｏ±ＳＥ、１０゜３７±０．１５．ｎ＝４）は、亜鉛処理細胞の４７ＰＭの平均に９値（１０，３３±０．１７）と有意差はなかった。すべての実験からの飽和分析の５ｃａｔｃｈａｒｄ）ランスフォーメーションは直線を与えた。野性タイプＬｔｋ−細胞は〔３Ｈ〕スピロベリドールの置換結合が検出されなかった（データ示さず）。ＬＺＲＩ細胞はＤ−２レセプターの高密度を有するので、これら細胞はすべての以後のすべての実験に使用された。アゴニス　による　■ガン′　ムの　：いくつかのアゴニストおよび関連化合物に対するＤ−２レセプターの見掛はアフィニティーを二つの実験において決定した（第９Ａ図１表１）。試験した６化合物のうち、ブロモクリプチンが最強力であり、平均Ｋｌ　［２ｎＭであったが、Ｄ−２選択性アゴニストキンピロールの不活性エナンチオマーであるＬＹ１８１９９０は最も弱かった。すべてのアッセイは、ＬＺＲＩ細胞から調製した膜を用いて、０．１ｍＭ　ＧＴＰおよび１２０ｍＭ　ＮａＣ１の存在下実施された。他の実験においては、ＤＡによる放射性リガンド結合の阻止に対するＧＴＰおよびＮａＣｌの影響が決定された（第９Ｂ図）。これらの実験には新たに調製された膜が使用され、ホモシネ−ジョンおよびアッセイ緩衝液へ４ｍＭ　ＭｇＣ１ｚが加えられた。ＧＴＰおよびＮａＣ１の不存在下、平均ＩＣ５ｏは２５＃Ｍ（平均−１ｏｇ（ＩＣ，。）±５Ｅ＝４．６±０．３）であった。アッセイ緩衝液へＧＴＰおよびＮＣＩの添加は平均ＩＣ２゜値を、〔３Ｈ〕スピロベリドールの結合を変えることなく１６７μＭ（３，８±０．３．ｎ＝４）へ上昇させた。ＧＴＰおよびＮａＣ１の不存在下のＨｉｌｌ計数は０．５０ないし０．６８（平均０．６４）の範囲であったが、ＧＴＰおよびＮａＣ１の存在下の値は０．７７ないし１．１（平均０．９４）の範囲であった。ＧＴＰおよびＮａＣｌの不存在下で、ＤＡの阻害曲線は、結合部位に二つクラスが存在すると仮定することによって最良に適中し得る。高いアフィニティーの一クラスは、しセプター総数の４８± １４％を表わし、０．３μＭＯＤＡに対する平均Ｋｒを持っていた。レセプター総数の５２±１３％を占める第２のクラスは平均に１値２４μＭを持っていた。ゴニス　に　−ニレ−イ　−−ゼゞ　の　：ＬＺＲＩ細胞からの新たに調製した膜において、しかし野性タイプＬｔｋ−細胞からの膜ではなくて、ＤＡはフォルスコリン刺激アデニレートサイクラーゼ活性の濃度依存変調を生ぜしめる。最大阻害は６２４　ｎＭのＥ　Ｃｓ。値をもって総活性の２７％であった（第１ＯＡ図、表１）。キンビロールはドパミンと大体同じく有効であり、すなわちキンビロールによって誘発される最高阻害はＤＡによる誘発と類似であった。ＬＹ１８１９９０はその活性異性体より強力でなくそして有効でなく（第１０Ｂ図、表１）、アデニレートサイクラーゼ活性のＤ−２レセプター仲介阻害は立体選択的であることを示す、３実験のうち２実験だけにおいて、ＬＹ１８１９９０が測定し得る酵素活性阻害を示した（表１）との知見は、この化合物はアゴニスト活性を少ししかまたは全く持っていないことを示唆する。同様に、（−）３−ＰＰＰは検出し得るアゴニスト活性を持っていなかった。ブロモクリプチンは、Ｅ　Ｃｓ。値４５ｎＭを持ち、最も強力なアゴニストであった。フ゛ロモクリブチンおよび（＋）３−ＰＰＰはＤＡより有効でなく、このためこれら薬物は部分的アゴニストであるように見える。１０ｍＭ　ＤＡによるＬＺＲＩ細胞中のアデニレートサイクラーゼ活性の阻害は、アッセイへ（＋）ブタクモールｌＯμＭの添加によって防止され（第１１図）、ＤＡの阻害はレセプター仲介であることを示す。また、百日咳トキシンによるＬＺＲＩ細胞の処理（５Ｏｎｇ／ｍｌ成育培地、１６時間）は、細胞から調製した膜においてＤＡ−阻害酵素活性をブロックしく第１０Ｃ図）、Ｇｉは酵素活性ＯＤＡによる阻害を仲介することを示す。興味あることに、百日咳トキシン処理細胞からの膜中のフォルスコリン刺激アデニレートサイクラーゼ活性は、対照膜中の活性よりも２．５倍大であった。（以下余白）表　１アゴニストによる放射性リガンド結合およびアデニレートサイクラーゼ活性阻害〔３Ｈ〕スピロペリドール（０，２ｎＭ）の結合阻害によって決定した、ＬＺＲＩ細胞から調製した膜上のＤ−２レセプターに対する６種の薬物の見掛はアフィニティーと、フォルスコリン刺激アデニレートサイクラーゼ活性の半最高阻害を生ずる各薬物の濃度（ＥＣ３゜）を示す。μＭで表した薬物濃度は、３実験（ＥＣ，。、キンビロールおよび（＋）３−ＰＰＰ）、４実験（ＥＣ，。、ＤＡ）または２実験（Ｋ２．すべての薬物およびＥＣ，。、ブロモクリプチン）の幾何平均である。観察されたアデニレートサイクラーゼ活性の最高阻害（Ｍａｙ）は、１０μＭフォルスコリンの存在下の総活性の％阻害の平均値±ＳＥＭとして表わした。ＬＹ１８９９０については、示した結果は酵素阻害が見られた２実験からのものである。３番目の実験では阻害がなかった。ｆ　−１旦Ｌ−Ｍ　ａ　ｘドパミン　１７　０．６　２７±３％キンビロール　９　０．７　２８±２％ＬＹ１８９９０　２７７　５．０　１０ ±２％ブロモクリプチン　０．００２４　０．０４　１７±１％（＋）３−ＰＰＰ　３３　４．０　１６±３％（−）３−ＰＰＰ　０．８７　−　− Ｉ論以前に報告したように、ラットＤ−２レセプターｃＤＮＡで形質転換したＬｔｋ −細胞はＲＡ　Ｄ−２レセプターの高密度を発現する（１）。我々は、Ｄ−２レセプターを７５０ないし１００１０００ｆ／ｍｇタンパクの密度で安定に発現する（現在の結果；１を参照）、ＬＺＲＩと命名したこれら細胞のサブクローンの一つを特徴化した。Ｄ−２ｃＤＮＡはプライミド　ｐＺｅｍ３に含まれるので、亜鉛誘発プロモーターの規制のもとで、放射性リガンド結合の性質に対する亜鉛処理の効果が決定された。ＬＺＲＩ細胞上のＤ−２レセプターは亜鉛の不存在下において最大に発現されるように思われ、そのため亜鉛処理はレセプターの密度に増加を生じなかった。亜鉛に対する応答性の欠如はＬｔｋ−細胞ラインの特徴ではない。我々はＬｔｋ−細胞の第２の形質転換されたラインＬＺＲ２を分離し、それではＤ−２レセプターの密度は４３５ないし６３０　ｆｍｏ　１７ｍｇタンパクから亜鉛処理によって約５０％上昇される。〔３Ｈ〕スピロペリドールに対するＤ−２レセプターのアフィニティーは亜鉛処理によって有意に変化しなかった。ＬＺＲＩ細胞上のＤ−２レセプターのいくつかのアゴニストおよび関連する薬物に対する見掛はアフィニティーは〔３Ｈ〕スピロペリドールの特異結合のＧＴＰ存在下での薬物による阻害に決定された。ブロモクリプチンは２ｎＭのに、値をもって極めて強力なアゴニストであった。キンビロールの強度は、ＤＡと同様に約１０ｕＭであった。アゴニストの結合は立体選択的であった。これはＬＹＩ８１９９０はその活性エチナチオマーであるキンビロールよりかなり弱く、そして（−）３−ＰＰＰは（＋）３−ＰＰＰより強力であるからである。これらデータはＬＺＲＩ細胞上のＤ−２レセプターに対するアンダゴニストの結合の我々の以前の研究（１）を拡大する。Ｄ−２レセプターの刺激の生理学的効果は、アデニレートライクラーゼ活性を阻害するグアニンヌクレオチド結合タンパクＧｉによって仲介されるものと考えられる（１６）。アゴニストの高いアフィニティー結合は、アゴニスト、レセプター、およびＧｉのα−サブユニット（Ｇｉα）よりなる三元複合体であると考えられ、ＧＴＰによるＤ−２レセプターへのアゴニスト結合の阻害はＧｉαからのＤ−２レセプター〇〇ＴＰ誘発解離を表明する。ＲＧＢ−２ＣＤＮＡによってコードされたＤ−２レセプター〇Ｇタンパクへ結合する能力を評価するため、放射性リガンド結合の阻害に対するＤＡの強度に対するＧＴＰの効果が決定された。ＬＺＲＩ細胞を用いた予備研究において、我々は１２０ｍＭ　ＮａＣ１を含みそして添加したＭｇ”を含まない我々のｊｌＡ１！アッセイ緩衝液において、ＤＡの結合はＧＴＰへ感受性ではないが（１）、同じ条件下でラット線条体膜へのＤＡの結合はＧＴＰによって阻害される（データ示さず）ことを発見した。ＬＺＲ１膜におけるＧＴＰへの感受性の欠如については三つの可能性ある説明が存在した。（１）Ｌｔｋ−細胞から誘導したＬＺＲＩ細胞は適当なＧタンパクを欠いている可能性がある。（２）ＲＧＢ−２ｃＤＮＡはＤ−２レセプターの結合サブユニットだけをコードする。ＲＧＢ−２によってコードされたこのタンパクの予想された主要構造とグアニンヌクレオチド結合タンパクへ結合した他のレセプター間の類似性のため、この可能性はありそうちなかった。（３）結合アッセイのイオン性条件が三元複合体の形成または不安定化のために適性ではなかった可能性がある。ここに記載した研究においては、イオン性条件はＧＴＰ感受性結合を観察する可能性を増すように変化された。高アフィニティーアゴニスト結合を最大にするため、組織はＭｇＣ１，と前インキュベートされ、そしてＭｇＣ１□はアッセイ緩衝液中に含めされた（１７）。三元複合体のＧＴＰ誘発不安定を最大にするため、ＮａＣ１をＧＴＰと共に加えた（１７）。これらの条件下、ＧＴＰおよびＮａＣ１の添加はＤ−２レセプターに対するＤＡの強度を低下させ、ＬＺＲ１細胞からの膜において阻害曲線の傾斜を増加させた。三元複合体の形成および不安定化のためのイオン必要性はＬＺＲ細胞からの膜においてラット線条体からの膜におけるよりも一層急務であったことは興味がある。ＤＡ　Ｄ−２レセプターによるアデニレートサイクラーゼ活性の阻害は良く特徴化された現象である（３，１８．１９）。いくつかの薬物によるアデニレートサイクラーゼ活性の阻害はＬＺＲＩ細胞からの膜において評価された。ＤＡおよびＤ−２選択性アゴニストであるキンピロールの最大有効濃度は、フォルスコリン刺激酵素活性を約３０％減少させた。ＤＡによる酵素活性の阻害はＤ−２アンタゴニストである（＋）ブタクラモールによってブロックされた。試験した最も強力なアゴニストであるブロモクリプチンは、他によって報告されたように（１９，２０）、部分的アゴニストのようであった。アゴニストによるアデニレートサイクラーゼの阻害は、キンピロールの右旋性エナンチオマーであるＬＹ１８１９９０は少ししかまたは全く有効性を持っていなかったので、立体選択的であった。以前報告されたように、部分的アゴニスト（＋）３−ＰＰＰは（−）３−ＰＰＰより強いアゴニストであるが、（−）３−ＰＰＰは高いアフィニティーをもってＤ−２レセプターへ結合する（２１．２２）。我々はＬＺＲＩ細胞からの膜においては（−）３−ＰＰＰによるアデニレートサイクラーゼ活性の阻害を観察しなかった。アゴニストによるアデニレート活性の阻害について決定したＥＣ，。値は、リガンド結合のアッセイにおいて決定したに、値よりも一般に低かった（表１）。これはこれら細胞上のレセプター予備の存在のためかも知れないが、薬物は酵素活性の最高阻害において異なるとの観察は、最も有効なアゴニストであるＤＡおよびキンピロールに対してさえも多くのレセプター予備は存在しないことを示唆する、さらに、（＋）３−ＰＰＰのような部分的アゴニストのためのレセプター予備も存在しないであろう。代りの説明は、アデニレートサイクラーゼ活性の阻害は、後部下垂体中のＤＡによる酵素活性の阻害について提案されているように（２３）、三元複合体の形成によって誘発された高アフィニティー状態におけるアゴニストのＤ−２レセプターへの結合に関係していることである。他方、ＧＴＰおよびＮａＣｌの存在下決定された本報告中のに１値は、低アフィニティー状態におけるアゴニストのレセプターへの結合を表明する。アデニレートサイクラーゼおよび放射性結合アッセイは異なる温度で実施されたので直接比較は困難であるが、高アフィニティークラスの部位へのＤＡ結合のに１値（０，３膜Ｍ）は、ＤＡ阻害アデニレートサイクラーゼに対するＥＣ，。値（０，６μＭ）に近く、低アフィニティークラスの部位へのＤＡの結合のためのに、値（２４μＭ）およびＧＴＰ存在下の結合のためのに、値（１７μＭ）はかなり高い。ＤＡは、百日咳トキシンで処理したＬＺＲＩ細胞からの膜中ではアデニレートサイクラーゼ活性を阻害しなかった。百日咳トキシン触媒ＧｉのＡＤＰリボシル化はアデニレートサイクラーゼのＧｉ仲介阻害を防止するので、この知見はＤ−２レセプターは形質転換したＬＺＲｌ細胞中のＧｉαと相互作用するとの仮説と一致する。他の細胞タイプの百日咳トキシン処理後アデニレートサイクラーゼのイソブレテレノールによる刺激について観察されたように（２４）、百日咳トキシンによる無傷のＬＺＲＩ細胞の処理はアデニレートサイクラーゼを刺激するフォルスコリンの能力を増強し、ある種の細胞ラインにおいてはＧｉはフォルスコリンおよびホルモン刺激アデニレートサイクラーゼ活性を変調するように通常作用することを示唆した。我々は、Ｄ−２レセプターの高密度を安定して発現する、ＲＧＢ−２ｃＤＮＡでトランスフェクトした細胞ラインを特徴化した。この細胞ラインをもって、アデニレートサイクラーゼ活性を阻害するようにグアニンヌクレオチド結合タンパクと生産的に相互作用するＤＡ　Ｄ−２レセプターをコードするｃＤＮＡが決定された。ＲＧＢ−２ｃＤＮＡは、殆どすべてのタイプの細胞において機能的Ｄ−２レセプターの発現を命令するように見える。例えば、ラット下垂体腫瘍から得た０Ｈ４Ｃ，細胞は、ラット前部下垂体中のラクトトロフはＤ−２レセプターを発現するけれども、ＤＡレセプターを欠くプロラクチン分泌細胞である。ＧＨ，Ｃ，細胞へのＲＧＢ−２ｃＤＮＡのトランスフェクションは、ここに記載したものと似た機能的特徴を有するＤ−２レセプターの発現を生ずる（２６）。Ｄ−２レセプターｃＤＮＡでのトランスフェクションによってつくられた細胞ラインは、Ｄ−２レセプターの作用および規制のメカニズムの研究に有用であろう。１、Ｂｕｎｚｏｗ、　Ｊ、Ｒ，、）１．Ｈ，Ｍ、　Ｖａｎ　Ｔｏｌ、　Ｄ、に− Ｇｒａｎｄｙ、Ｐ、λ１ｂａｒｔ　。Ｊ、　５ａｌｏｎ、　Ｍ、　Ｃｈｒｉｓｔｉｅ、　Ｃ，λ、　Ｍａｃｈｉｄａ、Ｋ、ｌ　Ｎａｖｅ。ａｎｄ　Ｏ，Ｃ１ｖｅｌｌｉ、Ｃｌｏｎｉｎｇ　ａｎｄ　＊ｘｐｒｅ＋ｓｇｉｎｇ　ｏｆ　ａ　ｒａｔｏｚ　ｄｏｐａｍｉｎｅ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ＣＤＮ八。ココ６：７８コー７８７　（１９８８）。ｌ　Ｋｅｂａｂｉａｎ、　Ｊ、Ｗ、、　ａｎｄ　Ｄ、Ｂ、　Ｃａ１ｎｓ、Ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ｒｅｃｅｐｔｏｒｓｆｏｒ　ｄｏｐａｍｉｎａ、　２７７：’Ｄ− ９６（１９７９）。３、Ｄｅ　Ｃａｍ１ｌｌｉ、　Ｐ、、　Ｄ、　Ｍａｃｃｏｎｉ、　ａｎｄ　Ａ、　５ｐａｄａ、Ｄｏｐａｍｉｎｅｉｎｈｉｂｉｔｓ　ａｄｅｎｙｌａｔｅ　ｃｙｃｌａｓａ　ｉｎ　ｈｕｍａｎ　ｐｒｏｌａｃｔｉｎ−ｓｅｃｒ＠ｔｉｎｑ　ｐｉｔｕｉｔａｒｙ　ａｄａｎｏｍａｓ。２７１１＝２５２−２５４　（１７９）。４、Ｍａｌｇａｒｏｌｉ、　Ａ、、　Ｌ、　Ｖａｌｌａｒ、　Ｆ、Ｒ，Ｅｌａｈｉ、　Ｔ、Ｐｏｚｚａｎ、　Ａ。５ｐａｄａ、　ａｎｄ　Ｊ、　Ｍａｌｄｏｉａｓｉ、Ｄｏｐａｍｉｎｅ１ｎｈｉｂｉｔｓ’ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ　Ｃａ　−ｚｎｃｒａａｓｅｓ　１ｎ　ｒａｔ　１ａｃｔｏｔｒｏｐｈ　ｃｅｌｌｓ＝Ｅｖｉｄｅｎｃｅ　ｏｆ　ａ　ｄｕａｌ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍ　ｏｆ　ａｃｔｉｏｎ、Ｌ二医ユ。ＱｇＢ、　２６２：ｌ：１９２０−１：＋９２７　（１９８））。５、Ｄｒｏｕｖａ、　Ｓ＋Ｖ、、　Ｅ＋Ｒａｒａｔ、　Ｃ，Ｂｉｈｏｒｅａｕ、　Ｅ、　Ｌａｐｌａｎｔｅ、　Ｒ＋Ｒａ５ｏｌｏｎｊａｎａｈａｒｙ、　Ｈ，Ｃ１ａｕｓａｒ、　ａｎｄ　Ｃ，Ｘｏｒｄｏｎ。Ｄｉｈｙｄｒｏｐｙｒｉｄｉｎａ−ｓａｎｓｉｔｉｖａ　ｃａｌｃｉｕｍ　ｃｈａｎｎｅｌａｃｔｉｖｉｔｙ　ｒ＠１ａｔｅｄ　ｔｏ　ｐｒｏｌａｃｔｉｎ、　ｇｒｏｗｔｈ　ｈｏｒｍｏｎｅ。ａｎｄ　ｌｕｔｅｉｎｉｚｉｎｇ　ｈｏｒｍｏｎｅ　ｒａｌａａｓａ　ｆｒｏｍ　ａｎｔｅｒｉｏｒｐｉｔｕｉｔａｒｙ　Ｃ＋１１１１！！　ｉｎ　ｃｕｌｔｕｒｅ、Ｉｎｔ＠ｒａｃｔｉｏｎｓ　ｗｉｔｈｇｏｍａｔｏａｔａｔｉｎ、　ｄｏｐａｍｉｎｅ、　ａｎｄ　ａｓｔｒｏｇｅｎｓ＋シ踵応ズカ五１ｚ■１２３：２７６２−２７７３　（１９８８）。６＋Ｌａｃｅｙ、　Ｍ、Ｇ、、　Ｎ、Ｂ、　Ｍｅｒｃｕｒｉ、　ａｎｄ　Ｒ，Ａ、　Ｎｏｒｔｈ、Ｄｏｐａｍｉｎｅａｃｔｓ　ｏｎ　Ｄ２　ｒ＠ｃｅｐｔｏｒｓ　ｔｏ　１ｎｃｒｅａｓｅ　ｐｏｔａｓｇｉｕｎ＋ｃｏｎｄｕｃｔａｎｃ＠　ｉｎ　ｎｅｕｒｏｎｅｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｒａｂ　ｇｕｂｓｔａｎｔｉａ４１ｇ　（１９８））。フ、　ＳｉｍｊＩｏｎｄｓ、Ｓ、Ｈ，、ａｎｄ　Ｐ、Ｇ、Ｓｔｒａｎｇｅ、　工ｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｏｆｉｎｏｓｉｔｏｌ　ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ　ｂｒｅａｋｄｏｗｎ　ｂｙ、　Ｄ２ｄｏｐａｍｉｎｅｒａｃｅｐｔｏｒｓ　ｉｎ　ｄｉｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｂｏｖｉｎａ　ａｎｔｅｒｉｏｒｐｉｔｕｉｔａ？ｙｃｅｌ１ｇ、　’　ｔ、６０：２６７−２７２（１９８５）。ａ、　Ｅｎプａｌｂｅｒｔ、Ａ、、Ｆ、５ｌａｄａｃｚｅｋ、Ｇ、Ｇｕｉｌｌｏｎ、Ｐ−Ｂｅｒｔｒａｎｄ。Ｃ，Ｓｈｕ、Ｊ、Ｅｐ＠ｌｂａｕｍ、Ａ＋　Ｇａｒｃｉａ−５ａｉｎｚ、Ｓ、Ｊａｒｄ、Ｃ。Ｌｏｍｂａｒｄ、Ｃ−Ｋｏｒｄｏｎ、ａｎｄ　Ｊ、Ｂｏｃｋａｅｒｔ、Ａｎｇｉｏｔａｎｓｉｎエエａｎｄ　ｄｏｐａｍｉｎｅ　ｍｏｄｕｌａｔａ　ｂｏｔｈ　ｃＡＭＰ　ａｎｄ　１ｎｏｓｉｔｏｌｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｓ　ｉｎ　ａｎｔｅｒｉｏｒ　ｐｉｔｕｉｔａｒｙＣａｌｌｓ：　工ｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ　ｉｎ　ｐｒｏｌａｃｔｉｎ　５ｅｃｒｅｔｉｏｎ、、Ｊ＝匙しよ３五剣ｙ　２６１：４０７１−４０７５　（１９８６）。９、Ｊｕｄｄ、入９Ｍ、、工、５．Ｌｏｇｉｎ、Ｘ、Ｋｏｖａｃｓ、Ｐ、Ｃ，Ｒｏｓｓ、Ｂ−Ｌ。Ｓｐａｎｇｅｌｏ、ｗ、ｏ、Ｊａｒｖｉｓ、ａｎｄ　Ｒ，Ｍ−ＭａｃＬｅｏｄ。Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈａ　ＭＭＱ　ｃｅｌｌ、　ａ　ｐｒｏｌａｃｔｉｎ−ｇ＊ｃｒａｔｉｎｇ　ｃｌｏｎａｄ　ｃａｌｌ　１ｉｎｅ　ｔｈａｔ　ｉｓ　ｒａｓｐｏｎｓｉｖｅ　ｔ。ｄｏｐａｍｉｎａ、　１２３＝２３４１−２：１５０　（１９８８）。ｌＯ−Ｌａｆｋｏｗｘｔｚ、　Ｒ−Ｊ−ａｎｄ　Ｍ−Ｇ−Ｃａｒｏｎ、ｘｃｉｒｅｎｅｒｇｘｃｒａｃａｐｔｏｒｓ＝　Ｍｏｄｅｌｓ　ｆｏｒ　ｔｈａ　５ｔｕｄｙ　ｏｆ　ｒｅｃｅｐｔｏｒｓｃｏｕｐｌｅｄ　ｔｏ　ｇｕａｎｉｎｅ　ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｐｒｏｔｅｉｎｓ、　ｅ　、　２６３：４９９３−４９９６　（１９８８）。１１、Ｕｈｌｅｒ、　Ｍ、Ｄ、、　ａｎｄ　Ｇ、Ｓ、　ＭｃＫｎｉｇｈｔ、Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｃＤＮＡｓｆｏｒ　ｔｗｏ　ｉｓｏｆｏｒｍｓ　ｏｆ　ｔｈａ　ｃａｔａｌｙｔｉｃ　５ｕｂｕｎｉｔ　ｏｆｃＡＭＰ−ｄｅｐｅｎｄａｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ　１ｃｉｎａｓａ、　’　、　。２６２：１５２０２−１５２０７．１９８７゜１２、Ｇｏｒｍａｎ、Ｃ，、Ｒ，ＰａｃＬｏ＋ａｎａｂｈａｎ、　ａｎｄ　Ｂ、Ｈ，Ｈｏｗａｒｄ、Ｈｉｇｈ＠ｆｆ１ｃｉｅｎｃｙ　Ｄ）ＪＡ−ｍａｄｉａｔａｄ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｒｉｍａｔａｃａｌｌｓ、ぶ二旦四遭２３１：５５１−５５３　（１９８３）。１３、Ｃｈｅｎｇ、　Ｙ、−Ｃ，ａｎｄ　Ｗ、Ｈ，Ｐｒｕｓｏｆｆ、Ｒａ１ａｔｉｏｎｓｈｉｐ　ｂａｔｗｅｅｎｔｈｅ　１ｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｃｏｎｓｔａｎｔ　（Ｋ、）　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆ　１ｎｈｉｂｉｔｏｒ　ｗｈｉｃｈ　ｃａｕｓｅｓ　５０　ｐｅｒ　ｃｅｎｔ　１ｎｈｉｂｉｔｉｏｎ（工ｓｏ）　ｏｆ　ａｎ　ａｎｚｙｍａｔｉｃ　ｒｅａｃｔｉｏｎ、扇Ω〇」ｈ２−ｕｌゑ９日、２２：３０９９−３１０８　（１９７３）−−１４，Ｓａｌｏｍｏｎ、Ｙ、、Ｃ，Ｌｏｎｄｏｓ、ａｎｄ　Ｍ、Ｒｏｄｂａｌｌ、Ａ　ｈｉｇｈｌｙｓａｎｓｉｔｉｖｅ　ａｄｅｎｙｌａｔｅ　ｃｙｃｌａｓｅ　ａｓｓａｙ、Ｎ瓜ｋｄ工亀は一一七１．　５８＝５４１−５４８　（１９７４）。Ｌ５−　Ｐａｔ＠ｒｓｏｎ、　Ｇ、Ｌ、Ａ　ｓｉｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｐｒｏｔｅｉｎａｓｓａｙ　ｍｅｔｈｏｄ　ｏｆ　Ｌｏｗｒｙ　ａｔ　ａｌ、ｗｈｉｃｈ　ｉｓ　ｍｏｒｅｇｅｎａｒａｌｌｙ　ａｐｐｌｉｃａｂｌｅ、　８コニ３４６−３５６　（１９７７）。１６、Ｃｏｔｓ、Ｔ、Ｅ、、Ｅ、Ａ、Ｆｒｅｙ、Ｃ，Ｗ、Ｇｒａｖｅ、ａｎｄ　Ｊ、Ｗ。Ｋａｂａｂｉａｎ、Ｅｖｉｄｅｎｃｅ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｄｏｐａｍｉｎｅ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　１ｎｔｈｅ　ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ　１ｏｂｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｒａｔ　ｐｉｔｕｉｔａｒｙ　ｇｌａｎｄＬｓ　ａｓｓｏｃｉａｔａｄ　ｗｉｔｈ　ａｎ　１ｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　ｇｕａｎｙ１１７、Ｈａｍｂｌｉｎ、　Ｍ、Ｗ、、　ａｎｄ　Ｘ、　Ｃｒｅａｓｅ、３Ｈ−Ｄｏｐａｍｉｎａ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ｔ。ｒａｔ　５ａｒｉａｔａｌ　Ｄ−２ａｎｄ　Ｄ−３ｓ土ｔｅｓ＝　Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ　ｂｙｍａｇｎｅｓｉｕｍ　ａｎｄ　１ｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｂｙ　ｇｕａｎｉｎｅ　ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓａｎｄ　ｓｏｄｉｕｍ、ＩＪ工り玉ｄ１３０：１５８７−１５９５　（１９Ｂ２）。ＬＢ、Ｗｅｉｓｓ、Ｓ、、Ｍ、５ａｂｂａｎ、Ｊ−Ａ、Ｇａｒｃｉａ−５ａｉｎｚ、ａｎｄ　Ｊ。Ｂｏｃｋａｅｒｔ、Ｄ２−Ｄｏｐａｍｉｎｅ　ｒｅｃａｐｔｏｒ−ｍｅｄｉａｔａｄｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃｙｃｌｉｃ　ＡＭＰ　ｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｉｎ　５ｔｒｉａｔａｌｎｅｕｒｏｎｓ　ｉｎ　ｐｒｉｍａｒｙ　ｃｕｌｔｕｒｅ、　ｃ２７：５９５−５９９　（１９８５）。１９、　０ｎａｌｉ、　Ｐ、、　Ｍ、Ｃ，０１ｉａｎａｓ、ａｎｄ　Ｇ、Ｌ、　Ｇｅ５ｓａ。Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｄｏｐａｍｉｎａ　ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ　ｍｅｄｉａｔｉｎｇｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｄｅｎｙｌａｔａ　ｃｙｃｌａｓａ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｉｎ　ｒａｔｓｔｒｉａｔｕｍ、　２Ｂ＝ｌコ８−１４５　（１９１１１５）。２０、Ａｇｕｉ、　Ｔ、、　Ｎ、　Ａｍ１ａｉｋｙ、　Ｍ、Ｇ、　Ｃａｒｏｎ、　ａｎｄ　Ｊ、Ｗ、　Ｋａｂａｂｉａｎ。Ｂｉｎｄｉｎｇ　ｏｆ　［１２５工］−Ｎ−（ｐ−ａｍｉｎｏｐｈｅｎａｔｈｙｌ　）　５ｐｉｒｏｐｅｒｉｄｏｌｔｏ　ｔｈｅ　Ｄ−２ｄｏｐａｍｉｎｅ　ｒａｃｅｐｔｏｒ　ｉｎ　ｔｈｅｎａｕｒｏｉｎｔａｒｍｅｄｉａｔａ　１ｏｂ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｒａｔ　ｐｉｔｕｉｔａｒｙ　ｇｌａｎｄ：Ａ　ｔｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃ　５ｔｕｄｙ、　ａ　１２：１６３−１６９　（１９８８）。２１、　Ｋｏｃｈ、Ｓ、Ｗ−、ＢＪＣ，Ｋｏａ、ａｎｄ　Ｎ−Ｇ、Ｂａｃｏｐｏｕｌｏｓ。Ｄｉｆｆｅｒａｎｔｉａｌ　ａｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｅｎａｎｔｉｏｍｅｒｓ　ｏｆ　３−（３−ｈｙｄｒｏｘｙｐｈａｎｙｌ）−Ｎ−ｎ−ｐｒｏｐｙｌｐｉｐｅｒｉｄｉｎａ　（３−ＰＰＰ）　ａｔｄｏｐａｍｉｎｅ　ｒａｃｅｐｔｏｒ　５ｉｔｅｓ＋９２：２７９−２８３　（１９８３）。２２、Ｍａｌｌａｒ、Ｅ、、Ｉｃ、Ｂｏｈｍａｋａｒ、Ｙ、Ｎａｍｂａ、Ａ、Ｊ、Ｆｒ１ｅｄｈｏｆｆ。ａｎｄ　Ｍ、　Ｇｏｌｄｓｔａｉｎ、Ｒａ１ａｔｉｏｎｓｈｉｐ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｒｅｃｅｐｔｏｒＯＣＣｕｐａｎＣｙａｎｄ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ａｔ　ｇｔｒｆａｔａｌ　ｄｏｐａｍｆｎｅａｕｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒｓ、　コ１：５９２−５９８（１９８７）。２コ、　Ｂｏｒｇｕｎｄｖａａｇ、Ｖ−、ａｎｄ　Ｓ、Ｒ，Ｇａｏｒｇａ−Ｄｏｐａ＋ｎ１ｎａｉｎｈｉｂｉセｉｏｎ　ｏｆ　ａｎｔｅｒｉｏｒ　ｐｉｔｕｉセａｒｙ　ａｄｅｎｙｌａｔｅｃｙｃｌａｓｅ　ｉｓ　ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｔｈｒｏｕｇｈ　ｔｈｅ　ｈｉｇｈ−ａｆｆｉｎｉｔｙｓｔａｔｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｃ２ｒｅｃｅｐｔｏｒ、　Ｉ、ム１（Ｌ」ム；Ｌ１　コ１：〕１９−コ８６（１９８５）。２４、Ａｂｒａｍｓｏｎ、Ｓ、Ｎ、、Ｍ、Ｗ、Ｍａｒｔｉｎ、Ａ−Ｒ，Ｈｕｇｈｅｓ、Ｔ、Ｋ。Ｈａｒｄｅｎ、）Ｃ，Ａ、Ｎｅｖａ、Ｄ＋入＋　Ｂａｒｒａｔｔ、ａｎｄ　Ｐ− Ｂ。Ｍｏ１ｉｎｏｆｆ、Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ　ｏｆβ＋ａｄｒｅｎａｒｇｉｃ　ｒｅｃｅｐｔｏｒｓｗｉｔｈ　ｔｈｅ　１ｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　ｇｕａｎｉｎａ　ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ　ｏｆ　ａｄｅｎｙｌａｔｅ　ｃｙｃｌａｓａ　ｉｎ　ｍｅｍｂｒａｎｅｓｐｒｅｐａｒｅｄ　ｆｒｏｍ　ＣＹＣ−５４９１ｙｍｐｈｏｍａ　ｃｅｌｌｇ、１江臆シ七ＬＰｈ復ｒｍ克ｑｑ１１　３フ：４２８９−４２９７　（１９８Ｂ）。２５、　Ｔａ５ｈうｉａｎ、Ａ、Ｈ，Ｃ１ｏｎａｌ　５ｔｒａｉｎｓ　ｏｆ　ｈｏｎｎｏｎｅ−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇｐｉｔｕｉｔａｒｙｃｅｌｌｓ、　ｅｔ、　５８：５２７−５３５（１９７９）。２６、Ａｌｂｅｒｔ、Ｐ、Ｒ，、に、Ｎａｖｅ、Ｊ、Ｂｕｎｚｏｗ、ａｎｄ　Ｏ，Ｃ１ｖｅｌｌｉ。Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｒａｔ　ｄｏｐａｍｉｎｅ　Ｃ２ｒ＠ｃａｐｔｏｒ　ｃＤＮＡ　ａｘｐｒａｓｓａｄ　ｉｎ　ＧＨ，Ｃ，ｒａｔ　ｐｉｔｕｉｔａｒｙｃａｌｌｇ、　フ１：　（ｉｎ　ｐｒｅｓｓ）。実施例２肛我々は、Ｃ２−ドパミンレセプターの薬理学との結合部位をエンコードするｃＤＮＡを記載した（Ｂｕｎｚｏｗ、Ｊ、Ｒ，ら（１９６８）Ｎａｔｕｒｅ　３３６．７８３−７８７）、我々は、このタンパクは機能性レセプターであること、すなわちｃＡＭＰ生産およびホルモン分泌を阻害するようにＧ−タンパクと結合することをここに明らかにする。このｃＤＮＡはドパミンレセプターを欠（ラット体泌乳刺激ホルモン細胞株であるＧＨ，Ｃ，に表現された。安定なトランスフェクトントが単離され、ノーザン班上のＣ２−ドパミンレセプターｍＲＮＡの最高レベルを持つ−クローンＧＨ，ＺＲ？が詳細に研究された。ＧＨ，ＺＲ？から単離された膜へのＣ２−ドパミン拮抗体３Ｈ−スピペロンの結合は、Ｋｏ＝９６ｐＭおよびＢｍａｘ＝２３００　ｆｍｏ　１７ｍｇタンパクで飽和し得る。ＧＴＰ／ＮａＣ１の添加は、３Ｈ−スピペロン結合に対してドパミン競合のＩＣ５ｏ値を２倍増加させ、Ｃ２−ドパミンレセプターは一種以上のＧタンパクと相互作用することを示した。ドパミン結合部位の機能へアクセスするため、ドパミンの急性生物学的作用がＧＨ４ＺＲ？細胞中で特徴化された。ドパミンは休止細胞内および細胞外ｃＡＭＰレベルを５０〜７０％（ＥＣｓｏ＝８±２ｎＭ）減少し、そして基準レベルの８〜１２倍であるｃＡＭＰレベルのＶＩＰ−誘発増強を完全にブロックした（ＥＣｓｏ＝６±１ｎＭ）。スピペロン、（＋）−ブタクラモール、（−）−スルピライドおよび５ＣＨ２３３９０によるＶＩＰ−増強ｃＡＭＰレベルのドパミン誘発阻害の拮抗作用は、Ｄ、−レセプターにおけるこれら拮抗体のに１値から予期される濃度において発生し、そして立体選択的であった。ドパミン（およびいくつかのＣ２−選択的アゴニスト）は、ＧＨ，ＺＲ，膜中５００〜８００　ｎＭのＥＣ，。をもって、フォルスコリン刺激アデニレートサクラーゼ活性を４５±６％阻害した。細胞ｃＡＭＰおよび脱調製物中におけるアデニレートサイクラーゼ活性のドパミン阻害は、百日咳トキシンによる前処理（５０ｎＭ／ｍ　ｌ、１６　ｈ）によって停止された。ドパミン（２００ｎＭ）はＶＩＰおよびＴＲＨ−誘発プロラクチン放出を停止した。これらデータは、このｃＤＮＡクローンは、Ｇタンパクへ結合し、アデニルサイクラーゼと、そしてｃＡＭＰ依存および非依存ホルモン分泌を阻害する機能的ド）ｉミンＤｉ　レセプターをエンコードすることを結論的に示す。ＧＨ，ＺＲ，細胞は、ドパミンＣ２レセプターの生化学のそれ以上の解明に有用であることを証明するであろう。庄並下垂体からのＰＲＬ分泌を支配する主要エレメントは、下垂体同車流中のドパミン濃度である（１）。ドパミンは下垂体ラクトトロフ上のドパミン−Ｃ２レセプターを介して基本およびホルモン刺激ＰＲＬ分泌を阻害するように作用する（１ −５）。ドパミン−Ｄｔレセプターは百日咳トキシン感受性阻害Ｇタンパクと相互作用しく６−９Ｌアゼニレートサイクラーゼ活性を減らし、そして他の剤によるｃＡＭＰレベルの増強をブロックする（６．１Ｏ−１２）。ドパミンはまた、ラクトトロフ中の（Ｃａ”）を減少させ、そして特にＴＲＨのような他の剤による（Ｃａ”）の上昇を阻害する（１３−１５）。ドパミンのｃＡＭＰおよび（Ｃａ　”）の阻害は、一つ以上の百日咳トキシン感受性Ｇタンパクへの結合によって仲介され、そしてＰＲＬ分泌のドパミン阻害に貢献するように見える（１５）。ドパミン作用のこれらの要素間の正確な関係は、非均質細胞タイプの存在、細胞数の制限、および広汎なラクトトロフ調製物の応答性の変動のため、研究することが困難であった（１５．１６）。ドパミン−Ｃ２レセプターｃＤＮＡの最近のクローニング（１７）は、このレセプターの細胞内作用および調節を検討するための有用な道具を提供する。このＣ２−ドパミンレセプタークローンが機能的レセプターの合成を指令し、ドパミン −Ｃ２レセプター活性化を生物学的効果の間の経路を規定するかどうかを検討するため、我々は下垂体由来細胞株Ｇ　Ｈａ　Ｃ＋細胞中ヘドパミンーＤ２レセプターｃＤＮＡをトランスフェクトした。０Ｈ４Ｃ＋細胞はラット下垂体細胞であり、これはＰＲＬおよびＧＨを合成分泌し、そして種々のホルモン、成長因子、神経伝達レセプター、二次メ・ノセンジャーシステムおよびイオンチャンネルを有し、そしてラクトトロフ機能のアクセスし得るモデルを提供した（１８．１９）、Ｌかしながら、これら細胞は正常ラクトトロフ上に存在するドパミン−Ｃ２レセプターを欠いており、このためドパミン＝Ｃ２レセプターの機能の研究のための理想的ホストを提供する。本報告は、ｃＤＮＡクローンの遺伝子生産物はドパミン−Ｃ２レセプターとして機能し、そして阻害Ｇタンパクへ結合し、ｃＡＭＰ蓄積およびＰＲＬ放出を減少させることを明らかにする。ここで特徴化されたＧＨ，Ｃ，）ランスフエクタントは、Ｃ２レセプターにおけるドパミン作用のメカニズムをさらに研究することができる有用な細胞システムを提供するに違いない。皇１１作材料：ドパミンアゴニストおよびアンタゴニストは、キンピロール（リリー）、ブロモクリプチン（サンド研究所）、および（＋）および（−）３−ＰＰＰ　（アトラス）を除いて、リサーチ、バイオケミカルズ、インコーホレーテッド（マサチューセッツ州つオルサム）からのものであった。２−０−スクシニル−ｃＡＭＰに対するウサギ抗体−ウシ血清アルブミン複合体は、ＩＣＮ（カリフォルニア州アービン）から得、そしてｒＰＲＬ［［準および抗−ｒＰＲＬ抗体はｌ　’ Ｊ−ラ７ド州ヘセスダ、ＮＩＤＤＫＳＳａｌｖａｔｏｒｅＲａ　ｉ　ｔ　ｉ博士からのものであった。ペプチド類はＰｅｎｌｎｓｕｌａ社（カリフォルニア）またはＳ　ｉ　ｇｍａ社（ミズリー州セントルイス）からのものであった。α”Ｐ −ｄｃＴＰ　（２，２０ＱＣｉ／ｍｍｏ　Ｉ）”！−２−０−　（ヨードチロシルメチルエステル）スクシニルｃＡＭＰ　（２，２００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）、３Ｈ −ｃＡＭＰ　（３１，９Ｃｉ／ｍｍｏ　ｌ）はＮｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ社（マサチューセッツ州ボストン）からのものであった。すべての他の薬品は主としてＳ　ｉ　ｇｍａ社から得た試薬級であったＰ　ＺＥＭ　Ｄｉ−ｃＤＮＡの構築：ｐＺＥＭ−３プラスミド（２０）をメタロチオネインプロモーターとｈＧＨ３’　−フランキング配列の間のＢｇｌ　ｎ部位において切断した。ドパミン−ＤｚｃＤＮＡ全長（１７）は、λＧＴＩＯからＳａｌ　Ｉで切開し、そしてｄＡＴＰおよびｄＧＴＰ　（２５０ｇＭ）の存在下切断したｐＺＥＭ−３プラスミドヘリゲートし、そしてＥ、Ｃｏｌｔ株ＸＬ−１（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中へ形質転換した。組換え物はそれらの３２ｐ標識Ｄ　ｚ　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａへのハイブリダイゼーションと、次に制限分析およびＤＮＡ配列によって特徴化された。オリエンテーシタンの意味におけるｃＤＮＡ挿入物による組換え物を調製し、真核細胞中へのトランスフェクションのためＣｓＣｌ勾配遠心によって精製した細胞培養：Ａ、Ｈ，Ｔａ５ｈｉｊｉａｎ、Ｊｒ、博士（マサチューセッツ州ボストン、バーバート大学）から得たＧＨａＣ＋細胞およびサブクローンを、１０％ウシ胎児血液を補給したＨａｍ　ＦｌＯ培地中、３７°Ｃにおいて５％ＣＯ２中で発育させた。３Ｈ−スピペロン結合またはアデニレートサイクラーゼ活性、の研究のため、細胞は１０％ウシ胎児血清を補給したＤｕＪｂｅｃｃｏの修正イーグル培地中、３７°Ｃで１０％ＣＯ２中で成育させた。培地はトランスフェクションまたは実験前１２〜２４時間に交換した。トランスフェクションのため、ＧＨ，Ｃ，ＩＩ胞は２〜４Ｘ１０”＄１１１Ｆ胞／１０ｃｍ皿へ成育させた。２０＃ｇのｐ　Ｚ　ＥＭ　Ｄｚ　ｃ　ＤＮＡおよびｌｕｇのｐＲ３Ｖ−ネオを２ｍｌのＨｅｐｅｓ緩衝化食塩水中リン酸カルシウムで共沈させ、細胞上に１０〜２０分置いた装加温Ｆ１０＋１０％ウシ胎児血清（ｐＨ７，０）８ｍｌを加え、細胞を３７°Ｃで４〜５時間インキュベートした。プレートを洗浄し、細胞をインキュベーター中に１６〜２０時間置いた装７００ｔ１ｇ／ｍｌのＧ４１８（ジェネチシン、Ｇｉｂｃｏ、Ｎ、Ｙ、）を補給した新しい培地を次の３〜４週にわたって添加し、ネオ抵抗を発現する安定なトランスフェクシントを選別した。個々のコロニー３〜５μｍを採取するため無菌マイクロピペットを使用して単一コロニーを単離した。トランスフェクタント細胞ラインのストックを液体窒素中に貯蔵冷凍すれば、０４１Ｂは成育培地から排除した。ＲＮＡ単離およびノーザン斑分析：細胞をカルシウム不含Ｈｅｐｅｓｉｌ衝化食塩水＋０．０２％ＥＤＴＡ中で洗い、そしてトリス緩衝化グアニジウム塩酸塩で抽出し、１．７ｇ／ｍｌ　ＣｓＣｌパッドを通して遠心しく３３．−００Ｏｒｐｍ、１６ｈ）、そしてペレットをフェノール／クロロホルムで抽出し、エタノール沈澱させる（２１）、ＲＮＡを再懸濁し、０Ｄ＝２６０　ｎｙｎにおけるＵＶ吸収によって定量する。ノーザン斑のため、ＲＮＡをグリオキサールＺＤＭＳＯ中で変性しくＩｈ、５０℃）、１０ｍＭリン酸ナトジナトリウム中ガロースゲル上へ流した。ＲＮＡをナイロン膜（Ｎ−結合。Ａｍｅｒｓｈａｍ）上に一夜しませ、８０°Ｃで２時間焼付けした。プレハイブリッド化は６時間４２℃において記載したように行った、ランダムにプライムしたＤ　ｚ　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａの３Ｒｐ標準１．　６ＫｂＢａｍＨＩ−Ｂｇｌ　１１７ラグメント（１〜２　Ｘ　Ｉ　Ｏ’　ｄ　ｐ　ｍ　／　Ｂｇ）を５０％ホルムアミド中４２℃における１６〜２０ｈのハイブリッド化のために使用した。斑点を２ＸＳＳＣＸＳＳＣ中室０で洗浄し、０．２ｘＳＳＣ，０，５％ＳＤＳ中７０°Ｃにおける３×１５分洗浄を行い、そして増悪スクリーンを使用してＸ線フィルムへ一夜−８０°Ｃにおいて露出した。リガンド結合：細胞膜は、最初成育培地を水冷した低張緩衝液（１ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７，４，２ｍＭ　ＥＤＴＡ）で交換することによって調製した。１０〜１５分膨潤した後、細胞をプレートからかき落し、２４，０００ｇにおいて２０分遠心し、トリス等張食塩水（５０ｍＭトリス、ｐＨ７，４，０，９ＮａＣＩ）中セツティング６においてＢｒｉｎｋｍａｎ　Ｐｏ１ｙｔｒｏｎホモジナイザーで１０秒分解し、レセプター結合実験のための一７０°Ｃにおいて貯蔵するか、またはアデニレートサイフサラーゼアッセイ（後記）に直ちに使用するため、５０ｍＭトリス、ＰＨ７，４中に再懸濁し、上記のように遠心し、５０ｍＭトリス中に再懸濁した。結合アッセイのため、膜調製物は解凍し、遠心しく２４，０００ｇＸ２０分）、特記した場合を除きトリス等張食塩水中に再懸濁した。膜調製物の部分標本を５０ｍＭトリス、ｐＨ７，４，０，９％ＮａＣ１，０，０２５％アスコルビン酸、０．００１％ウシ血清アルブミンａＨ−スビペロンおよび指示した薬物を含んでいる試験管へ加える。（＋）−ブタクラモール（２μＭ）は非特異性結合を規定するために使用した。これは放射性リガンドのに、値近くの濃度における総結合の１０％以下であった。アッセイは、飽和分析のため２ｍｌのまたは阻害分析のため１ｍｌの容積において二度実施した。インキュベーションは膜タンパク１０〜５０μｇの添加によって関しされ、そして３７°Ｃにおいて５０分実施し、そして各試験管へ水冷した緩衝液（１０ｍＭトリス、ｐＨ７，４，０，９％ＮＣＩ）１０ｍｌの添加によって停止した。サンプルはガラス繊維フィルター（Ｓｃｈｌｉｃｈｅｒおよび５ｃｈｕｅｌｌ　Ｎｏ、３０）を通して直ちに濾過し、水冷緩衝液１０ｍ１で洗った。フィルター上に保持された放射能をベックマンＬＳ１７０１シンチレーションカウンターを用いてカウントした。ドパミン結合に対するＧＴＰの効果を調べる実験においては、細胞を収穫し、遠心し、トリス−Ｍｇ”（５０ｍＭ）リス、ｐＨ７，４，５ｍＭ　ＭｇＣｌ、）中に再懸濁し、１５分間３７°Ｃでインキュータートした。遠心後再懸濁したタンパクを、ＧＴＰまたはＮａＣｌを添加しないトリス−Ｍ　ｇ　”、または１２０ｍＭ　ＮａＣｌおよびｌｏｏμＭ　ＧＴＰを添加したトリス−Ｍｇ”を含むアッセイへ加えた。ｃ　Ａ　Ｍ　ＰおよびＰＲＬアッセイ：細胞を実験３〜７日前に６ウエル、３５ｍｍ皿中にプレートした。細胞は２ｍｌ／ウェルの加温下１０＋０．１％（−）アスコルビン酸＋２ｍＭ）リス（ｐＨ７，２）（ＦＡＴ）中５〜１０分プレインキュベートし、１ｍｌ／ウェルのＦＡＴ＋１００μｍ　ＩＢＭＸ＋実験化合物を加え、３７℃において３０分間インキュベートした。実験化合物はアッセイ直前につくったストック溶液から２００〜１０００倍希釈した。最終エタノール濃度はＧＨ，ＺＲ，細胞中の基準またはＶＩＰ増強ｃＡＭＰまたはＰＲＬレベルに対し影響のない濃度である、０．１％を決してこえなかった。培地を集め、細胞を沸騰水１ｍｌ中で直ちに分解した。細胞分解物および培地を遠心しく２０００　ｇ、１０分、４°Ｃ）、上清を細胞抽出物としてアッセイのため集めた。細胞抽出物および培地サンプルは、もし直ちにアッセイしなければアッセイまで一２０ ℃で冷凍した。ｃＡＭＰは、使用した抗体を１：５００希釈して記載した特異性ラジオイムノアッセイ（２２）によってアッセイした。４℃において１６時間インキュベーション後、１０％Ｂ５Ａ２０μ！および９５％エタノール１ｍｌを続いて加え、抗体−抗原複合体を沈澱させた。標準曲線はｃＡＭＰを標準として用い、０゜５±０．２μｍｏｌのＩＣ，、を示した。ＰＲＬは、ＦＡＴ培地中３０分インキュベーションの間ＩＢＭＸを省略したことを除き、上記のようにして得た培地サンプル中でアッセイした。ＰＲＬレベルは抗体−抗原複合体を沈澱するため５ｔａｐｈｙｌｏｃｃｕｓ　Ａ分解物（ＩｇＳｏｒｎｂ、Ｔｈｅ　Ｅｎｚｙｍｅ　Ｃｅｎｔｅｒ、Ｍａｌｄｅｎ、ＭＡ）を使用する特異性ラジオイムノアッセイ（２３）によって測定した。アデニレートサイクラーゼアッセイ：α”Ｐ−ＡＴＰの：＋ｚｐ−ｃＡＭＰへの転換は、本質上Ｓａｌｏｍｏｎ　ｅｔ　ａｌ　（２４）によって記載されたように測定された。膜（１０〜５０μｇ）は１００μｍの容積において、５０ｍＭ）リス、ｐＨ７，４，５ｍＭ　ｃＡＭＰ、１ｍＭ　ＩＢＭＸ、１ｍＭ　ＭｇＣ１ｚ、０．５ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．２５ｍＭ　ＡＴＰ、３０μｍ　ＧＴＰ、約２Ｘ１０”ｃｐｍのα”Ｐ−ＡＴＰおよび種々の薬物を含んでいるアッセイ２００μｌへ添加された。、３回実施されたアッセイは、２５°Ｃへ加温することによって開始され、０°Ｃへ冷却することにより停止された、各アッセイへトリクロル酢酸（３０％溶液１００μｌ）を加え、そして各チューブ’Ｈ−ｃＡＭＰ　（３０，０００ｃ　ｐｍ）を内部標準として加えた。アッセイ容積は水の添加によって１ｍｌへ増量され、チューブは遠心（２０００ｇＸ１０分）された。上清中のｃＡＭＰはＤｏｗｅ　ｘ　ＡＣｙ５０Ｗ−Ｘｓ樹脂および中性アルミナを含むカラム上のシーケンシアルクロマトグラフィーによって単離された。各アルミナカラムからの２ｍｌ溶離物を液体シンチレーション計数のため１０ｍ１のＢｌｏ−３ａｆｅＩＩ　（ＲＰＩ、ＭｏｕｎｔＰｒｏｓｐｅｃｔ、ｒＬ）中に溶解した。計算：ｃＡＭＰおよびＰＲＬアッセイからのデータは、３回測定の平均上標準誤差として表わされる。曲線あてはめパラメータは、Ｅｎｚｆｉｔｔｅｒプログラム（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ　Ｂｉｏｓｏｆｔ）を使いる非直線回帰分析によって得られた。平均アフィニティ＋、ＥＣ，。およびＩＣｓ。値は、実験の指示数の幾何平均である。競合実験においては、Ｋ１値はＣｈｅｎｇおよびＰｒｕｓｏｆｆの方法（２５）により実験的に決定したＩＣ，、値から計算された。すべての実験は第１６図に提供したもの（２回）を除いて、独立した３〜５回の試験の代表であった。結果：安定なトランスフェクトントの特徴化：ｃ）１．ｃ、細胞は、ｐＺＥＭ　Ｄｚ　ｃＤＮＡおよびｐＲ３Ｖ−ネオで同時トランスフェクトされ、抗生物質Ｇ４１８へ抵抗性のコロニーが単離され、最初ノーザン斑分析によって特徴化された。− クローンＧＨ，ＺＲ，は、他のクローンより高い２．５ｋｂ　Ｄｚ　ＲＡＡレベルを持っていた（第１３Ａ図）。野性タイプ（トランスフェクトしない）ＧＨ，Ｃ、ｍ胞、そしてｐ　ＺＥＭ−３ベク９−３中ニア　ット５　ＨＴ’＋ａレセプター遺伝子を発現するＧＨ，Ｃ，細胞トランスフェクトント（ＧＨ，ＺＤ、。）は、Ｄ！−レセプタープローブへハイブリッド化を示さなかった。３６時間１０ μＭ　ＺｎＳＯ４によるＯＨ，ＺＲ４細胞の前処理は、Ｄ２レセプターｍＲＮＡの著しい増強を誘発し、転写されたｍＲＮＡは亜鉛感受性メタロチオネインプロモーターによって調節されること（２０）を示す。ＧＨ，ＺＲ，クローンは、このクローンにおけるドパミン−Ｄ２レセプター発現の高レベルのため、以後の分析（後記）のために使用された。選択的ドパミン−Ｄ２レセプターアンタゴニストである３Ｈ−スピペロンの特異的結合は、ＧＨ，ＺＲ，細胞から調製した粗製膜中でアッセイされた（第１３Ｂ図）、ＧＨ，ＺＲ，膜は、ＺｕＭ（＋）ブタクラモールによって置換された３Ｈ −スピペロン結合の飽和し得る成分を示したが、野性タイプＧＨ４Ｃ，細胞からの膜は特異的３Ｈ−スピペロン結合を示さなかった（データ示さす）。５回の実験において、ＧＨ，ＺＲ，細胞膜は２０４６±３１５ｆｍｏｌ／ｍｇタンパクの最高特異性３Ｈ−スピペロン結合と、９Ｇ±１ｐＭの平均に、値を示した。これらの値は、これら細胞中のドパミン−Ｄ２結合部位の強い発現と、そしてラット線状膜中に、そしてＰＺＥＭ−Ｄ、−ｃＤＮＡでトランスフェクトしたＬｔｋ− 細胞中に得られるもの（１７）に匹敵するｓＨ−スピペロンに対する親和性を指示する。発現されたドパミン結合部位がＧタンパクと相互作用するかどうか確かめるため、ドパミンによる３Ｈ−スピペロン結合の阻害を１００μＭ　ＧＴＰおよび１２０ｍＭ　ＮａＣ１の不存在または存在下においてＯＨ，ＺＲ？細胞膜中でアッセイした（第１３Ｃ図）。アッセイはドパミンの高いアフィニティー結合を向上させるため４ｍＭ　ＭｇＣｌ□の存在下で実施された。添加したＧＴＰおよびＮａＣ１の不存在下では、ドパミンはＩＣ，。＝４９±１５μＭと、Ｈｉｌｌ計数０．６９をもって８Ｈ−スピペロン結合を阻害し、ドパミンに対し高いおよび低いアフィニティ一部位の存在を示唆した。２種類の結合部位の存在を推測させるモデルに従ったデータの解析は、レセプターの４６±１５％はドパミンに対し高いアフィニティ（Ｋｎ＝０．５μＭ）を有し、残りのレセプターはアゴニスト点対して低いアフィニティー（３０μＭ）を持っていることを示した。ＧＴＰおよびＮａＣ１の存在下においては、ドパミンに対する■ＣＳＯは、単一性（０，９３）へ近いＨｉｌｌ計数をもって１０９± ２０μＭ（Ｋ＋−ｔ７μＭ）へ２倍シフトした。このように、ＧＴＰ／ＮａＣｌの存在は、線条細胞調製物中で観察されたように（６、７）、ドパミンレセプターを高いおよび低いアフィニティーレセプターの不均質集団から低アフィニティーアゴニスト集団状態にあるレセプターの殆ど均質な集団へコンバートする。これらのデータは、クローン化したドパミン結合部位はＯＨ，細胞中に発現させる時Ｇタンパクと相互作用することを示唆する。ｃＡＭＰおよびＰＲＬレベルに対するドパミンの作用：発現したドパミン−Ｄｔ　レセプタークローンの機能を直接テストするため、細胞ｃＡＭＰレベルに対するドパミンの作用を測定した。これらのアッセイは、これら細胞中のフォスフオシエステラーゼ活性を阻害するため、１００μＭ　ＩＢＭＸの存在下で実施した（２２）。このように、ｃＡＭＰレベルの観察された変化は、ｃ　Ａ　Ｍ　Ｐの分解の変化ではなくその合成速度の変化を表わす、ベースｃＡＭＰレベルに対するドパミンの作用と、そしてｃＡＭＰのＶＩＰ−増強レベルのドパミン阻害が測定された。ＧＨ４Ｃｔ　１胞は、他者により記載されたように（２２，２６）、ｃＡＭＰ蓄積の増強をもってＶＩＰに応答する（第１４Ａ図）、ドパミンは、インキュベーションの間ｖ！Ｐが存在してもしなくても、野性タイプＧＨ，Ｃ，細胞における細胞外ｃＡＭＰレベルに対して効果を持たなかった。この結果Ｄ２− ドパミンレセプターｍＲＮＡおよびＧＨ，Ｃ，細胞中の結合穴上昇させないため検知し得るり、〜ドパミンレスポンスを欠いていることを指示する。ＧＨ４ＺＲ？からの培地においては、ドパミンはベースｃＡＭＰレベルを阻害しく５０〜７０％）、そしてＶＩＰ−増強ｃＡＭＰをベースレベルへ減少させた。ｃＡＭＰレベルヲ減少させるドパミンのこれらの作用は、すべて実験に一貫して観察され、そしてドパミンは細胞内ｃＡＭＰレベルの低下にも等しく有効であった（第１４Ｂ図）。ＧＨ，Ｃ，細胞において以前観察されたように、細胞内および細胞外ｃＡＭＰレベルは平行して変化するが、ｃＡＭＰの低回収率のために一層著明であり得る。ｃＡＭＰ蓄積に対するドパミンの作用は、高度に選択的なドパミン−Ｄ２アンタゴニストである（−）スルピライドによってブロックされるが、非活性立体異性体（＋）スルピライドはｃＡＭＰ蓄積に対するドパミン阻害をブロックしなかった。スルピライドによる立体選択的ブロックは、ドパミンによるＧＨ，ＺＲ７中のｃＡＭＰレベルの阻害は野性タイプＧＨ，Ｃ，Ｉ−中に存在しないドパミン−Ｄ２レセプターの活性化によって仲介されたことを示した。ドパミン作用の生理学的成果は分泌の阻害であり、それはＧＨ。ＺＲ，細胞中の急性（３０分）ＰＲＬ放出を測定することによってアッセイされた（第１４Ｄ図）。ＶＩＰおよびＴＲＨはＰＲＬ分泌をそれぞれ１．　５倍および３倍増強した。ＶＩＰはｃ　Ａ　Ｍ　Ｐ依存メカニズムによってＰＲＬ放出を増強するものと考えられ（２２，２３，２６）、他方ＴＲＨはカルシウム代謝へリンクしたｃＡＭＰ非依存メカニズムによって作用する（１９．２７）。ドパミンはベースＰＲＬ放出を阻害しないが、ＶＩＰおよびＴＲＨ誘発ＰＲＬ分泌の増強はドパミンによってブロックされた。このようにドパミンはＧＨ４ＺＲ？細胞においてｃＡＭＰ依存およびｃＡＭＰ非依存分泌をブロックした。ドパミンのこれらの作用は（−）スルピライドによって逆転されるが、しかしく＋）スルピライドによっては逆転されない、Ｃ；Ｈ４Ｃｔ細胞においては、ドパミンはＰＲＬのベース、ＶＩＰ刺激またはＴＲＩ刺激分泌に対して効果を持たなかった（データ示さず）。生物学的応答に必要な濃度がドパミン＝Ｄ２レセプターに対するアフィニティーと相関するかどうかを調べるため、ｃＡＭＰレベルに対するドパミン作用について投与量レスポンス関係を調べた（第１５図）、ドパミンは似たｃＡＭＰレベルを強力に阻害した。さらに、ドパミンは、それぞれ８±２ｎＭおよび６±１ｎＭのＥＣ，。値をもって、ベースおよびＶＩＰ増強ｃＡＭＰ蓄積を阻害した。これらのデータは、ドパミンは大体等しい強度をもってベースおよび促進ｃＡＭＰ蓄積を阻害することを示す。ドパミンのこれら阻害作用の高強度は、ＧＨａＺＲｔ細胞が機能的ドパミン＝Ｄ２レセプターを発現するとの主張を支持する。ＧＨ，ＺＲ，中のｃＡＭＰのＶＩＰ増強レベルのドパミン阻害の薬理学的特異性は、特異性レセプターアンタゴニストを使用してさらに検討された（第１６図）、このデータは、ある種のレセプターアンタゴニストは細胞外ｃＡＭＰのＶＩＰ増強レベルのドパミン誘発阻害を逆転することを示す、最高ｃＡＭＰ（１００％）はＶＩＰ単独の存在下におけるｃＡＭＰレベルに相当した。ドパミン−Ｄ２アンタゴニスト（スピペロン、（＋）ブタクラモール、（−）スルピライド）の低濃度はドパミン作用をブロックしたが、特異性ドパミンアンタゴニストである５ＣＨ２３３９０は非常に高濃度においてのみ活性であった。Ｄよ一アンタゴニストの不活性立体異性体（−）ブタクラモール、（＋）スルピライド（第１４Ｃ図）はドパミン作用に対し少ししかまたは全く効果がなかった。ドパミン不存在下添加したアンタゴニストはｃＡＭＰ濃度を変えなかった。アンタゴニストに対するＩＣｓ。値から得た推測に１値（第１６図の説明を見よ）は、ドパミンレセプターの結合競合研究（Ｉ７）から決定した値に似ており、ＧＨ，ＺＲ，細胞中ドパミンによるｃＡＭＰレベル・の阻害は、ドパミン−Ｄ２レセプターと薬理学的に区別されるレセプターによって仲介されることを示す。アデニレートサイクラーゼの阻害：ドパミンレセプターアゴニスト↓こよるアデニレートサイクラーゼ活性の阻害を直接評価するため、”Ｐ−ＡＴＰのコ”Ｐ− ｃＡＭＰへの変換をＧＨ４ＺＲ？細胞から調製した膜中で測定した（第１７図）。ドパミンは総フォルスコリン（１０μＭ）刺激活性を０．３６μＭ　（ｎ＝５）の平均ＥＣ５ｏ値をもって４５％阻害した。下垂体において（１１）そして線状（２８）Ｈにおいて観察されたように、ブロモクリプチンは部分的アゴニストとして行動し、酵素活性を最高２３％阻害した（ＥＣｓ＝６ｎＭ）、選択的Ｄｔ −アゴニストによるアデニレートサイクラーゼ活性の阻害は立体選択的であった０例えば、キンピロールはフォルスコリン刺激サイクラーゼ活性を４１％（Ｅ　Ｃｓ。−０，３２ｎＭ）阻害したが、ＬＹ１８１９９０すなわちキンピロールの不活性（＋）エナンチオマーは酵素活性の一貫した減少を生じなかった。同様に、（＋）　３　Ｐ　Ｐ　Ｐ　（ＥＣｓｏ”０．　８６　ｎＭ）はドパミンのように有効であったが、エナンチオマー（−）３−ＰＰＰはアデニレートサイクラーゼ活性を一貫して減少しなかった。ＶＩＰもＧＨａＺＲ１細胞膜において、野性タイプＧＨ，Ｃ，ＩＩ胞膜について報告されているように（２９）、アデニレートサイクラーゼ活性を刺激した。２００ｍＭ　ＶＩＰにより刺激された総括性は２２±７ｐｍ。１７ｍｇタンパク／分（ｎ＝３）であり、そしてＶＩＰ増強活性はラット前下垂体膜中５０〜５０％阻害（１１）と比較して、ドパミン（１００μＭ）によって４１％阻害された。これら調製物においてベースアデニレートサイクラーゼ活性に対するドパミンの効果は観察されなかった。それにもかかわらず、ドパミンによるフォルスコリンまたはＶＩＰ刺激アデニレートサイクラーゼ活性の阻害は、ＧＨ，ＺＲ？細胞におけるドパミンによるｃＡＭＰ蓄積の阻害の可能性あるメカニズムを徒供スる。百日咳トキシン感受性：百日咳トキシンに対する感受性は、レスポンスを誘発するように阻害Ｇタンパク（例えばＧｉまたはＧｏ）へ結合する、ドパミン−Ｄ２レセプター（６〜１２．１５）のようなレセプターの品質証明である。１６時間の百日咳トキシンによるＧＨ４ＺＲ？細胞の前処理（第１２図）は、フォルスコリン刺激膜アデニレートサイクラーゼ活性のドパミン仲介阻害を解離し、ドパミンによるベースおよびＶＩＰ刺激ｃＡＭＰ蓄積の阻害を破壊した、使用した百日咳トキシン濃度およびインキュベーション時間は野性タイプ細胞におけるソマトスタチンレスポンスの最高ブロックを生じ（３０）、そしてドパミンレスポンスはこれらの条件下で殆ど完全に阻害された。対照的に、ベースおよびＶＩＰ刺激ｅＡＭＰ蓄積、およびベースおよびフォルスコリン刺激サイクラーゼ活性は百日咳トキシン前処理によって有意に変化しなかった。これらデータは、発現されたｃＤＮＡクローンはＧ　Ｈａ細胞中に存在する阻害Ｇタンパクへ機能的に結合し、そのため善意のレセプターを代表するドパミン−Ｄ２結合部位をコードするという主張を支持する。量論ドパミン−Ｄ２結合部位をコードするｃＤＮＡクローンは、該クローンがアデニレートサイクラーゼ阻害、ｃＡＭＰ蓄積、およびＰＲＬ分泌の阻害（６〜１２．１５）、へ百日咳トキシン感受性阻害Ｇタンパクによって結合される、機能的Ｄ２レセプターを発現するかどうかを決定するため、ＧＨ，Ｃ，細胞中に発現された。ドパミン−Ｄ　ｚ　レセプターは、ＧＨ，、ＺＲ７）ランスフェクタント中のＤｔレセプターｍＲＮＡの存在によって証明されるように、マウスメタロチオネインプロモーター（２０）の制御下Ｄ　ｚ　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ構造から特異的に発現された。ドパミン−Ｄ２２レセプターＲＮＡレベルはトランスフェクトしないＧＨ，Ｃ，細胞中、またはラット５−”ＨＴ１Ａレセプターサブタイプでトランスフェクトした細胞中において検出できなかった（第１３Ａ図）。ＧＨ，ＺＲ，細胞中に発見されたｍＲＮＡスペシスはラット脳中に見られるＤ２２レセプターＲＮＡと大体同じ分子量であった（１７）。ドパミン−Ｄ　ｔ　ｍ　ＲＮ　ＡのレベルはＧＨ４ＺＲ？細胞中１１００ｕ　Ｚｎ”の添加によって増加し、ｍＲＮＡの発現はＺｎ”ｉ受性マウスメタロチオネインプロモーターによって制御され、内因性遺伝子の転写を表わさないことを指示する。３Ｈ−スピペロン結合の特異的結合はＧＨ４ＺＲ？細胞のみに存在し、１００μＭ　Ｚｎ”によって増加され、そのためこれら細胞におけるドパミン＝Ｄ２レセプターｍＲＮＡの発現に相関した。Ｄｔ−レセプターｍＲＮＡはＧＨ，ＺＲ？細胞中の高アフィニティードパミンＤ２結合部位の強力な発現が得られるように転写された。ｃＨ，ＺＲｔ　）ランスフェクタント中のドパミン−〇ｚ、結合の存在は、ｃＡＭＰの強力な阻害およびＰＲＬ放出と、フォルスコリン刺激アデニレートサイクラーゼ活性の阻害に相関したが、ドパミンの作用はトランスフェクトしない゛Ｇ珂ａ　Ｃ＋細胞に見られなかった、ドパミンのこれら阻害作用は、下垂体ラクトトロフ中のドパミンの既知の生理学的作用（１，２）と正確に一致する。特に、ドパミンは、これらのプロセスの刺激はドパミン濃度が低濃度へ減少しない限り発生しないように、ラクトトロフ中のＰＲＬ分泌およびｃＡＭＰ蓄積を制御する（ｌ、３〜５）。同様に、ドパミンの最高濃度の存在下、ｖｒｐはＯＨ，ＺＲ？細胞中のｃＡＭＰレベルまたはＰＲＬ分泌を増強しない（第１４図）。ＧＨ，ＺＲ，細胞中のベースおよびＶ　Ｉ　Ｐｉｌ１強ｃＡＭＰ蓄積のドパミン阻害の強度（第１５図）は、下垂体間車流中のドパミン濃度が発情前記のメスラットにおいて７ＨＭから発情中２０ｎＭに変化し、そしてオスラットにおいては３ＨＭであること（３１）を考慮に入れ、ラクトトロフについて期待される濃度範囲内であった。特異性アゴニストおよびアンタゴニストを使用するアデニレートサイクラーゼおよびｃＡＭＰ蓄積のドパミン誘発阻害の薬理の詳細な解析は、ＧＨａＺＲｔ細胞中のドパミン作用はドパミン−Ｄｔ　レセプターとは区別し得るレセプターによって仲介されるとの結論と完全に一致する。 °　ドパミンの測定されたアフィニティー（第１３Ｃ図）とｃＡＭＰ蓄積阻害するドパミンの強度（第１３Ｃ図）との間の食い違いは、ＧＨａＺＲｑ細胞は余分のレセプターを持っていること、すなわち生物学的作用のためのＥ　Ｃｓ。をＫゎ値より低い値シフトされるのに十分に過剰の結合部位を持っている可能性を生ずる。代りの説明の一つは、膜調製物中のレセプターは細胞自体よりもアゴニストに対して低アフィニティーを持っている（しかし測定したＩＣ３゜値はに１）値に相関しているからアンタゴニストに対するアフィニティーは不変）ということである、そのままの細胞中に存在する一細胞質ゾルまたは膜関連成分は膜結合およびアデニレートサイクララーゼアッセイ条件では完全に置換されないから、膜調製物中のドパミンレセプターの最適機能を許容す、る成分が欠けている可能性がある。この主張はドパミンによる粒状アデニレートサイクラーゼの阻害に対するＥＤ５゜値、すなわち結合競合実験からドパミンに対して得られたに、値（５００ｎＭ）に近い値と、しかしそのままの細胞においてドパミンによるｃ　Ａ　Ｍ　Ｐレベルの阻害に対して得られた１００倍高いＥＣ，。値（６〜８ｎＭ）によって支持される。この条件の差はそのままの細胞対細胞調製物間のアッセイに見られまた差を説明し得る。しかしながら、アンタゴニストのアフィニティーはｃＡＭＰ蓄積実験から得られた推定に、値（第１６図）と良く相関し、アンタゴニスト結合は膜および全細胞において同様であることを指示した発現されたドパミン−Ｄ２結合部位のＧタンパクへの結合の別の証拠は、ＧＴＰの存在下ドパミン結合アフィニティーの低アフィニティーへのシフトである。このようなアフィニティーのＧＴＰ誘発シフトはラット脳からの膜におけるドパミン結合について報告されており（６，７ＬそしてレセプターとＧタンパクとの相互作用のためである（８．９）。ＧＴＰの存在下、Ｇタンパクはレセプターから解離し、レセプターを低アフィニティーアゴニスト状態に置く（６，７）ｗ　ドパミンの場合、この二つの状態間のアフィニティーの差は小さく、その５．ため低アフィニティー状態へのＧＴＰ誘発シフトは小さく　（２倍）、そしてＧ！タンパク解離を最大にするためＮａ゛イオンの存在を必要とする（２８）。ドパミンアフィニティーにおけるＧＴＰ−誘発シフトの観察は、発現されたレセプターはＧＨ，ＺＲ，細胞中の一種以上のＧタンパクと関連していることを示唆する。ドパミンの阻害作用は、レセプターが阻害Ｇタンパクへ結合することを指示するが、これは阻害Ｇタンパクを不活性化するようにＧＨ４ＺＲ７細胞を百日咳トキシンで前処理することによって一層直接的にテストされた（３０）。百日咳トキシン前処理は、ベースまたはＶＩＰ誘発ｃＡＭＰ蓄積を変えることなく、ドパミン作用を完全にブロックした。このように、百日咳トキシンは、多分ドパミン− Ｄｔレセプターを阻害Ｇタンパクから解離することにより、生物学的レスポンスのドパミン増強形質導入を阻止した。他の系（３２）と異なって、しかし野性タイプＧＨ，Ｃ，細胞（３０）と同様に、スチミュレーター（例えばＶＩＰ）によるｃＡＭＰレベルの増強は百日咳トキシン処理ＧＨ，ＺＲ，細胞においては増強されないし、ベースｃＡＭＰレベルも百日咳トキシンによって変化しなかった。これはＧＨ−ＺＲ７細胞中に存在する阻害ＧタンパクはｃＡＭＰ生産を強くするように阻害しないことを示唆する。ＧＨ，Ｃ，細胞上のソマトスタチンレセプターの存在は、ソマトスタチンとドパミンの阻害作用の直接比較を許容する。ドパミンと同様に、ソマトスタチンはベースアデニレートサイクラーゼ活性（２９）またはベースＰＲＬ分泌（３０）を阻害しない。ＧＨ４Ｃ１細胞におけるＶＩＰ刺激サイクラーゼ活性（２９）、ＶＩＰ増強ＣＡＭＰ蓄積（２２）、およびＰＲＬ分泌（２３，３０）のソマトスタチン誘発阻害は、すべてＧＨ，ＺＲ，細胞においてドパミンによって誘発された最大阻害の約半分であった。ドパミンの大きな効果はＤ２レセプターの過剰数の存在のためではなかった。これはｃＡＭＰ蓄積およびＰＲＬ分泌実験の条件下でのレセプター数は、ＧＨ４Ｃ１細胞中のソマトスタチンレセプター数（１３，０００部位／細胞）（３３）より少ない１０，０００部位／細胞以下であったからである。これら細胞に発現されたドパミンレセプターは形質導入阻害作用においてソマトスタチンよりも有効であることが明らかであり、ＧＨ細胞に存在するＧタンパクに対するドパミンレセプターの一層効果的な結合を示唆する。ＧＨ，Ｃ，細胞におけるドパミン−Ｄ２レセプターｃＤＮＡの発現の第２の理由は、ドパミン作用およびＤｔ　レセプターメカニズムを研究する新しいモデルを確立することである。今日までドパミンＤ２レセプターを発現する最も入手し易い細胞系であるラソトラクトトロフ中のドパミン作用の現在の研究は、ドパミン阻害のメカニズムについて多岐の結論へ導いた。ノイロンにおいて、ドパミンはＤ２レセプターが阻害Ｇタンパクへ結合することによって仲介される作用である（１５Ｌカリウムチヤンネルを開くこと（３５）による膜電位を高分極する（３４）。ラクトトロフにおけるドパミンによって誘発された腋窩分極（３６）はカルシウムチャンネルを閉じ、ベースカルシウム流入束を減らし、ドパミンによって誘発されたベース（Ｃａ”）の観察された低下（１３〜１５，３７．３８）を説明するであろう。しかしながら、ドパミンはある種の下垂体細胞において（Ｃａ”）を増加することが観察されている（３７）。ＧＨ４ＺＲ？Ｉ］１胞中の（Ｃａ”）のドパミン誘発変化を検討することにより、Ｄ２レセプターが（Ｃａ”）の変化に特異的に関連し、そしてホルモン分泌のドパミン阻害の仲介において（Ｃａ”）の役割を確かめることが可能になるであろう。他の解決されない論争の一つは、ドパミンが分泌の増強を阻止し、そしてＴＲＨのようなカルシウム移動ホルモンによって阻害するメカニズムである。あるものはフォスファチジルイノシトール代謝（３９，４０）および〔Ｃａ”）（１３，１４）のＴＲＨＫ発増強のドパミンによる阻害を報告し、他のものは変化を認めていない（３８，４１）。ＧＨ，ＺＲ１細胞においてドパミンによるＴＲＨ誘発ＰＲＬ放出の認められた阻害は、ドパミンはＴＲＨ誘発カルシウム移動またはフォスファチジルイノシトール代謝を変えるプロセス（例えばカリウムチャンネルの開口）へＧタンパクによって結合されることができることを示唆する。Ｇ　Ｈａ　Ｚ　Ｒを細胞は、ドパミン−Ｄ２レセプターのメカニズムに関するこれらおよび他の疑問を研究するための均質な、豊富なそして高度に応答性の調製物を提供するであろう。この報告に提供されたデータは、発現されたクローン（１７）は、ＰＲＬ分泌、ｃＡＭＰ生産、およびアデニレートサイクラーゼ活性を含む検討されたすべての作用において、ドパミン−Ｄ２レセプターの薬理を持っていることを指示する。Ｄ２クローン、１）ドパミン−Ｄ２結合部位のためのｃＤＮＡクローンはＧタンパク結合レセプターの原型構造を有する；２）該クローンは飽和し得るそして特異性結合性質を持ったタンパクを発現する；３）発現された結合部位に対するアゴニスト結合アフィニティーはＧＴＰの存在下減少する；４）発現されたレセプターはＧタンパクによって規制される合される；５）Ｇタンパクを解離する剤（例えば百日咳トキシン）は適当するレスポンスの発生から発現されたレセプターの活性化を解離する；との機能的Ｇタンパク結合レセプターとしての分類のための五つの基本的基準を満たす。結論として、クローン化したドパミン−Ｄ２レセプターとＧタンパクとの相互作用は生産的であり、α、またはα。サブユニットへ導びき、そしてｃＡＭＰ依存性およびｃＡＭＰ非依存性メカニズムによるｃＡＭＰおよびＰＲＬレベルの阻害へ導びく。２の欠（以下余白）ｅｅｌｌ１．　Ｂａｎ−Ｊｏｎａｔｈａｎ、Ｎ、（１９８５）、Ｅｎｄｏｃｒ、Ｒｊｖ、６，５６４−５８９゜２、Ｍｅｍｏ、　Ｍ、、　Ｍｉｇｓａｌａ、　Ｃ，、Ｃａｒｒｕｂａ、　Ｍ、Ｏ，、ａｎｄ　５ｐａｎｓ、　Ｐ、乙（１９８６）、Ｊ、Ｎｅｕｒａｌ　Ｔｒａｎｓｍ、（Ｓｕｐｐｌ、）２２．　１９−３２゜３、Ｍａｒｔｉｎ＠ｚ　ｄａ　ｌａ　Ｅｓｃａｌｅｒａ、　Ｇ、、　ａｎｄ　ｗｅｉｎａｒ、　Ｒ，工、（１９８６）。Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｑｙ　貝Ｌ１６８２−４６８７゜４、Ｌｏｐｅｚ、ＦＪ、、Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ、、７．Ｒ，，５ａｎｃｈ＠ｚ−Ｃｒｉａｄｏ、Ｊ、Ｅ、。ａｎｄ　Ｎｅｇｒｏ−Ｖｉｌａｒ、　Ａ、（１９８８）　、　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ　−区。５、　よりｉｄ、　ｐｐ、　５３６−５４２゜６、　５ｉｂｌａｙ、　Ｄ、Ｒ，、ＤｅＬａａｎ、　Ａ、、　ａｎｄ　Ｃｒａａｓ＠、　Ｌ　（１９Ｂ２）、　Ｊ。Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｗ、Ｌ２Ｌ　６コ５１−６３６１゜７、　ＤｅＬｅａｎ、Ａ、、Ｋ１１ｐａｔｒｉｃｋ、Ｂ、Ｆ＋、ａｎｄ　Ｃａｒｏｎ、Ｍ、Ｇ、　（１９ａ２ン。Ｍｏ１．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、２２，２９０−２９７＋８、Ｓｅｎｏｇｌｅｇ、　Ｓ、Ｅ、、　Ｂｅｎｏｖｉｃ、　Ｊ、Ｌ、、　Ａｍ１ａｉｋｙ、　Ｎ、、　ｔＪｎｓｏｎ。Ｃ，、Ｍｉｌｌｉｇａｎ、　Ｇ、、　Ｖｉｎｉｔｓｋｙ、　Ｒ，、Ｓｐｉｅｇｅｌ、　Ａ、Ｍ、。ｃａｒｏｎ、　Ｍ、Ｇ、（１９８７）、　、７．　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈａｍ、　ｚ１シ４８６０−９、　０ｈａｒａ、　ＩＣ，、Ｈａｑａ、　Ｋ、、　Ｂａｒｓｔｅｉｎ、　Ｇ、、　Ｈａｇａ、　？＋。ＩＣｈｉｙａｍａ、　Ａ、、　ａｎｄ　０ｈａｒａ、　Ｌ　（１９８Ｂ）、　Ｍｏｌ。Ｐｈａｒｍａ（：０１．ユニ、２９０−２９６゜１０、ＤｅＣａｍｉｌｌｉ、Ｐ、、Ｍａｃｃｏｎｉ、Ｄ、、ａｎｄ　５ｐａｄａ、Ａ、（１９７９）。Ｎａｔｕｒｅ　２２ｆｌ、２５２−２５４゜１１＋０ｎａｌｉ、Ｐ、、　Ｓｃｈｗａｒｔｚ、　Ｊ、Ｐ、、　ａｒ＋ｄ　Ｃｏ５ｔａ、　Ｅ、（１９８１）。Ｐ、Ｎ、Ａ、５．７４１，６５３１−６５３４゜１２、Ｃｒｏｎｉｎ、Ｍ、Ｊ、、Ｍｙａｒ、Ｇ、Ａ、、ＭａｃＬａｏｄ、Ｒ，Ｍ、、ａｎｄ　Ｈａｗｌｅｔｔ。Ｅ、（１９８］）、　Ａｍ、　Ｊ、　Ｐｈｙｓｉｏｌ、　２Ａ！Ｌ、　Ｅ４９９ −Ｅ５０４゜Ｃｈｅｗ、　λｌ、１３９２０−１３９２７゜Ｌ５．　Ｖａｌｌａｒ、　Ｌ、　ａｎｄ　Ｍａｌｄｏｌｓｇｉ、　Ｊ、　（１９１１９）、　ＴＸＰＳ　ｌｊｌ、　７４−７７゜１６、　Ｊｕｄｄ、　Ａ、Ｍ、、　ｌＡｇ１ｎ、工＋５．．　Ｋｏｖａｅｓ、　Ｋ−、Ｒｏｍｓ、　Ｐ、Ｃ，。Ｓｐａｎｇ＠ｌｏ、　Ｂ、Ｌ＋、　Ｊａｒｖｉｓ、　Ｗ、Ｄ、、　ａｈｄ　ＭａｃＬａｏｄ、　Ｒ，Ｍ。（１９８８）ｒ　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｑｙ　ＡＬＬ　２コ４１−２コ５０゜１７、Ｂｕｎｚｏｗ、Ｊ、Ｒ，、ＶａｎＴｏｌ、Ｈ，Ｈ，Ｍ−、にｒａｎｄｙ、Ｄ、に、、八１ｂｅｒｔ。Ｐ、、　５ａｌｏｎ、　Ｊ、、　Ｃｈｒ１ｇｔ１＊、　Ｍ、、　Ｍａｃｈｌｄａ、　Ｃ，、Ｎｅｖａ。Ｋ、Ａ、、　ａｎｄ　Ｃ１ｖｅｌｌｉ、　Ｏ，（１９８Ｂ）、　Ｎａｔｕｒａ　ｎＬ７８３−１８、　Ｔａ５ｈｊｉａｎ、　Ａ、Ｈ，、Ｊｒ、　（１９７９）、　Ｍｏｔｈ、　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　５Ｊ、　５２６−１９−　Ｏｚａｗａ、Ｓ、、ａｎｄ　５ａｎｄ、Ｏ，（１９８６ン、Ｐｈｙｓｉｏｌ−Ｒｅｖ、ｆＬｆＬｔ２０、　Ｌ）ｈｌｅｒ、　Ｍ、、　ａｎｄ　ＭｃＫｎｉｇｈｔ、　Ｇ、Ｓ、（１９Ｂ？）、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ。２□、１５２０２−１５２０７゜２’Ｌ、Ｃｈｉｒにｘｎ、　Ｊ−Ｍ−ｒ　Ｐｑｂｙｌａ、　ｋ、Ｅ、ｒ　ＭａｃＤｏｎａｌｄ、　Ｒ−Ｊ−ｔ　ａｎｄＲｕｔｔａｒ、　Ｗ、Ｊ、（１９７９）− ２２、Ｄｏｒｆｌｉｎｇｅｒ、Ｌ、Ｊ−、ａｎｄ　５ｃｈｏｎｂｒｕｎｎ、＾、（１９８コ）。Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ　」コ、１５４１−１５５０゜２コ、Ｄｏｒｆｌｉｎｇａｒ、ＬＪ、、ａｎｄ　５ｃｈｏｎｂｒｕｎｎ、Ａ、（１９８３）。ＥｎｄＯＣｒｉｎＯＩＯｇｙ　Ｊ、　１５５１−１５５８゜２４、　Ｓａｌｏｍｏｌｉ、　Ｙ、、　Ｌｏｎｄｏｓ、　Ｃ＋、　ａｎｄ　Ｒｏｄｂｅｌｌ、　Ｍ、　（１９ハ）。Ａｎａｌｙｔ、　Ｂｉｏｃｈａｍ、　５Ｊｌ、　５４１−５４８゜２５、　ｅｈｅｎｇ、　Ｙ、−Ｃ，、ａｎｄ　Ｐｒｕｓｏｆｆ、　Ｗ、Ｈ−（１９７３）、　Ｂｉｏｃｈｅｍ。Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、　２２．３０９９−３１０８゜２６、　Ｇｏｕｒｄｊｉ、　Ｄ、、　Ｂａｔａｉｌｌｅ、　Ｄ、、　Ｖａｕｃｌｉｎ、　Ｎ、、　Ｇｒｏｕｓｅｌｌｅ。、Ｄ、、Ｒｏｓｇｅｌｉｎ、Ｇ、、ａｎｄ　Ｔｉｘｉｅｒ−Ｖｉｄａｌ、Ａ、（１９）９）。ＦＩ：ＢＳし化ｔ、記１４．：１６５−１６８゜２７、　Ａｌｂｅｒｔ、　Ｐ＋Ｒ＋、　ａｎｄ　Ｔａ５ｉｈｊｉａｎ、　Ａ、Ｈ，、Ｊｒ、（１９８４）、　Ｊ。Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　讃、　１５３５０−１５３６３゜２８、０ｎａｌｉ、　Ｐ、、　０１ｉａｎａｓ、　Ｍ、Ｃ，、ａｎｄ　Ｇｅ５ｓａ、　Ｇ、Ｌ、　（１９８５）。Ｍｏ１．　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、　３Ｊｌ、１３８−１４５゜２９、　Ｋｏｃｈ、　Ｂ、Ｄ、、　ａｎｄ　５ｃｈｏｎｂｒｕｎｎ、　Ａ＋（１９８す、　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙユニ、４ｉ、１７８４−１７９０゜３０−　Ｋｏｃｈ、　Ｂ、Ｄ、、　Ｄｏｒｆｌｉｎｇａｒ、　Ｌ、Ｄ、、　ａｎｄ　５ｃｈｏｎｂｒｕｎｎ、　Ａ。（１９８５）、、？、Ｂｉｏｌ、（：ｈａｍ、２ｉＱ、１３１３Ｂ−１３１４５゜３１、　Ｂａｎ−Ｊｏｎａｔｈａｎ、　Ｎ、、　０１ｉｖｅｒ、　Ｃ，、％４ｅｉｎｅｒ、　Ｈ，Ｊ、、　Ｍｉｃａｌ。Ｒ，Ｓ、、ａｎｄ　Ｐｏｒｔｅｒ、　Ｊ、Ｃ，（１９７７）、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙよ００゜３２、Ｋｕｒｏｓｅ、Ｈ，、Ｋａｔａｄａ、Ｔ、、Ａｍａｎｏ、Ｔ、、ａｎｄ　Ｕｉ、Ｍ−（１９８コ）。Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｗ、Ｌ上、４８７０−４８７５゜コ３．　５ｃｈｏｎｂｒｕｎｎ、Ａ、、ａｎｄ　Ｔａ５ｈｊｉａｎ、Ａ、Ｈ，、Ｊｒ、（１９７８）、Ｊ。Ｂｉｏｌ、Ｃｈａｍ、　記ユ、６４７：ｌ−６４Ｂ３゜３４、Ｂｕｎｎｅｙ、Ｂ、Ｓ、、Ａｇｈａｊａｎｉａｎ、Ｇ、に、、ａｎｄ　Ｒｏｔｈ、Ｒ，Ｈ。（１９７コ）、Ｎａｔｕｒａ　（Ｎｅｗ　Ｂｉｏｌ、）　ｊ、生ｆｉ、１２３− １２５゜３５、　Ｌａｃｅｙ、　Ｍ、Ｇ、、　Ｍａｒｃｕｒｉ、　Ｎ、Ｂ、、　ａｎｄ　Ｎｏｒｔｂ、　Ｒ，Ａ＋（１９８７）。、７−　Ｐｈｙｓｉｏｌ、３３ｊ、、：１９７−４４６゜３６−　Ｔａｒａｓｋｅｖｉｃｈ、Ｐ、Ｓ、、ａｎｄ　Ｄｏｕｇｌａｓ、Ｗ、Ｗ−（１９７８）、ＮａｔｕｒｅＣ，Ｂ、、ａｎｄ　Ｓｃｈｌｅｇｅｌ、Ｗ、（１９８７）、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ　Ｌｕ。３Ｂ、Ｌａｗ、Ｇ、Ｊ、、Ｐａｃｈｔａｒ、Ｊ、Ａ、、ａｎｄ　Ｄａｎｎｉｅｓ、Ｐ、（１９８Ｂ）。Ｍｏ１．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、２，９６６−９７２゜３９、Ｊｏｕｒｎｏｔ、Ｌ、、Ｈｏｍｂｕｒｇｅｒ、Ｖ、、Ｐａｎｔａｌｏｎｉ、Ｃ，、Ｐｒｉａｍ、Ｍ、。Ｂｏｃｋａａｒｔ、　Ｊ、、　ａｎｄ　Ｅｎｊａｌｂｅｒｔ、　Ａ、（１９８７）、　、７＋Ｂｉｏｌ。Ｃｈｅｗ、　２ｆ１２．１５１０６−１５１１０゜４０、Ｖａｌｌａｒ、Ｌ、、Ｖｉｃａｎｔｉｎｉ、Ｌ、Ｍ、、ａｎｄ　Ｍａｌｄｏｌ＠ｓｉ、Ｊ＋（１９８Ｂ）、　Ｊ、Ｂｉｏｌ、　ＣｈｅＩ！１．２ｆＬＪ、、１０１２７−１０１３４゜４１、Ｃａｎｏｎｉｃｏ、Ｐ、Ｌ、、Ｊａｒｖｉｓ、Ｗ、Ｄ、、Ｊｕｄｄ、Ａ、Ｍ、、ａｎｄＭａｃＬｅｏｄ、Ｒ，Ｍ、　（１９８６）、Ｊ、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、】−ＬＱ、コ８９−３９３゜１　使用した略語は以下のとおり。ＰＲＬ、プロラクチン；ＧＨ，成長ホルモン；（Ｃａ”）、細胞質ゾル不合カルシウム濃度；　Ｖ　Ｉ　Ｐ、血管活性腸ペプチド；ＴＲＨ、タイロトロピン放出ホルモン、ｒ、ＢＭＸ、３−インブチル−１−メチルキサンチン；に８．平衡解離定数、ＥＣ，。（ＩＣ５゜）、５０％最大効果（阻害）を誘発するのに必要な濃度。２　これらの結果は一部第７１回Ａｎｎｕａｌ　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ　Ｍｅｅｔｉｎｇ、５ｅａｔｔｌｅ、ＷＡにおいて発表。抄録＃３　Ａｌｂｅｒｔ、Ｐ、Ｒ，ｅｔ　ａｔ、、投稿準備中実施例３！拾ヒトドパミンＤ２レセプターをコードするクローンを下垂体ｃＤＡＮライブラリーから単離し、配列化した。推論されたタンパク配列は、一つの主な差をもってクローン化したラットレセプター〔Ｂｕｎｚｏｗ　ｅｔ　ａｌ、（１９８８）、Ｎａｔｕｒｅ　３３６゜７８３−７８７）と９６％同じである。ヒトレセプターはその推定３番目細胞質ループ中に追加の２９個のアミノ酸を含んでいる。サウザン班は工種だけのヒトドパミンＤ２レセプター遺伝子の存在を示した。この遺伝子を含む２＃１の重複するファージが単離され、特徴化された。これらクローンのＤＮＡ配列分析は、コーディング配列は６個のイントロンによって中断され、そしてヒト下垂体レセプター中に存在する追加のアミノ酸は８７ヘースペアの単一エキソンによってコードされることを示した０代替スプライシングにおけるこの配列の関与およびその生物学的意義が論ぜられる。１説霊長類中枢神経系中のドパミンニューロンは、運動の開始および実行、感情安定性の推持、および下垂体機能の調節に関与する。パーキンソン病（１）および分裂症（２）を含むヒト神経病は、ドパミンレセプターとドパミンの間のインバランスの発現であると考えられる。ドパミンの効果を仲介するレセプターはＤｌおよびＤ２サブタイプに分けられ、それらはそれらのＧタンパク結合（３，４）、リガンド特異性、解剖学的分布および生理学的効果（５）によって区別し得る。ドパミンＤ２レセプターは、プロラクチン分泌の調節（６）および抗精神薬に対するアフィニティー（７，８）の故に特別の臨床的関心である。ドパミンＤ２レセプターはＧタンパク結合レセプターのファミリーに属す。このファミリーのメンバーが占める配列類似性は、我々がラット脳ドパミンＤ２レセプターｃＤＮＡをクローンすることを可能にする（９）。我々は、ここに記載するヒト下垂体ドパミンＤ２レセプターｃＤＮＡを単離するためのこのクローンを使用した。これら二つのレセプターの推論されたアミノ酸配列は一つの著しい相違点を除いて非常に似ている。ヒトレセプターは、遺伝子のエクソンの一つによってコードされるその推定３番目細胞質レープ中に追加の２９個のアミノ酸を含んでいる。このゲノム組織は、２種のドパミンＤ２レセプターｍＲＮＡの存在は代替スライシングイベントの結果であることを示唆する。林粁夫圭丈方法ヒ　ｃＤＮＡのクローニングヒト下垂体組織はカナダのＣ１１ｎｉｃａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈＩｎｓｔｉｔｕｄｅ　ｏｆ　ＭｏｎｔｒｅａｌのＮ、５ｅｉｄａｈおよびＭ、Ｃｈｒｅｔｉｅｎ博士からの親切な贈物であった。ポリ（Ａ）ｍＲＮＡおよびｃＤＮＡは以前記載された方法（９）で調製した。ｃＤＮＡはアガロースゲル上でサイズ選別（１〜６ｋｂ）Ｌ、Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ　（Ｂｉｏ　１０１）を使用して単離し、ＥｃｏＲＩアダプターヘリゲートし、そしてパッケージ（Ｇｉｇａｐａｋ　Ｇｏｌｄ）した。組換物（１，５Ｘ１０’　”）はレプリカナイロンフィルター（デュポンブラック／コロニーハイブリダイゼーションフィルター）上で（ｉｚｐ）標識ハイブリダイゼーションプローブでスクリーンされた。前ハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションは、５０％ホルムアミド、１％ＳＤＳ、２ＸＳＳＣ（ＩＸＳＳＣ＝０．１５Ｍ　ＮａＣ１１０，０１５Ｍ　クエン酸ナトリウム、ｐＨ７）中３７℃で実施された。ＤＮＡの両方のストランドの完全な配列は、合成オリゴヌクレオチドをプライムしたシーケナーゼ（Ｕ、Ｓ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）を用いてＭｌ　３！ｐ　１９中で決定された。主里夫スゲ１理２．５ｋｂヒト下垂体とｃＤＮＡ　（ｈＰ　ｉ　ｔＤｚ　）はｐＺｅｍ’（Ｄｒ、ＥｏＭｕｌｖｉｈｉｌｌ、Ｚｙｍｏｇｅｎｅｔｉｃｓからの贈物）ヘクローンされ、ＣａＰＯ４沈澱によってマウスＬ　ｔ　Ｋ−中へｐＲ３Ｖｎｅｏと共に同時トランスフェクトされた。安定なトランスフェクタントが選ばれ、Ｇ４１Ｂ（ゲネチシン硫酸塩、Ｇｉｂｃｏ）の７５０Ｍｇ　／　ｍ　Ｉ中に保持された。膜収穫２０時間前に、これら細胞は７０ＭＭ硫酸亜鉛とインキュベートされた。膜はＬ−ＨＰｉＤ、Ｚｉｍから、クローンしたラットドパミンＤ２レセプターを発現するＬｔＫ＝細胞ライン（Ｌ−ＲＧＢ　２　Ｚ　ｅｍ　−１）から、そして新たに分離したラット線条体（Ｔａｃｏｎｉｃ　Ｆａｒｍ、Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）から、以前記載された（１１．１２）ように調製された。結合アンセイのため、膜タンパクはＬ−ｈＰｉｔＤｚ　Ｚｅｍからは１０〜１５ μｇにおいて、Ｌ−ＲＧＢ２Ｚｅｍ−１からは５０〜７５９Ｈにおいて、う７ト線条体からは２２０〜２５０Ｍｇにおいて使用された。結合アンセイは、５０ｍＭ１−リス−ＨＣｌ、１２０ｍＭ　ＮａＣ１，５ｍＭ　ＫＣＩ、２ｍＭ　ＣａＣ１ｚ、１ｍＭ　ＭｇＣＬ、ｐＨ７，４中３７°Ｃで６０分インキュベートされ、そしてガラスフィルター（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　ａｎｄ　５ｃｈｕｅｌｌ、Ｎｏ、３２）上の急速濾過によって停止された。フィルターは０．５％ポリエチレンイミン中に事前浸漬した。フィルターは氷冷５０ｍＭｔ−リス−ＭＣＩ、ｐＨ７，４中で２回洗った。飽和曲線は高度にＤ２特異性アンタゴニスト〔１Ｈ〕　トムペリトン（１３）の上昇する濃度を使用して発生させた。アンタゴニスト薬物はそれらの特異性結合〔３Ｈ〕トムベリトン（１ｎＭ）を阻害するそれらの能力について評価した。Ｂｍａｘ、Ｋｄ、およびＩＣ，。値は以前記載された方法（１４）のように決定した。サウザンブロー−ング正常男性ドナーから調製したヒトゲノムＤＮＡはＭ、Ｌｉｔｔからの贈物であった。ＤＮＡ３μｇを制限酵素で消化し、フラグメントを０．７％アガロース中で電気泳動し、ニトロセルロースフィルター（Ｓｃｈｌｉｃｈｅｒ　ａｎｄ　５ｃｈｕｅｌｌ）上へプロットした。前ハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーシヨンは、以前記載されたように（１５）５０％ホルムアミド中３７°Ｃにおいて実施された。Ｙ左Ａ配且決定正常ヒト男性ＤＮＡから調製したゲノムバクテリオファージラムダライブラリーは、Ｓｔｒａｔｒａｇｅｎｅ　ａｎｄ　Ｃ１ｏｎｔｅｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ、から購入し、そしてクローンしたラフトドパミンＤ２レセプターｃＤＮＡの一部分づつでスクリーンした。ＤＮＡ配列はゲノム配列決定アプローチ（１６，１７）によって決定された。要約すると、使用した各制限酵素について、クローンしたゲノムファージＤＮＡ（５０Ｍｇ）が消化され、化学的開裂にかけられ、そして得られたフラグメントが変性するポリアクリルアミドゲル中で分割された。次にＤＮＡはゲルから移されたナイロンフィルター（Ｐｌａｓｃｏ　Ｇｅｎｅｔｒａｎ）上に固定された。（３！ｐ）末端標識合成オリゴマーを使用して、配列の梯子がエクソン内に可視化され、隣接するイントロン中に読取られた。次にフィルターは異なるオリゴマーでプローブされるか、またはエクソンを横断して戻る補完的配列を読取るため新しいフィルターがつくられた。コーディング区域の両方のスタンダードが配列決定された。 ■ ヒ　ｃＤＮＡの　ローニン　゛　ｉプローブとしてラット脳Ｄ２レセプターｃＤＮＡを使用し、ヒト下垂体ライブラリーから３種の部分的ｃＤＮＡが単離され、配列決定された。これら配列に基づく２種のオリゴヌクレオチドブ口−ブがレセプタータンパクの全長（第１８図）をコードする４番目のＣＤＮＡ　ｈＰｉｔＤｚを単離するために使用された。ヒト下垂体レセプターは７個の推定トランスメンブレン領域を含み、そしてシグナル配列を欠いている。全体として、ヒトおよびラットヌクレオチド配列は９０％類似であり、アミノ酸レベルにおいて９６％同一であることを示す。Ｎ−結合グリコシル化、タンパクキナーゼＡフォスフォリル化およびバルミトイル化のためのい（つかの一致した配列（１８）がヒトおよびラットレセプター間に保存される。これらタンパク間には１８個のアミノ酸の遅い（１個の欠如を含む）があり、驚くべきことにヒトレセプターはその推定３番目細胞ループ中追加のアミノ酸２９個を含んでいる。ｈＰｉｔ　Ｄ　ｃＤＮＡの　゛　Ｗヒト下垂体レセプターの薬理学的特徴を評価するため、そのｃＤＮＡをｐＺｅｍ３中にサブクローンし、マウスＬｔｋ−細胞中に発現させた（Ｌ−ｈＰ　ｉ　ｔＤｚ　Ｚｅｍ）。これら細胞から調製した膜は、４．０５±０．３膜ｍｏｌ／ｍｇタンパク（ｎ＝２）のＢｍａＸおよび０．７４±Ｏ６ｌ　１　ｎＭ　（ｎ＝２）のＫｄ値をもって、Ｄ２選択性アンタゴニストである（１２，１３）（’Ｈ）トムペリトンとの特異性結合を示した。このＫｄ値は、マウス脳細胞膜中の公表された値０．７４ｍＭと良く一致している。このデータの５ｃａｔｃｈａｒｄプロツトは直線であった。ｐＺｅｍ３のみでトランスフェクトした細胞から調製した膜には検出し得る〔３Ｈ〕　トムペリトン結合は存在しなかった（データ示さず）。Ｌ−ｈＰｉｔＤｚＺｅｍに対する〔３Ｈ〕トムペリトン結合は多数のドパ与ンＤ２特異性薬物によって阻害された（第１９図）。それらの強さの順序は、スピペＱン、（＋）ブタクラモール、へロペリドールおよびスルピライドの順であった。セロトニン選択性アンタゴニストであるミアンセリンおよびり、選択性アンタゴニストである５ＣＨ−２３３９０は、不活性異性体（−）ブタクラモールと同様に、非常に高濃度においてのみトムペリトン結合を阻害した。これらの値は、クローンしたラットドパミンＤ２レセプターｃＤＮＡでトランスフェクトしたＬｔｋ−細胞（Ｌ−ＲＧＢ２Ｚｅｍ−１）から、そしてラット線条細胞からの膜について得たものに実質上同じである（第２２図）。ヒトドパミンＤ　レセブ　−゛　− プローブとしてラントｃＤＮＡを一部分づつ使用し、ヒトゲノムライブラリーからクローンを単離した。このゲノムクローン、λＨＨ２Ｇ１は、ヒトＤ２レセプターの最後の６４個のアミノ酸をコードする１、６ｋｂ　ＢａｍＨＩフラグメントと、そして３”非コード配列の１．２ｋｂを含んでいた。１．６ｋｂフラグメントは３種の制限酵素を消化したヒトゲノムＤＮＡのサウザンプロットをプローブするために使用された。各酵素はプローブへハイブリッド化された単一フラグメントを生成しく第２０図）、多分１種だけのヒトドパミンＤ２レセプター遺伝子が存在することを指示する。ヒトレセプタータンパクのＮ末端をコードするゲノムクローンを単離するため、クローンしたラットドパミンＤ２レセプターｃＤＮＡからのｔｔｓｂｐ制限フラグメント（アミノ酸残基１−３９に相当）が２番目のゲノムライブラリーをスクリーンするために使用された。λＨＯ２Ｇ２が単離され、４００個のヌクレオチドだけλＨＤ２Ｃ，１と重複することが発見された。これらファージはヒトドパミンＤ２レセプター遺伝子位置の３４．ｋｂ　ＤＲＤ２をスパンしく１９）、そしてｈＰ　ｉ　ｔＤｚ　ｃＤＮＡに見られる配列と、それにポリアデニル化シグナルの下［３，７ｋｂおよびほん訳開始部位の上流３．７ｋｂを延びる配列を含んでいる。この遺伝子のイントロン／エキフン構造を特徴化するため、オリゴヌクレオチドプローブおよび化学的開裂を採用するゲノム配列決定アプローチが使用された（第２１ｂ図）。このレセプターファミリーのヒトおよびラットメンバー間のヌクレオチド配列の違いは約１０％（未発表所見）であるため、我々はクローンしたラットドパミンＤ２レセプターｃＤＮＡ中に存在するハイブリダイゼーションプローブおよび制限部位に依存してゲノム配列決定を開始することができた。我々の結果は、ヒトドパミンＤ２レセプター遺伝子のコーディング部分は７個のエキソンに分れることを示した（第２１ｂ図）。興味あることに、エキソン５は５７ｂｐ長さであり、そしてクローンしたヒト下垂体レセプターに存在する２９個のアミノ酸配列全体をコードすることを発見した（第１８および２１ｃ図）。６個のイントロンの分析は、第２３図に要約するように、各自Ｇ　Ｔ／Ａ　Ｇ規則（２０）に一致するアクセプターおよびドナー配列を含むことを明らかにした。これらイントロンの大体のサイズはサウザンプロテイング実験の結果に基いたものである（データ示さず）。比較する時、ゲノムおよびＣＤＮＡ配列は二つの過渡点、一つは９３９（遺伝子においてＴからＣ）および他は９５７（遺伝子においてＣからＴ）において異なるだけであることが判明した。１論我々のヒト下垂体Ｄ２レセプターｃＤＮＡクローンに存在する余分の配列についていくつかの仮説を立てることができる。一つの可能性は、ヒト遺伝子はラット遺伝子が持っていない余分の８７個の塩基を含んでいることである。他の一つは、ヒトおよびラットの両方は２種の異なるドパミンＤ２レセプターをコードする一２種の異なる遺伝子を持っていることである。最後に、単一転写の代替スプライシングは１個のｍＲＮＡとそして８７個塩基なしの他のものを生ずることがあり得る。この最後の仮説の支持として、我々は多分１種だけのヒトドパミンＤ２レセプター遺伝子ＤＲＤ２が存在すること、および８７ｂＰ配列はその遺伝子の別のエキモノ上に含まれていることを示した。さらに、我々は８７ｂｐ配列を含むラット脳ＣＤＮＡをクローンした（未発表結果）。この配列はヒ）ｃＤＮＡに高度に類似であり、２９残基を含んでいるドパミンＤｚ　レセプターはヒト下垂体独自のものでないことを確立した。Ｌ−ｈＰ　ｉ　ｔＤｚ　Ｚｅｍに発現されたヒトドパミンＤ２レセプターは、ラット線条およびＬ−ＧＢ２２ｅｍ−１膜と実質上同じ薬物結合プロフィルを有する。それ故、アミノ酸２９個は結合に影響しないから、それらはレセプター機能の他のレベルにおいて関与し得る。例えば、β２−アドレナリンレセプターの３番目の細胞質ループは適切なＧタンパク結合に必要であることが示されている（２１）。それ故、一つの可能性は、この配列はドパミンＤ２レセプター刺激がアデニルサイクラーゼを阻害し、カリウムチャンネル伝導度を活性化するかまたはカルシウム移動を阻害するかどうかに影響し得ること（２２）である。他の可能性の一つは、２９個アミノ酸が後部シナプスドパミンＤ２レセプターを前記シナプス自己レセプターから分化すること（２３）である。コンピューター検索（ＶＡＸ／ｒｎｔｅ　ｌ　ｌ　ｉｇｅｎｅｔ　１ｃｓ）は有意な同族性の他の配列を同定するのに失敗したので、我々はこの配列はＤ２レセプター独自のものであると考える。ゲノムおよびｃＤＮＡ配列の比較に基いて、ヒトドパミンＤ２レセプター遺伝子は少なくとも７種のエキソンに分けられる。ムスカリンレセプター遺伝子の場合そうであることが示されたように（２４）、遺伝子の５°端に一以上の追加のエキソンが固定されずに残っていることもあり得る。イントロンによるコーディング配列の中断はヒトドパミンＤ２レセプター遺伝子を、オプシン遺伝子（２５）を除いてＧタンパク結合レセプター遺伝子ファミリーの大多数の他のメンバーから区別する。有意義な観察の一つは、このヒト遺伝子ウニつのイントロン（ＮＯ１３および５）の配置はウシおよびＤｒｏｓｏｐｈｉａオプシン遺伝子（２６，２７）に保存されたイントロン位置に殆ど正確に対応することである。この発見の最も簡単な解釈は、約ｌＯ億年令の遺伝子であるそれらの共通の祖先（２８）がこれらのイントロンを含んでいたことである。我々の遺伝子構造の特徴化は、エキソンがタンパク構造の認識し得るエレメントをコードする証拠を提供する（２９）。そのようなイントロンはトランスメンブレンセグメントＩｆ、ＩＩＩ、および■の後に見られ（第１８および２１図を見よ）、繰り返し構造がこれらレセプターの特徴をモチーフするとの議論が内部重複化によって発生し得る。さらに、３番目細胞質ループ内のいくつかのイントロンの存在は、ファミリーにわたって観察された長さの実質的変動の良い説明を提供する（３０）。構造的に別の形へ発展する代替的にスプライスされたドパミンＤ２レセプターｍＲＮＡの可能性は興味深い。ドパミンＤ２レセプター　ｍ　ＲＮ　Ａの一つの形または他の形の発現は、ヒト疾病に関する含蓄を持ち得るコントロールレベルを表わす。謝辞我々はＨｏｗａｒｄ　Ｇｏｏｄｍａｎに対し原稿の討論および校閲、Ｄｅｅ　Ｙａｒｏｚｅｓｋｉに対し原稿作成、およびＶｉｃｋｙ　Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ、Ｎａｎｃｙ　ＫｕｒｋｉｎｅｎおよびＪｕｎｅ　Ｓｈｉｉｇｉに対しイラストレーションのために感謝する。Ｄ、　Ｋ、　Ｇ、はＮＩＨからの奨学金を得ている。この研究はＮＩＨグランドＮｏｓ、ＤＫ３７２３１およびＭＫ４５６１４と、Ｃａｍｂｉｄｇｅ　Ｎｅｕｒｏ　５ｃｉｅｎｃｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ。Ｉｎｃ、、Ｃａｍｂｒ　ｉｄｇｅ、から０．Ｃ９に対するグランドによって支援された。（以下余白）Ｂ１３仄旦ｍ四５Ｎ−Ｌ１４！ｅｔ　Ｔ−＃　Ｂｅ＠ｍａｎｅ　Ｐ−ｔ　Ｒａｊｐｕｔ、　ｋ−ｔ　Ｙａｒ’Ｌｇａｙｔ　工、Ｊ、ａｎｄＨｏｒｎｙｋｉｅｗｉｃｚ、　Ｏ，（１９７８）　Ｎａｔｕｒｅ　Ｌ〕、５９−６１２、Ｓｅｅｍａｎ、Ｐ、、ｔ）ｌｐｉａｎ、Ｇ、、Ｂｅｒｇｅｒｏｎ、Ｃ，、Ｒｉａｄｅｒｅｒ、Ｐ−。Ｊｅｌｌｉｎｇｅｒ、　Ｌ、　Ｇａｂｒｉｅｌ、　Ｅ、、　Ｒｅｙｎｏｌｄｓ、　Ｇ、Ｐ、　ａｎｄＴｏｕｒｔｅｌｌｏｔｔｅ、Ｗ、Ｗ、（１９８４）　５ｃｉｅｎｃｅ　２１１，７２８−７３０゜３、　Ｋｅｂａｂｉａｎ、Ｊ、Ｗ、　（１９）ａ）　Ａｄｖ、Ｂｉｏｃｈｅｍ。Ｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌ、　川、１３１−１５４゜４、ＤｅＣａｍｉｌｌｉ、　Ｐ、、　Ｍａｃｏｎｉ、　Ｄ、　ａｎｄ　５ｐａｄａ、　Ａ、（１９７９）Ｎａｔｕｒｅ　（Ｌｏｎｄｏｎ）　２ＪＪＬ、２５２−２５５゜Ｌ　Ｃ１ａｒｋ、　Ｄ、　ａｎｄ　１ｆｈｉｔｅ、Ｆ、Ｊ、（１９８７）　５ｙｎａｐｓｅ　Ｘ、３４７−３８８゜６、Ｗｅｉｎｅｒ、　Ｒ，ニー　ａｎｄ　Ｇａｎｏｎｇ、　Ｗ、（１９７８）　Ｐｈｙｓｉｏｌ、　Ｒｅｖ。シし　９０５−９７６＋７−　ｓｅａｍａｎ、ｐ、ａｎｄし田、Ｔ、（１９７５）Ｓｃｉｅｎｃｅ　１ＪＪｊｌ、１２１７−１２１９゜８、Ｃｒ＠＠Ｂ＠、工＋、Ｂｕｒｔ、Ｄ、Ｒ，，ａｎｄ　５ｎｙｄａｒ、Ｓ、Ｈ，（１９７６）Ｓｃｉｅｎｃｅ　ＬＩＪＬ、　４８１−４８３゜９、Ｂｕｎｚｏｗ、　Ｊ、Ｒ，、Ｖａｎ　Ｔｏｌ、　Ｈ，Ｈ，Ｍ、、　Ｇｒａｎｄｙ、　Ｄ、に、、　Ａｌｂｅｒｔ。Ｐ、Ｒ，、５ａｌｏｎ、Ｊ、、Ｃｈｒｉｓセｉｅ、Ｍ、、Ｍａｃｈｉｄａ、Ｃ，Ａ、。Ｎａｖａ、　Ｋ、、ａｎｄ　Ｃ１ｖｅｌｌｉ、　Ｏ，（１９８８）　Ｎａｔｕｒｅ　Ｌ匝。７８３−７８７゜１０、Ｇｏｒｍａｎ、Ｃ，、Ｐａｄｍａｎａｂｈａｎ、Ｒ，ａｎｄ　Ｈｏｗａｒｄ、Ｂ、Ｈ，（１９８３）Ｓｃｉｅｎｃｅ　息、５５１−５５３゜１、Ａｌｂａｒｔ、Ｐ−Ｒ，、Ｗａｖｅ、に＋、Ｂｕｎｚｏｗ、Ｊ、Ｒ，ａｎｄ　Ｃ１ｖｅｌｌｉ、Ｏ。（１９８９）　ｓｕｂｍｉｔｔｅｄ。 −１２，Ｇｒｉｇｏｒｉａｄｉｓ、　Ｄ、　ａｎｄ　Ｓｅｅｍａｎ、　Ｐ、（１９８６）　Ｎａｕｎｙｎ−５ｃｈｍｉａｄａｒｂｅｒｇ　Ａｒｃｈ、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、　息、２１−２５゜１３、Ｂａｕｄｒｙ、Ｍ、、Ｍａｒｔｒｅｓ、Ｍ、Ｐ、ａｎｄ　Ｓｃｈｗａｒｔｚ、Ｊ、Ｃ，（１９７９）Ｎａｕｎｙｎ−５ｃｈｉｅｄａｒｂｅｒｇ　Ａｒｃｈ、　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、　３ｊｌＪＪ、２］１ −２３７＋１４、Ｆｉｓｃｈａｒ、　Ｊ、Ｂ、　ａｎｄ　５ｃｈｏｎｂｒｕｎｎ、＾、（１９８８１Ｊ、　Ｂｉｏｌ。Ｃｈｅｍ、ｐｕ２８０８−２８１６１５、Ｇｒａｎｄｙ、　Ｄ、に、　ａｎｄ　Ｄｏｄｇｓｏｎ、　、ｆｆ、Ｂ、（１９ｅ７）　Ｎｕｃ、＾Ｃ１ｄｓＲｅｓ、１塁、１０６３−１０８０゜１６、Ｃｈｕｒｃｈ、　Ｇ、Ｍ、　ａｎｄ　Ｇ１１ｂｅｒｔ、　Ｗ、（１９８リ　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　！Ｊ１，１９９１−１９９５゜１７、　Ｍａｒｃｈｉｏｎｎｉ、Ｍ、ａｎｄ　Ｇ１１ｂｅｒｔ、Ｍ、（１９８６）　ｃｅｌｌ　ｉｆｌ、１コ〕−１４１゜１８、　０’Ｄｏｗｄ、　Ｂ、Ｆ、、　Ｈｎａｔｏｗｉｃｈ、　Ｍ、、　Ｍ、Ｃ，（ニー、　Ｌ＠ｆｋｏｗｉｔｚ、　Ｒ，Ｊ。ａｎｄ　Ｂｏｕｖｉａｒ、　Ｍ、（１９Ｂ９）　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　２ｊｌ。７５６４−７５６９゜１９、Ｇｒａｎｄｙ、　Ｄ、に、、　Ｌｉｔｔ、　Ｍ、ｌ　＾１ｌｅｎ、　Ｌ、、　Ｂｕｎｚｏｗ、　Ｊ、Ｒ，。Ｍａｒｃｈｉｏｎｎｉ、Ｍ、八、、Ｍａｋａｍ、Ｈ，、Ｆｒｏｔｈｉｎｇｈａｍ、Ｌ、。Ｍａｑ＠ｎＬＳ、Ｒ−Ｅ、ａｎｄ　ＣＬＶｅｌｌｌ＋　００（１９８９）　馳、Ｊ。Ｈｕｍ、ｃｅｎｅｔ＋　ａｃｃｅｐセａｄ。２０、Ｍｏｕｎｔ、　Ｓ、Ｍ、（１９８２）　Ｎｕｃ、　ＡＣｉｄｓ　Ｒ＠！！＋、　川、４６１−４７２゜２１、　５ｔｒａｄｅｒ、　Ｃ，Ｄ、、　Ｄｉｘｏｎ、　Ｒ，Ａ、Ｆ、、　Ｃｈｅｕｎｇ、　ＩＨ，。Ｃａｎｄａｌｏｒｅ、　Ｍ、Ｒ，、Ｂｌａｋｅ、　Ａ、Ｄ、　ａｎｄ　Ｓｉｇａｌ、工、Ｓ。（１９８７）　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２ｆ１２．１６４３９−１６４４３゜２２、Ｖａｌｌａｒ、　Ｌ、　ａｎｄ　Ｍｅｌｄｏｌｅｓｉ、　Ｊ、（１９Ｂ９）　ＴｉＰＳ　銭、　７４−７７゜２３、Ｔａｐｐｅｒ、　Ｊ、Ｍ、、　Ｇａｒｉａｎｏ、　Ｒ，Ｆ、　ａｎｄ　Ｇｒｏｖｅｓ、　Ｐ、Ｍ、（１９８７）Ｃｈｉｏｄｏ、　Ｌ、Ａ、　ａｎｄ　Ｆｒｅｅｍａｎ、　Ａ、Ｓ＋（ＬａｋｅｇｈｏｒａＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏ、、　Ｍｉｃｈｉｇａｎ）、　ｐｐ、　９３−１２７゜２４、Ｐｅｒａｌｔａ、　Ｅ、Ｇ、、　Ｗｉｎｓｌｏｗ、　Ｊ、Ｗ、、　Ｐｅｔａｒｓｏｎ、　Ｆ、Ｌ、、　Ｓｍ１ｔｈ。Ｄ、Ｈ，、Ａｓｈｋｅｎａｚｉ、　Ａｖｉ、　Ｒａｍａｃｈａｎｄｒａｎ、　Ｊ、。Ｓｃｈｉｍａｒｌｉｋ、　Ｍ、Ｘ、　ａｎｄ　Ｃａｐｏｎ、　Ｄ、Ｊ、（１９８７）　５ｃｉｅｎｃｅＬ匝、６００−６０５＋２５、ｏ’ｏｏｗａ、　Ｂ、Ｆ、、　Ｌｅｆｋｏｗｉｔｚ、　Ｒ，Ｊ、　ａｎｄ　ｃａｒｏｎ、　Ｍ、Ｇ、（１９Ｅ１９）Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｎａｕｒｏｓｃｉ＋　１２．　６７−８３゜２６、Ｎａｔｈａｎｓ、　Ｊ、　ａｎｄ　Ｈｏｇｎｅｓｓ、　Ｄ、Ｓ、（１９８３）　Ｃｅ１ｌ　、；１に、　８０７−８１４゜２７、　０’Ｔｏｕｓａ、　Ｊ、Ｅ、、　Ｂａａｈｒ、　Ｗ、、　Ｍａｒｔｉｎ、　Ｒ，Ｌ、、　Ｈｉｒｓｃｈ、　Ｊ、。Ｐａｋ、Ｗ、Ｌ、ａｎｄ　Ａｐｐｌｅｂｕｒｙ、Ｍ、Ｌ＋　（１９８５）　Ｃｅ１ｌ　ｉＱ。８３９−１１５０゜２Ｂ、Ｄｏｏｌｉｔｔｌａ、Ｒ，Ｆ、　（ｘ９８７）　（υｎｉｖｅｒｓｉｔｙｈ＋　ｏ＜　ｏ＜　ｃ／）Ｃ，Ｄ　ｙｕ１謝　＞＜　と８　と８　辰　。８ａ、１ＱＱＬ＋　Ｅ−４２−１Ｌ／’ＩＱＪＥ−１ｈａ　００（１）＜　３３　、＜＠Ｅ−１＜０：ｊＱ　（社）００　Ω吐−０へＣ−〇Ｆ−１？　Ｑ　ぷＣヘ−ｕ　＜Ｕ　へくＱ＜ｃＤ　■ｃｐ　＋＜　■く　山Ｕ　三１句←　コＣｊ　ＭＨｋＥ−１００ 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Claims

【特許請求の範囲】１．哺乳類Ｄ２ドパミンレセプターの生物学的活性を有するポリペプチドをコードする請求項５３の単離されたＤＮＡ配列、またはそのような配列のためのプローブとして有用でありかつそれをハイブリダイズする核酸配列。２．第１図に記載した配列を有するＤＮＡ配列、その補完的ストランド、コードン縮重によりそれと異なる配列、それとハイブリダンズしかつ哺乳類Ｄ２ドパミンレセプターをコードする配列、またはそのような配列のためのプローブとして有用でありかつそれをハイブリダイズする核酸配列。３．ドパミンレセプターの生物学的活性を有するポリペプチドをコードする単離されたＤＮＡ配列。４．哺乳類Ｄ２ドパミンレセプター遺伝子またはそのようなレセプターの生物学活性を有するポリペプチドをコードするそのフラグメントである請求項５３の核酸配列。前記哺乳類はヒトである請求項５３の核酸配列。第７図のＤＮＡ配列、その補完的ストランド、コードン縮重によりそれと異なる配列、それとハイブリダイズしかつヒトＤ２ドパミンレセプターをコードする配列、そのような配列のためのプローブとして有用でありかつそれとハイブリダイズする核酸配列、または前記配列の一つを含む配列。７．請求項５３の核酸配列とハイブリダイズするプローブとして有用なオリゴヌクレオチド。８．請求項１の核酸配列とハイブリダイズするプローブとして有用なオリゴヌクレオチド。９．請求項５の核酸配列とハイブリダイズするプローブとして有用なオリゴヌクレオチド。１０．検出し得る基で標識した請求項７のオリゴヌクレオチド。１１．その７個のトランスメンブレンドメインの１個からまたはその３番目の細胞質ループから哺乳類Ｄ２ドパミンレセプターフラグメントをコードする請求項７のオリゴヌクレオチドプローブ。１２．請求項５３のＤＮＡを含むベクター。１３．請求項１のＤＮＡを含むベクター。１４．ＤＮＡはビールスプロモーターの制御下にある請求項１２のベクター。１５．ワクチンビールスまたはレトロビールスである請求項１２のベクター。１６．請求項１２のベクターにより形質転換された細胞。１７．請求項１３のベクターにより形質転換された細胞。１８．前記哺乳類がヒトである請求項１２のベクターで形質転換された細胞。１９．多細胞生物からの請求項１６の細胞。２０．哺乳類細胞である請求項１９の細胞。２１．請求項１６の細胞を培養することを含むドパミンレセプターの生物学的活性を有するポリペプチドの製造法。２２．請求項１８の細胞を培養することを含むドパミンレセプターの生物学的活性を有するポリペプチドの製造法。２３．神経伝達レセプターをコードする配列とハイブリダイズする配列の存在について核酸サンプルをプローブする方法であって、前記サンプルをハムスターβ ２ＡＲの１．３ｋｂ　ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントとハイブリダイズするか、または前記フラグメントとハイブリダイズするプローブとハイブリダイズすることを含む前記方法。２４．哺乳類Ｄ２ドパミンレセプターである請求項２９の実質上純粋なポリペプチド。２５．第１図のＤＮＡ配列またはそれとハイブリダイズする配列によってコードされた請求項２４のレセプター。２６．前記哺乳類はヒトである請求項２４のレセプター。２７．請求項２４のドパミンレセプターから少なくとも１個のアミノ酸が置換、挿入または除去されている実質上純粋な哺乳類ドパミンＤ２レセプター。２８．ドパミンレセプターの生物学的活性を有するミュータントである請求項２７のドパミンレセプター。２９．哺乳類Ｄ２ドパミンレセプターの生物学的活性を有する実質上純粋なポリペプチド。３０．ヒトドパミンレセプターのフラグメントである請求項２９のポリペプチド。３１．哺乳類Ｄ２ドパミンレセプターの抗原決定基を規定するアミノ酸配列を有する前記レセプターのフラグメント。３２．前記レセプターの３番目細胞質ループから選ばれた請求項３１のフラグメント。３３．哺乳類Ｄ２ドパミンレセプターを結合し得る抗体。３４．請求項３３のモノクローナル抗体。３５．ドパミンレセプターを結合し得るフラグメントである請求項３３の抗体のフラグメント。３６．Ｆａｂフラグメントである請求項３５の抗体フラグメント。３７．前記哺乳類はヒトである請求項３３の抗体。３８．標識されている請求項３３のフラグメント。３９．哺乳類Ｄ２ドパミンレセプターの生物学的活性を有するポリペプチドまたはその生物学的に活性なフラグメントもしくは変種、その抗体もしくは抗体フラグメント、または請求項１の核酸配列と、薬剤学的に許容し得る担体とを含む組成物。４０．前記哺乳類はヒトである請求項３９の組成物。４１．哺乳頬Ｄ２ドパミンレセプターの生物学的活性を有するポリペプチドをコードする請求項１の単離したＤＮＡ配列をある座に配置するかまたは該座において発現させるか、またはそのようなポリペプチドを実質上純粋な形において該座に配置することを含む、ある座において哺乳類Ｄ２ドパミンレセプター活性を増加させる方法。４２．哺乳類Ｄ２ドパミンレセプターに対する条件または物質の効果を決定する方法であって、そのようなドパミンレセプターを前記条件または物質へ曝露することよりなり、その際前記ドパミンレセプターとして請求項２９のポリペプチドを使用することを含む改良。４３．哺乳類Ｄ２ドパミンレセプターに対する親和性について、または哺乳類Ｄ２ドパミンレセプターへ結合するリガンドによってトリガされるレスポンスを修正もしくは開始するその能力について化合物をスクリーニングすることを含む請求項４２の方法。４４．アミノ酸番号２−１３，１８２−１９２，２６４−２７７，２８７−２９８または４０４−４１４を含む、第１図の部分的配列を結合する請求項３３の抗体。４５．請求項５３の核酸配列がある座においてそのクロモシーム中に集積され、それにより該配列は哺乳類Ｄ２ドパミンレセプター遺伝子として活性である遺伝子組換非ヒト哺乳類。４６．サンプルの少なくとも一成分をドパミンレセプターに独自に関連した核酸もしくはアミノ酵配列へ曝露することを含む、サンプルのドパミンレセプター関連性質を決定する方法。４７．前記サンプルはヒトからのものであり、そしてドパミンレセプターに関連した病的状態が診断または特徴化される請求項４６の方法。４８．前記病気は分裂症である請求項４７の方法。４９．請求項１６の細胞内の発現によって調製された、哺乳類Ｄ２ドパミンレセプターの生物学的活性を有するポリペプチド。５０．請求項１７の細胞内の発現によって調製された、哺乳類Ｄ２ドパミンレセプターの生物学的活性を有するポリペプチド。５１．請求項５のＤＮＡを含むベクターで形質転換された細胞内の発現によって調製された、哺乳類Ｄ２ドパミンレセプターの生物学的活性を有するポリペプチド。５２．請求項５４の組成物を投与することを含む、哺乳類Ｄ２ドパミンレセプター活性を変調する方法。５３．実質純粋な形の哺乳類Ｄ２ドパミンレセプター遺伝子またはその生物学的に活性なフラグメント。５４．哺乳類Ｄ２ドパミンレセプターの生物学的活性を有するポリペプチドまたはその生物学的に活性なフラグメントもしくは変種、または請求項５３の核酸配列と、薬剤学的に許容し得る担体を含んでいる組成物。