JP3018045B2 - ドーパミンリセプター及び遺伝子 - Google Patents

ドーパミンリセプター及び遺伝子

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Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 本発明は哺乳類からのドーパミンリセプター及びそれ
に対応する遺伝子に関する。特に、本発明はD2ドーパミ
ンリセプター遺伝子の単離、配列及び／又はクローニン
グ、変換細胞によるD2ドーパミンリセプターの合成及び
ドーパミンリセプターをコードするDNAの同定及びクロ
ーニングにより可能となる新規の産物の製造及び使用に
関する。
ドーパミンリセプターは一般に非常に多くの神経学的
及び他の異常−例えば運動異常、精神分裂、薬物依存、
パーキンソン氏病、トゥレット症候群、晩発生運動障害
及びその他多く−に関与している。その結果、ドーパミ
ンリセプターは多くの薬理学的及び生化学的研究の対象
となってきた。
一般に、ドーパミンリセプターは、薬理学的及び生化
学的特徴に基づいてD1及びD2のサブタイプに分類される
（1,2）。D2ドーパミンリセプターは薬理生理学及び上
記の異常に関連づけられてきた。加えて、D2ドーパミン
リセプターは第２のメッセンジャー系を調節するために
グアニジンヌクレオチド結合蛋白質と相互作用すること
が知られている（6,7）。
ドーパミンリセプター及びその遺伝子の存在及び性質
の解明について力点がおかれていたにも拘わらず、同
定、単離、およびクローニングはこれまでなしえなかっ
た。Ｇリセプターと結合する類縁のリセプターが、一次
アミノ酸配列においてかなりの類似性を示し７個の推定
上の膜横断領域（８）よりなると予測される構造形態を
呈するということが知られているにもかかわらずそうで
あった。セロトニンリセプターに関しては、例えば、Ju
lius et al.,Science,241:558（1988）を参照のこ
と。
発明の概要 本発明は成功裏に人類を含む哺乳類のD2ドーパミンリ
セプター遺伝子配列を同定し、単離し、クローン化しコ
ード化されたドーパミンリセプターを製造した。対応す
るポリペプチドが合成された。遺伝子とポリペプチド双
方の配列が決定された。本発明はまた、多くの新規で有
用な核酸、細胞ライン、ベクター、及びポリペプチド及
びとりわけ医薬品、並びにそれらを使用する方法を提供
する。
このように、本発明はDNA配列−その同定された部分
は構造遺伝子であり哺乳類D2ドーパミンリセプターの生
物学的活性を有するポリペプチドをコードしている−の
単離に関する。特にそれは、哺乳類D2ドーパミンリセプ
ターをコードするDNA配列にハイブリッドされる単離さ
れたDAN配列に関する。それはまた、特に哺乳類のドー
パミンリセプターの生物学的活性を有するポリペプチ
ド、特に哺乳類D2ドーパミンリセプター、をもコードす
るそのような配列のフラグメント、変種及び突然変異体
に関する。好ましくは、ヒトのドーパミンリセプターで
ある。他に好ましくは、その配列は図１に示したように
ラットのD2ドーパミンリセプターである。無論、本発明
の核酸はまた、前記の相補的ストランド、並びにコドン
の変性による異なった配列及び前記の配列とハイブリッ
ドした配列をも含むものである。
他に好ましくは、本発明は好ましくは放射性又はビオ
チン標識等の検出し得る部分で標識した、オリゴヌクレ
オチドのプローブとして有用な核酸配列及びフラグメン
トを含む。例えば、そのようなプローブは、D2ドーパミ
ンリセプターの生物学的活性を有するポリペプチドをコ
ードするDNAと又はそれに関連した例えば、D2ドーパミ
ンリセプター遺伝子若しくはそのイントロンの制御を提
供するDNA等のDNAとハイブリッドさせることができる。
本発明のDNAはまたベクターの部分であることもでき
る。
本発明はまた、本発明のベクターで形質転換される細
胞及びこれらの細胞をポリペプチド−例えばD2ドーパミ
ンリセプターの生物学的活性を有するもの−を製造する
ために培養する方法をも含む。好ましくは、該細胞はそ
のような方法に用いる場合には哺乳類起源のものであ
る。
本発明はまた、前記の核酸配列によりコードされるポ
リペプチド、特に単離された哺乳類のドーパミンリセプ
ター−好ましくはヒト起源のもの−に関する。本発明は
更に、かかるリセプターの突然変異体又は変種、好まし
くはリセプターから１又はより多くのアミノ酸が置換さ
れ、挿入され及び／又は除去されたもの、特にドーパミ
ンリセプターの生物学的活性を保持している突然変異体
にも関する。本発明はまた、抗体であって、好ましくは
標識され、そして最も好ましくはモノクローナルであ
り、ドーパミンリセプター−好ましくはヒトのものであ
る−のアミノ酸配列に結合することができるもの又はか
かる抗体のフラグメントにも関する。
本発明は、上記の種々の産物の一、及び、典型的に
は、薬剤学的に許容し得る担体を含んでなる組成物に関
し、並びに広範囲の効用のある結果を達成するためにこ
れらの産物を使用する方法にも関する。
図面の簡単な説明 本発明の種々の他の目的、態様及び付随する利点は、
添付の図面と連結して考慮され一層よく理解されるとき
に一層完全に認識されるであろう。図において、 図１は、RGB2cDNAのための核酸配列及びそれから導かれ
るラットのD2ドーパミンリセプターのアミノ酸配列を示
す。該核酸配列は、長い開環読み取りフレームの第１の
メチオニンに始まる番号を付与されている。ヌクレオチ
ド番号は、各行の右手末端におけるヌクレオチド配列の
下に現れている。導かれるアミノ酸配列はヌクレオチド
配列の上に示されている。二重下線は、５′非翻訳領域
における小さい開環読み取りフレームを表す。仮定され
るＮ−結合グリコシル化部位は、アスタリスクにより示
されている。推定されるプロテインキナーゼＡリン酸化
部位にはその上に線を引いてある。イントロンの繋ぎ接
合は矢印で示されている。ポリＡアデニル化部位は下線
が施されている。
図２は、ラットD2ドーパミンリセプター、ハムスター
β２−アドレナリンリセプター、ヒトα２−アドレナリ
ンリセプター、ヒトＧ−21（セロトニン1a）リセプタ
ー、ブタのムスカリンＭリセプター及び牛のサブスタン
スＫリセプターのアミノ酸配列の並びを示す。実線で囲
み陰を付けたアミノ酸は、D2ドーパミンリセプターと比
較したとき少なくとも２つの他の配列において同一であ
る残基を示している。推定される膜横断ドメインはメイ
ンはローマ数字で標識した括弧で示されている。変化し
うる第３の細胞質ループ内の及びＣ末端における残基の
数は括弧に入れてある。
図３は、ラットの脳及び下垂体におけるRGB−２トラ
ンスクリプトのNothernブロック分析を示す。各レーン
は20μｇの全RNAを含有する。右の数字は、RNAサイズ標
識（BRL）で測定した分子量を示す。A:臭球、B:海馬、
C:小脳、D:口部皮質、E:前部皮質、F:視床、G:視床下
部、H:髄質、I:扁桃体、J:中脳、K:中隔、L:後部基底神
経節、M:前部基底神経節、N:下垂体神経性中葉、O:下垂
体前葉 図４は、Ｌ−RGB2Zem−１細胞からの膜に対する3H−
スピペロンの結合を示す。
ａ）1:L−RGB2Zem−１細胞及びラット線条体から調製さ
れた膜に対する3H−スピペロンの特異的結合を飽和等温
線。４つの独立した実験からの結果を示す。
2:データのスカッチャード分析。
ｂ）Ｌ−RGB2Zem−１膜を用いた競合曲線。Ｌ−RGB2Zem
−１細胞からの膜における3H−スピペロンの特異的結合
の薬物による阻害を求めるための代表的な曲線を示す。
各薬物は３回試験した。
ｃ）Ｌ−RGB2Zem−１及びラット線条体に対するKiの
表。結果は、種々の濃度の非標識薬物で0.5nMの3H−ス
ピペロンを阻害した３つの実験の幾何平均である。いく
つかの薬物にあっては、ラット線条体組織における阻害
曲線は、２つのクラスの結合部位の存在を想定すること
によって最もよく当てはまった。阻害剤に対する高い又
は低い親和性を有する結合部位の比率は括弧に示した。
10乃至25％の特異的結合を示す結合部位クラスについて
のKi値は、放射性リガンドがKd値1nMでセロトニンリセ
プターに結合しているという仮定のもとに算定した。
図５は、（ａ）図１に示したアミノ酸配列の疎水性プ
ロット、及び（ｂ）β２−アドレナリンリセプターのア
ミノ酸配列の疎水性プロットを示す。膜横断領域はロー
マ数字で印を付してある。
図６は、図１に示した核酸配列の2477塩基EcoR Iフラ
グメントの計算された制限地図である。
図７は、ヒトD2ドーパミンリセプターの部分的配列を
示し、示された中央のアミノ酸配列は正しいものであ
る。
図８は、LZR1及びLZR2細胞に対する特異的な〔3H〕ス
ピペロン結合の飽和分析を示す。結果は、示してあるよ
うに、対照成長培養液または硫酸亜鉛を加えた培養液に
おいてLZR1及びLZR2細胞を成長させた代表的な実験から
のものである。データは、特異的に結合した放射性リガ
ンドを遊離の放射性リガンドの補正した濃度で割った値
を、特異的に結合した放射性リガンドに対してプロット
したものである。亜鉛処理のためには、成長培養液に10
0μＭの硫酸亜鉛を16時間加えた。対照細胞と亜鉛処理
細胞の双方を、次いで洗浄しそして集める前に対照培養
液で１日間成長させた。示した実験においては、対照の
LZR1細胞又は亜鉛で処理したLZR1細胞についての、非線
型回帰分析で決定したBmax値は、それぞれ876及び914fm
ol/mg蛋白質であった。対照の又は亜鉛処理したLRZ2細
胞のBmax値は、それぞれ385及び593fmol/mg蛋白質であ
った。
図９は、アゴニストによる放射性リガンドの結合の阻
害を示す。結果は、競合薬物の不存在下の特異的結合の
パーセントとして表した特異的結合を、競合薬物の濃度
の対数に対してプロットしたものである。膜は、次に記
述するようにしてLRZ1細胞から調製した。
A. アゴニストによる〔3H〕スピペロンの結合の阻害を
求めるために一回の実験からの曲線が示されている。各
薬物は２回試験した。この実験においては、遊離の
〔3H〕スピロペリドール濃度は230pM、〔3H〕スピロペ
リドールのKD値は60pMであった。この実験においては、
K1値及びHill係数は、ブロモクリプチンについてはそれ
ぞれ5nM及び1.05、（−）３−PPPについては790mM及び
0.89、キンピロールについては８μＭ及び1.0、（＋）
３−PPPに対しては31μＭ及び1.05、LY181990に対して
は0.3mM及び0.72であった。
B. 〔3H〕スピロペリドールの結合のDAによる阻害に対
するGTP及びNaClの効果を測定した４つの独立した実験
のうち１つの結果を示す。〔3H〕スピロペリドールの濃
度は323から498pMであった。この実験においては、放射
性リガンドの濃度は323pMであった。白丸は0.1mMのGTP
及び120mMのNaClの存在下でのDAによる阻害を表し、黒
丸はGTP及びNaClの添加なしの場合の阻害を表す。この
実験でのIC50値及びHill係数は、GTP及びNaClの不存在
下ではそれぞれ29μＭ及び0.65、存在下ではそれぞれ11
5μＭ及び1.03であった。
図10は、LZR1細胞におけるアデニレートサイクラーゼ
活性の阻害を示す。アゴニストが、LZR1細胞から調製し
た膜におけるアデニレートサイクラーゼ活性の阻害を求
めるために試験された。各定量において50乃至100μｇ
の蛋白質が使用された。結果を、10μＭのフォルスコリ
ン存在下での全活性に対するパーセントとして表し、〔
32P〕cAMP/mg蛋白質／分として示す。少なくとも各３回
試験された６種の薬物について代表的な容量−作用曲線
を示す。データは、酵素活性を薬物濃度の対数に対して
プロットしたものである。阻害が何らみられないから、
（−）３−PPPのデータについては曲線をプロットして
いない。この図に示した実験においては、基準の及びフ
ォルスコリンにより刺激された活性は、それぞれ約、0.
8乃至1.5及び8.5乃至15.8pmol/mg蛋白質／分であった。
図11は、DA感受性アデニレートサイクラーゼの阻害を
示す。結果は３つの実験の平均±SEであり、10μＭのフ
ォルスコリン存在下における全活性のパーセントとして
プロットしてある。フォルスコリン（FSK）は、示され
ているように、10μＭのドーパミン（DA）又はDA及び10
μＭの（＋）−ブタクラモール（BUT）と共に、示した
全ての実験において存在している。細胞のいくつかは、
酵素活性の測定のために集める前に、百日咳トキシン
（PT）で処理した。対照の基準活性及びPT−処理細胞の
活性は、それぞれ1.2±0.07及び1.6±0.15pmol/mg蛋白
質／分であった。対照細胞における全フォルスコリン刺
激活性（FSK）は11.9±1.0pmol/mg蛋白質／分であっ
た。対平均に対してしたｔ−検定によると、対照細胞に
おけるFSKとの比較は（＊）ｐ＜0.05。
図12は、百日咳トキシン処理によるドーパミン阻害の
逆転を示す。膜アデニレートサイクラーゼ活性について
下に掲げたデータは、平均（ｘ）と標準誤差（S.E.）及
び％阻害（％Inh.）を示す。％阻害は方程式100×〔１
−（Ｓ−B/I−B1）〕から算出した。ここにおいて、
Ｂ、Ｓ及びＩはそれぞれ、基準活性、刺激剤（Ｓ）又は
阻害剤（Ｉ）の存在下での活性を示し、B1は阻害剤の存
在下での基準活性を示す。結果は、対照と、百日咳トキ
シン（＋P.T.として示した）で前処理（16時間、50ng/m
l）した細胞における、平行測定から得られた。
（Ａ） アデニレートサイクラーゼ。アダニレートサイ
クラーゼ測定用の膜は短時間10μＭのフォルスコリン
（FSK）又は100μＭのドーパミン（DA）に曝し、アデニ
レートサイクラーゼ活性は、pmol/mg蛋白質／分で表現
した。
（Ｂ） 細胞内cAMP。細胞を短時間VIP（200nM）及びド
ーパミン（１μＭ）で処理し、cAMP蓄積量（pmol/シャ
ーレとして表現）を細胞抽出液にて測定した。
（Ｃ） 細胞外cAMP。同じ細胞のシャーレからの培養液
サンプルよりcAMPを測定しpmol/シャーレで表した。
図13は、特異的ドーパミンD2リセプターmRNAの表現及
びGH4ZR7転換細胞における結合を示す。
（Ａ） GH4C1細胞の全RNA（20μg/レーン）のNothern
ブロット分析。Ｙ軸はRNA分子量標準（kb）の移動を示
す。
（Ｂ）（１） GH4ZR7細胞より調製された膜への3H−ス
ピペロンの特異的結合が、飽和分析により特徴づけられ
た（実施例２「実験手順」を参照）。４つの独立した実
験から得られたデータを、特異的に結合した放射性リガ
ンド（縦座標）を補正した遊離の放射性リガンド濃度
（全量引く全結合量）に対してプロットしてある。この
実験ににおける算出されたKD及びBmax値は、60pM及び11
65fmol/mg蛋白質であった。
（Ｂ）（２） 特異的結合／遊離（Ｙ軸）を3H−スピペ
ロンの特異的結合濃度（Ｘ軸）に対してプロットしたス
キャッチャード法によるデータの変換。
（Ｃ）ドーパミンによる特異的3H−スピペロン結合の変
位:GTP/NaClの効果。GH4ZR7細胞膜を、100μMGTP/120mM
NaClの不存在下（○）又は存在下（・）にて、3H−スピ
ペロン（0.47nM）及び示した濃度のドーパミン（Ｘ軸）
と共にインキュベートした。結果は４つの実験のうちの
１つである。示した実験におけるドーパミンについて算
出されたIC50及びHill係数値は、GTP/NaClの不存在下で
は16μＭ及び0.61、GTP/NaClの存在下では56μＭ及び0.
85であった。
図14は、GH4ZR7細胞における、ドーパミンによるcAMP
の蓄積阻害及びPRLの放出を示す。インキュベーション
は、実施例２の「実験手順」に記述したように、３つ行
った。
（Ａ）ドーミンによる細胞外cAMP蓄積の阻害。GH4C1及
びGH4ZR7細胞の平行なシャーレを、種々の濃度のVIP、
ドーパミン（Ｄ）並びに250nM、10μＭ及び５μＭの
（−）−スルピリド（−Ｓ）をそれぞれ加えてインキュ
ベートした。無処理対照は「Ｃ」で表す。培養液は集め
られ、cAMPを測定し、pmol/シャーレ（縦座標）で表し
た。
（Ｂ）GH4ZR7細胞におけるドーパミンによる細胞内cAMP
の蓄積阻害。細胞抽出液につきcAMPを測定し、縦座標に
表した。薬物濃度は、（Ａ）におけると同様に、（＋）
−スルピリドを除いて５μＭであった。
（Ｃ）GH4ZR7細胞における刺激されたPRL放出のドーパ
ミンによる阻害。示した処理の後、培養液サンプルにつ
きPRL（縦座標）を測定した。VIP、THR、ドーパミン
（Ｄ）及び（−）−スルピリド（−Ｓ）の濃度はそれぞ
れ200nM,200nM,100nM及び２μＭであった。
図15は、GH4ZR7細胞における基準の及びVIP刺激cAMP
蓄積のドーパミン阻害の容量−作用関係を示す。
（Ａ）示した各濃度のドーパミンの存在下における、細
胞内（・）及び細胞外（○）蓄積。ドーパミンの不存在
下において、基準のcAMPレベルは22±6pmol/シャーレ
（細胞内）及び12.4±0.6pmol/シャーレ（細胞外）であ
った。ドーパミン作用のEC50は4.9nM（細胞内）及び8.5
nM（細胞外）であった。
（Ｂ）各濃度のドーパミンの存在下における、細胞内
（・）及び細胞外（○）蓄積。VIP（250nM）−刺激での
細胞内及び細胞外cAMPレベル（ドーパミンの不存在下に
おいて）は、それぞれ145±2.8pmol/シャーレ及び146±
2.8pmol/シャーレ、であり基準cAMPレベルは、それぞれ
35±1.6pmol/シャーレ及び15±0.2pmol/シャーレであっ
た。ドーパミン阻害のEC50は5.5nM（細胞内）及び5.8nM
（細胞外）であった。
図16は、VIP−刺激cAMP蓄積のドーパミンによる阻害
の特異的阻止を示している。GH4ZR7細胞を、250nMのVIP
及び100nMのドーパミン、並びに示した濃度の種々のド
ーパミンアンタゴニストの存在下に、FAT培養液（実施
例２の「方法」参照）中でインキュベートし、細胞外cA
MPレベルを測定した。最大cAMPレベルのパーセントを示
した濃度のドーパミンアンタゴニストの対数に対してプ
ロットしてデータとした。３つの定量の標準誤差は８％
未満であった。基準の及びVIP−刺激cAMPレベル（ドー
パミン及びアンタゴニストの不存在下にて）は25.8±1.
6mol/シャーレ及び214±14pmol/シャーレであった。ド
ーパミン作用のアンタゴニストについてのIC50及び推定
Ki値：スピペロン0.56nM及び30pM;（＋）−ブタクラモ
ール4.5nM及び0.2nM;（−）−スルピリド38nM及び1.8n
M;SCH23390＞１μM;（−）−ブタクラモール＞10μＭで
あった。推定KI値は方程式KI−IC50/（１＋（値DA〕/EC
50））で算出された。ここにおいて、〔DA〕は100nM及
びドーパミンのEC50は6nMである。スピペロン、（＋）
−ブタクラモール及び（−）−スルピリドのみ、基準cA
MPレベルを変化させなかった。
図17は、ドーパミンD2アゴニストによるアデニレート
サイクラーゼの阻害を示す。アデニレートサイクラーゼ
活性の阻害は10μＭのフォルスコリンの存在下で測定し
た。全活性のパーセントとして表した酵素活性の３つ測
定の平均を薬物濃度の対数に対してプロットしてデータ
とした。基準アデニレートサイクラーゼ活性の平均は4.
6±0.2pmol/mg蛋白質／分であり、全フォルスコリン刺
激活性は63.8±0.2pmol/mg蛋白質／分であった。示した
実験におけるEC50値及び最大阻害は、ドーパミンについ
てはそれぞれ79nM及び57％、。キンピロールについては
200nM及び49％、ブロモクリプチンにおいては5nM及び23
％、そして（＋）−３−PPPにおいては600μＭ及び40％
であった。
図18は、ヒト下垂体ドパミンD2レセプターcDNAの核酸
配列を第２列に示す。導かれるアミノ酸配列は第１列に
示してある。第３列はクローン化したラットcDNAの核酸
配列であり、それから導かれるアミノ酸配列のヒトドパ
ミンD2レセプターマミノ酸配列との違いが第４列に示さ
れている。番号Ｉ−VIIのボックスで囲んだ領域は推定
される膜横断領域を表す。三角はエキソン／イントロン
スプライシング接合を、DAN配列中ヒリオドで結んだ部
分は存在しない塩基対部分を、アスタリスクは可能性あ
るＮ−結合グリコシル化部位を示し、そしてタンパクキ
ナーゼＡの標的にはアンダーラインを、ポリアデニル化
信号には二重にアンダーラインを付してある。
図19は、Ｌ−hPitD2Zem膜への〔3H〕ドムペリドンの
結合の競合曲線を示す。該放射性リガンドは、1nMの濃
度で使用され、特異的結合は１μＭの（＋）ブタクラモ
ールを用いて決定した。データは３つの実験のうち１つ
を示してある。
図20は、ヒトゲノムDNAのSouthernブロットを示す。
エキソン７を含んでいるゲノムBamH I1.6−kbフラグメ
ントは、λHD2G1から調製されプローブとして使用され
る（特異的活性、２×108cpm）。DNAは、BamH I（レー
ン１）、Ba1 II（レーン２）、BamH I/Ba1 II（レーン
３）及びHind III（レーン４）で消化した。
図21は、ヒトドーパミンD2リセプター遺伝子及び下垂
体cDNAの概念的表現である。
（ａ）２つの重複するゲノム相、λhD2G1及びλhD2G2;
A,ApaL I;B,BamH I;Bg,Bg1 II;H,Hind IIIの制限地図。
（ｂ）ヒト遺伝子ローカスDRD2の図。箱によって示され
たエクソンに番号が付されている。黒塗りの箱はコード
している配列を示し、白抜き箱は翻訳されない配列を示
す。ゲノムの配列決定の戦略が遺伝上に拡大される。こ
れらの領域は一定のスケールでは描かれていない。DNA
配列（＋はセンス配列を、−はアンチセンス配列を示
す）は、各梯子を下から上へと矢印によって示された方
向へと読まれる（右を指して、５′から３′へそして左
を指して、３′から５′へと）。87−bpエキソンは５番
である。イントロンのサイズはSouthernブロッティング
と制限地図により決定され、一つの例外を除いて10パー
セント以内の正確さを有している：すなわち、イントロ
ン１は20パーセント以内の正確さである。
（ｃ）ヒト下垂体cDNAの構造。エキソン／イントロン繋
ぎ接合が三角形により示されている。膜横断領域をコー
ドしている領域Ｉ−VIIは斜線を含んだ箱によって囲ま
れている。87−bp配列には縦筋を付してある。翻訳開始
部位（ATG）及び終始部位（TAG）は、ポリアデニル化信
号配列（AATAAAA）と同様に示されている。
図22は、Ｌ−hPitD2Zem,L−RGB2Zem1及びラット線条
体のIC50値（nM）の比較を示している。
図23は、ヒトドーパミンD2リセプター遺伝子における
エキソン／イントロン接合を示している。
考察 本発明は、Ｇ蛋白質に結合するリセプターをコードす
る遺伝子ファミリー各々間の核酸配列の類似性を独特な
方法で利用したものである。ハイブリッド形成プローブ
として独特なハムスターβ２−アドレナリンリセプター
（β2AR）遺伝子を使用することにより、ラットのD2ド
ーパミンリセプターをコードしているcDNAが同定され単
離された。該リセプターは、３つの基準のもとに特徴づ
けられる:1）Ｇ蛋白質結合受容体のファミリーのメンバ
ーであることが明らかである誘導アミノ酸配列、２）D2
ドーパミンリセプターに知られているのと平行した対応
するmRNAの組織分布、及び、３）該cDNAで形質転換され
たLtk−細胞の薬理学的な性質。
ラットのゲノムライブラリーは、ハムスターのβ2AR
遺伝子のコード領域の大部分を含むnick−翻訳1.3kb H
ind IIIフラグメントによって緩和なハイブリッド化の
条件下でスクリーンされた。ハムスターβ2ARリセプタ
ー遺伝子は、部分的なハムスター肺λgt10ゲノムDNAラ
イブラリー（サイズ分画された（５−7kb）EcoR I消化D
NA）から、Dixon等（９）の配列から設計された２つの
オリゴヌクレオチドプローブ（30−mer,TCTGCTTTCAATCC
CCTCATCTACTGTCGG;40−mer,CTATCTTCTGGAGCTGCCTTTTGGC
CACCTGGAAGACCCT）によってクローン化される。その遺
伝子のコード配列の大部分を含むハムスターβ2AR遺伝
子の1.3kb Hind IIIフラグメントは、nick翻訳によっ
て標識され、市販のファージEMBL3におけるラットゲノ
ムDNAライブラリーを探索するのに使用される。該ライ
ブラリーは、コロニープラークスクリーンフィルター
（NEN）に移され、次のハイブリッド化条件下を用いた
32P標識プローブでスクリーンされる:25％ホルムアミ
ド、５×SSC、５×Denhardts,0.1％ピロリン酸ナトリウ
ム、１％SDS及びサケ精子DNA（100μg/ml）、37℃。フ
ィルターは２×SCCで及び0.1％SDSで55℃にて洗浄し
た。
これらの条件を用いると数種のクローンがハムスター
プローブにハイブリッド化することが見出された。RGB
−２と呼ばれる一つのクローンは、Southernブロット分
析においてハムスターβ2ARプローブとハイブリッドと
なる0.8kb EcoE I−Pst Iフラグメントを有することが
見出された。このフラグメントは配列決定され、ハムス
ターβ2ARの膜横断領域VIIの核酸配列に高度の同一性
（40塩基中32）を有する核酸鎖を有することが示され
た。可能な読み取りフレームの一つは、ハムスターβ2A
Rの膜横断領域VI及びVIIのアミノ酸配列に有意な類似性
を示した。このゲノムフラグメント内に、３′イントロ
ン繋ぎ部位（10）及び400bpの推定されるイントロン配
列がある。
0.8kb EcoR I−Pst Iフラグメント（nick翻訳）が、
50％のホルムアミドを使用する以外は上記と同じハイブ
リッド化条件で、λgt10中のラット脳cDNAライブラリー
を探索するのに用いられた。フィルターの洗浄は0.2×S
SC及び0.1％DSDにて65℃で行った。これらの高度に厳し
いハイブリッド化条件のもとで、サイズ約2.5kbの２つ
の明らかなクローンが、500,000クローンのライブラリ
ーの中から同定された。両方の鎖から、シーケネース
（U.S.Biochemical）を用いたSangerジデオキシチェー
ン決定法により、DNA配列が得られた（26）。配列と制
限分析とが、これら２つのクローンが単一のクローンの
レプリカであり、プローブとして使用されたゲノムフラ
グメントの配列を含むものであることを示した。ラット
の脳から単離されたmRNAのNorthernブロット分析におい
てRGB−２ cDNAが使用されたときには、約2.5kbの帯が
検出された。この発見は、RGB−２クローンが殆ど完全
な長さのものであることを示すものであった。
図１は、RGB−２ cDNAの2445塩基の核酸配列を示
す。415アミノ酸蛋白質（相対的分子量（Mr＝47064））
のcDNAコードにおける最長の開いた読み取りフレームは
また、該図に示されている。この分子量は、SDSポリア
クリルアミドゲル電気泳動により決定されたD2リセプタ
ーのグリコシル化型について報告されている（11）のと
近似している。推定開始部位から36塩基上流にあるフレ
ーム内ジペプチドがRGB−２ cDNAの５′非翻訳領域に
見出される。小さな開いた読み取りフレームがβ2AR m
RNAの５′非翻訳配列に認められる（９）。
RGB−２ cDNAから導かれる蛋白質の数種の構造的特
徴が、それがＧ蛋白質結合リセプターのファミリーに属
することを示している。蛋白質配列の疎水性プロット
（図５）が、７つの膜横断領域（８）を表し得る７本の
疎水性アミノ酸の鎖の存在を示している。更に、RGB−
２の一次アミノ酸配列は、他のＧ蛋白質結合リセプター
と高度の類似性を示している（図２）。最大のアミノ酸
同一性は推定される膜横断領域の内部に集まっている。
これらの領域の内部において、RGB−２蛋白質は、ヒト
α２−アドレナリンリセプター（12）とは50％、ヒトＧ
−21リセプター（13）とは42％、ハムスターβ2AR−ア
ドレナリンリセプター（９）とは38％、ブタM1リセプタ
ー（14）とは27％、及びウシsubstance Ｋ−リセプタ
ー（15）とは25％、の同一性を有している。
第３に、RGB−２は、Ｇ蛋白質結合リセプターのファ
ミリーのメンバーに共通ないくつかの構造的特徴を有し
ている。信号配列を有しないＮ末端にＮ結合グリコシル
化のための３個の一致配列がある。膜横断領域IIに見出
されるAsp80は、全ての知られているＧ蛋白質結合リセ
プターにおいて保たれている。膜横断領域IIIには、Asp
114があり、それには陽イオン性アミン類に結合するリ
セプターにのみ見出されるAsp残基が対応する（16）。
リン酸化が、リセプター機能を制御する手段として提案
されてきた（17）。プロテインキナーゼＡによるリン酸
化の潜在的部位は、第３の細胞質ループにあるSer228に
存在する。ロドプシンとβ−アドレナリンリセプターの
Ｃ末端部分には、リセプターキナーゼ類の潜在的基質で
ある多くのSer及びThr残基が見出される（18）。これに
対し、RGB−２の短いＣ末端はSer及びThr残基を有しな
い。しかし、α２−アドレナリンリセプターの場合のよ
うに、RGB−２はリン酸化基質として役立ち得る第３の
細胞質ループに多くのSer及びThr残基（22残基）を有す
る。RGB−２は、膜横断領域ＶとVIとの間に、短いＣ末
端（14アミノ酸）を伴った大きな細胞質ループ（135ア
ミン酸）を含む。この構造組織は、β２−アドレナリン
リセプターやM2ムスカリンリセプターのようなGI（阻害
的GI蛋白質）によって係合される他のリセプターに近似
している。アドレナリンリセプター及びムスカリンリセ
プターのファミリーとは異なり、RGB−２遺伝子は、膜
横断領域VIに位置するコード配列に少なくとも１つのイ
ントロンを有する。
RGB−２の同定に向けた最初の段階として、RGB−2mRN
Aの組織分布がNorthernブロット分析で試験された（図
３）。
雄性のSprague Dawleyラットから脳組織が切り取ら
れ、Chirgwin等（27）及びUllrich等（28）に従ってRNA
が単離された。Northernブロットには、RNAはグリオキ
サール及びDMSOを用いて変性し、そして1.2％アガロー
スガス上で展開した。電気泳動の後、RNAはナイロン膜
上にブロットし（Ｎ−Bond,Amersham）、80℃で２時間
焼付けた。膜は、50％ホルムアミド、0.2％PVP（M.W.4
0,000）、0.2％ficol（M.W.400,000）、pH7.5の0.05％
トリス、1MのNaCl、0.1％PPi、１％SDS及び変性サケ精
子DNA（100μg/ml）中で42℃にて16時間、前ハイブリッ
ド化した。RGB−２の1.6kb BamH I−Ba1 IIフラグメン
トでこのクローンのコード領域を含むものから製したラ
ンダムに標識した32P−標識フラグメント（１−２ 108
dpm/μｇ）が、42℃で終夜該フィルターを探索するため
に、上記で得たハイブリッド化溶液中で107dpm/mlの濃
度で使用された。ブロットは2x SSC及び0.1％SDSで65
℃10分間にて２回、0.5x SSC及び0.1％SDSにて室温15
分間にて２回、そして0.1x SSC及び0.1％SDSにて65℃1
5分間にて１回、洗浄した。ブロットは増感スクリーン
を有するＸ線フィルムに−70℃にて終夜曝した。
RGB−２のmRNAは、ラット脳の種々の領域で異なった
レベルに表現されるが、基底神経節が最も高い濃度を示
す。更に、RGB−２のmRNAは、ラットの下垂体神経性中
葉に高濃度に見出され、この腺の前葉には少ない程度に
した見出されない。RGB−２のmRNAの表現パターンは、
組織標本でのリセプターオートラジオグラフィー及び結
合研究によって決定されたD2ドーパミンリセプターの分
布と著しく近似している。
RGB−２によりコードされるリセプターの薬理学的特
徴を研究するために、cDNAが親核細胞にて表現された。
全RGB−２ cDNAが：マウスのメタロチオネインプロモ
ーター（21）からの転写を開始させるユーカリオート表
現ベクターpZem3（20）中にクローン化された。このプ
ラスミドは、選択的ネオマイシンフォスフォトランスン
フェラーゼ遺伝子（pRSVneo）と共に、標準CaPO4沈澱技
術（21）によりLtk−マウス繊維芽細胞ライン中に同時
トランスフェクトされた。細胞は、350μg/mlのG418中
で選別された。トランスフェクト体は分離され、Northe
rnブロット分析により、RGB−２ mRNAの表現の有無が
試験された。RGB−２に指令されたＬ−RGB2Zem−１を表
現している細胞ラインが単離された。RGB−２ mRNAは
親Ltk−細胞ランインには検出されなかった。
RGB− mRNAがD2ドーパミンリセプターに期待される
組織分布を示したことから、D2リガンド3H−スピペロン
を用いて、Ｌ−RGB2Zem−１細胞ライン、自然のLtk−細
胞及びラット線条体につき薬理学的研究が行われた。
膜は、細胞を４℃にて0.25M蔗糖、pH7.4の25mMトリ
ス、6mM MgCl2、1mM EDTA中でDounceホモジナイザー
で細胞をホモジナイズすることにより調製した。ホモジ
ナイズした溶液は800×ｇで10分間遠心し、そしてペレ
ットは前記と同様にホモジナイズし遠心した。上澄は集
められ、200,000×ｇで１時間遠心された。この遠心の
ペレットは、25mMのpH7.4のトリス、6mMの塩化マグネシ
ウム、1mMのEDTA中で、約250μｇ蛋白質/mlの濃度に再
懸濁され、少量ずつ−70℃にて保存された。放射性リガ
ンドの結合測定は、2ml（飽和分析）又は1ml（阻害曲
線）で各２つ行われた。液は（最終濃度として）次のも
のを含む:50mMのpH7.4のトリス、0.9％塩化ナトリウ
ム、0.025％アスコルビン酸、0.001％牛血清アルブミ
ン、3H−スピペロン（Amersham,95Ci/mmol）及び適当な
薬物。いくつかの実験においては、100μＭのグアノシ
ン５′−トリフォスフェートが含まれた。（＋）−ブタ
クラモール（２μＭ）が、非特異的結合を明らかにする
ために使用された。各測定において、インキュベーショ
ンは、15−40μｇの蛋白質の添加により開始され、37℃
で50分間行われ、10mlの氷冷洗浄用緩衝液（10mMトリ
ス、pH7.4及び0.9％塩化ナトリウム）の添加によって停
止された。サンプルは、硝子繊維フィルター（Schleich
er及びSchuell No.30）にて濾過され、追加の10mlの洗
浄用緩衝液にて洗浄された。フィルター上に保持された
放射活性は、Beckman LS 1701シンチレーションカウ
ンターを用いてカウントされた。データは、データ解析
プログラムEnzfitterを用いて描く以外は、前記（29）
の通りにして解析された。得られたIC50値は、Cheng及
びPrusoff（30）の方法によりKi値へと変換された。
対照Ltk−細胞から調製された膜は、3H−スピペロン
の、（＋）−ブタクラモール−又はスルピリド置換性の
結合を示さなかった。Ｌ−RGB2Zem−１細胞から調製し
た膜への3H−スピペロンの結合は、Kd値48pM（図4a）で
飽和した。この値は、平行実験におけるラット線条体膜
はの3H−スピペロンの結合において観察されたもの（52
pM）と一致する。図4aに示した実験において、Ｌ−RGB2
Zem−１から調製された膜についてのKd及びBmax値は、4
0pm及び876fmol/mg蛋白質であり、一方、線条体膜の対
応する値は37pm及び547foml/mg蛋白質であった。結合部
位の濃度は、４つの実験で測定したところでは、Ｌ−RG
B2Zem−１膜においては945fmol/mg蛋白質及びラット線
条体膜においては454fmol/mg蛋白質であった。
Ｌ−RGB2Zem−１細胞からの膜への3H−スピペロンの
結合は、多くの薬物により阻害され、得られたKi値は線
条体膜を用いて得られたものとよく一致した（図4b,4
c）。D2アゴニストである（＋）−ブタクラモール及び
ハロペリドールは、最も強い阻害剤であり、スルピリド
がこれに続いた。D1ドーパミンアンタゴニストであるSC
H23390及びセロトニン5HT2アンタゴニストであるケタン
セリンは、3H−スピペロン結合の阻止力がずっと弱かっ
た。結合の阻害において（＋）−ブタクラモールが
（−）−ブタクラモールよりずっと強かったことから、
結合は立体選択性を有するものと思われた。これらの実
験においては、ドーパミンアンタゴニストの絶対的親和
性と薬物の強さの序例（スピペロン＞ハロペリドール＞
スルピリド＞＞（−）−ブタクラモール）は、前に公表
されたD2ドーパミンリセプターの値（２）とよく一致し
ている。
Ｌ−RGB2Zem−１膜の全ての結合データは、単一のク
ラスの結合部位の存在を想定することにより最も良く当
てはまった。他方、ラット線条体膜への3H−スピペロン
の結合の数種の薬物による阻害は、２つのクラスの結合
部位の存在を想定することにより最もよく当てはまっ
た。こうして、SCH23390及びケタンセリンは、ラット線
条体膜への3H−スピペロンの結合の10−20％を高い親和
性をもって阻害した（図4c）。ラット線条体膜において
は、スルピリドによる放射性リガンドの結合の阻害は、
１つのクラスの結合部位により最もよく当てはまった
が、（＋）−ブタクラモール置換性結合の10−15％は、
使用した濃度のスルピリドでは阻害されなかった。ケタ
ンセリン及びSCH23390に高い親和性を有し且つスルピリ
ドによっては置換されない結合部位は、ラット線条体膜
の5TH2セロトニンリセプターへの3H−スピペロンの結合
を示しているものと思われる。5TH2リセプターへのSCH2
3390の結合は既に記述されている（22）。ラット線条体
膜においては、D2ドーパミンリセプター−80乃至90％の
3H−スピペロン結合を含んでなるクラスの結合部位−に
ついての薬物の見かけの親和性は、Ｌ−RGB2Zem−１細
胞から調製するされた膜への薬物の見かけの親和性と区
別のつかないものであった（図4c）。
D2ドーパミンリセプターの刺激の生理学的効果は、Gi
により仲介されるように見える。GTPによるD2ドーパミ
ンリセプターへのアゴニストの結合の阻害は、アゴニス
トに対して高い親和性を有するリセプターGi複合体のGT
P−誘導性の解離（23、24）によるものと考えられる。3
H−スピペロン結合がKi値17μｍにてＬ−RGB2Zem−１膜
において阻害されたとはいえ、このドーパミン結合は追
加のGTPには反応しなかった。しかしこの知見は、報告
されているＬ細胞におけるGiの欠如（25）と符合してい
る。ここに提示した薬理学的データは、D2ドーパミンリ
セプターの結合特性がRGB−２ cDNAを表現しているLtk
−細胞において見出されたことを証明している。
前述のデータは、RGB−２ cDNAが、親核細胞にトラ
ンスフェクトされたとき、D2ドーパミン結合蛋白質の表
現を指令することを示している。このcDNAに対応するmR
NAがD2ドーパミンリセプターの存在が知られている組織
に局在していることから、そして、このmRNAがＧ蛋白質
結合リセプターの全ての予期される特徴を有する蛋白質
をコードすることから、RGB−２はラットD2ドーパミン
リセプターのクローンである。
図１に示した核酸配列は、例えばEcoR I部位又は他の
適当な部位を用いて、広範な種類の通常のそして好まし
くは市販のプラスミドに挿入することができる。図６
は、図１の配列の制限地図である。
この開示に基づく本発明のドーパミンリセプター遺伝
子、特に哺乳類D2ドーパミンリセプター遺伝子は、多く
の通常の方法をもちいて今や日常的に製造し、単離し及
び／又はクローン化することができる。例えば、ここに
開示した手順は、ドーパミンリセプターDNA配列を含む
ライブラリーについて実質的に反復することができる。
代わりに、ドーパミンリセプター遺伝子、特にヒトドー
パミンD2リセプター遺伝子、に選択的にオリゴヌクレオ
チドのプローブが、例えば図１の配列及び／又は省略さ
れたイントロンから、日常的に設計され得る。これら
は、ドーパミンリセプター核酸配列を含む核酸ライブラ
リーをスクリーニングするのに用いることができる。該
プローブ、特にそのようなプローブの複数（例えば２又
は３）の全て、にハイブリッドするこれらのライブラリ
ーにおける配列は、高い確率をもって本発明のDNA配列
であろう。無論、通常の方法を用いて図１又はそのいか
なるフラグメントの配列をも合成することが可能であ
る。
本発明はまた、広範囲にわたる有用な産物の製造及び
広範囲にわたる種々の有用な方法の使用を可能にし、並
びにドーパミンリセプターの研究及び制御のための基礎
的な道具を提供する。
これら産物及び方法は、よく知られた組み換えDNA、
免疫化学的な及びその他のバイオテクノロジー産業の方
法を用いて、それぞれ生産それ及び実施されることがで
きる。次を参照のこと：米国特許第4237224号、米国特
許第4264731号、米国特許第4273875号、米国特許第4293
652号、ヨーロッパ特許第093619号、Davis et al.,
“Ａ Manual for Genetic Engineering,Advanced
Bacterial Genetics",Cold Sring Harbor Laborato
ry,Cold Spring Harbor,New York（1980）;Maniatis
et al.,Molecular Cloning,Cold Spring Harbor
Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.;Davis et
al.,Basic Methods in Molecular Biology,Elsevie
r,N.Y.（1986）;Methods in Enzymology,Berger ＆
Kimmel（Eds.），（1987）． 本発明は、第一に、ドーパミンD2リセプターの１次ア
ミノ酸配列の全て並びにその生物学的性質を有する、精
製され及び単離されたポリペプチド産物を提供する。そ
れは次のものを含む：リン酸化及びグリコシル化のよう
な共有結合的修飾のための全ての部位、機能的蛋白質の
２次、３次及び４次構造を決定する全ての１次アミノ酸
配列、抗原性及び抗体結合部位を提供する全ての分子部
分、資質、炭水化物、及び蛋白質例えばグアニンヌクレ
オチド結合調節蛋白質のような他の生物学的分子との非
共有結合的相互作用を提供する全ての蛋白質部分、アゴ
ニスト、部分的アゴニストおよびアンタゴニストその他
のリガンドへの結合部位を形成する全蛋白質部分、脱感
作のような正常の生物学的活性に含まれる機能的なコン
フォメーション変化のために必要な全蛋白質部分、及び
このリセプターの遺伝子のそのたの繋ぎにより生じ得る
全蛋白質。
これらのポリペプチドは、例えば培養した細菌、酵母
又は哺乳類細胞のような、原核又は親核ホストにより、
完全に慣用の形質転換又はトランスフェクション（例え
ば哺乳類細胞ではリン酸カルシウムによる）技術を用い
て、本発明の核酸から表現させることができる。脊椎動
物（例えば哺乳類及び鳥類）細胞におけるそのような表
現の産物は、自然の形態では関連するであろう他のヒト
例えば又は夾雑物を含まないものとして得られるという
点において、特に有利である。表現のための好ましいホ
ストは、哺乳類でありこれは例えば、マウスLkt細胞、
ハムスターCHO細胞、マウスGH4細胞、マウスC6細胞、マ
ウス／ラットNG108−15細胞及びマウスAtT20細胞を含
む。例えば、図１の遺伝子が市販の成長ホルモンGH4細
胞にトランスフェクトされると、cAMPセカンドメッセン
ジャー系が調節されるのが認められた。好ましいベクタ
ーには、pZem又はpRSV又はワクチニアウイルス及びレト
ロウイルスのようなウイルスのベクターが含まれる。
本発明のポリペプチドは、例えばグリコシル化及び非
グリコシル化形態の双方の全ての可能な変種を含む。含
まれる特定の炭水化物は、表現のために使用した哺乳類
又は他の親核細胞の依存するであろう。本発明のポリペ
プチドはまた、先頭メチオニンアミノ酸残基を含むこと
もできる。
更に本発明には、合成的又は他の方法で、図１のアミ
ノ酸配列及び／又は本発明のドーパミンリセプター自身
を複製した、又はこれを部分的にのみ複製した、ポリペ
プチドも含まれる。これら全体または部分的に複製した
ポリペプチドは、好ましくはまた、ドーパミンリセプタ
ー自身の生物学的及び／又は免疫学的活性を保持するで
あろう。更に本発明の範囲には、そのようなポリペプチ
ドと免疫学的に反応性のあるモノクローナルまたはポリ
クローナル抗体（慣用の技術で生産され好ましくは標識
された）をも含む。
好ましい部分的ポリペプチド（フラグメント）は図２
に示した疎水性膜横断領域V,VI及びVIIに位置する配列
の一部を少なくとも含むものである。これらは、リガン
ド結合部位、特に領域VIIの位置に近似している。第３
の細胞質ループもまた重要なフラグメント領域である。
すなわち例えばＧ−蛋白質結合はこの領域及び領域Ｖ及
びVIを必要とする。特定の領域リセプターに高度に選択
的な抗体を得たい場合には、そのような抗体を生産する
フラグメントが、膜横断領域Ｖ及びVIの間の高度に特徴
的な領域、すなわちいずれも他のリセプターとは相同性
が低いものである第３の細胞質ループ、又はＣ末端領域
が選別され及び／又はこれらの領域にあるエピトープに
特異的な抗体が選別されるであろう。他のリセプター／
遺伝子の特異的領域は、イントロン配列、例えば上記の
RGB−２の領域である。合成された特に好ましいペプチ
ドは（図１のアミノ酸番号を参照して）：（Ａ）２−1
3;（Ｂ）182−192;（Ｃ）264−277;（Ｄ）287−298;及
び（Ｅ）404−414である。これらは次の原理に基づいて
選別される。すなわち、大きな数のPro残基（B/C/D）を
含むペプチドの知られた抗原性、Ｎ及びＣ末端（Ａ）及
び（Ｅ）のカバリッジ、リセプター反応をブロックする
に効果的な細胞外領域（リセプター反応領域）に抗体を
向かわせる能力（A/C/D）。これらフラグメントに対す
る抗体、例えば完全に慣用のハイブリドーマ技術による
モノクローナル抗体、は慣用の方法で作られる。
本発明はまた、ドーパミンリセプター全体又はそのフ
ラグメントをコードするDNA配列、並びに、そのような
全体又は部分的配列を含んだ表現ベクター（例えばウイ
ルス及び環状プラスミドベクター）にも関するものであ
る。同様に、ホスト（例えば細菌、酵母及び哺乳類）又
はそのようなベクターで形質転換され又はトランスフェ
クトされた細胞も含まれる。そのようなベクターにある
配列に対応するポリペプチドを表現させる対応した方法
もまた含まれるが、それらは例えば、外因性配列の大き
い規模での表現のための及び例えば成長培養液、細胞溶
解液又は細胞膜分画からのポリペプチドの単離のため
の、適当な条件のもとで形質転換され又はトランスフェ
クト細胞を培養することを含んでなるものである。
本発明のDNA配列はまた、ここに記述された自然の配
列と異なるポリペプチドの変種、突然変異又は類縁体を
コードするものをも含む。そのような相違は、自然の配
列から１又はより多くのアミノ酸残基を除去することに
より、そのような残基を置換することにより及び／又は
自然の配列に１又はより多くのアミノ酸残基を加える添
加により、誘導することができる。好ましくは、得られ
る修飾されたポリペプチドはドーパミンリセプターの生
物学的又は免疫学的活性のうち少なくとも１つを保持す
るであろう。
ドーパミン親和性活性に影響を及ぼしそうな突然変異
は、膜横断領域V,VI若しくはVIIにおける又は第３の細
胞質ループにおけるものであろう。加えて、DNA配列は
また、ここにおいて述べられた、特に各図にて示した、
他のDNA鎖のいかなる相補的な配列をも含む。すなわ
ち、典型的にはここに述べたハイブリッド化条件下にて
若しくはより激しい条件下にてここに述べたDNA配列に
ハイブリッドする又はそのようなDNA配列のフラグメン
トとハイブリッドするDNA配列、及び遺伝子コードの変
性によりここに示したものと異なっているDAN配列。こ
うして、本発明は、ドーパミンリセプターをコードし及
びここに示した配列の１又はより多くのものとハイブリ
ッドする全てのDNA配列を含む。これらには、対立変種
及びここに記述した実験にて述べた種以外の哺乳類から
のドーパミンリセプターが含まれる。cDNA又はゲノムド
ーパミンリセプターDNAの修飾は、部位指向性の突然変
異技術を含むよく知られた技術により容易に達成するこ
とができる。そのような修飾されたDNA配列は、ドーパ
ミンリセプターの生物学的活性の保持が望まれる場合に
は例えば膜横断領域Ｖ、VI若しくはVIIや第３の細胞質
ループではない選ばれた領域おいてなされた、除去、付
加及び／又は置換を含むことができる。前述の生物学的
活性及び／又は対応するDNA配列を保持しない修飾され
た蛋白質もまた、例えば本発明の種々の測定において、
有用であろう。そのような特に好ましいものにおいて
は、膜横断領域Ｖ、VI、VII又は第３の細胞質ループ
は、配列の修飾により除去又は不活化されるであろう。
グリコシル化部位の除去もまた、例えば酵母細胞におけ
るポリペプチドの表現のためには有用な変種である。
上記のように、ドーパミンリセプターをコードするDN
A配列のかなりの部分が種々の哺乳類種で保存されてい
るということが確立されている。従って、日常的な実験
を用いるのみで、熟練した当業者は、５′側、図１に示
したイントロン性及び構造遺伝子配列並びに図７に示し
たヒト配列を含むここに示した配列の詳細に従って製造
されたプローブを用いて、他のドーパミンリセプター遺
伝子特にD2ドーパミンリセプターの存在を求めて、例え
ば与えられた哺乳類からのDNAゲノムライブラリー又は
好ましくはcDNAライブラリーを、容易にスクリーニング
することができる。プローブは好ましくは、図２に示し
た７つの高度に保存された膜横断領域、好ましくは領域
VI及びVII、から選ばれるであろう。そのような日常的
スクリーニングは、プローブとハイブリッドするクロー
ンを同定するであろう。これらから、ここに記述した技
術を用いてドーパミンリセプターは日常的に選別される
ことができる。ヒトD2ドーパミンリセプターに関して
は、特に有用な原料としては、cDNAには線条体、下垂
体、神経芽細胞種、腎臓、胎盤細胞等が、ゲノムDNAに
は肝臓、胎盤細胞等が含まれる。例えば赤毛ザルのよう
な霊長類に関しては、特に有用なゲノムDNA又はcDNAラ
イブラリーとしては、脳、腎臓及び胎盤細胞が含まれ
る。
ヒトD2ドーパミンリセプター遺伝子に関しては、図７
に示した部分的配列は、λgt10中のラット脳cDNAの0.8k
bのEcoR I−Pst Iフラグメントによる探索のための上記
の激しいハイブリッド化条件の下で、全長ラットcDNA、
RGB−２であるプローブを用いて下垂体cDNAライブラリ
ーを慣用によりスクリーニングすることによって同定さ
れた。ここに述べたcDNAライブラリーは、例えば上に引
用した、例えばDavis et al.の参考文献に記載された
ような、完全に慣用の方法により調製することができ
る。この配列又はそのフラグメントもまた、ヒトドーパ
ミンリセプター遺伝子を求めて上記の及び他の全く慣用
の手順に従って、例えば上記の慣用のライブラリーをス
クリーニングするために、プローブとして有用であり得
る。図７の配列と図１及び２に示した配列とを比較すれ
ばわかるように、図７の部分的なヒトの配列は、図１の
第259番のアミノ酸に始まるRGB−２と高い相同性を有し
ている。
同様に、本発明はより一般的に、最も広い意味におけ
る哺乳類D2ドーパミンリセプター遺伝子、例えばそのよ
うな調節及び構造遺伝子を、例えば読み取りフレーム中
に、単体で又は組み合わせで、含むものである。例え
ば、ここに論ずる日常的な方法を用いて、そのような遺
伝子が哺乳類DNAライブラリーからクローン化されてき
たし、またそうされ得る。同様に、本発明は、生物学的
に活性なそのような遺伝子のフラグメント、例えば哺乳
類D2ドーパミンリセプターの生物学的活性を有するポリ
ペプチドをコードするフラグメント、又はそのようなコ
ードするフラグメントの表現を調節するのに有用なフラ
グメント、又は、例えばそれとハイブリッドさせること
により、そのような遺伝子若しくはフラグメントのため
のプローブとして有用なフラグメント、を含む。
本発明の種々のポリペプチド及び配列は、検出マーカ
ー物質、典型的には共有結合により、及び更に典型的に
は放射性標識により、又はDNAの場合にはビオチンのよ
うな非同位体標識により、慣用のように標識することが
できる。該ポリペプチド産物（例えば標識抗体）は、種
々のサンプル中のドーパミンリセプターの存在の検出及
び定量のために慣用の方法で使用することができる。す
なわち、該標識DNA産物は、通常のハイブリッド法（例
えばNortherブロット、Southernブロット、スポットア
ッセイ等）において、例えば、種々の哺乳類染色体地図
におけるドーパミン遺伝子の位置をつきとめるため、標
準レベルに比較してmRNA又はリセプター濃度が異常に高
い又は低いか否かを測定するため等の目的に、サンプル
中の関連核酸（DNA、RNA）の存在を検出し及び定量する
ため、慣用の方法で使用することができる。それらはま
た、やはり全く慣用の手順を用いて、例えば染色体異常
を検出する等のため、例えばRFLP分析（例えばGenes I
II,Levin,John Wiley and Sons（1987）を参照）を
用いて、与えられた患者からのDNAサンプルに基づくin
vitroの診断にてドーパミンリセプター遺伝子異常を
同定するために、有用であろう。例えば、ドーパミンリ
セプターが精神分裂症に関与することが言われれいるこ
とから、本発明の産物及び方法は、精神分裂症の患者か
らの核酸を例えばサイズ分画形態で特徴づけ、とりわけ
患者を精神分裂症サブグループに分類し、標準DNA分画
列との比較に基づき診断する等のために、使用すること
ができる。無論、それらはまた、ヒト又は他の哺乳類ゲ
ノムのマッピングにおいて、随伴する遺伝子を、例えば
RFLP分析及び適用しうるときは他の異常の分析におい
て、同定するための遺伝子マーカーとして使用すること
もできる。上に論じた遺伝子の特徴的領域、例えばイン
トロン領域、第３の細胞質ループ等は、この点特に有用
であろう。
本発明のポリペプチドが使用できる典型的な測定に
は、RIA:ELISAその他の、in vitro及びin vivo双方
の、よく知られたイムノアッセイ技術のあらゆるものが
含まれる。ドーパミンリセプターのポリペプチド配列の
種々のフラグメントはまた、与えられたフラグメント内
のエピトープを求めて、対応するポリクローナル抗体又
は好ましくはモノクローナル抗体（例えば、対応するハ
イブリドーマの慣用の調製及び表現により）を製造する
ために慣用のようにして使用することができる。抗体
は、しばしば慣用のようにして、例えば放射性又は酵素
的に標識されよう。好ましくは、得られるポリクローナ
ル又はモノクローナル抗体はまた、上述のフラグメント
に対してのみならず全蛋白質に対しても免疫特異的であ
ろう。そのような抗体は、例えば、ドーパミンリセプタ
ー及び関連産物の検出及びアフィニティー精製又はクロ
マトグラフィーにおいて、慣用のようにして使用されよ
う。
無論、本発明のポリペプチドは、上記のようにして細
胞から慣用の手順に従って表現されたもの及びやはり慣
用の手順を用いて合成したものを含む。本発明は、第１
に、自然環境の成分を実質上含まない哺乳類ドーパミン
リセプターの非自然的調製を可能にする。「実質上純粋
な」の語はここではこの意味、すなわち実質上これらの
自然の成分を含まないという意味、で用いられている。
本発明はまた、上記の種々の原料より単離することので
きる又は全く慣用の方法を用いて合成的に調製すること
のできるDNA配列を含む。
更に本発明の範囲に含まれるのは、本発明のポリペプ
チド産物の１若しくはより多くの又は本発明の核酸配列
の１若しくはより多くのものの有効量を、製薬産業にお
いてよく知られている適当な慣用の賦形剤、補助薬及び
／又は単体と混合してなる、薬剤学的組成物である。こ
れらはin vitroの使用、例えば、サンプル中のドーパ
ミンリセプターの存在の若しくはサンプル中の遺伝子若
しくは異常遺伝子の存在の検出のため、又はサンプル中
のリセプター若しくはその遺伝子の濃度を高めるため、
又は遺伝子治療のようなin vivoでの使用（例えば欠損
遺伝子若しくは遺伝子を不活化し、例えば適当なモノク
ローナル抗体によりそれをブロックすること）のため及
び／又は新しい機能的遺伝子（例えばレトロウイルスベ
クターを使用して）を提供するため、または与えられた
位置におけるドーパミンリセプターの濃度を高めるた
め、例えばアンチセンスオリゴ配列を投与することによ
りリセプター表現及び／又は活性を調節するために、ヒ
トを含む全ての哺乳類において、使用することができ
る。かくして、これらの組成物は、疾患状態、とりわけ
上述のようなドーパミンリセプターやその遺伝子の構
造、表現又は濃度の異常に関連するものを、治療するに
有用であろう。与えられた患者におけ与えられた状態に
対する有効な個々の投与量は、よく知られているよう
に、患者の全身状態、体重、特定のドーパミン欠乏疾患
状態の同一性及び重症度を含む通常の状態によって変化
するであろう。
本発明のポリペプチドはまた、薬物のような候補化合
物のそれに対する親和性、例えばD2ドーパミンリセプタ
ーに対する（例えばアゴニスト的又はアンタゴニスト的
な）親和性、を試験するために、例えば競合的結合測定
において使用することができる。そのような手順は、例
えば、ここにおいて及び／又はドーパミンリセプターの
自然の原料に基づく知られた慣用のプロトコールに類似
の、例えば、Schwarcz et al.,J.Neurochemistry,34
（1980）,772−778及びCreese et al.,European J.P
harmacol.,46（1977）,377−381の方法に従って、線条
体リセプター、及び他のリセプターに対するトリチル化
したドーパミンアゴニスト及びアンタゴニスの結合の阻
害のための知られた試験と類似の、全く慣用の手順を用
いて行うことができる。ドーパミンリセプターへのリガ
ンドの結合によって開始される反応、例えばセカンドメ
ッセンジャー系の調節のような細胞反応、を修正し又は
開始させる能力を求めて物質をスクリーニングすること
も可能である。そのような分析は、本発明の核酸配列で
形質転換した本発明の細胞を利用することができる。
ドーパミンリセプターに対する又はドーパミンリセプ
ター遺伝子、特にD2ドーパミンリセプター、に対する本
発明の抗体は、例えば放射線診断、MRI又はポジトロン
造影による、診断的造影技術にも使用することができ
る。放射性、パラマグネティック又はポジトロン標識
は、抗体（好ましくは自然のモノクローナルな）に慣用
の方法、例えばポジトロン放射、放射性核種若しくはパ
ラマグネティック金属のためにはキレート性基の共有結
合、により取りつけることができる。MRI、放射線感受
性又はポジトロン造影は、これらの試薬を用いて慣用の
方法を達成することができる。例えば、Maziere et a
l.,Life Sci.,35,1349（1984）を参照。
適当な薬剤学的担体としては、水、生理的食塩水、ヒ
ト血清アルブミン等が含まれる。組成物はまた、慣用の
ドーパミンアゴニスト、ドーパミンアンタゴニスト等
の、関与する特定の疾患状態の緩和に適した他の活性成
分を含むこともできる。組成物は、例えば抗体又はDNA
プローブ（例えば、遺伝子の相同性や異常を検出できる
もの）を、例えば酵素、基質、DNA制限フラグメント分
析用材料のような検出方法に特異的な試薬と共に含有す
る、慣用のキットの形態で提供することができる。本発
明はまた、例えば米国特許第4736866号に記載されてい
るのに類似の、知られた方法を用いて、対応する形質転
換動物、特に例えばラット、サル等のヒト以外の哺乳
類、を製造するためにも有用である。そのような動物は
例えば、特に商業的な研究目的に有用である。DNA配列
又は対応するmRNAはまた、例えばカエルからの卵母細胞
に注入するのに慣用のようにして使用することができ、
それは次いで慣用のようにして結合やセカンドメッセン
ジャーの解析に使用することができる。更に、１次アミ
ノ酸配列が入手しうること自体、ドーパミンリセプター
の２次及び３次構造についての実験的及びコンピュータ
ーモデル化と理解とを可能ならしめるものである。この
３次元的情報は、例えば細胞膜、そのリガンド（結合ポ
ケット）、関連蛋白質、メッセンジャー系等との相互作
用等のリセプター機能の詳細をモデル化して理解するの
に基礎を提供する。そのような解析は、理性的な薬物設
計を可能にし、それによって例えば新しいドーパミンリ
セプター調節化学薬剤がこの相互作用の詳細に従って設
計されることができる。
さらに研究することなく、以上の説明を利用して、当
業者は本発明のその全範囲において利用することができ
るものと信じられる。それ故言及した具体例は単に例示
と考えるべきであり、開示の残部の限定と考えるべきで
はない。
以上の説明から、当業者は本発明の本質的特徴な容易
に確かめることができ、そしてその精神および範囲から
逸脱することなく、種々の使用および条件に適応させる
ため本発明の種々の変更および修飾を行うことができ
る。
上に引用したすべての出願、特許および文献のすべて
は参照のためここに取入れる。
実施例 実施例１ 要約 我々は最近ラットドパミンＤ−２レセプターに対する
相補的DNAをクローンし、このレセプターを発現する細
胞ラインをつくることを可能にした。Ｄ−2cDNA（RGB−
２）をマウスフィブロブラストLtk-細胞中にトランスフ
ェクトすることによって細胞ライン（LZR1）がつくられ
た。以前Ｌ−RGB2Zem−１として記載された（１）LZR1
細胞はＤ−２レセプターの高密度を発現したが、野生タ
イプの細胞は発現しなかった。RGB−2cDNAのトランスフ
ェクションは亜鉛誘発マウスメタロチオネインプロモー
ターによって調節されるけれども、LZR1から調節された
膜上のＤ−２レセプターの密度は該細胞を亜鉛で処理後
も増加しなかった。LZR2と命令されたLtk-細胞から誘導
された第２の細胞ラインは非誘発状態においてＤ−２レ
セプターの低密度を持っていたが、亜鉛による処理はレ
セプター密度に50％増加を誘発した。多数のアゴニスト
は、発現したＤ−２レセプターに対する〔3H〕スピロペ
ルドールの結合を競合的にそして選択的に阻害した。LZ
R1細胞においては、ドパミンはGTPおよびNaClの存在し
たよりも不存在下において放射性リガンド結合のより強
力な阻害剤であった。ドパミンは、LZR1細胞から調製し
た膜においてフォルコリン刺激アデニレートサイクラー
ゼ活性を27％減少させた。ドパミンによる阻害は（＋）
ブタクラモールにより、または無傷の細胞の百日咳トキ
シンによる前処理によってブロックされた。これらデー
タは、RGB−２ cDNAはグアニンヌクレオチド結合タン
パクと相互作用し、そしてアデニレートサイクラーゼ活
性を阻害することができるドパミンＤ−２レセプターの
発現を命令することを指示する。さらにRGB−２ cDNA
は、ドパミンＤ−２レセプターの生物学的および薬理学
的特徴化のための道具として有用な多数の細胞ラインを
つくる手段を提供する。
序論 ドパミン（DA）レセプターは、機能的および薬理学的
プロフィルに基いて二つのサブタイプに分けられている
（２）。DA Ｄ−２レセプターはそれらのアデニレート
サイクラーゼ活性を阻害する能力によって機能的に特徴
化される（３）。Ｄ−２レセプターの活性化はカルシウ
ムチャンネルを阻害し（4,5）、カリウム伝導度を増加
し（６）、そしてイノシトールフォスフェートの蓄積を
阻害し得る（7,8）。DAレセプターの調節および機能的
特徴の研究を妨げていた一つの要因は、該レセプターを
発現する細胞ラインがないことであった。プロラクチン
分泌腫瘍から誘導された一つの細胞ラインが最近その中
でDAがアデニレートサイクラーゼ活性およびプロラクチ
ン分泌を阻害すると記載された（９）。
我々は最近、β２−アドレナリンレセプターおよびグ
アニンヌクレオチド結合タンパクと相互作用する他のレ
セプターと著明な同族性を有する、RGB−２と命名した
ラット脳相補DNA（cDNA）をクローンした。三系統の証
拠がRGB−２ cDNAはDA Ｄ−２レセプターをコードす
ることを指示する。（１）このタンパクの推定アミノ酸
配列はグアニンヌクレオチド結合タンパクへ結合するレ
セプターに典型的である７個の膜スパニング領域（10）
の存在を指示する。（２）cDNAとハイブリダイズするメ
ッセンジャRNAの分布がＤ−２レセプターの分布と平行
している。（３）RGB−２ cDNAをＤ−２選択性リガン
ド〔3H〕スピロペリドールの高いアフィニティー結合を
欠く細胞中へトランスフェクトする時、細胞はＤ−２レ
セプターの薬理学的プロフィル特徴（１）を有する放射
性リガンドのための結合部位を発現する。
Ｄ−２レセプターcDNAのクローニングは、レセプター
活性化の効果が容易に決定できる細胞ライン中にDAレセ
プターを発現させることが可能になる。我々は、マウス
Ｌ細胞を亜鉛誘発マウスメタロチオネインプロモーター
の規制のもとでRGB−２でトランスフェクトすることに
よって得られた細胞ラインへ〔3H〕スピロペリドールお
よび他のＤ−２アンタゴニストの結合を以前記載した
（１）。我々はまた、以前使用したアッセイ条件のもと
では、DAのLZR1膜への結合はGTPへ応答しなかったこと
を報告した。我々は今や、RGB−２ cDNAによってコー
ドされたＤ−２レセプターはアゴニストの結合のグアニ
ンヌクレオチド感受性およびアゴニストがアデニレート
サイクラーゼ活性を阻害する能力に関して機能的である
ことを示す。
方法 材料：〔α−32P〕アデノシン−５′−トリリン酸（A
TP,10〜50Ci/mmol）および〔3H〕サイクリックATP（31.
9Ci/mmol）はNew England Nuclear（Boston,MA）から
購入し、〔3H〕スピロペリドール（95Ci/mmol）はAmers
ham（Arlington Heights,I1）から購入した。グアノシ
ン−５′−トリリン酸（GTP）,DA,サイクリックATP,3−
イソブチル−１−メチルキサンチン、ATPおよびフォル
コリンはSigma Chemical Company（St.Louis,MO）か
ら購入した。キンピロール,LY181990（Lilly Laborato
ries），ブロモクリプチン（Sandoz Research Instit
ute），（＋）および（−）３−PPP（Astra）は親切な
贈与品であった。
トランスフェクション：全RGB−２ cDNAはプラスドp
Zem3（11）にクローンされた。cDNAおよびベクターはベ
クター上のBg1 II部位およびcDNAアダプター上のSal
Ｉ部位へ部分的にはめ込むことによって両立性とされ
た。このプラスミドはプラスミドpRSVneoと共にアウスL
tk-細胞中へCaPO4沈澱技術（12）によって同時トランス
フェクトされた。トランスフェクタントはG418の350μg
/ml中で選択され、単離され、ノーザンブロット分析に
よってRGB−２ mRNAの発現についてスクリーンされ
た。RGB−２ mRNAの高い発現に基いで選択されたサブ
クローンLZR1は以前Ｌ−RGB2Zem−１として一部特徴化
された（１）。第２の細胞ライン、LZR2は同じ方法で単
離された。
組織培養：細胞は、150mm直径のFalcon組織培養プレ
ート（Beckton Dickinson,Lincoln Park,NJ）中20,00
0細胞/cm2の密度においてプレートされ、成育培地をト
リプシン−EDTA（0.1％トリプシン,0.02％EDTA,リン酸
塩緩衝食塩水中）で交換するか３日目に供給することに
よってサブカルチャーされ、そして５日または６日目に
収穫された。細胞は、５％ウシ胎児血清および５％鉄補
給子ウシ血清（Hyclone,Logan,UT）を補強したDulbecco
修正イーグル培地（Sigma）中、10％CO2/90％空気雰囲
気中37℃で成育された。細胞は、成育培地を氷冷低張緩
衝液（1mM Na+−HEPES,pH7.4,2mM EDTA）で交換する
ことによって溶解された。10〜15分間膨潤後、細胞をプ
レートからかき落とし、24,000xgにおいて20分遠心し
た。得られた粗膜分画をBrinkmann Polytronホモジナ
イザーでセッティング６において10秒トリス等張食塩水
（50mMトリスHCl,pH7.4,0.9％NaCl）中に再懸濁し、レ
セプター結合実験のため−70℃で貯蔵するか、または直
ちにアデニレートサイクラーゼ実験に使用するためトリ
ス等張食塩水に再懸濁し、24,000xgで20分遠心し、トリ
ス等張食塩水に再懸濁した。
レセプター結合アッセイ：膜調製物を解凍し、24,000
xgで20分遠心し、指示した場合を除きトリス等張食塩水
に再懸濁した。膜調製物の部分標本は、（最終濃度）50
mMトリスHCl,pH7.4,0.9％NaCl,0.025アスコルビン酸、
0.001％ウシ血清アルブミン、〔3H〕スピロペリドー
ル、および適当な薬物を含んでいるアッセイチューブへ
加えた。（＋）ブタクラモール（２μＭ）は、KD値に近
い放射性リガンドの濃度においては典型的には総結合の
10％以下である非特異性結合を決定するために使用され
た。アッセイは、飽和分析のためには2ml,阻害分析のた
めには1mlの容積を実施された。インキュベーションは
タンパク15〜50μｇの添加によって開始され、37℃で50
分実施され、そして各アッセイへ氷冷緩衝液（10mMトリ
ス,pH7.4,0.9％NaCl）を加えることによって停止され
た。サンプルはガラス繊維フィルター（Schlicher ＆
Schuell No.30）を通して濾過され、洗浄緩衝液の10
mlで洗浄された。フィルターに残っている放射能をBeck
manLS 1701シンチレーションカウンターを用いてカウ
ントした。データは、データ解析プログラムEnzfitter
（Elsevier−Biosoft）を用いて非直線回帰によって解
析された。競合実験においては、KI値が実験的に決定し
たIC50値からChengおよびPrusoff法によって計算され
た。KIおよびKDの平均値は幾何平均である。DAの結合に
対するGTPおよびNaClの効果を評価するために仕組まれ
た実験においては、新鮮な組織が使用される。細胞が収
穫され、遠心され、そしてトリスMg++（50mMトリス,pH
7.4,4mM MgCl2）中にMg++再懸濁された。組織は再遠心
前にこの緩衝液中37℃で15分インキュベートされた。再
懸濁したタンパクは、添加したNaClまたはGTPなしのト
リスMg++か、または120mM NaClおよび100μＭ GTPを
含むアッセイへ添加された。
アデニレートサイクラーゼアッセイ：〔α32P〕ATPの
〔32P〕cAMPへの変換はSalomon et al.（14）が記載
したのと実質的に同じようにして決定した。トリス等張
食塩水に再懸濁した膜（50〜100μｇタンパク）は、50m
M トリスHCl,pH7.4,5mM cAMP,1mM ３−イソブチル−
１−メチルキサンチン、1mM MgCl2,0.5mM EDTA,0.25m
M ATP,30μＭ GTP,約２×106cpm〔α32P〕ATP,および
種々の薬物を含む0.2mlのアッセイへ0.1mlの容積で加え
られた。アッセイは25cDNAへ加温することにより開始さ
れ、20分後０℃へ冷却し、次に各アッセイへトリクロル
酢酸（30％溶液100μｌ）を加えることによって停止さ
れた。〔3H〕サイクリックATP（約30,000cpm）を内部標
準として各アッセイへ加えた。アッセイ容積を水で1ml
とし、チューブを2000xgで10分遠心した。上清中のサイ
クリックAMPは、Dowex AG50W−X4および中性アルミン
を含むカラム上の逐次クロマトグラフィーによって単離
した。各アルミナカラムからの2ml溶離液は液体シンチ
レーションカウントのためBio−Safe II（RPI,Mount
Prospect,IL）10mlに溶かした。アルゴニストによるア
デニレートサイクラーゼの阻害のための投与量レスポン
ス曲線は、プログラムEnzfitterを使用する非直線回帰
により解析した。データは以下の式にあてはめた。
Ｅ＝（100−Emax）/1＋（A/EC50）Ｎ＋Emax ここでＥは総刺激活性の％で表した酵素活性の量であ
り、Ａはアゴニストの濃度、EC50は酵素活性の50％最高
阻害を生ずるアゴニストの濃度、Emaxはアゴニストの最
高に阻害する濃度の存在下観察された酵素活性（総刺激
活性の％で表す）、Ｎは傾斜計数である。EC50値の平均
値は幾何平均である。タンパク濃度はPeterson法（15）
によって決定した。
結果 〔3H〕スピロプリドール結合の飽和分析： LZR1細胞から調製した膜上のＤ−２レセプターの密度
は〔3H〕スピロペリドール結合の飽和分析によって決定
された。RGB−２は亜鉛誘発マウスメタロチオネインプ
ロモーターの制御下にあるので、細胞の100μＭ硫酸亜
鉛前処理の〔3H〕スピロペリドール結合に対する効果も
決定した。結合部位の密度は、対照LZR1細胞においては
736±140fmol/mgタンパクであり、亜鉛で処理したLZR1
細胞では759±155fmol/mgタンパクであった。LZR2と命
名した第２の細胞ラインは、Ｄ−２レセプターの低い密
度（平均Bmax±SE,435±71fmol/mgタンパク）を持って
いた。LZR1細胞と対照的に、LZR2細胞の結合部位密度は
亜鉛処理により、630±52fmol/mgタンパクへ50％増加し
た（ｎ＝２）。対照LZR1およびLZR2細胞のための42pMの
平均KD（pKD±SE,10.37±0.15,n＝４）は、亜鉛処理細
胞の47pMの平均KD値（10.33±0.17）と有意差はなかっ
た。すべての実験からの飽和分析のScatchardトランス
フォーメーションは直線を与えた。野生タイプLtk-細胞
は〔3H〕スピロペリドールの置換結合が検出されなかっ
た（データ示さず）。LZR1細胞はＤ−２レセプターの高
密度を有するので、これら細胞はすべての以後のすべて
の実験に使用された。
アゴニストによる放射性リガンド結合の阻害：いくつか
のアゴニストおよび関連化合物に対するＤ−２レセプタ
ーの見掛けアフィニティーを二つの実験において決定し
た（第9A図，表１）。試験した６化合物のうち、ブロモ
クリプチンが最強力であり、平均KI値2nMであったが、
Ｄ−２選択性アゴニストキンピロールの不活性エナンチ
オマーであるLY81990は最も弱かった。すべてのアッセ
イは、LZR1細胞から調製した膜を用いて、0.1mM GTPお
よび120mM NaClの存在下実施された。
他の実験においては、DAによる放射性リガンド結合の
阻止に対するGTPおよびNaClの影響が決定された（第9B
図）。これらの実験には新たに調製された膜が使用さ
れ、ホモジネーションおよびアッセイ緩衝液へ4mM MgC
l2が加えられた。GTPおよびNaClの不存在下、平均IC50
は25μＭ（平均−log（IC50）±SE＝4.6±0.3）であっ
た。アッセイ緩衝液はGTPおよびNClの添加は平均IC50値
を、〔3H〕スピロペリドールの結合を変えることなく16
7μＭ（3.8±0.3,n＝４）へ上昇させた。GTPおよびNaCl
の不存在下のHill計数は0.50ないし0.68（平均0.64）の
範囲であったが、GTPおよびNaClの存在下の値は0.77な
いし1.1（平均0.94）の範囲であった、GTPおよびNaClの
不存在下で、DAの阻害曲線は、結合部位に二つクラスが
存在すると仮定することによって最良に通中し得る。高
いアフィニティーの一クラスは、レセプター総数の48±
14％を表わし、0.3μＭのDAに対する平均KIを持ってい
た。レセプター総数の52±13％を占める第２のクラスは
平均KI値24μＭを持っていた。
アゴニストによるアデニレートサイクラーゼ活性の阻
害： LZR1細胞からの新たに調製した膜において、しかし野
生タイプLtk-細胞からの膜ではなくて、DAはフォルスコ
リン刺激アデニレートサイクラーゼ活性の濃度依存変調
を生ぜしめる。最大阻害は624nMのEC50値をもって総活
性の27％であった（第10A図、表１）。キンピロールは
ドパミンと大体同じく有効であり、すなわちキンピロー
ルによって誘発される最高阻害はDAによる誘発と類似で
あった。LY181990はその活性異性体より強力でなくそし
て有効でなく（第10B図、表１）、アデニレートサイク
ラーゼ活性のＤ−２レセプター仲介阻害は立体選択的で
あることを示す。３実験のうち２実験だけにおいて、LY
181990が測定し得る酵素活性阻害を示した（表１）との
知見は、この化合物はアゴニスト活性を少ししかまたは
全く持っていないことを示唆する。同様に、（−）３−
PPPは検出し得るアゴニスト活性を持っていなかった。
ブロモクリプチンは、EC50値45nMを持ち、最も強力なア
ゴニストであった。ブロモクリプチンおよび（＋）３−
PPPはDAより有効でなく、このためこれら薬物は部分的
アゴニストであるように見える。
10mM DAによるLZR1細胞中のアデニレートサイクラー
ゼ活性の阻害は、アッセイへ（＋）ブタクモール10μＭ
の添加によって防止され（第11図）、DAの阻害はレセプ
ター仲介であることを示す。また、百日咳トキシンによ
るLZR1細胞の処理（50ng/ml成育培地,16時間）は、細胞
から調製した膜においてDA−阻害酵素活性をブロックし
（第10C図）、Giは酵素活性のDAによる阻害を仲介する
ことを示す。興味あることに、百日咳トキシン処理細胞
からの膜中のフォルスコリン刺激アデニレートサイクラ
ーゼ活性は、対照膜中の活性よりも2.5倍大であった。
表 １ アゴニストによる放射性リガンド結合およびアデニレー
トサイクラーゼ活性阻害 〔3H〕スピロペリドール（0.2nM）の結合阻害によっ
て決定した、LZR1細胞から調製した膜上のＤ−２レセプ
ターに対する６種の薬物の見掛けアフィニティーと、フ
ォルスコリン刺激アデニレートサイクラーゼ活性の半最
高阻害を生ずる各薬物の濃度（EC50）を示す。μＭで表
した薬物濃度は、３実験（EC50,キンピロールおよび
（＋）３−PPP）,4実験（EC50,DA）または２実験（KI,
すべての薬物およびEC50,ブロモクリプチン）の幾何平
均である。観察されたアデニレートサイクラーゼ活性の
最高阻害（Mex）は、10μＭフォルスコリンの存在下の
総活性の％阻害の平均値±SEMとして表わした。LY18990
については、示した結果は酵素阻害が見られた２実験か
らのものである。３番目の実験では阻害がなかった。 薬 物 KI EC5 Max ドパミン 17 0.6 27±３％ キンピロール 9 0.7 28±２％ LY18990 277 5.0 10±２％ ブロモクリプチン 0.0024 0.04 17±１％ （＋）３−PPP 33 4.0 16±３％ （−）３−PPP 0.87 − − 議論 以前に報告したように、ラットＤ−２レセプターcDNA
で形質転換したLtk-細胞はRA Ｄ−２レセプターの高密
度を発現する（１）。我々は、Ｄ−２レセプターを750
ないし100fmol/mgタンパクの密度で安定に発現する（現
在の結果;1を参照）、LZR1と命名したこれら細胞のサブ
クローンの一つを特徴化した。
Ｄ−２ cDNAはプラスミドpZem3に含まれるので、亜
鉛誘発プロモーターの規制のもとで、放射性リガンド結
合の性質に対する亜鉛処理の効果が決定された。LZR1細
胞上のＤ−２レセプターは亜鉛の不存在下において最大
に発現されるように思われ、そのため亜鉛処理はレセプ
ターの密度に増加を生じなかった。亜鉛に対する応答性
の欠如はLtk-細胞ラインの特徴ではない。我々はLtk-細
胞の第２の形質転換されたラインLZR2を分離し、それで
はＤ−２レセプターの密度は435ないし630fmol/mgタン
パクから亜鉛処理によって約50％上昇される。〔3H〕ス
ピロペリドールに対するＤ−２レセプターのアフィニテ
ィーは亜鉛処理によって有意に変化しなかった。
LZR1細胞上のＤ−２レセプターのいくつかのアゴニス
トおよび関連する薬物に対する見掛けアフィニティーは
〔3H〕スピロペリドールの特異結合のGTP存在下での薬
物による阻害に決定された。ブロモクリプチンは2nMのK
I値をもって極めて強力なアゴニストであった。キンピ
ロールの強度は、DAと同様に約10μＭであった。アゴニ
ストの結合は立体選択的であった。これはLY181990はそ
の活性エチナチオマーであるキンピロールよりかなり弱
く、そして（−）３−PPPは（＋）３−PPPより強力であ
るからである。これらデータはLZR1細胞上のＤ−２レセ
プターに対するアンダゴニスの結合の我々の以前の研究
（１）を拡大する。
Ｄ−２レセプターの刺激の生理学的効果は、アデニレ
ートライクラーゼ活性を阻害するグアニンヌクレオチド
結合タンパクGiによって仲介されるものと考えられる
（16）。アゴニストの高いアフィニティー結合は、アゴ
ニスト、レセプター、およびGiのα−サーブユニット
（Giα）よりなる三元複合体であると考えられ、GTPに
よるＤ−２レセプターへのアゴニスト結合の阻害はGiα
からのＤ−２レセプターのGTP誘発解離を表明する。RGB
−２ cDNAによってコードされたＤ−２レセプターのＧ
タンパクへ結合する能力を評価するため、放射性リガン
ド結合の阻害に対するDAの強度に対するGTPの効果が決
定された。LZR1細胞を用いた予備研究において、我々は
120mM NaClを含みそして添加したMg++を含まない我々
の標準アッセイ緩衝液において、DAの結合はGTPへ感受
性ではないが（１）、同じ条件下でラット線条体膜への
DAの結合はGTPによって阻害される（データ示さず）こ
とを発見した。LZR1膜におけるGTPへの感受性の欠如に
ついては三つの可能性ある説明が存在した。（１）Ltk-
細胞から誘導したLZR1細胞は適当なＧタンパクを欠いて
いる可能性がある。（２）RGB−２ cDNAはＤ−２レセ
プターの結合サブユニットだけをコードする。RGB−２
によってコードされたこのタンパクの予想された主要構
造とグアニンヌクレオチド結合タンパクへ結合した他の
レセプター間の類似性のため、この可能性はありそうも
なかった。（３）結合アッセイのイオン性条件が三元複
合体の形成または不安定化のために適正ではなかった可
能性がある。ここに記載した研究においては、イオン性
条件はGTP感受性結合を観察する可能性を増すように変
化された。高アフィニティーアゴニスト結合を最大にす
るため、組織はMgCl2と前インキュベートされ、そしてM
gCl2はアッセイ緩衝液中に含めされた（17）。三元複合
体のGTP誘発不安定を最大にするため、NaClをGTPと共に
加えた（17）。これらの条件下、GTPおよびNaClの添加
はＤ−２レセプターに対するDAの強度を低下させ、LZR1
細胞からの膜において阻害曲線の傾斜を増加させた。三
元複合体の形成および不安定化のためのイオン必要性は
LZR細胞からの膜においてラット線条体からの膜におけ
るよりも一層急務であったことは興味がある。
DA Ｄ−２レセプターによるアデニレートサイクラー
ゼ活性の阻害は良く特徴化された現象である（3,18,1
9）。いくつかの薬物によるアデニレートサイクラーゼ
活性の阻害はLZR1細胞からの膜において評価された。DA
およびＤ−２選択性アゴニストであるキンピロールの最
大有効濃度は、フォルスコリン刺激酵素活性を約30％減
少させた。DAによる酵素活性の阻害はＤ−２アンタゴニ
ストである（＋）ブタクラモールによってブロックされ
た。試験した最も強力なアゴニストであるブロモクリプ
チンは、他によって報告されたように（19,20）、部分
的アゴニストのようであった。アゴニストによるアデニ
レートサイクラーゼの阻害は、キンピロールの右旋性エ
ナンチオマーであるLY181990は少ししかまたは全く有効
性を持っていなかったので、立体選択的であった。以前
報告されたように、部分的アゴニスト（＋）３−PPPは
（−）３−PPPより強いアゴニストであるが、（−）３
−PPPは高いアフィニティーをもってＤ−２レセプター
へ結合する（21,22）。我々はLZR1細胞からの膜におい
ては（−）３−PPPによるアデニレートサイクラーゼ活
性の阻害を観察しなかった。アゴニストによるアデニレ
ート活性の阻害について決定したEC50値は、リガンド結
合のアッセイにおいて決定したKI値よりも一般に低かっ
た（表１）。これはこれら細胞上のレセプター予備の存
在のためかも知れないが、薬物は酵素活性の最高阻害に
おいて異なるとの観察は、最も有効なアゴニストである
DAおよびキンピロールに対してさえも多くのレセプター
予備は存在しないことを示唆する。さらに、（＋）３−
PPPのような部分的アゴニストのためのレセプター予備
も存在しないであろう。代りの説明は、アゴニレートサ
イクラーゼ活性の阻害は、後部下垂体中のDAによる酵素
活性の阻害について提案されているように（23）、三元
複合体の形成によって誘発された高アフィニティー状態
におけるアゴニストのＤ−２レセプターへの結合に関係
していることである。他方、GTPおよびNaClの存在下決
定された本報告中のKI値は、低アフィニティー状態にお
けるアゴニストのレセプターへの結合を表明する。アデ
ニレートサイクラーゼおよび放射性結合アッセイは異な
る温度で実施されたので直接比較は困難であるが、高ア
フィニティークラスの部分へのDA結合のKI値（0.3μ
Ｍ）は、DA阻害アデニレートサイクラーゼに対するEC50
値（0.6μＭ）に近く、低アフィニティークラスの部位
へのDAの結合のためのKI値（24μＭ）およびGTP存在下
の結合のためのKI値（17μＭ）はかなり高い。
DAは、百日咳トキシンで処理したLZR1細胞からの膜中
ではアデニレートサイクラーゼ活性を阻害しなかった。
百日咳トキシン触媒GiのADPリボシル化はアデニレート
サイクラーゼのGi仲介阻害を防止するので、この知見は
Ｄ−２レセプターは形質転換したLZR1細胞中のGiαと相
互作用するとの仮説と一致する。他の細胞タイプの百日
咳トキシン処理後アデニレートサイクラーゼのイソプレ
テレノールによる刺激について観察されたように（2
4）、百日咳トキシンによる無傷のLZR1細胞の処理はア
デニレートサイクラーゼを刺激するフォルスコリンの能
力を増強し、ある種の細胞ラインにおいてはGiはフォル
スコリンおよびホルモン刺激アデニレートサイクラーゼ
活性を変調するように通常作用することを示唆した。
我々は、Ｄ−２レセプターの高密度を安定して発現す
る、RGB−２ cDNAでトランスフェクトした細胞ライン
を特徴化した。この細胞ラインをもって、アデニレート
サイクラーゼ活性を阻害するようにグアニンヌクレオチ
ド結合タンパクと生産的に相互作用するDA Ｄ−２レセ
プターをコードするcDNAが決定された。RGB−２ cDNA
は、殆どすべてのタイプの細胞において機能的Ｄ−２レ
セプターの発現を命令するように見える。例えば、ラッ
ト下垂体腫瘍から得たGH4C1細胞は、ラット前部下垂体
中のラクトトロフはＤ−２レセプターを発現するけれど
も、DAレセプターを欠くプロラクチン分泌細胞である。
GH4C1細胞へのRGB−２ cDNAのトランスフェクション
は、ここに記載したものと似た機能的特徴を有するＤ−
２レセプターの発現を生ずる（26）。Ｄ−２レセプター
cDNAでのトランスフェクションによってつくられた細胞
ラインは、Ｄ−２レセプターの作用および規制のメカニ
ズムの研究に有用であろう。
実施例２ 要約 我々は、D2−ドパミンレセプターの薬理学との結合部
位をエンコードするcDNAを記載した（Bunzow,J.R.ら（1
968）Nature 336,783−787）。我々は、このタンパク
は機能性レセプターであること、すなわちcAMP生産およ
びホルモン分泌を阻害するようにＧ−タンパクと結合す
ることをここに明らかにする。このcDNAはドパミンレセ
プターを欠くラット体泌乳刺激ホルモン細胞株であるGH
4C1に表現された。安定なトランスフェクタントが単離
され、ノーザン班上のD2−ドパミンレセプターmRNAの最
高レベルを持つ一クローンGH4ZR7が詳細に研究された。
GH4ZR7から単離された膜へのD2−ドパミン拮抗体3H−ス
ピペロンの結合は、KD＝96pMおよびBmax＝2300fmol/mg
タンパクで飽和し得る。GTP/NaClの添加は、3H−スピペ
ロン結合に対してドパミン競合のIC50値を２倍増加さ
せ、D2−ドパミンレセプターは一種以上のＧタンパクと
相互作用することを示した。ドパミン結合部位の機能へ
アクセスするため、ドパミンの急性生物学的作用がGH4Z
R7細胞中で特徴化された。ドパミンは休止細胞内および
細胞外cAMPレベルを50〜70％（EC50＝８±2nM）減少
し、そして基準レベルの８〜12倍であるcAMPレベルのVI
P−誘発増強を完全にブロックした（EC50＝６±1nM）。
スピペロン，（＋）−ブタクラモール，（−）−スルピ
ライドおよびSCH23390によるVIP−増強cAMPレベルのド
パミン誘発阻害の拮抗作用は、D2−レセプターにおける
これら拮抗体のKI値から予期される濃度において発生
し、そして立体選択的であった。ドパミン（およびいく
つかのD2−選択的アゴニスト）は、GH4ZR7膜中500〜800
nMのEC50をもって、フオルスコリン刺激アデニレートサ
クラーゼ活性を45±６％阻害した。細胞cAMPおよび膜調
製物中におけるアデニレートサイクラーゼ活性のドパミ
ン阻害は、百日咳トキシンによる前処理（50nM/ml,16
h）によって停止された。ドパミン（200nM）はVIPおよ
びTRH−誘発プロラクチン放出を停止した。これらデー
タは、このcDNAクローンは、Ｇタンパクへ結合し、アデ
ニルサイクラーゼと、そしてcAMP依存および非依存ホル
モン分泌を阻害する機能的ドパミン−D2レセプターをエ
ンコードすることを結論的に示す。GH4ZR7細胞は、ドパ
ミンD2レセプターの生化学のそれ以上の解明に有用であ
ることを証明するであろう。
序論 下垂体からのPRL分泌を支配する主要エレメントは、
下垂体門血流中のドパミン濃度である（１）。ドパミン
は下垂体ラクトトロフ上のドパミン−D2レセプターを介
して基本およびホルモン刺激PRL分泌を阻害するように
作用する（１−５）。ドパミン−D2レセプターは百日咳
トキシン感受性阻害Ｇタンパクと相互作用し（６−
９）、アゼニレートサイクラーゼ活性を減らし、そして
他の剤によるcAMPレベルの増強をブロックする（6,10−
12）。ドパミンはまた、ラクトトロフ中の〔Ca++〕を減
少させ、そして特にTRHのような他の剤による〔Ca++〕
の上昇を阻害する（13−15）。ドパミンのcAMPおよび
〔Ca++〕の阻害は、一つ以上の百日咳トキシン感受性Ｇ
タンパクへの結合によって仲介され、そしてPRL分泌の
ドパミン阻害に貢献するように見える（15）。ドパミン
作用のこれらの要素間の正確な関係は、非均質細胞タイ
プの存在、細胞数の制限、および広汎なラクトトロフ調
製物の応答性の変動のため、研究することが困難であっ
た（15,16）。
ドパミン−D2レセプターcDNAの最近のクローニング
（17）は、このレセプターの細胞内作用および調節を検
討するための有用な道具を提供する。このD2−ドパミン
レセプタークローンが機能的レセプターの合成を指令
し、ドパミン−D2レセプター活性化を生物学的効果の間
の経路を規定するかどうかを検討するため、我々は下垂
体由来細胞株GH4C1細胞中へドパミン−D2レセプターcDN
Aをトランスフェクトした。GH4C1細胞はラット下垂体細
胞であり、これはPRLおよびGHを合成分泌し、そして種
々のホルモン、成長因子、神経伝達レセプター、二次メ
ッセンジャーシステムおよびイオンチャンネルを有し、
そしてラクトトロフ機能のアクセスし得るモデルを提供
した（18,19）。しかしながら、これら細胞は正常ラク
トトロフ上に存在するドパミン−D2レセプターを欠いて
おり、このためドパミン−D2レセプターの機能の研究の
ための理想的ホストを提供する。本報告は、cDNAクロー
ンの遺伝子生産物をドパミン−D2レセプターとして機能
し、そして阻害Ｇタンパクへ結合し、cAMP蓄積およびPR
L放出を減少させることを明らかにする。ここで特徴化
されたGH4C1トランスフェクタントは、D2レセプターに
おけるドパミン作用のメカニズムをさらに研究すること
ができる有用な細胞システムを提供するに違いない。
実験操作 材料：ドパミンアゴニストおよびアンタゴニストは、
キンピロール（リリー）、ブロモクリプチン（サンド研
究所）、および（＋）および（−）３−PPP（アトラ
ス）を除いて、リサーチ、バイオケミカルズ、インコー
ポレーテッド（マサチューセッツ州ウオルサム）からの
ものであった。２−Ｏ−スクシニル−cAMPに対するウサ
ギ抗体−ウシ血清アルブミン複合体は、ICN（カリフォ
ルニア州アービン）から得、そしてrPRL標準および抗−
rPRL抗体はメリーランド州ベセスダ、NIDDK、Salvatore
Raiti博士からのものであった。ペプチド類はPeninsu
la社（カリフォルニア）またはSigma社（ミズリー州セ
ントルイス）からのものであった。α32P−dCTP（2,200
Ci/mmol）125I−２−Ｏ−（ヨードチロシルメチルエス
テル）スクシニルcAMP（2,200Ci/mmol）,3H−cAMP（31.
9Ci/mmol）はNew England Nuclear社（マサチューセ
ッツ州ボストン）からのものであった。すべての他の薬
品は主としてSigma社から得た試薬級であった。
方法： pZEM−D2−cDNAの構築:pZEM−３プラスミド（20）を
メタロチオネインプロモーターとhGE3′−フラランキン
グ配列の間のBg1 II部位において切断した。ドパミン
−D2cDNA全長（17）は、λGT10からSa1 Ｉで切開し、
そしてdATPおよびdGTP（250μＭ）の存在下切断したpZE
M−３プラスミドヘリゲートし、そしてE.Coli株XL−１
（Stratagene）中へ形質転換した。組換え物はそれらの
32P標識D2−cDNAへのハイブリダイゼーションと、次に
制限分析およびDNA配列によって特徴化された。オリエ
ンテーションの意味におけるcDNA挿入物による組換え物
を調製し、真核細胞中へのトランスフェクションのため
CsCl勾配遠心によって精製した。
細胞培養:A.H.Tashijian,Jr.博士（マサチューセッツ
州ボストン、ハーバート大学）から得たGH4C1細胞およ
びサブクローンを、10％ウシ胎児血液を補給したHam F
10培地中、37℃において５％CO2中で発育させた。3H−
スピペロン結合またはアデニレートサイクラーゼ活性の
研究のため、細胞は10％ウシ胎児血清を補給したDulbec
coの修正イーグル培地中、37℃で10％CO2中で成育させ
た。培地はトランスフェクションまたは実験前12〜24時
間に交換した。トランスフェクションのため、GH4C1細
胞は２〜４×106細胞/10cm皿へ成育させた。20μｇのpZ
EM−D2cDNAおよび１μｇのpRSV−ネオを2mlのHepes緩衝
化食塩水中リン酸カルシウムで共沈させ、細胞上に10〜
20分置いた。加温F10＋10％ウシ胎児血清（pH7.0）8ml
を加え、細胞を37℃で４〜５時間インキュベートした。
プレートを洗浄し、細胞をインキュベーター中に16〜20
時間置いた。700μg/mlのG418（ジェネチシン,Gibco,N.
Y.）を補給した新しい培地を次の３〜４週にわたって添
加し、ネオ抵抗を発現する安定なトランスフェクタント
を選別した。個々のコロニー３〜５μｌを採取するため
無菌マイクロピペットを使用して単一コロニーを単離し
た。トランスフェクタント細胞ラインのストックを液体
窒素中に貯蔵冷凍すれば、G418は成育培地から排除し
た。
RNA単離およびノーザン班分析：細胞をカルシウム不
含Hepes緩衝化食塩水＋0.02％EDTA中で洗い、そしてト
リス緩衝化グアニジウム塩酸塩で抽出し、1.7g/ml CaC
lパッドを通して遠心し（33,000rpm,16h）、そしてペレ
ットをフェノール／クロロホルムで抽出し、エタノール
沈澱させる（21）。RNAを再懸濁し、OD＝260nmにおける
UV吸収によって定量する。ノーザン班のため、RNAをグ
リオキサール/DMSO中で変性し（1h,50℃）、10mMリン酸
ナトリウム中１％アガロースゲル上へ流した。RNAをナ
イロン膜（Ｎ−結合,Amersham）上に一夜しませ、80℃
で２時間焼付けした。プレハイブリッド化は６時間42℃
において記載したように行った。ランダムにプライムし
たD2−cDNAの32P標準1.6KbBamH I−Bg1 IIフラグメン
ト（１〜２×106dpm/μｇ）を50％ホルムアミド中42℃
における16〜20hのハイブリッド化のために使用した。
斑点を２×SSC中10分間室温で洗浄し、0.2×SSC,0.5％S
DS中70℃における３×15分洗浄を行い、そして増感スク
リーンを使用してＸ線フィルムへ一夜−80℃において露
出した。
リガンド結合：細胞膜は、最初成育培地を氷冷した低
張緩衝液（1mM Hepes,pH7.4,2mM EDTA）で交換するこ
とによって調製した。10〜15分膨潤した後、細胞をプレ
ートからかき落し、24,000gにおいて20分遠心し、トリ
ス等張食塩水（50mMトリス,pH7.4,0.9NaCl）中セッティ
ング６においてBrinkman Polytronホモジナイザーで10
秒分解し、レセプター結合実験のための−70℃において
貯蔵するか、またはアデニレートサイクサラーゼアッセ
イ（後記）に直ちに使用するため、50mMトリス,pH7.4中
に再懸濁し、上記のように遠心し、50mMトリス中に再懸
濁した。結合アッセイのため、膜調製物は解凍し、遠心
し（24,000g×20分）、特記した場合を除きトリス等張
食塩水中に再懸濁した。膜調製物の部分標本を50mMトリ
ス,pH7.4,0.9％NaCl,0.025％アスコルビン酸、0.001％
ウシ血清アルブミン、3H−スピペロンおよび指示した薬
物を含んでいる試験管へ加える。（＋）−ブタクラモー
ル（２μＭ）は非特異性結合を想定するために使用し
た。これは放射性リガンドのKD値近くの濃度における総
結合の10％以下であった。アッセイは、飽和分析のため
2mlのまたは阻害分析のため1mlの容積において二度実施
した。インキュベーションは膜タンパク10〜50μｇの添
加によって関しされ、そして37℃において50分実施し、
そして各試験管へ氷冷した緩衝液（10mMトリス,pH7.4,
0.9％NCl）10mlの添加によって停止した。サンプルはガ
ラス繊維フィルター（SchlicherおよびSchuell No.3
0）を通して直ちに濾過し、氷冷緩衝液10mlで洗った。
フィルター上に保持された放射能をベックマンLS1701シ
ンチレーションカウンターを用いてカウントした。ドパ
ミン結合に対するGTPの効果を調べる実験においては、
細胞を収穫し、遠心し、トリス−Mg++（50mMトリス,pH
7.4,5mM MgCl2）中に再懸濁し、15分間37℃でインキュ
ベートした。遠心後再懸濁したタンパクを、GTPまたはN
aClを添加しないトリス−Mg++,または120mM NaClおよ
び100μＭ GTPを添加したトリス−Mg++を含むアッセイ
へ加えた。
cAMPおよびPRLアッセイ：細胞を実験３〜７日前に６
ウエル,35mm皿中にプレートした。細胞は2ml/ウエルの
加温下10＋0.1％（−）アスコルビン酸＋2mMトリス（pH
7.2）（FAT）中５〜10分プレインキュベートし、1ml/ウ
エルのFAT＋100μｍ IBMX＋実験化合物を加え、37℃に
おいて30分間インキュベートした。実験化合物はアッセ
イ直前につくったストック溶液から200〜1000倍希釈し
た。最終エタノール濃度はGH4ZR7細胞中の基準またはVI
P増強cAMPまたはPRLレベルに対し影響のない濃度であ
る、0.1％を決してこえなかった。培地を集め、細胞を
沸騰水1ml中で直ちに分解した。細胞分解物および培地
を遠心し（2000g,10分,4℃），上清を細胞抽出物として
アッセイのため集めた。細胞抽出物および培地サンプル
は、もし直ちにアッセイしなければアッセイまで−20℃
で冷凍した。cAMPは、使用した抗体を1:500希釈して記
載した特異性ラジオイムノアッセイ（22）によってアッ
セイした。４℃において16時間インキュベーション後、
10％BSA20μｌおよび95％エタノール1mlを続いて加え、
抗体−抗原複合体を沈澱させた。標準曲線はcAMPを標準
として用い、0.5±0.2pmolのIC50を示した。PRLは、FAT
培地中30分インキュベーションの間IBMXを省略したこと
を除き、上記のようにして得た培地サンプル中でアッセ
イした。PRLレベルは抗体−抗原複合体を沈澱するためS
taphyloccus Ａ分解物（IgSornb,The Enzyme Cente
r,Malden,MA）を使用する特異性ラジオイムノアッセイ
（23）によって測定した。
アデニレートサイクラーゼアッセイ：α32P−ATPの32
P−cAMPへの転換は、本質上Salomon et al（24）によ
って記載されたように測定された。膜（10〜50μｇ）は
100μｌの容積において、50mMトリス,pH7.4,5mM cAMP,
1mM IBMX,1mM MgCl2,0.5mM EDTA,0.25mM ATP,30μ
ｍ GTP,約２×106cpmのα32P−ATPおよび種々の薬物を
含んでいるアッセイ200μｌへ添加された。３回実施さ
れたアッセイは、25℃へ加温することによって開始さ
れ、０℃へ冷却することにより停止された。各アッセイ
ヘトリクロル酢酸（30％溶液100μｌ）を加え、そして
各チューブ3H−cAMP（30,000cpm）を内部標準として加
えた。アッセイ容積は水の添加によって1mlへ増量さ
れ、チューブは遠心（2000g×10分）された。上清中のc
AMPはDowex AG50W−X4樹脂および中性アルミナを含む
カラム上のシーケンシアルクロマトグラフィーによって
単離された。各アルミナカラムからの2ml溶離物を液体
シンチレーション計数のため10mlのBio−Safe II（RPI,
Mount Prospect,IL）中に溶解した。
計算:cAMPおよびPRLアッセイからのデータは、３回測
定の平均±標準誤差として表わされる。曲線あてはめパ
ラメータは、Enzfitterプログラム（Elsevier Biosof
t）を使いる非直線回帰分析によって得られた。平均ア
フィニティー,EC50およびIC50値は、実験の指示数の幾
何平均である。競合実験においては、KI値はChengおよ
びPrusoffの方法（25）により実験的に決定したIC50値
から計算された。すべての実験は第16図に提供したもの
（２回）を除いて、独立した３〜５回の試験の代表であ
った。
結果： 安定なトランスフェクタントの特徴化:GH4C1細胞は、
pZEM−D2−cDNAおよびpRSV−ネオで同時トランスフェク
トされ、抗生物質G418へ抵抗性のコロニーが単離され、
最初ノーザン班分析によって特徴化された。一クローン
GH4ZR7は、他のクローンより高い2.5kb D2RAAレベルを
持っていた（第13A図）。野生タイプ（トランスフェク
トしない）GH4C1細胞、そしてpZEM−３ベクター３中に
ラット５−HT1Aレセプター遺伝子を発現するGH4C1細胞
トランスフェクタント（GH4ZD10）は、D2−レセプター
プローブへハイブリッド化を示さなかった。36時間10μ
Ｍ ZnSO4によるGH4ZR4細胞の前処理は、D2レセプターm
RNAの著しい増強を誘発し、転写されたmRNAは亜鉛感受
性メタロチオネインプロモーターによって調節されるこ
と（20）を示す。GH4ZR7クローンは、このクローンにお
けるドパミン−D2レセプター発現の高レベルのため、以
後の分析（後記）のために使用された。
選択的ドパミン−D2レセプターアンタゴニストである
3H−スピペロンの特異的結合は、GH4ZR4細胞から調製し
た粗製膜中でアッセイされた（第13B図）。GH4ZR7膜
は、ZuM（＋）ブタクラモールによって置換された3H−
スピペロン結合の飽和し得る成分を示したが、野生タイ
プGH4C1細胞からの膜は特異的3H−スピペロン結合を示
しなかった（データ示さず）。５回の実験において、GH
4ZR7細胞膜は2046±315fmol/mgタンパクの最高特異性3H
−スピペロン結合と、96±1pMの平均KD値を示した。こ
れらの値は、これら細胞中のドパミン−D2結合部位の強
い表現と、そしてラット線状膜中に、そしてpZEM−D2−
cDNAでトランスフェクトしたLtk-細胞中に得られるもの
（17）に匹敵する3H−スピペロンに対する親和性を指示
する。
発現されたドパミン結合部位がＧタンパクと相互作用
するかどうか確かめるため、、ドパミンによる3H−スピ
ペロン結合の阻害を100μＭ GTPおよび120mM NaClの
不存在または存在下においてGH4ZR7細胞膜中でアッセイ
した（第13C図）。アッセイはドパミンの高いアフィニ
ティー結合を向上させるため4mM MgCl2の存在下で実施
された。添加したGTPおよびNaClの不存在下では、ドパ
ミンはIC50＝49±15μＭと、Hill計数0.69をもって3H−
スピペロン結合を阻害し、ドパミンに対し高いおよび低
いアフィニティー部位の存在を示唆した。２種類の結合
部位の存在を推測させるモデルに従ったデータの解析
は、レセプターの46±15％はドパミンに対し高いアフィ
ニティー（KD＝0.5μＭ）を有し、残いのレセプターは
アゴニスト煮対して低いアフィニティー（30μＭ）を持
っていることを示した。GTPおよびNaClの存在下におい
ては、ドパミンに対するIC50は、単一性（0.93）へ近い
Hill計数をもって109±20μＭ（KI＝17μＭ）へ２倍シ
フトした。このように、GTP/NaClの存在は、線条細胞調
製物中で観察されたように（6,7）、ドパミンレセプタ
ーを高いおよび低いアフィニティーレセプターの不均質
集団から低アフィニティーアゴニスト集団状態にあるレ
セプターの殆ど均質な集団へコンバートする。これらの
データは、クローン化したドパミン結合部位はGH4細胞
中に発現させる時Ｇタンパクと相互作用することを示唆
する。
cAMPおよびPRLレベルに対するドパミンの作用：発現
したドパミン−D2レセプタークローンの機能を直接テス
トするため、細胞cAMPレベルに対するドパミンの作用を
測定した。これらのアッセイは、これら細胞中のフオス
フオジエステラーゼ活性を阻害するため、100μＭ IBM
Xの存在下で実施した（22）。このように、cAMPレベル
の観察された変化は、cAMPの分解の変化ではなくその合
成速度の変化を表わす。ベースcAMPレベルに対するドパ
ミンの作用と、そしてcAMPのVIP−増強レベルのドパミ
ン阻害が測定された。GH4C1細胞は、他者のより記載さ
れたように（22,26）。cAMP蓄積の増強をもってVIPに応
答する（第14A図）。ドパミンは、インキュベーション
の間VIPが存在してもしなくても、野生タイプGH4C1細胞
における細胞外cAMPレベルに対して効果を持たなかっ
た。この結果D2−ドパミンレセプターmRNAおよびGH4C1
細胞中の結合欠如（第13図）と一致し、これら細胞はド
パミンがcAMP濃度を上昇させないため検知し得るD2−ド
パミンレスポンスを欠いていることを指示する。GH4ZR7
からの培地においては、ドパミンはベースcAMPレベルを
阻害し（50〜70％）、そしてVIP−増強cAMPをベースレ
ベルへ減少させた。cAMPレベルを減少させるドパミンの
これらの作用は、すべて実験に一貫して観察され、そし
てドパミンは細胞内cAMPレベルの低下にも等しく有効で
あった（第14B図）。GH4C1細胞において以前観察された
ように、細胞内および細胞外cAMPレベルは平行して変化
するが、cAMPの低回収率のために一層著明であり得る。
cAMP蓄積に対するドパミンの作用は、高度に選択的なド
パミン−D2アンタゴニストである（−）スルピライドに
よってブロックされるが、非活性立体異性体（＋）スル
ピライドはcAMP蓄積に対するドパミン阻害をブロックし
なかった。スルピライドによる立体選択的ブロックは、
ドパミンによるGH4ZR7中のcAMPレベルの阻害は野性タイ
プGH4C1細胞中に存在しないドパミン−D2レセプターの
活性化によって仲介されたことを示した。
ドパミン作用の生理学的成果は分泌の阻害であり、そ
れはGH4ZR7細胞中の急性（30分）PRL放出を測定するこ
とによってアッセイされた（第14D図）。VIPおよびTRH
はPRL分泌をそれぞれ1.5倍および３倍増強した。VIPはc
AMP依存メカニズムによってPRL放出を増強するものと考
えられ（22,23,26）、他方TRHはカルシウム代謝へリン
クしたcAMP非依存メカニズムによって作用する（19,2
7）。ドパミンはベースPRL放出を阻害しないが、VIPお
よびTRH誘発PRL分泌の増強はドパミンによってブロック
された。このようにドパミンはGH4ZR7細胞においてcAMP
依存およびcAMP非依存分泌をブロックした。ドパミンの
これらの作用は（−）スルピライドによって逆転される
が、しかし（＋）スルピライドによっては逆転されな
い。GH4C1細胞においては、ドパミンはPRIのベース、VI
P刺激またはTRH刺激分泌に対して効果を持たなかった
（データ示さず）。
生物学的応答に必要な濃度がドパミン−D2レセプター
に対するアフィニティーと相関するかどうかを調べるた
め、cAMPレベルに対するドパンミン作用について投与量
レスポンス関係を調べた（第15図）。ドパミンは似たcA
MPレベルを強力に阻害した。さらに、ドパミンは、それ
ぞれ８±2nMおよび６±1nMのEC50値をもって、ベースお
よびVIP増強cAMP蓄積を阻害した。これらのデータは、
ドパミンは大体等しい強度をもってベースおよび促進cA
MP蓄積を阻害することを示す。ドパミンのこれら阻害作
用の高強度は、GH4ZR7細胞が機能的ドパミン−D2レセプ
ターを発現するとの主張を支持する。
GH4ZR7中のcAMPのVIP増強レベルのドパミン阻害の薬
理学的特異性は、特異性レセプターアンタゴニストを使
用してさらに検討された（第16図）。このデータは、あ
る種のレセプターアンタゴニストは細胞外cAMPのVIP増
強レベルのドパミン誘発阻害を逆転することを示す。最
高cAMP（100％）はVIP単独の存在下におけるcAMPレベル
に相当した。ドパミン−D2アンタゴニスト（スピペロ
ン，（＋）ブタクラモール，（−）スルピライド）の低
濃度はドパミン作用をブロックしたが、特異性ドパミン
アンタゴニストであるSCH23390は非常に高濃度において
のみ活性であった。D2−アンタゴニストの不活性立体異
性体（−）ブタクラモール，（＋）スルピライド（第14
C図）はドパミン作用に対し少ししかまたは全く効果が
なかった。ドパミン不存在下添加したアンタゴニストは
cAMP濃度を変えなかった。アンタゴニストに対するIC50
値から得た推測KI値（第16図の説明を見よ）は、ドパミ
ンレセプターの結合競合研究（17）から決定した値に似
ており、GH4ZR7細胞中ドパミンによるcAMPレベルの阻害
は、ドパミン−D2レセプターと薬理学的に区別されるレ
セプターによって仲介されることを示す。
アデニレートサイクラーゼの阻害：ドパミンレセプタ
ーアゴニストによるアデニレートサイクラーゼ活性の阻
害を直接評価するため、32P−ATPの32P−cAMPへの変換
をGH4ZR7細胞から調製した膜中で測定した（第17図）。
ドパミンは総フォルスコリン（10μＭ）刺激活性を0.36
μＭ（ｎ＝５）の平均EC50値をもって45％阻害した。下
垂体において（11）そして線状（28）膜において観察さ
れたように、ブロモクリプチンは部分的アゴニストとし
て行動し、酵素活性を最高23％阻害した（EC5＝6nM）。
選択的D2−アゴニストによるアデニレートサイクラーゼ
活性の阻害は立体選択的であった。例えば、キンピロー
ルはフォルスコリン刺激サイクラーゼ活性を41％（EC50
＝0.32nM）阻害したが、LY181990すなわちキンピロール
の不活性（＋）エナンチオマーは酵素活性の一貫した減
少を生じなかった。同様に、（＋）３−PPP（EC50＝0.8
6nM）はドパミンのように有効であったが、エナンチオ
マー（−）３−PPPはアデニレートサイクラーゼ活性を
一貫して減少しなかった。VIPもGH4ZR7細胞膜におい
て、野生タイプGH4C1細胞膜について報告されているよ
うに（29）、アデニレートサイクラーゼ活性を刺激し
た。200mM VIPにより刺激された総活性は22±7pmol/mg
タンパク／分（ｎ＝３）であり、そしてVIP増強活性は
ラット前下垂体膜中50〜50％阻害（11）と比較して、ド
パミン（100μＭ）によって41％阻害された。これら調
製物においてベースアデニレートサイクラーゼ活性に対
するドパミンの効果は観察されなかった。それにもかか
わらず、ドパミンによるフォルスコリンまたはVIP刺激
アデニレートサイクラーゼ活性の阻害は、GH4ZR7細胞に
おけるドパミンによるcAMP蓄積の阻害の可能性あるメカ
ニズムを提供する。
百日咳トキシン感受性：百日咳トイシンに対する感受
性は、レスポンスを誘発するように阻害Ｇタンパク（例
えばGiまたはGo）へ結合する、ドパミン−D2レセプター
（６〜12,15）のようなレセプターの品質証明である。1
6時間の百日咳トキシンによるGH4ZR7細胞の前処理（第1
2図）は、フォルスコリン刺激膜アデニレートサイクラ
ーゼ活性のドパミン仲介阻害を解離し、ドパミンによる
ベースおよびVIP刺激cAMP蓄積の阻害を破壊した。使用
した百日咳トキシン濃度およびインキュベーション時間
は野生タイプ細胞におけるソマトスタチンレスポンスの
最高ブロックを生じ（30）、そしてドパミンレスポンス
はこれらの条件下で殆ど完全に阻害された。対照的に、
ベースおよびVIP刺激cAMP蓄積、およびベースおよびフ
ォルスコリン刺激サイクラーゼ活性は百日咳トキシン前
処理によって有意に変化しなかった。これらデータは、
発現されたcDNAクローンはGH4細胞中に存在する阻害Ｇ
タンパクへ機能的に結合し、そのため善意のレセプター
を代表するドパミン−D2結合部位をコードするという主
張を支持する。
議論 ドパミン−D2結合部位をコードするcDNAクローンは、
該クローンがアデニレートサイクラーゼ阻害、cAMP蓄
積、およびPRL分泌の阻害（６〜12,15）へ百日咳トキシ
ン感受性阻害Ｇタンパクによって結合される、機能的D2
レセプターを発現するかどうかを決定するため、GH4C1
細胞中に発現された。ドパミン−D2レセプターは、GH4Z
R7トランスフェクタント中のD2レセプターmRNAの存在に
よって証明されるように、マウスメタロチオネインプロ
モーター（20）の制御下D2−cDNA構造から特異的に発現
された。ドパミン−D2レセプターmRNAレベルはトランス
フェクトしないGH4C1細胞中、またはラット５−HT1Aレ
セプターサブタイプでトランスフェクトした細胞中にお
いて検出できなかった（第13A図）。GH4ZR7細胞中に発
見されたmRNAスペシスはラット脳中に見られるD2レセプ
ターmRNAと大体同じ分子量であった（17）。ドパミン−
D2mRNAのレベルはGH4ZR7細胞中100μＭ Zn++の添加に
よって増加し、mRNAの発現はZn++感受性マウスメタロチ
オネインプロモーターによって制御され、内因性遺伝子
の転写を表わさないことを指示する。3H−スピペロン結
合の特異的結合はGH4ZR7細胞のみに存在し、100μＭ Z
n++によって増加それ、そのためこれら細胞におけるド
パミン−D2レセプターmRNAの発現に相関した。D2−レセ
プターmRNAはGH4ZR7細胞中の高アフィニティードパミン
D2結合部位の強力な発現が得られるように転写された。
GH4ZR7トランスフェクタント中のドパミン−D2結合の
存在は、cAMPの強力な阻害およびPRL放出と、フォルス
コリン刺激アデニレートサイクラーゼ活性の阻害に相関
したが、ドパミンの作用はトランスフェクトしないGH4C
1細胞に見られなかった。ドパミンのこれら阻害作用
は、下垂体ラクトトロフ中のドパミンの既知の生理学的
作用（1,2）と正確に一致する。特に、ドパミンは、こ
れらのプロセスの刺激はドパミン濃度が低濃度へ減少し
ない限り発生しないように、ラクトトロフ中のPRL分泌
およびcAMP蓄積を制御する（1,3〜５）。同様に、ドパ
ミンの最高濃度の存在下、VIPはGH4ZR7細胞中のcAMPレ
ベルまたはPRL分泌を増強しない（第14図）。GH4ZR7細
胞中のベースおよびVIP増強cAMP蓄積のドパミン阻害の
強度（第15図）は、下垂体門血流中のドパミン濃度が発
情前記のメスラットにおいて7nMから発情中20nMに変化
し、そしてオスラットにおいては3nMであること（31）
を考慮に入れ、ラクトトロフについて期待される濃度範
囲内であった。特異性アゴニストおよびアンタゴニスト
を使用するアデニレートサイクラーゼおよびcAMP蓄積の
ドパミン誘発阻害の薬理の詳細な解析は、GH4ZR7細胞中
のドパミン作用はドパミン−D2レセプターとは区別し得
るレセプターによって仲介されるとの結論と完全に一致
する。
ドパミンの測定されたアフィニティー（第13C図）とc
AMP蓄積阻害するドパミンの強度（第13C図）との間の食
い違いは、GH4ZR7細胞は全分のレセプターを持っている
こと、すなわち生物学的作用のためのEC50をKD値より低
い値シフトされるのに十分に過剰の結合部位を持ってい
る可能性を生ずる。代りの説明の一つは、膜調製物中の
レセプターは細胞自体よりもアゴニストに対して低アフ
ィニティーを持っている（しかし測定したIC50値はKI）
値に相関しているからアンタゴニストに対するアフィニ
ティーは不変）ということである。そのままの細胞中に
存在する細胞質ゾールまたは膜関連成分は膜結合および
アデニレートサイクララーゼアッセイ条件では完全に置
換されないから、膜調製物中のドパミンレセプターの最
適機能を許容する成分が欠けている可能性がある。この
主張はドパンミンによる粒状アデニレートサイクラーゼ
の阻害に対するED50値、すなわち結合競合実験からドパ
ミンに対して得られたKI値（500nM）に近い値と、しか
しそのままの細胞においてドパミンによるcAMPレベルの
阻害に対して得られた100倍高いEC50値（６〜8nM）によ
って支持される。この条件の差はそのままの細胞対細胞
調製物間のアッセイに見られた差を説明し得る。しかし
ながら、アンタゴニストのアフィニティーはcAMP蓄積実
験から得られた推定KI値（第16図）と良く相関し、アン
タゴニスト結合は膜および全細胞において同様であるこ
とを指示した。
発現されたドパミン−D2結合部位のＧタンパクへの結
合の別の証拠は、GTPの存在下ドパミン結合アフィニテ
ィーの低アフィニティーへのシフトである。このような
アフィニティーのGTP誘発シフトはラット脳からの膜に
おけるドパミン結合について報告されており（6,7）、
そしてレセプターとＧタンパクとの相互作用のためであ
る（8,9）。GTPの存在下、Ｇタンパクはレセプターから
解離し、レセプターを低アフィニティーアゴニスト状態
に置く（6,7）。ドパミンの場合、この二つの状態間の
アフィニティーの差は小さく、そのため低アフィニティ
ー状態へのGTP誘発シフトは小さく（２倍）、そしてＧ
タンパクの解離を最大にするためNa++イオンの存在を必
要とする（28）。ドパミンアフィニティーにおけるGTP
−誘発シフトの観察は、発現されたレセプターはGH4ZR7
細胞中の一種以上のＧタンパクと関連していることを示
唆する。
ドパミンの阻害作用は、レセプターが阻害Ｇタンパク
へ結合することを指示するが、これは阻害Ｇタンパクを
不活性化するようにGH4ZR7細胞を百日咳トキシンで前処
理することによって一層直接的にテストされた（30）。
百日咳トキシン前処理は、ベースまたはVIP誘発cAMP蓄
積を変えることなく、ドパミン作用を完全にブロックし
た。このように、百日咳トキシンは、多分ドパミン−D2
レセプターを阻害Ｇタンパクから解離することにより、
生物学的レスポンスのドパミン増強形質導入を阻止し
た。他の系（32）と異なって、しかし野生タイプGH4C1
細胞（30）と同様に、スチミュレーター（例えばVIP）
によるcAMPレベルの増強は百日咳トキシン処理GH4ZR7細
胞においては増強されないし、ベースcAMPレベルも百日
咳トキシンによって変化しなかった。これはGH4ZR7細胞
中に存在する阻害ＧタンパクはcAMP生産を強くするよう
に阻害しないことを示唆する。
GH4C1細胞上のソマトスタチンレセプターの存在は、
ソマトスタチンとドパミンの阻害作用の直接比較を許容
する。ドパミンと同様に、ソマトスタチンはベースアデ
ニレートサイクラーゼ活性（29）またはベースPRL分泌
（30）を阻害しない。GH4C1細胞におけるVIP刺激サイク
ラーゼ活性（29）、VIP増強cAMP蓄積（22）、およびPRL
分泌（23,30）のソマトスタチン誘発阻害は、すべてGH4
ZR7細胞においてドパミンによって誘発された最大阻害
の約半分であった。ドパミンの大きな効果はD2レセプタ
ーの過剰数の存在のためではなかった。これはcAMP蓄積
およびPRL分泌実験の条件下でのレセプター数は、GH4C1
細胞中のソマトスタチンレセプター数（13,000部位／細
胞）（33）より少ない10,000部／細胞以下であったから
である。
これら細胞に発現されたドパミンレセプターは形質導
入阻害作用においてソマトスタチンよりも有効であるこ
とが明らかであり、GH細胞に存在するＧタンパクに対す
るドパミンレセプターの一層効果的な結合を示唆する。
GH4C1細胞におけるドパミン−D2レセプターcDNAの発
現の第２の理由は、ドパミン作用およびD2レセプターメ
カニズムを研究する新しいモデルを確立することであ
る。今日までドパミンD2レセプターを発現する最も入手
し易い細胞系であるラットラクトトロフ中のドパミン作
用の現在の研究は、ドパミン阻害のメカニズムについて
多岐の結論へ導いた。ノイロンにおいて、ドパミンはD2
レセプターが阻害Ｇタンパクへ結合することによって仲
介される作用である（15）、カリウムチャンネルを開く
こと（35）による膜電位を高分極する（34）。ラクトト
ロフにおけるドパミンによって誘発された膜高分極（3
6）はカルシウムチャンネルを閉じ、ベースカルシウム
流入束を減らし、ドパミンによって誘発されたベース
〔Ca++〕の観察された低下（13〜15,37,38）を説明する
であろう。しかしながら、ドパミンはある種の下垂体細
胞において〔Ca++〕を増加することが観察されている
（37）。GH4ZR7細胞中の〔Ca++〕のドパミン誘発変化を
検討することにより、D2レセプターが〔Ca++〕の変化に
特異的に関連し、そしてホルモン分泌のドパミン阻害の
仲介において〔Ca++〕の役割を確かめることが可能にな
るであろう。他の解決されない論争の一つは、ドパミン
が分泌の増強を阻止し、そしてTRHのようなカルシウム
移動ホルモンによって阻害するメカニズムである。ある
ものはフォスファチジルイノシトール代謝（39,40）お
よび〔Ca++〕（13,14）のTRH誘発増強のドパミによる阻
害を報告し、他のものは変化を認めていない（38,4
1）。GH4ZR7細胞においてドパミンによるTRH誘発PRL放
出の認められた阻害は、ドパミンはTRH誘発カルシウム
移動またはフォスファチジルイノシトール代謝を変える
ブロセス（例えばカリウムチャンネルの開口）へＧタン
パクによって結合されることができることを示唆する。
GH4ZR7細胞は、ドパミン−D2レセプターのメカニズムに
関するこれらおよび他の疑問を研究するための均質な、
豊富なそして高度に応答性の調製物を提供するであろ
う。
この報告に提供されたデータは、発現されたクローン
（17）は、PRL分泌、cAMP生産、およびアデニレートサ
イクラーゼ活性を含む検討されたすべての作用におい
て、ドパミン−D2レセプターの薬理を持っていることを
指示する。D2クローン、１）ドパミン−D2結合部位のた
めのcDNAクローンはＧタンパク結合レセプターの原型構
造を有する;2）該クローンは飽和し得るそして特異性結
合性質を持ったタンパクを発現する;3）発現された結合
部位に対するアゴニスト結合アフィニティーはGTPの存
在下減少する;4）発現されたレセプターはＧタンパクに
よって規制されることが既知の機能（例えばアデニレー
トサイクラーゼの阻害）へ結合される;5）Ｇタンパクを
解離する剤（例えば百日咳トキシン）は適当するレスポ
ンスの発生から発現されたレセプターの活性化を解離す
る；との機能的Ｇタンパク結合レセプターとしての分離
のための五つの基本的基準を満たす。結論として、クロ
ーン化したドパミン−D2レセプターとＧタンパクとの相
互作用は生産的であり、αｉまたはαｏサブユニットへ
導びき、そしてcAMP依存性およびcAMP非依存性メカニズ
ムによるcAMPおよびPRLレベルの阻害へ導びく。
実施例２の参考文献 脚注 １ 使用した略語は以下のとおり。
PRL,プロラクチン;GH,成長ホルモン；〔Ca++〕，細胞
質ゾル不含カルシウム濃度;VIP,血管活性腸ペプチド;TR
H,タイロトロピン放出ホルモン;IBMX,3−イソブチル−
１−メチルキサンチン;KD,平衡解離定数;EC50（IC50）,
50％最大効果（阻害）を誘発するのに必要な濃度。
２ これらの結果は一部第71回Annual Endocrine Mee
ting,Seattle,WAにおいて発表。抄録＃1278 ３ Albert,P.R.et al.,投稿準備中 実施例３ 要約 ヒトドパミンD2レセプターをコードするクローンを下
垂体cDNAライブラリーから単離し、配列化した。推論さ
れたタンパク配列は、一つの主な差をもってクローン化
したラットレセプター〔Bunzow et al.（1988）,Natu
re 336,783−787〕と96％同じである。ヒトレセプター
はその推定３番目細胞質ループ中に追加の29個のアミノ
酸を含むんでいる。サウザン班は１種だけのヒトドパミ
ンD2レセプター遺伝子の存在を示した。この遺伝子を含
む２種の重複するファージが単離され、特徴化された。
これらクローンのDNA配列分析は、コーディング配列は
６個のイントロンによって中断され、そしてヒト下垂体
レセプター中に存在する追加のアミノ酸は87ベースペア
の単一エキソンによってコードされることを示した。代
替スプライシングにおけるこの配列の関与およびその生
物学的意義が論ぜられる。
序説 霊長類中枢神経系中のドパミンニューロンは、運動の
開始および実行、感情安定性の維持、および下垂体機能
の調節に関与する。パーキンソン病（１）および分裂症
（２）を含むヒト神経病は、ドパミンレセプターとドパ
ミンの間のインバランスの発現であると考えられる。ド
パミンの効果を仲介するレセプターはD1およびD2サブタ
イプに分けられ、それらはそれらのＧタンパク結合（3,
4），リガンド特異性、解剖学的分布および生理学的効
果（５）によって区別し得る。ドパミンD2レセプター
は、プロラクチン分泌の調節（６）および抗精神薬に対
するアフィニティー（7,8）の故に特別の臨床的関心で
ある。
ドパミンD2レセプターはＧタンパク結合レセプターの
ファミリーに属す。このファミリーのメンバーが占める
配列類似性は、我々がラット脳ドパミンD2レセプターcD
NAをクローンすることを可能にする（９）。我々は、こ
こに記載するヒト下垂体ドパミンD2レセプターcDNAを単
離するためのこのクローンを使用した。これら二つのレ
セプターの推論されたアミノ酸配列は一つの著しい相違
点を除いて非常に似ている。ヒトレセプターは、遺伝子
のエクソンの一つによってコードされるその推定３番目
細胞質レープ中に追加の29個のアミノ酸を含んでいる。
このゲノム組織は、２種のドパミンD2レセプターmRNAの
存在は代替スライシングイベントの結果であることを示
唆する。
材料および方法 ヒト下垂体cDNAのクローニング ヒト下垂体組織はカナダのClinical Research Inst
itude of MontrealのN.SeidahおよびM.Chretien博士
からの親切な贈物であった。ポリ（Ａ）mRNAおよびcDNA
は以前記載された方法（９）で調製した。cDNAはアガロ
ースゲル上でサイズ選別（１〜6kb）し、Geneclean（Bi
o 101）を使用して単離し、EcoR Iアダプターへリゲー
トし、そしてパッケージ（Gigapak Gold）した。組換
物（1.5×106）はレプリカナイロンフィルター（デュポ
ンプラック／コロニーハイブリダイゼーションフィルタ
ー）上で〔32P〕標識ハイブリダイゼーションプローブ
でスクリーンされた。前ハイブリダイゼーションおよび
ハイブリダイゼーションは、50％ホルムアミド、１％SD
S,2×SSC（１×SSC＝0.15M NaCl/0.015M クエン酸ナ
トリウム,pH7）中37℃で実施された。DNAの両方のスト
ランドの完全な配列は、合成オリゴヌクレオチドをプラ
イムしたシーケナーゼ（U.S.Biochemical）を用いてM13
mp19中で決定された。
発現および薬理 2.5kbヒト下垂体とcDNA（hPitD2）はpZem3（Dr.E.Mul
vihill,Zymogeneticsからの贈物）へクローンされ、CaP
O4沈澱によってマウスLtK-中へpRSVneoと共に同時トラ
ンスフェクトされた。安定なトランスフェクタントが選
ばれ、G418（ゲネチシン硫酸塩,Gibco）の750μg/ml中
に保持された。膜収穫20時間前に、これら細胞は70μＭ
硫酸亜鉛とインキュベートされた。膜はＬ−HPiD2Zimか
ら、クローンしたラットドパミンD2レセプターを発現す
るLtK-細胞ライン（Ｌ−RGB2Zem−１）から、そして新
たに分離したラット線条体（Taconic Farm,Germantow
n,New york）から、以前記載された（11,12）ように調
製された。結合アッセイのため、膜タンパクはＬ−hPit
D2Zemからは10〜15μｇにおいて、Ｌ−RGB2Zem−１から
は50〜70μｇにおいて、ラット線条体からは220〜250μ
ｇにおいて使用された。結合アッセイは、50mMトリス−
HCl,120mM NaCl,5mM KCl,2mM CaCl2,1mM MgCl2,pH
7.4中37℃で60分インキュベートされ、そしてガラスフ
ィルター（Schleicher and Schuell,No.32）上の急速
濾過によって停止された。フィルターは0.5％ポリエチ
レンイミン中に事前浸漬した。フィルターは氷冷50mMト
リス−HCl,pH7.4中で２回洗った。飽和曲線は高度にD2
特異性アンタゴニスト〔3H〕ドムペリドン（13）の上昇
する濃度を使用して発生させた。アンタゴニスト薬物は
それらの特異性結合〔3H〕ドムペリドン（1nM）を阻害
するそれらの能力について評価した。Bmax,Kd,およびIC
50値は以前記載された方法（14）のように決定した。
サウザンブロッティング 正常男性ドナーから調製したヒトゲノムDNAはM.Litt
からの贈物であった。DNA3μｇを制限酵素で消化し、フ
ラグメントを0.7％アガロース中で電気泳動し、ニトロ
セルロースフィルター（Schlicher and Schuell）上
へブロットした。前ハイブリダイゼーションおよびハイ
ブリダイゼーションは、以前記載されたように（15）50
％ホルムアミド中37℃において実施された。
ゲノム配列決定 正常ヒト男性DNAから調製したゲノムバクテリオファ
ージラムダライブラリーは、Stratragene and Clontc
h Laboratories,Inc.から購入し、そしてクローンした
ラットドパミンD2レセプターcDNAの一部分づつでスクリ
ーンした。DNA配列はゲノム配列決定アプローチ（16,1
7）によって決定された。要約すると、使用した各制限
酵素について、クローンしたゲノムファージDNA（50μ
ｇ）が消化され、化学的開裂にかけられ、そして得られ
たフラグメントが変性するポリアクリルアミドゲル中で
分割された。次にDNAはゲルから移されたナイロンフィ
ルター（Plasco Genetran）上に固定された。〔32P〕
末端標識合成オリゴマーを使用して、配列の梯子がエク
ソン内に可視化され、隣接するイントロン中に読取られ
た。次にフィルターは異なるオリゴマーでプローブされ
るか、またはエクソンを横断して戻る補完的配列を読取
るため新しいフィルターがつくられた。コーディング区
域の両方のスタンダードが配列決定された。
結果 ヒト下垂体cDNAのクローニングおよび配列分析 プローブとしてラット脳D2レセプターcDNAを使用し、
ヒト下垂体ライブラリーから３種の部分的cDNAが単離さ
れ、配列決定された。これら配列に基づく２種のオリゴ
ヌクレオチドプローブがレセプタータンパクの全長（第
18図）をコードする４番目のcDNA hPitD2を単離するた
めに使用された。ヒト下垂体レセプターは７個の推定ト
ランスメンブレン領域を含み、そしてシグナル配列を欠
いている。全体として、ヒトおよびラットヌクレオチド
配列は90％類似であり、アミノ酸レベルにおいて96％同
一であることを示す。Ｎ−結合グリコシル化、タンパク
キナーゼＡフォスフォリル化およびパルミトイル化のた
めのいくつかの一致した配列（18）がヒトおよびラット
レセプター間に保存される。これらタンパク間には18個
のアミノ酸の違い（１個の欠如を含む）があり、驚くべ
きことにヒトレセプターはその推定３番目細胞質ループ
中追加のアミノ酸29個を含んでいる。
hPit D2 cDNAの発現および薬理学的評価 ヒト下垂体レセプターの薬理学的特徴を評価するた
め、そのcDNAをpZem3中にサブクローンし、マウスLtk-
細胞中に発現させた（Ｌ−hPitD2Zem）。これら細胞か
ら調製した膜は、4.05±0.3pmol/mgタンパク（ｎ＝２）
のBmaxおよび0.74±0.11nM（ｎ＝２）のKd値をもって、
D2選択性アンタゴニストである（12,13）〔3H〕ドムペ
リドンとの特異性結合を示した。このKd値は、マウス脳
細胞膜中の公表された値0.74mMと良く一致している。こ
のデータのScatchardプロットは直線であった。pZem3の
みでトランスフェクトした細胞から調製した膜には検出
し得る〔3H〕ドムペリドン結合は存在しなかった（デー
タ示さず）。Ｌ−hPitD2Zemに対する〔3H〕ドムペリド
ン結合は多数のドパミンD2特異性薬物によって阻害され
た（第19図）。それらの強さの順序は、スピロン，
（＋）ブタクラモール，ハロペリドールおよびスルピラ
イドの順であった。セロトニン選択性アンタゴニストで
あるミアンセリンおよびD1選択性アンタゴニストである
SCH−23390は、不活性異性体（−）ブタクラモールと同
様に、非常に高濃度においてのみドムペリドン結合を阻
害した。これらの値は、クローンしたラットドパミンD2
レセプターcDNAでトランスフェクトしたLtk-細胞（Ｌ−
RGB2Zem−１）から、そしてラット線条細胞からの膜に
ついて得たものに実質上同じである（第22図）。
ヒトドパミンD2レセプター遺伝子 プローブとしてラットcDNAを一部分づつ使用し、ヒト
ゲノムライブラリーからクローンを単離した。このゲノ
ムクローン，λHH2G1は、ヒトD2レセプターの最後の64
個のアミノ酸をコードする1.6kb BamH Iフラグメント
と、そして３′非コード配列の1.2kbを含んでいた。1.6
kbフラグメントは３種の制限酵素を消化したヒトゲノム
DNAのサウザンブロットをプローブするために使用され
た。各酵素はプローブへハイブリッド化された単一フラ
グメントを生成し（第20図）、多分１種だけのヒトドパ
ミンD2レセプター遺伝子が存在することを指示する。
ヒトレセプタータンパクのＮ末端をコードするゲノム
クローンを単離するため、クローンしたラットドパミン
D2レセプターcDNAからの118bp制限フラグメント（アミ
ノ酸残基１−39に相当）が２番目のゲノムライブラリー
をスクリーンするために使用された。λHD2G2が単離さ
れ、400個のヌクレオチドだけλHD2G1と重複することが
発見された。これらファージはヒトドパミンD2レセプタ
ー遺伝子位置の34kb DRD2をスパンし（19）、そしてhP
itD2cDNAに見られる配列と、それにポリアデニル化シグ
ナルの下流3.7kbおよびほん訳開始部位の上流3.7kbを延
びる配列を含んでいる。この遺伝子のイントロン／エキ
ソン構造を特徴化するため、オリゴヌクレオチドプロー
ブおよび化学的開裂を採用するゲノム配列決定アプロー
チが使用された（第21b図）。このレセプターファミリ
ーのヒトおよびラットメンバー間のヌクレオチド配列の
違いは約10％（未発表所見）であるため、我々はクロー
ンしたラットドパミンD2レセプターcDNA中に存在するハ
イブリダイゼーションプローブおよび制限部位に依存し
てゲノム配列決定を開始することができた。我々の結果
は、ヒトドパミンD2レセプター遺伝子のコーディング部
分は７個のエキソンに分れることを示した（第21b
図）。興味あることに、エキソン５は87bp長さであり、
そしてクローンしたヒト下垂体レセプターに存在する29
個のアミン酸配列全体をコードすることを発見した（第
18および21c図）。６個のイントロンの分析は、第23図
に要約するように、各自GT/AG規則（20）に一致するア
クセプターおよびドナー配列を含むことを明らかにし
た。これらイントロンの大体のサイズはサウザンブロテ
ィング実験の結果に基いたものである（データ示さ
ず）。比較する時、ゲノムおよびcDNA配列は二つの過渡
点、一つは939（遺伝子においてＴからＣ）および他は9
57（遺伝子においてＣからＴ）において異なるだけであ
ることが判明した。
議論 我々のヒト下垂体D2レセプターcDNAクローンに存在す
る余分の配列についていくつかの仮説を立てることがで
きる。一つの可能性は、ヒト遺伝子はラット遺伝子が持
っていない余分の87個の塩基を含んでいることである。
他の一つは、ヒトおよびラットの両方は２種の異なるド
パミンD2レセプターをコードする２種の異なる遺伝子を
持っていることである。最後に、単一転写の代替スプラ
イシングは１個のmRNAとそして87個塩基なしの他のもの
を生ずることがあり得る。この最後の仮説の支持とし
て、我々は多分１種だけのヒトドパミンD2レセプター遺
伝子DRD2が存在すること、および87bp配列はその遺伝子
の別のエキソン上に含まれていることを示した。さら
に、我々は87bp配列を含むラット脳cDNAをクローンした
（未発表結果）。この配列はヒトcDNAに高度に類似であ
り、29残基を含んでいるドパミンD2レセプターはヒト下
垂体独自のものでないことを確立した。
Ｌ−hPitD2Zemに発現されたヒトドパミンD2レセプタ
ーは、ラット線条およびＬ−GB2Zem−１膜と実質上同じ
薬物結合プロフィルを有する。それ故、アミノ酸29個は
結合に影響しないから、それらはレセプター機能の他の
レベルにおいて関与し得る。例えば、β２−アドレナリ
ンレセプターの３番目の細胞質ループは適切なＧタンパ
ク結合に必要であることが示されている（21）。それ
故、一つの可能性は、この配列はドパミンD2レセプター
刺激がアデニルサイクラーゼを阻害し、カリウムチャン
ネル伝導度を活性化するかまたはカルシウム移動を阻害
するかどうかに影響し得ること（22）である。他の可能
性の一つは、29個アミン酸が後部シナプスドパミンD2レ
セプターを前記シナプス自己レセプターから分化するこ
と（23）である。コンピューター検索（VAX/Intelligen
etics）は有意な同族性の他の配列を同定するのに失敗
したので、我々はこの配列はD2レセプター独自のもので
あると考える。
ゲノムおよびcDNA配列の比較に基いて、ヒトドパミン
D2レセプター遺伝子は少なくとも７種のエキソンに分け
られる。ムスカリンレセプター遺伝子の場合そうである
ことが示されたように（24），遺伝子の５′端に一以上
の追加のエキソンが同定されずに残っていることもあり
得る。
イントロンによるコーディング配列の中断はヒトドパ
ミンD2レセプター遺伝子を、オプシン遺伝子（25）を除
いてＧタンパク結合レセプター遺伝子ファミリーの大多
数の他のメンバーから区別する。有意義な観察の一つ
は、このヒト遺伝子中二つのイントロン（No.3および
５）の配置はウシおよびDrosophiaオプシン遺伝子（26,
27）に保存されたイントロン位置に殆ど正確に対応する
ことである。この発見の最も簡単な解釈は、約10億年令
の遺伝子であるそれらの共通の祖先（28）がこれらのイ
ントロンを含んでいたことである。我々の遺伝子構造の
特徴化は、エキソンがタンパク構造の認識し得るエレメ
ントをコードする証拠を提供する（29）。そのようなイ
ントロンはトランスメンブレンセグメントII,III,およ
びIVの後に見られ（第18および21図を見よ）、繰り返し
構造がこれらレセプターの特徴をモチーフするとの議論
が内部重複化によって発生し得る。さらに、３番目細胞
質ループ内のいくつかのイントロンの存在は、ファミリ
ーにわたって観察された長さの実質的変動の良い説明を
提供する（30）。
構造的に別の形へ発展する代替的にスプライスされた
ドパミンD2レセプターmRNAの可能性は興味深い。ドパミ
ンD2レセプターmRNAの一つの形または他の形の発現は、
ヒト疾病に関する含蓄を持ち得るコントロールレベルを
表わす。
謝辞 我々はHoward Goodmanに対し原稿の推論および校
閲、Dee Yerozeskiに対し原稿作成、およびVicky Rob
ertson,Nancy KurkinenおよびJune Shiigiに対しイラ
ストレーションのために感謝する。D.K.G.はNIHからの
奨学金を得ている。この研究はNIHグラントNos.DK37231
およびMK45614と、Cambidge Neuro Science Researc
h,Inc.,Cambridge,からO.C.に対するグラントによって
支援された。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 グランディ，デービッド ケイ アメリカ合衆国 97221 オレゴン、ポ ートランド、エス ダブリューパットン ロード 3730 (72)発明者 マチダ，カーチス エイ アメリカ合衆国 97229 オレゴン、ポ ートランド、エヌ ダブリューラブジョ イ 12720 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C07K 14/705 C12P 21/00 - 21/02 C12N 5/00 C12N 15/00 - 15/90 ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲ／ＧｅｎｅＳ ｅｑ Ｇｅｎｂａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／Ｇ ｅｎｅＳｅｑ ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (11)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】ａ）図１−１ないし図１−５に示したアミ
    ノ酸配列、またはｂ）図18−１ないし図18−８の第１列
    に示したアミノ酸配列を有する哺乳類D2ドパミンレセプ
    ター活性を有する組換えポリペプチド。
  2. 【請求項２】ａ）図１−１ないし図１−５に示した核酸
    配列、ｂ）図18−１ないし図18−８の第２列に示した核
    酸配列、またはｃ）前記核酸配列ａ）もしくはｂ）の一
    つへ高度に厳密な条件下でハイブリダイズする核酸配列
    を有する核酸によってコードされる哺乳類D2ドパミンレ
    セプター活性を有する組換えポリペプチド。
  3. 【請求項３】ａ）図１−１ないし図１−５に示したアミ
    ノ酸配列、またはｂ）図18−１ないし図18−８の第１列
    に示したアミノ酸配列を有する哺乳類D2ドパミンリセプ
    ター活性を有するポリペプチドをコードする単離された
    DNA分子。
  4. 【請求項４】ａ）図１−１ないし図１−５に示したDNA
    配列の配列１ないし1245、ｂ）図18−１ないし図18−８
    の第２列に示したDNA配列の配列１ないし1329、ｃ）前
    記配列ａ）もしくはｂ）へ相補的なDNA配列、または
    ｄ）前記配列ａ）もしくはｂ）へ高度に厳密な条件下で
    ハイブリダイズするDNA配列を含むDNA分子である請求項
    ３の単離されたDNA分子。
  5. 【請求項５】請求項３または４のDNA分子を含むベクタ
    ー。
  6. 【請求項６】哺乳類D2ドパミンレセプターをコードする
    DNA分子がウイルスプロモーターのコントロール下にあ
    る請求項５のベクター。
  7. 【請求項７】ワクチニアウイルスまたはレトロウイルス
    である請求項５のベクター。
  8. 【請求項８】哺乳類D2ドパミンレセプターをコードする
    DNA分子が発現コントロール配列へ連結されている請求
    項５のベクター。
  9. 【請求項９】請求項５ないし８のいずれかのベクターで
    形質転換された細胞。
  10. 【請求項１０】該細胞は哺乳類細胞または多細胞生物か
    らの細胞である請求項９の細胞。
  11. 【請求項１１】請求項９または10の細胞を発現条件下に
    培養し、該細胞から哺乳類D2ドパミンレセプタータンパ
    クを単離することを含む単離された哺乳類D2ドパミンレ
    セプタータンパクの製造法。
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