JPH04504903A - 放射状免疫拡散法及びそれに類する技術 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 犬　〉　びそれに　する　′。

本発明（よ　放射状免疫拡散法及びそれに類する技術についての、またそれらに 関連する改良に関する。

従東　サンプル中のタンパク抗原の濃度を測定するいくつかの方法が知られてい る。これらのうち、次のような方法が周知で広く利用さ札　通常免疫拡散法と呼 ばれている。すなわち、所定の濃度に希釈された抗原物質を含むサンプルを、そ の抗原に特異な抗体を含むアガロースゲルのプレートのくぼみに注入する方法で ある。この抗体はゲル中に所定の濃度で存在している。サンプルはくぼみからゲ ルに向がって放射状に拡散し、そこで抗原は抗体と解離可能に結合する。その結 果、環状、時にはディスク状に見えるマトリックスがくぼみの周りに形成される 。時間の経過につれ環状またはディスク状のマトリックスは径が最大となるまで 増大し、外径が最大となると通常マトリックスの内側は目だたなくなるか、ある いは消失する。実験結果によると、もとのサンプル中の抗原の濃度は環状または ディスク状のマトリックスの最大径に直接比例する。この方法（表　マンシーニ 　ジー　カルボナラニス　オー、及びヘレマンス　ジエー、エフ、共著の「免疫 化学」第２巻２３５章（１９６５年）に記載されている。

この第一の方法とは逆にサンプル中の抗体の濃度を測定する方法もある。この場 合、アガロースゲルは所定の濃度の抗原を含み、サンプル中には濃度不明の相補 性の抗体が含まれる。

肉眼で認識可能なマトリックスは、タンパク質と抗体の濃度が最適である時に最 も顕著に形成される。この最適濃度において、はとんどの抗体は分離した二つの 抗原分子に結合し、またほとんどの抗原分子は分離した二つまたはそれ以上の抗 体に結合して、さらに大きな分子の複合体を形成する。これらの複合体は肉眼で 認識可能なマトリックスの基盤を構成する。抗体が過剰な場合、分難した抗原分 子と結合できる抗体は殆どないか、全くない。同様に抗原分子が過剰な場合、数 対の抗原分子は抗体分子により各々結合するかもしれないが、十分な抗体分子が 存在しないので、その結合した対の抗原は目に見える大きな複合体を形成するほ ど互いにそれ以上には結合することはない。

光がゲルから直接入射するのを防ぐに未　マトリックスは光の波長の少なくとも 約２０分の１程度の大きさである分子よりなる複合体により形成されなければな らない。顕著に光散乱が生じるの（よ　直径がそれぞれ２００ｎｍから４００ｎ ｍの複合体が存在する時である。実際には各抗体分子または一般的な各抗原分子 は亘径数ｎｍ、例えば直径約５ｎｍから８ｎｍＬかないので、各々多数の分子、 一般に少なくとも数１００万個の分子からなる複合体を形成するまで可視的な光 散乱は起こらないということになる。

さらに、ゲルの間質にある抗体及び抗原の分子の濃度は比較的高いことになる。

このことからさらに、ゲル中に予め適当な濃度の抗体（または逆に抗原）が存在 することが推定される。

上記のような放射状免疫拡散法はある種の目的には大変有益なものであるが、比 較的大きな分子複合体を形成する必要があるため測定感度が制限されるという欠 点がある。さらに、この方法は低濃度では長時間を必要とする。

サンプル中のタンパク抗原の濃度を測定する屓知の第二の方法としては、抗体に 覆われたラテックス粒子の懸濁液を含む液体試薬を用いる方法がある。粒子は小 さいので、試薬の透明度はそれほど低くない。しかしながら使用時に試薬にタン パク抗原が添加されると、抗原が抗体に覆われた侮れかの試薬と結合し、複合体 を形成してその透明度を顕著に低くする。抗原の濃度は試薬の不透明度を測定す ることより決定される。この方法は比較的迅速であり、上記の第一の方法よりも さらに感度がよいが、不透明度を正確に測定するための比較的複雑で高価な装置 を必要とする。

本発明は現存する方法の改善を特に提供する。この改善により、これらの方法に 関連する少なくとも幾つかの欠点を回避または軽減することができる。

第一に本発明（友　サンプル中の一対の相補性マトリックス形成媒体のうちの第 一媒体の存在を横比する方法であり、その方法においてサンプルを前記一対の相 補性マトリックス形成媒体のうちの第二媒体が存在するゲルを含有する試験体に 添加し、前記第二媒体は担体手段に付着しており、　（もし存在すれば）前記第 一媒体を光散乱マトリックスが取り込まれるまでゲル中に拡散させ、そのマトリ ックスの光散乱の性質は試験体のそれとは異なり、マトリックスの存在及び従っ てサンプル中の前記第一媒体の存在を横比するためにマトリックスの形成により 生じる光散乱の変化を利用することを特徴とする方法に関する。

マトリックスは上記のように光散乱マトリックスと称され、この物性によりマト リックスの存在が認識さ札　さらにその大きさを決定できる。この光散乱効果は 単純な観察で肉眼により観測できるが、感光性横比器を備えた装置などの無生物 横比手段により観測してもよい。さらに、散乱を観測される光は通常可視スペク トラム内にあるが常にそうであるとは限らず、その散乱光が可視スペクトラム外 にある場合、例えばスペクトラムの紫外部分の光にも本発明の方法が利用可能で ある。

第二１：、本発明は上記の本発明の第一の方法において使用される試験体に関し 、その試験体は前記第二マトリックス形成媒体が担体手段に付着しているゲルを 含む。

この担体手段はゲルそのものを含んでも良く、その場合第二マトリックス形成媒 体はゲルに付着する。その他の方法として、またはそれに加えて担体手段は粒状 物質を含んでも良い。

またこの試験体は上記の周知の方法に用いられるような試験体であることが望ま しい。つまり、試験体は薄片である方がよい。

これにサンプルが注入される、あるいは注入できる孔または「くぼみ」が形成さ れることが望ましい。さらにその薄片は、形成されたマトリックスの体積をその 表面積を測ることにより、あるいはもし円形ならその直径または半径を測定する ことにより測定できるように、均一な厚みであることが望ましい。

本発明では薄片状のゲルにサンプルを放射状に拡散させて注入してもよいが、そ の他の形状のゲルを使用してもよい。例えばサンプルを細い帯状または円柱状の ゲルに沿って拡散させてもよい。

本発明（友　前記第二媒体を担体手段に付着させた際に有効な結果が得られると いう発見に基づきなされたものである。これが発見されるまで（よ　この方法に よりこのような結果が得られるとは予想されていなかっ旭 特開　ゲル中にマトリックスを形成するための必要条件として、両マトリックス 形成媒体がゲルの間質を通って白肉に拡散することが必要であるとこれまで考え られていた　従って第二マトリックス形成媒体が担体手段に付着すると、マトリ ックスの形成を妨ばたり、あるいはマトリックスの形成を完全に阻止してしまう と考えられていた　しかしながら本発明により、それは事実ではなく、前記第二 媒体が担体手段に付着し従ってゲルの間質中を拡散するのが比較的困難であるか 、実質的に困難であるが、あるいは完全に不可能である場合にも、マトリックス は十分形成されることが発見された 粒状の担体物質が使用される場合、その物質は最終的に生成される光散乱複合体 の一部を構成し、その複合体中のマトリックス形成媒体の濃度は同じ大きさの複 合体において担体物質を生じない程度の濃度よりも低いことが理解される。その 結果、上記の第二の周知の方法（表　第一の周知の方法よりも低い濃度のサンプ ルを使用して通常実施される。即ち、粒状の担体を使用すると感度が向上する。

一方上記のように、粒状の担体が液体ではなくゲルに含まれる場合法　担体の粒 子がゲル中を移動するのを妨げられたり制限されたりするであろうという観点か ら、マトリックスの形成が不可能であるか、あるいは少なくとも十分なマトリッ クス形成が行われないであろうと考えられてぃ翫しかしながら、実際は粒状担体 がゲル中であっても有効な結果が得られる。その理由は以下のように推定される 。まず、第一の周知の方法を実施する際、あらゆる肉眼で認識可能な複合体を形 成するにはそこで抗原分子と抗体分子とが比較的大量に結合することが必要であ るが、第二の周知の方法の場合は複合体が粒状担体を取り込んでもその結合度は 低い。さらに、粒径が大きくなるに従い肉眼で認識可能な複合体における結合度 はより低くなる。

従って、比較的小さな粒径の粒子を使用することによりそれらの粒子の移動がゲ ルにより部分的にのみ阻止されるようにしたり、また結果的にマトリックス形成 のスピードが落ちても必要な結合の度合を低減することにより少なくとも部分的 にこれを緩和することが提案されている。比較的大きな粒子が使用される場合、 その粒径によりゲル中での拡散は殆ど、あるいは完全に妨げられる可能性がある 。しかしながらゲルの構成要素は十分に柔軟性があり、近隣の粒子が互いに十分 に接近するので、これらの粒子に付着したマトリックス形成媒体がゲル中を拡散 する相手の媒体と結合することが可能であると考えられる。従って、粒径が大き くなるに従い粒子の移動が困難となっても、マトリックス形成に必要な結合の度 合を低減することにより、またゲルの構成要素が有する予期されなかった柔軟性 により、これを適度に補うことができると考えられる。

同様に、担体手段がゲルそのもので構成される場合、形成される光散乱複合体は ゲルの一部を取り込む。測定感度を向上させるため、比較的厚みのある構成要素 よりなるゲルを使用してもよい。

比較的厚みのある構成要素よりなるラテックスゲルが適当である。

本発明の利点を理解するために　以下の点においてのみ異なっている二つの方法 を比較してもよい。この異なった点とは、第一の方法では周知の第一の方法に特 徴的であるように第二媒体がゲル中に浮遊しており、一方、第二の方法では本発 明に特徴的であるように第二媒体が担体手段に付着している点である。第二媒体 の濃度は両方法で同一であり、サンプル中の第一媒体の濃度も両方法で同一であ る。サンプルが注入されると、マトリックスが二つのゲル中で実質的に間じ速度 で形成されるが、第一の方法では肉眼で認識可能な複合体が第二の方法よりもゆ っくりと形成される。さらに媒体濃度が低い場合、第一の方法では肉眼で認識可 能な複合体が全く形成されない可能性がある。従って、本発明の第二の方法を用 いることにより媒体の濃度が低い場合でもより高い感度の結果が得ら札　高い濃 度の場合でもより迅速に結果が得られるという利点がある。

本発明の方法（友　前記第一マトリックス形成媒体の存在を横比するためだけで なく、サンプル中の第一媒体の量を測定するためにも利用できる。これ匝　予め ゲル中に既知の濃度の前記第二媒体を供給し、増大し終わった後のマトリックス の大きさを測定する方法である。所定の体積のサンプルを注入する孔あるいはく ぼみを有した薄片状の試験体を使用する場合、第一媒体の量は孔の周りに形成さ れた環状またはディスク状のマトリックスの径に比例する。−力試験体が細い帯 状または円柱状である場合（よ　円柱状のサンプル中の第一媒体の量は帯状また は円柱状試験体中の肉眼で認識可能なマトリックスの長さに比例する。

逆に、本発明の方法をゲル中の前記第二媒体の濃度を測定するために利用しても よい。この目的には既知の濃度の前記第一媒体を含むサンプルを使用する。

相補性マトリックス形成媒体のうち一方は抗体であり、他方は抗原であることが 望ましい。抗体は前記第二媒体を構成し、ゲル中に予め存在することが望ましい 。

周知のように、結合定数が解離定数よりはるかに大きいという原理により抗原は 解離可能に抗体に結合する。従って、マトリックスが形成される割合は解離定数 の値に大きく左右される。前記第一媒体の可能な全ての、あるいは実質的に全て の分子を取り込むマトリックスを形成する際、第一媒体はゲル中を拡散し、マト リックスが形成されるまで前記第二媒体との結合及び解離を繰り返す。

本発明が十分に作用するように結合定数は比較的大きくなければならないことが 発見さね　その結果として媒体間の結合力がその結合を解離しようとするゲルの 構成要素の弾力に対抗できるだけの大きさでなければならないと考えられる。本 発明の方法に使用できる相補性媒体の組合せの種類（表　実験により決定するこ とが最善である。上記のように、抗体及びタンパク抗原は通常十分に使用できる 。一般に、十分に作用するためには結合定数を比較的大きくすべきである。例え ば平衡定数に、、は通常少なくとも１０”ｍｏ　ｌ　ｅ　ｓ−’であるべきであ る。

本発明の方法で（表　抗体及びタンパク抗原を相補性媒体として使用してもよい 。またその他の広範囲の相補性媒体を利用してよい。例え（二　一方の媒体がア ビディンで、他方がビオチンでもよい。どちらが第一媒体でもよいが、ビオチン が第一媒体を、アビディンが第二媒体を構成し粒状担体に付着する方法が望まし い。

使用できるその他の相補性媒体として（表　レクチンと炭水化物、特に砂糖があ る。この場合、レクチンは第二媒体を構成してゲル中の粒状担体に付着し、炭水 化物は第一媒体を構成する方法が望ましい。

周知の第一の方法及び本発明の方法において形成されるマトリックスの性質につ いてＩＬ　ｍ知の第一の方法の場合、肉眼で認識可能なディスク状のマトリック スが通常まず形成される。その径は最大に達するまで増大するが、同時にディス ク状のマトリックスの内側部分が再び次第に消失していき、目に見える最終的な マトリックスは環状となる。これは　両方の構成媒体がゲル中で拡散する結果で あると考えられる。反対に本発明の場合で匝　目に見えるディスク状のマトリッ クスは通常内側部分が消失しない。

これ（表　第二媒体が通常ゲル中で動かない、あるいは実質的に動かない結果で あると鴬えられる。

前記第一媒体の分子（上　ゲルから環状またはディスク状のマトリックスの縁へ 向かう経路において、前記第二媒体の多数の分子に結合またはそれから解離しな がら、ゲル中の濃度の傾度のみにより漸次的かつ全体的に非直線状の経路に沿っ て移動すると考えられる。上記の第一の周知の方法において、肉眼で認識可能な 複合体が形成されるまでに多数の連結がなされなければならないので、この方法 は比較的長時間を要する。しかしながら本発明の場合、互いに結合する媒体が肉 眼で認識可能な複合体を形成するのに必要な濃度は担体手段があるため低く、従 って通常より迅速に結果が得られる。

担体手段が粒状の場合、担体手段は前記第二媒体の複数の分子にそれぞれが付着 する複数の微細な粒子を含む。この粒子はポリスチレンラテックスのようなラテ ックス粒子でもよい。抗体分子で覆われたコロイド状のポリスチレン粒子の生成 方法（瓢　上記の第二の周知の方法で被覆された分子を生成する方法などのよう に、既に周知である。この種の現存するその他の被覆された分子を本発明のゲル 中で使用してもよい。その４Ｎ　粒子は金のような金属を含んでもよい。ポリス チレン粒子や金の粒子（よ　いずれも上記のような複合体の一部を形成する際は 比較的透明である。それらの粒子が一部を形成するマトリックス（瓢　光が屈折 しこれらの構成粒子により内部で反射するので肉眼で見えるのである。予めより 不透明な物質を使用すれ１区　マトリックスはさらによく見えるようになる。例 えば、各々鉄のコアを有しポリスチレンで覆われている粒子を含む担体を使用し てもよい。

粒子の性質がいかなるものであろうと、各粒子は表面に多数の前記第二マトリッ クス形成媒体の分子を担持する。従ってゲル中の第二媒体の全体の濃度が比較的 高けれ（二　両媒体の相対的濃度が最適となるために必要な前記第一媒体の濃度 はそれに伴って高くなる。この場合、肉眼で認識可能な複合体は比較的早く現れ 始めるが、マトリックスの形成速度は比較的遅いようである。しかしながら、各 粒子が表面上に担持している前記第二媒体の分子数を減らし、粒子の濃度はその まま保つことにより、ゲル中の第二媒体の全体の濃度は下がり、よって両媒体の 相対的濃度が最適となるのに必要な第一媒体の濃度もそれに伴って下がる。その 結果、本発明の方法の感度は向上するが、マトリックス形成速度は遅いままであ る。粒子の大きさくよ　第二媒体の分子がそれらの粒子に結合していても所定の 波長の光を散乱しない程度の大きさである。

しかしながら、比較的少数の粒子、例えば５個以下の粒子が互いに結合した除光 を散乱する大きさの複合体を形成する程度の大きさでもよい。一般に約１１００ ｎの直径の粒子を使用するが、その他の直径の粒子でもよい。

添付の図面は本発明に使用されるテストプレートの一つの独特な形の斜視図であ る。この図は単に一例として示されている。

テストプレートＬＬ　角が丸く長方形の平面の基盤である強固なトレイ１と、直 立した湯送のフランジ２より成る。トレイは本発明に従った試験体を構成する均 一な厚さの薄片３を担持する。図に示すように、貫通孔アレイ４が薄片に形成さ れている。

薄片３は抗体に覆われたポリスチレン粒子を含有するゲルを含む。ポリスチレン 粒子は均一な大きさで、各々の直径は概して１１００ｎである。このようなポリ スチレン粒子は市場で入手可能であり、固体を５０％含有し比較的高いｐＨ（通 常９．５）の懸濁水の状態で通常販売されている。粒子が被覆される際、懸濁液 は薄めらね　粒子を完全に互いに分離させるため超音波放射を受ける。所望の抗 体を含む溶液が注入されると、抗体は自ら粒子と結合する。これは抗体も粒子も 疎水性であるため自然に生じるのである。この作用はもし必要ならば比較的小量 のアルブミンを添加することにより促進してもよい。

薄片は比較的長い連鎖のアガロースゲルより形成される。アガロースゲルは通常 約１００℃である融点まで加熱さ札　その後約４０℃の凝固点で再び凝固し始め ないよう制御状態で冷却される。

被覆された粒子はその融点以上Ｓ６°Ｃ以下の温度で液体寒天に注入される。５ ６℃以上であると抗体が破損し始める。粒子が液体と全体的に混合されると、そ の混合物はトレイ１に注入さ札　均一な厚さで薄片を形成し始める。形成が終わ ると薄片は一時的にトレイから取り出さ札　トレイに戻される前に孔４が形成さ れる。

識別ラベル５がゲルに添付される。

使用時、抗体に相補する抗原を含有する所定体積の液体サンプルが孔の一つへ注 入さ札　抗原が上記のようにゲル中を拡散して肉眼で認識可能なマトリックスが 次第に形成される。これは通常孔と同心のディスク状であり、この種の一般的な 形状のマトリックス６が図示されている。そして、サンプル中の抗原の濃度を推 定するためディスク状マトリックスの直径を測定する。

このプレートを利用する方法は種々考えられる。一つに（瓢　未知の強度のテス トサンプルを孔４の一つに注入し、各々既知の強度の数個の標準サンプルをその 他の孔に注入する。サンプルの濁りのディスク状のマトリックスが適度な大きさ になった後、それらの直径を測定する。標準サンプルの結果値を直径と強度の関 係のグラフ上に点で表示する。それらの点を線で結び、テストサンプルを注入し た孔の濁りに生じた肉眼で認識可能なマトリックスの直径に基づきサンプルの強 度を調べる。この方法を利用すると、−日で有効な結果を得る可能性もある。ま た類似した方法として、この方法をディスク状マトリックスが最大直径になるま で継続すれ＋ｉ　時間はかかるがより正確である。この方法では２日またはそれ 以上の日数を必要とする。その他の方法として（友　製造者がプレートに目盛り を付け、所定の強度のサンプルにより得られるマトリックスの最大直径を示すテ ーブルを使用する方法もある。

上記のようなテストプレート（表　比較的未熟練な者も複雑で高価な測定装置を 必要とせずに使用できる。特に、医師がこのプレートを使用する場合でも、病院 でしか利用できないような設備や専門的技術を使用しなくともテストを迅速にか つ簡単に実施できる。

上記の第一の理知の方法では、５ｍｇ／／程度まで低い濃度の抗原を含有するサ ンプルを測定するが、本発明の方法によれば０゜５　ｍ　ｇ　／、／　の濃度、 場合によっては０．１５ｍｇ／、／　あるいは０゜２　ｍ　ｇ　／／　の濃度の 抗原を含有するサンプルを容易に測定できる。

従って本発明を利用することにより、従来病院に照会して初めて検土及び測定で きた多くの状態が、地方の医師により検量及び測定できるのである。

１．１．ｌｌ＋＋、□＋ｌｌ＋＋ｌ＋Ｎ＋　ＰＣ工／ＧＢ　９０１００６５５

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　サンプル中の一対の相補性マトリックス形成媒体のうちの第一媒体の存在を 検出する方法であり、その方法においてサンプルを前記一対の相補性マトリック ス形成媒体のうちの第二媒体が存在するゲルを含有する試験体に添加し、前記第 二媒体は担体手段に付着しており、もし存在すれば前記第一媒体が光散乱マトリ ックスに取り込まれるまでゲル中に拡散させ、そのマトリックスの光散乱の性質 は前記試験体のそれとは異なり、マトリックスの存在及び従つてサンプル中の前 記第一媒体の存在を検出するためにマトリックスの形成により生じる光散乱の変 化を利用することを特徴とする方法。 ２　前記担体手段がゲルを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。 ３　前記担体手段が粒状物質を含むことを特徴とする請求項１又は２に記載の方 法。 ４　マトリックス形成媒体のうち一方が抗体で、他方が抗原であることを特徴と する請求項１から３のうちいずれか一つに記載の方法。 ５　前記請求項のうち何れか一つに記載された方法を実施する際に使用され、担 体手段に付着した前記第二マトリックス形成媒体が存在するゲルを含むことを特 徴とする試験体。 ６　前記担体手段がゲルを含むことを特徴とする請求項５に記載の試験体。 ７　前記担体手段が粒状物質を含むことを特徴とする請求項５又は６に記載の試 験体。 ８　粒状担体がポリスチレン粒子を含むことを特徴とする請求項７に記載の試験 体。 ９　各粒子が約１００ｎｍの直径であることを特徴とする請求項７又は８に記載 の試験体。 １０　試験体が均一な厚みの薄片状であり、サンプルを注入できる少なくとも一 つの孔またはくぼみを有することを特徴とする請求項５ないし９のいずれか一つ に記載の試験体。 １１　添付図面を参照して実質的に記載された試験体。