JPH04502668A - 多糖類分割ゲル及び積層電気泳動用ゲルシステム - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 多糖類分割ゲル及び積層電気泳動用ゲルシステム本発明は、電気泳動ゲルに関す る。さらに詳しくは、本発明は、その少くとも１種が部分的に解重合された１種 以上の多糖類又は多糖類誘導体よりなる、改良したふるい分は及び作業性を有す る電気泳動分割ゲル；１種以上の多糖類又は誘導体化多糖類積層ゲルと分割ゲル との電気泳動的に有効な不連続ゲルシステムの組合わせ；及び予め１ｌｆ１１定 された又はヒドロゲルの形のゲルシステム成分よりなるキットに関する。

数％のＮ、Ｎ’−メチレンビスアクリルアミドを含むアクリルアミドを重合する ことにより製造した橋かけ結合多糖類は、ゲル電気泳動のためのマトリックスと して広く用いられる。これは、主として重合体の３種の性質、即ち優れた機械的 強さ、ガラス表面への接着及び孔のサイズの広いコントロールにより、それ虻よ って簡単なアミノ酸から数百万の分子量を有する複雑な生物学的物質に及ぶ部分 の分別が行われる。

しかし、電気泳動媒体としてのその応用を減らす橋かけ結合ポリアクリルアミド の成る特質が存在する。主な重要事は、ゲルが発熱性である遊離基を利用する重 合反応により形成されることである。十分に認識されるように、遊離基反応は、 種々のパラメーター例えばそれ自体不安定になり勝ちな開始剤の濃度、単量体の 純度、温度、時間、酸素の張力及び他の阻害剤の不存在に依存し、これらのファ クターを処理することは、再現可能な結果を達成するために、過度の量の配慮及 び注意を必要とする。橋かけ結合ポリアクリルアミドに対する他の少くとも潜在 的な反対は、プレカーサー単量体の取扱いにより生ずる健康への害の可能性であ り、アクリルアミドは神経毒であることが分っている。

過去数年間、多くの努力が、ポリアクリルアミドにともなう問題のない電気泳動 ゲルシステムの研究及び開発に費されている。これらの研究の努力の結果として 、多糖類アガロースが、かなりの将来性を示すゲルの候補者として現れてきた。

アガご−スは、無毒であり、高いゲル強さ及び低い電気内方浸透を有し、ゲル形 成のための遊離基重合を要しない。アガロースは、熱的に可逆的であり、それ故 分離した成分を溶融したゲルから回収できるゲルを形成する天然の実質的に線状 の重合体である。

本来の（誘導体化されていない）アガロースから製造したゲルは、特徴的な粗い 孔構造を示し、その特徴はそれらをして大きな高分子の電気泳動的分離のための 好ましい媒体にする。一般的に、約５０００００　（５００ｋＤ）以上の分子量 を有する蛋白が、主として分割できる。ゲルの７ガロース含量を上げることによ り、より小さい分子量の部分が分割（制限）できるが、これはアガロース注型溶 液に高い粘度を生せしめ、そのためそれらの取扱いを困難にする。アガロースゲ ルは、従って多くの分析及び調製法に用いられるのを妨げる。

アガロースゲルの大きな孔の制限は減少し、そしてそれらのふるい分は作用は、 元の７ガロースより細い孔構造を有する成るアガロース誘導体からゲルを形成す ることにより改善される。この変性されたアガロースの一つの好ましい群は、ヒ ドロキシアルキル部分によりアガロース重合体鎖のアガロビオース単位の１−４ 個のヒドロキシル水素原子を置換することＫより生成されるヒドロキシアルキル 化アガロースである。特に好ましいものは、アルカリの存在下アガロースと２− クロロエタノールとを反応させて得られるヒドロキシエチル化アガロースである 。ヒドロキシエチル化アガロースからのゲルは、約５０ｋＤから約６００ｋＤへ 蛋白を分割できる。その上、これらのゲルは、本来のアガロースゲルより低い融 点を有し、それは再溶融ゲルから反応性生物学的物質を回収するときの利点とな る。

ヒドロキシエチル化アガロースは、商標名Ｓｅａ　ＰｌａｑｕｅでＦＭＣＣｏｒ ｐｏｒａｔｉｏｎ、ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ　ＧｒｏｕｐｓＲｏｃｋｌａｎｄ、 　Ｍａｉｎｅ　０４８４１　Ｕ、Ｓ、Ａ、により販売されている。ヒドロキシア ルキル化アガロースの記述及び製造の詳細は、米国特許第３９５６２７３号に見 い出され、それはここに参考文献として引用される。

当該技術において明白な進歩であるが、本来のアガロースと同じくヒドロキシア ルキル化アガロースは、その粘度がゲル濃度とともに増大する注型溶液を形成す る。

これは、最大のふるい分は作用を達成するのに十分な濃度のゲルを製造すること を困難にする。

アガロースゲルのふるい分は性は、それらと他のゲル形成材料例えばポリアクリ ルアミドとを組合わせることにより改良できる。例えば、Ｂｏｄｅ、　Ｈ，Ｊ− Ｃ１９７７）Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　８３．２０４−２１０参照。しか し、これら混合物は、特にそれらが高い％のアガロースを含むとき、融和性の問 題を有する。その上、これら不均一なアガロースブレンドは、蛋白分離パターン の一定した改良を与えない。これは、ゲル構造に配合されない添加物が、緩衝剤 に配合されない限り、ゲルの外に拡散する傾向を有する液内電気泳動を行うとき 、特に真実である。対照的に、すべてのアガロースシステムは、多層ケルを形成 する。

種々のアガロースふるい分はゲルは周知であるが、すべてのふるい分はゲルは、 分割ゲルとして用いられるのに最適ではない。周知のふる（・分はゲルの例は、 以下のものを含む。

ＮｕＳｉｅｖｅ　ＧＴＧは、アガロースふるい分はゲルであって、それはＦＭＣ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ　＋　ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｌｓ　Ｇｒ。

ｕｐ、　Ｒｏｅｋｌａｎｄ、　Ｍａｉｎｓ　０４８４１、Ｕ、Ｓ、Ａ、の製品で あり、その使用は、Ｄｕｍａｉｓ及びＮｏｃｈｕｍｓｏｎ、「Ｂｉ。

ＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓＪ　５：６２（１９８７）により「Ｓｍａ　ｌ　１ＤＮＡ 　Ｆｒａｇｍｅｎｔ　５ｅｐａｒａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｍｌ　３　Ｃｌｏｎｉｎ ｇＤｉｒｅｃｔｌｙ　ｉｎ　Ｒｅｍｅｌｔｅｄ　ＮｕＳｉｅｖｅ　ＧＴＧ　Ａｇ ａｒｏｓｅＧｅｌｍｌに記載されている。ＮｕＳｉｅｖｅ　ＧＴＧアガロースと 一緒に用いられる、ＦＭＣＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎの文献に開示されている緩衝 剤システムは、ＴＡＥ　（４０ｍＭ　Ｔｒｉｓ、２０ｍＭアセテート、２　ｍＭ 　ＥＤＴＡ、　ｐＨ８，０）及びＴＨＥ（８９ｍＭ　Ｔｒｔｓ、８９ｍＭボレー ト、２ｍＭ　Ｆ、ＤＴＡ、　ｐＨ８，０）を含む。ＮｕＳｉｅｖｅは、先ずヒド ロキシエチルアガロースに誘導体化され次に部分的に解重合された本来のアガロ ースよりなる。

他の周知のふるい分はアガロースは、１部のＳｅ　ａｋｅｍ本来アガロース（Ｆ ＭＣＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、　ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓＧｒｏｕｐ、　Ｒｏｃ ｋｌａｎｄ、　Ｍａｉｎｓ　Ｏ４８４］、Ｕ、Ｓ、Ａ、の製品）と３部の上記の ＮｕＳｉｅｖａ　アガロースとの組合わせである。この組合わせは、５ａｉｋｉ 、　Ｇｅ１ｆａｎｄ、　５ｔｏｆｆｅｌら、ｌ”　Ｐｒｉｍｅｒ−Ｄｉｒｅｃｔ ｅｄ　Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ　Ａｍｐｌｊｆｉｃａｔｊｏｎ　ｏｆ　ＤＮＡ　ｗｉ ｔｈ　ａ　Ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｊ　、 　５ｃｉｅｎｃｅ、　２３９，４８６−４９１（１９８８）により重合鎖反応（ ＰＣＲ）法に有用であると開示されている。

さらに他の周知のふるい分はゲルは、Ｓｅａ　Ｐｒｅｐヒドロキシエチル（誘導 体化）アガロースであって、ＦＭＣＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、　ＢｉｏＰｒｏｄ ｕｃｔａ　Ｇｒｏｕｐ、　Ｒｅｃｋｌａｎｄ。

Ｍａｉｎｅ　Ｏ４８４１Ｕ、Ｓ、Ａ、の製品である。「Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒ ｅｓｉｓ’８１Ｊ、　２１３　２１８、Ａ１１ｅｎ及びＡｒｎａｕｄ　（編）、 Ｗ、　ｄｅ　Ｇｒｕｙｔｅｒ　ａｎｄ　Ｃｏ、　（発行）、ニューヨーク（１９ ８１）において、Ｎｏｃｈｕｍｓｏｎ　、　Ｓ、による電気泳動におけるふるい 分けのためのこの製品の使用の開示がある。

他の周知のふるい分はゲル組成物は、［Ｉｍｐｒｏｖｅｄ　Ｒｅ５ｏｌｕ＊Ｊｏ ｎ　ｏｆ　ＤＮＡ　Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ　ｉｎ　Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ −Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄ　Ａｇａｒｏｓｅ　Ｇｅ１ｓ　Ｊ、Ａｎａｌｙｔｉ ｃａｌＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ％１６３．２４７−２５４Ｃ１９８７）におい てＰｅｒｌｍｉｎ、　Ｃｈｉｋａｒｍａｎｅ及びＨａｌｖｏｒｓｏｎにより開示 されているよ５に、アガロース及びヒドロキシエチルセルロースの混合物を含む 。

本発明は、〔１〕新規な多糖類分割ゲル組成物、〔２〕不不連続多糖横積ゲルと 電気泳動的に結合した前記の新規及び／又は周知の多糖類分割ゲル組成物よりな る新規の「ゲルシステム」及び〔３〕　予め測定された乾燥粉末及び、／又は予 め混合したヒドロゲル分割ゲル並びに不連続積層ゲルの組合わせよりなるキット に関し、これらのもののすべては任意に適切な緩衝剤システムを含む。本発明の 分割ゲルは、粘度が増大する一注型溶液により通常もたらされる取扱い問題なし に高濃度で製造できる、改良したふるい分は及び分割性を有するゲルを形成でき ることにより特に特徴付けられる。分割ゲル及び分割積層ゲルシステムは、ゲル 電気泳動に周知の有用性を有する操作例以外に、又は他に示されているとき、こ こで用いられる成分の量、パラメーター又は反応条件を表すすべての数は、用語 「約」によりすべての例で修飾されるものと理解すべきである。

ここで用いられるとき、用語「不連続」は、ゲルの孔径又は重合体の組成又はそ れぞれに結合した緩衝剤のイオン強度、イオン組成又はｐＨの少くとも１種に関 して、分割ゲルと結合した積層ゲルとの間の差に関する。本発明の積層ゲルシス テムをここに記載したやり方で操作させるのは、この差（不連続性）である。電 気泳動の技術において周知のように、電極緩衝剤と用いられるゲルの緩衝剤との 間の第二の不連続性が通常存在するのに違（・ない。この第二の不連続性は、本 発明の一部ではなく、他に示された場合を除いて、用語「不連続」内に含まれな い。

ここで用いられるとき、用語「多糖類」は、アガー、アガロース、カードラン、 ゲラン、コンニャク、ペクチン、ブルーランそしてより低い程度でアルギネート 及びカラギーナンから好ましくは選ばれる本来又は誘導体化された熱可塑性及び ／又はｐＨ可逆性ヒドロゲル形成多糖類、並びにそれが電気泳動的条件下で顕著 に解離しないようにゲル形成重合体と固く結合する他の多糖類又は非多糖類重合 体の何れかと前記のものの任意のものとの熱可塑性又はｐＨ可逆性ヒドロゲルの 組合わせに関する。（線状多糖類は、本発明のゲル形成重合体と固（結合しない 。） 本発明とは対照的に、従来の技術のポリアクリルアミドゲルは、ｐＨ可逆性でも 又は熱可逆性でもないということが知られている。本発明のヒドロゲル組成物及 びゲルシステムは、特にアクリルアミドを除き、橋かけ又は重合剤を要しない。

本発明のゲルは、標準の装置及び緩衝液を用いて垂直、水平及び逆転注型フォー マントで使用でき、そして本発明の最も重要な利点を構成するゲル強度又は分割 能力を犠牲にすることなく、これはこの注型の容易さを増す。それらは熱可逆性 及び／又はｐＨ可逆性なので、本発明の分割及び（分離した）積層ゲルは、電気 泳動後前溶融でき、早いサンプルの採取及び可能なゲルの採取及びその後のゲル の利用を可能にする。

〔■〕　第一の態様において、本発明は、１種以上（好ましくは２種以上、さら に好ましくは２種）の多糖類ヒドロゲル（少くともその１種は誘導体化されてお り、そして独立して少くともその１種は、分割ゲルの注型能力が改良される程度 にその粘度を低下させるのに十分な根部分的に解重合されるが、しかし分割ゲル の強度が電気泳動法に必要なのを超えて弱まる点ではない）を含み、そして好ま しくは主としてそれよりなる分割ゲル組成物を生じさせる。ヒドロゲルとして、 成る誘導体化ヒドロゲル及び解重合後の同じゲルの混合物を用いることができる 。これは、「分割ゲルの注型に有効な粘度を十分に低下させるように解重合され るｊとも述べることができる。ゲル成分重合体（１種より多いものが存在すると き）は、ヒドロゲルの形成前物理的にブレンド（混合）され、そして同じ重合体 がともに解重合及び誘導体化されたとき、この解重合及び誘導体化の順序は、重 要ではない。本発明の分割ゲルは、好ましくは又下記に述べるように、好適な電 気泳動緩衝剤を含む。

本発明の分割ゲル組成物を製造するのに用いられる好ましい多糖類は、アガロー スであり、そして１種以上の他の前記の多糖類がそれ故当業者に周知のやり方で 置換できるが、ここでの以下の記述は、アガロースの用語で記述されよう。分割 ゲル組成物を製造する好ましいアガロースは、任意の本来又は誘導体化アガロー スであり、その例は、本来の７ガロ〜ス、ヒドロキシアルキル化アガロース（よ り好ましくはヒドロキシ−Ｃ２−４−アルコキシル化アガロース、最も好ましく はヒドロキシエチルアガロース）、そしてジヒドロキシアルキル化アガロース（ より好ましくはジヒドロキシプロピルアガロース、最も好ましくは１．２−ジヒ ドロキシプロピルアガロースンの１種以上を含み、その少くとも１種は、解重合 されてその粘度を少くとも注型に有効な程度に低下される。

本発明の分割ゲル組成物の最も好ましい１．２−ジヒドロキシプロピルアガロー ス成分は、アルカリ性条件下アガロースとグリシドールとを反応させることによ り製造する周知の物質である。それは、低融点ゲルを水により形成する白色の粉 末又は頌粒として単離される。その製造の詳しい記述については、米国特許第４ ３１２７２７号を参照すること。

本発明が分割ゲル組成物それ自体である限り、それは、（１）ガンマ線照射によ り次に部分的に解重合された単一のとドロキシエチルアガロースヒドロゲル〔他 の目的に有用であると既に開示された〕及び（＋Ｄ　（＋）　３部と本来のアガ ロース１部との混合物〔重合鎖反応（ＰＣＲ）に有用であると既に開示された〕 を除（ことに注意すべきである。

それらがその粘度を十分に低下されるように解重合（劣化ンした少くとも１種の アガロースを含むのが、本発明の分割ゲル組成物の重要な態様である。分割ゲル 組成物の少くとも１種のアガロースの粘度は、その粘度が３％容量水溶液で７５ ℃で測定したとき５−４０５−４０ｃｐｓ（に低下するまで、解重合されるのが 好ましい。

本発明の最も広（・態様において、解重合の方法は重要ではな（、それが７５℃ で３％水溶液で測定されたとき、全分割ゲル又は好ましくは２種以上の分割ゲル 多糖類成分の１種の粘度を５−４０好ましくは約３Ｏ−４０ｅｐｓに低下させる のに十分な解重合を達成しなければならないことのみに制限される。センチポイ ズ（ｃｐｓ）は、ミリパスカル（ｍＰａ）に大体等しい。しかし、解重合の方法 は、混在イオンを導入せず、そしてそれは重合体の本質を変えないことが、特に 重要である。

重合体の解重合（劣化）の技術は、当業者に周知であり、そして任意の好適な方 法は以下のものを用いる。ガンマ線照射への曝露、ガンマ線以外例えば活性線の 照射への曝露、水素化ホウ素によるベリオデート酸性化多糖類の還元次に酸によ る温和な加水分解を含む「Ｓｍ１ｔｈ劣化」を含む酸加水分解［「Ａｄｖａｎｃ ｅｓ　ｉｎ　Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｂｉｏ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙＪ　、　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅａｓ、ニューヨーク、１ ９７５．３１巻、２０３ページ以下〕、アルカリ性加水分解、接触加水分解例え ば遷移金属の添加とともに又はなしに鉄ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）又 は１７　Ｔ　Ａ　（二）　！７０三酢酸）の使用による、酵素加水分解、機械的 せん断、熱的解重合例えば乾燥又は含水（水溶液）状態における８０−１２０℃ における長時間加熱による、又は他の周知の手段。本発明において有用な重合体 劣化の多くの周知の技術及び態様は、Ｒｅ１ｃｈ及び５ｔｉｖａｌａによる「Ｅ ｌｅｍｅｎｔｓ　ｏｆ　Ｐｏｌｙｍｅｒ　Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ　Ｊ　、　Ｍ ｅ　Ｇｒａｙ　Ｈｉｌｌ　Ｂｏｏｋ　Ｃｏ、ニューヨーク、１９７１に記載され ており、それを引用する。

解重合の好ましい方法は、ガンマ線照射通常コバルト６０の源への多糖類の曝露 （アガロースに対して２００ｍＲ−８００ｍＨの投与量で）、醪加水分解例えば コントロールされた条件下のｒｓｍｔｔｂ劣化コ及び熱的劣化である。

ふるい分は効率の成る損失は、解重合した（劣化した）分割ゲル成分により生ず るが、これは分割ゲルブレンド中の非解重合成分の存在により好ましい態様で相 殺される。従って、成るふるい分は作用は処理可能なゲル注型溶液をもたらす成 分混合物に達するために、低下した粘度を犠牲にする取捨選択がある。

一般に、解重合処理の程度及び強さは、それ単独又は他のアガロースと組合わさ って、それが分割ゲルについて作業可能な注型溶液を提供する、即ちその粘度が 少くとも注ｍＫ有効な量に低下する点にまで、少くとも１種のアガロース重合体 を解重合するのに十分なものである。望ましくは、分割ゲルを形成するための水 性の注型溶液は、２Ｏ−４５０ｃｐｓの粘度を有し、そして分割ゲル中の１種以 上のアガロースの全量は、２−１２重量％好ましくは４−８重量％である。２種 のアガロース成分（ａ）及び（ｂｌが分割ゲルに存在するとき、ａ：ｂの重量比 は、１：０．１１−９好ましくは１：１である。

本発明の分割ゲルを製造するのに、多糖類成分を形成する個々のゲルは、乾燥し た状態で組合わされ、ヒドロゲルは混合物から製造し、一方各成分は溶解して、 混合し次に複合ゲルに注型される別々の溶液を与える。望ましくは、誘導体化の 程度そしてそれより低い程度で多糖類（アガロースのとき）成分の濃度は、ゲル 化温度（Ｔｇ）が１０−２５℃のようなものである。約１０℃より低いＴｇは、 破断し勝ちな弱（・又はもろいゲルを生ずるが、一方約２５℃より高いＴｇは、 ふるい分は能力を失う。

分割ゲル中の多糖類（好ましくはアガロース）成分の全濃度は、又もし７５℃で 約１５００ｃｐｓならばゲルの注型を困難又は実施不能にする注型溶液の粘度に より規定できる。粘度は、又各成分のタイプ及び割合に依存しよう。例えば、ブ レンドが主として解重合したアガロース例えばガンマ線照射ヒドロキシエチル化 アガロースを含むとき、２０％のブレンドされたアガロースを含むゲルは注型で きた。本発明の分割ゲル組成物は、０，５−１００００好ましくは３−５７０最 も好ましくは１〇−２００ｋＤ（キロダルト／）の分子量範囲の、％にナトリウ ムドテシルサルフェート（ＳＤＳ）［３コンプレツクスを含む、生物学的高分子 の広い選択の分離について電気泳動ヒドロゲル媒体に形成できる。

電気泳動で有用であると当業者に周知の緩衝剤は、本発明の分割ゲルに関して利 用される。好適な緩衝剤の詳細については、本発明のゲルシステムの態様に関す る下記の記述を参照。アガロースが多糖類のときには、ボレート含有緩衝剤シス テムが好ましく、それは１種以上のアガロース中にヒドロキシル部分が多いこと がボレートのコンプレックス形成に利用できるからである。当業者に周知のよ５ に、これは、電気泳動中蛋白分子の改良した分割についてアガロースゲルシステ ムの孔径をさらに減少するための橋かけ結合のメカニズムとして作用できる。１ ，２〜ジヒドロキシアガロースにヒドロキシ部分を加えることにより、橋かけ結 合は、ボレートをさらに加えることにより強化されることが分った。

又、分割ゲル組成物に少くとも１種の低分子量ポリオールを加えることにより、 より小さい分子量の蛋白物質特に２０　ｋＤ以下のものを分割するその能力が増 大することが分った。さらに、ポリオール（％にグリコール）は、分割ゲル組成 物の光学的透明性を増大する。これらの発見は１本発明の任意の他の態様を構成 する。ここで有用なポリオールは、水溶性でなげればならず、本発明の組成物が 製造又は利用される温度特に外界温度で、溶液から出現し℃はならない。ポリオ ールは、好ましくは、６０−２０００さらに好ましくは６０−６００の範囲の分 子量を有する。ポリオールの例は、エチレングリコール、グリセロール、砂糖、 ソルビトール及び２０〇−６００Ｄのポリオキンエチレングリコールを含む。存 在するとき、ポリオールは、分割ゲルに応じて１−５好ましくは５％Ｗ／Ｗの＃ に度である。

〔■〕　第二の態様では、本発明は、Ｌａｅｒｒｍｌｉ　において例示されるよ うな不連続緩衝剤の概念を利用するが、明らかに区別される所は、ポリアクリル アミドよりむしろ完全に又は実質的に多糖類（好ましくはアガロース）システム である蛋白電気泳動システムにおいて、積層ゲルと、本発明の新規及び／又は成 る他の分割ゲル組成物との組合わせよりなろゲルシステムを与えるＣ、Ｌ　ａ　 ｅｍｍｌ　ｉ。

英ｒ　Ｎａｔｕｒｅ　Ｊ、２２７．６８０−６８５（１９７０）］。本発明のゲ ルシステムは、（１）個々の蛋白バンドを優れて分割する、１．００００−２０ ００００ダルトンの分子量範囲の蛋白の分離、（２）存在する蛋白電気泳動装置 及び蛋白検出技術との融和性、（３）取扱いの容易な適度の粘度、（４）容易な サンプル採取のための低温におけるゲルの溶融及び（５）　ポリアクリルアミド ゲルで用いられる有毒成分の回避乞与える。

一つの好ましい態様において、ここで開示されたようなゲルシステム（工、分割 ゲルとして、（Ａ）　ヒドロキシ−Ｃ，、−アルキル化アガロース及び（Ｂ）１ ．２−ジヒドロキンプロピルアガロースのブレンドを含み、そのアガロース成分 の少くとも１種好ましくはヒドロキシアルキル化アガロースは、好ましくは酸加 水分解又はガンマ線照射さらに好ましくは後者により解重合されている。

本発明の分割ゲル組成物（比較的小さい孔を有する）は、重ねられた又は隣接の 積層ゲル（比較的大きい孔を有する）と組合わされ、組合わせは、本発明の他の 態様である「ゲルシステム」を形成する。積層ゲルと組合わさった分割ゲルを形 成且つ利用する技術は、当業者にとり周知である。分離されるべき生物学的材料 は、適切な緩衝剤に懸濁され、電気泳動装置内で小さい（より小さい）孔の分割 ゲル上に重ねられた大きい（より大きい）孔の積層ゲル中の穴に適用される。積 層ゲルのイオン組成及びｐＨＧ！、電極緩衝剤（即ち「ランニング」緩衝剤）か らゲル（即ち「トノ−リング」イオン）へ移動するイオンが、す／プル分子又は 積層グル（即ち「リーディング」イオン）より低い移動度を有する。サンプルは 、リーディング及びトレーリングイオン先端の間のサンプル先端の位ｇ１ｒｃよ りｎＩ層ゲルを通るサンプル「先端」の運動中、次第に圧縮（即ち積層）される 。積層及び分割ゲルの界面で、条件は、通常緩衝剤のイオン強度及びｐＨ並びに ゲルの孔径の１ｍ（又は好ましくはそれより多い）が変化し℃、トレーリング先 端をしてサンプル分子（次に「積層されない」）の先に促進しそして移動させる 。サンプルは、非常に薄いゾーンに圧縮されるよ５になって、全サンプルは大体 同時に分割ゲルに入り、その結果、？／プルが分割ゲル中の電気泳動の間、分子 量により分離されるとき、ｆ７プル中の異なる物質がシャープなバンドとして分 割される。

上記のＬａｅｍｍｌ　ｉ　１ｃ７１０え℃、積層ゲルの優れた解説が、「Ｇｅｌ 　Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ　ｏｆ　ＰｒｏｔｅｉｎｓＪ、Ｈａｍｅｓ、 　Ｂ、Ｄ、及びＲｉｃｋｗｏｏｄ、Ｄ、　（編）、　Ｉ　ＲＬ　Ｐｒｅｓｓ、ワ シントン、Ｄ、Ｃ，（１９８１）、７−１７ページに見い出されろ。積層ゲル技 術及び理論の他の記述は、ｏｒｎｓｔｅｉｎ、Ｌ、　−Ｄｉｓｃ　Ｅｌｅｃｔｒ ｏｐｈｏｒｅｓｉｓ　−Ｉ　Ｂａｃｋｇｒｏｕ　。

ｎｄ　ａｎｄ　Ｔｈｅｏｒｙ　”　、　Ａｎｎａｌｓ　Ｎ、Ｙ、Ａｃａｄ　ｏｆ 　５ｃｉｅｎｃｅｓ、　１２１　：　３２１−３４９（１９６４）　；Ｄａｖｉ ｓ、Ｂ。

−Ｄｉｓｃ　Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ−［Ｉ　Ｍｅｔｈｏｄ　ａｎｄ　 Ａｐｐ目Ｃａｔｉｏｎ　ｔｏ　Ｈｕｍａｎ　Ｓｅｒｕｍ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　− ＋　Ａｎｎａｌｓ　Ｎ、Ｙ。

Ａｃａｄ、５ｃｉｅｎｃｅｓ　、　１２１　：４０４−４２７（１９６４）；、 Ｔｏｖｉｎ、Ｔ、、ｅｔ　ａｌ、、　−Ｍｕｌｔｉｐｈａｓｉｃ　Ｂｕｆｆｅｒ 　ＳｙｓｔｅｍｓＯｕｔｐｕｔ　”　、　Ｕ、Ｓ、　Ｇｏｖｅｒｎｍｅｎｔ　Ｐ ｒｉｎｔｉｎｇ　０ｆｆｉｃｅ　ＮＴｌ５　ｎｏ、１９６０８５−１９６０９２ 及び２０３０１６（１９７０）；及びＪｏｖｉｎ　、　Ｔ、　”Ｍｕｌｔｉｐｈ ａｓｉｃＺｏｎｅ　Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ”、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔ ｒｙ＋１２　：　８７１−８９８（１９７３）に見い出されるだろう。

分割ゲル緩衝剤及び積層ゲル緩衝剤は、緩衝剤の差が、本発明のゲルシステム内 の分割及び積層ゲルの間に存在するのに違いない不連続性の唯−又は一部の源と して望まれるかどうかに応じて、同じか又は異なる。積層ゲルシステム内で有用 であることが知られているすべての緩衝剤は、ここで有用であり、そしてこれら の緩衝剤の広範な（しかし不完全な）リストは、Ｊｏｖｉｎ＋　Ｄａｎｔｅ　ｒ ＆　Ｃｈｒａｍｂａｃｈ、　Ａ　Ｍｕｌｔｉｐｈａａｉｃ　Ｂｕｆｆｅｒ　Ｓｙ ｓｔｅｍｓＯｕｔｐｕｔ″、Ｕ、Ｓ、　Ｇｏｖｅｒｎｍｅｎｔ　Ｐｒｉｎｔｉｎ ｇ　Ｑｆｆｉｃｅ＋ＮＴｌ５　４１９６０８５−１９６０９２、２０３０１６（ １９７０）に見い出され、そのリストはここに参考文献として引用される。

好ましい緩衝剤は、分割ゲルにはトリス−ボレートであり、積層ゲルにはトリス −ＭＣＩであり、トリス−グリシンは電極緩衝液に用いられる。しかし、すべて の生物と融和性の緩衝剤の１種以上が、前記の３種について働くだろう。同一の 緩衝剤は、（そう人した）積層ゲル緩衝剤が不連続のとき、電極緩衝剤及び分割 ゲル緩衝剤に使用できる。もしそれらのものがゲルシステム内の必要な不連続性 に関する他のベース例えば孔径であるならば、単一の緩衝剤も又隣接のゲルに使 用できる。同一の緩衝剤が用いられるとき、それは、必要な不連続性を作るため に、イオン強度（即ち濃度）に関して変化できる。

ｐｉｆ　（本発明の目的のためにそれ自体適切な不連続性である）は、同一の緩 衝剤を用いて変化できる。Ｗｅ　ｂ　ｅ　ｒ及び０＋ｂｏｒｎにより開示された ような燐酸ナトリウム緩衝剤は、トリスを肯換する他のアミン例えばトリエタノ ールアミン、トリエチルアミンなどと同じく、使用できる。他の好適な緩衝剤は 、ヒスチジン、イミダゾール及びリジンである。もし陰イオンが緩衝剤ならば、 陽イオンは緩衝剤ではな（、アルカリ金属又は第四級アミンである。アンモニア は使用できるが、揮発性のために好ましくない。二価陽イオンは、分離されるサ ンプルとの相互反応の可能性のために好ましくない。

陰イオンは、緩衝陽イオンと用いられるとき、しばしば緩衝的ではない。例は、 サルフェート、クロリド、アセテ−）（ｐＨ８のときのようＫ、しばしば緩衝的 ではない）などである。緩衝陰イオンも又使用できる。例は、ホスフェート、シ トレート及びカーボネート／バイカーボネートである。−価に荷電した陰イオン が、普通好ましい。

双性イオ／は、それらが強くめられて（・る、特に積層ゲルに用いられる。グリ シンは、特にトン−リングイオンとして使用できる。「Ｇｏｏｄの緩衝剤」例え ば）ＩＥＰＥＳは、しばしば双性イオンであり、ｐＨに応じて積層ゲル又はゲル システムの他の部分の何れかに使用できる。古典的なＫｏｌｒａｕｓｃｈ積層は 、トレーリングイオン（必ずしもそうではないがしばしば双性イオン）に依存し 、境界の上の低い移動度の状態から境界を超えた高い移動度の状態に動くことに 注意すべきである。Ｋｏｌｒａｕｓｃｈの積層は、本発明内に含まれ、しかし、 Ｋｏｌｒａｕｓｃｈの概念を概念的に十分に超えて拡大する。グリシン（アミン 酢酸）は、ｐＨ６，８で十分に双性イオン的であり、２個のピークの間の大体中 点であって、従って低い移動度を有する。ｐＨ８で、即ち境界の下で、アミンは 部分的に脱プロトン化され、従ってグリシンの移動度は鋭く増ス。例えば、ＭＯ ＰＳ　（３−Ｎモルホリノエタンスルホン酸→はスルホン酸及び第三級アミンを 有し、ｐＨ７゜２のそのアミンピークを経て動く移動度を増す。これらの化合物 を用いるシステムのデザインは、前記のＪｏｖａｎ、　Ｄａｎｔｅ及びＣｈｒａ ｍｂａｃｈ　（１９７０）　Ｋ説明されているように、周知である。

本発明の分割ゲル、ゲルシステム及びキットにより電気泳動法で利用される電極 緩衝剤は、当業者にとり既に周知のものであり、本発明の一部を形成しない。こ れら電極緩衝剤は、それ自体Ｋｏｌｒａｕｓｃｈによりイオン強度又は組成又は ｐＨについて積層ゲル緩衝剤から不連続であるが、そうでなければならないこと はない。

積層ゲルそれ自体は、前記の多糖類の少くとも１種であり、アガロース又は誘導 体化アガロースが好ましい。

それは、高いゲル強度並びに低い負とやや正との間の電気内方浸透（′ＥＥＯ） 値を有すべきである。特に有用なのは、そのＥＥＯ値が（−）　０．１５−　（ 十）　０．０５、好ましくは（−）　１．ｏ　−（十）　０．０５、より好まし くは（−）０．０３−　（十）　０．０３、最も好ましくは零に接近（例えば± ０．０１）のｍｒを有するゲルシステムである。

本発明による積層ゲルに有用な材料は、ここで規定されたような任意の多糖類を 含む。特に有用なのは、低いＥｇｏを有するか又は中性であるか又は僅かに正で すらある市販又はそれ以外に入手可能なアガロース又は誘導体化アガロースゲル 、例えば等電点フォーカシングに有用であることが既に知られて（・るもの、好 ましくは又高いゲル化温度を有するものである。これらゲルは、ＤＥＡＥ−Ｃジ エチルアミンエチル〕−アガロース〔即ちＣＥＤ（クロロエチルジエチルアミン ）により処理されたもの〕、ＥＤＡＣ［１−エチル−３（３−ジメチルアミノプ ロピル）カルボジイミド塩酸塩］処理イオン交換アガロース並びにアガロースゲ ル例えば米国特許第４３１２７３９及び４３１９９７５号（この両者は、ここで 参考として引用される）に開示されたものを含む。

従って、ボレート含有緩衝剤システム中のアガロースブレンドの６％溶液は、蛋 白サンプル混合物を濃縮するために、零から僅かに正の電気内部浸透を有する１ ％積層ゲルを用いて、垂直なゲルとして、代表的には注型される。

アガロース溶液のゲル化後、ゲル媒体は、電気泳動分離を行うのに用いられ、次 に通常のやつ方で処理される。電気泳動のため積層ゲルと組合わせる分割ゲルを 用いる技術は、一般に周知であり、それ故詳しい記述はここで繰返す必要はない 。得られる蛋白分離パターンは、橋かけ結合ポリアクリルアミドゲルで得られる ものに匹敵するＯ （資）第三の態様において、本発明は、ＣＩ）緩衝剤を有する予め緩衝した分割 ヒドロゲル又はゲル溶液又は予め測定したゲル粉末、及び〔■〕緩衝剤を有する 予め緩衝した積層ヒドロゲル又はゲル溶液又は予め測定したゲル粉末（任意に特 に積層ゲル中の指示薬として有効量で存在する色指示薬とともに、そして任意に ％に分割ゲル中の前記の１種以上のポリオールとともに）を、それぞれが別々の コンテナー中に含まれるキットよりなる。代表的に、分割ゲル水溶液は、８．５ のｐＨのトリス−ボレート緩衝液中の６％アガロース本発明分割ゲル組成物より 主としてなり、そして積層ゲル水浴液は、５關ｍ／ｍのフェノールレッド色指示 薬とともに、６．８のｐＨのトリス−ＭＣＩ緩衝液中の１．５％アガロース積層 ゲル組成物より主としてなる。本発明のゲルシステムは、次に各溶液を加熱し、 それを連続的に予め加温したカセットに注いで二層を形成することにより製造さ れる。なお他の態様として、本発明のキットは、他の物理的アクセサリ−ととも に、代表的には０．７５　Ｋｍ、１．０　ｍ及び１．５關の徨々の厚さの積層ゲ ルスペーサーよりなる。これらのスペーサーがゲル注型で用いられて、周知のや り方で、積層ゲルと分割ゲルとの間の滑かな界面を生ずる。キットは、又別々の コンテナー中に、製造された電極又はサンプル緩衝剤などを含むことができる。

前記のキットを用（・て注型した、組合わせたゲル組成物は、１０に一２００ｋ ＤＭＷの範囲のＳＤＳ処理蛋白の優れた分離を行う。

実施例１゜ アガロース積層ゲルシステムの製造 Ａ８分割ゲル 二成分の完全にアガロースの小孔分割ゲルを製造した。成分１は、粉末状ヒドロ キシアルキル化アガロース（ＳｅａＰＩａｑｕｅ、　ＦＭＣＢｉｏＰｒｏｄｕｃ ｔｇ、　Ｒｏｃｋｌａｎｄ、　Ｍａｉｎａ０４８４１、米国の製品）を６００ｍ Ｒの照射量でガンマ線照射して４％水溶液の粘度を７５℃で３０ｃｐｓ４０ｃｐ ｓに低下させることにより製造された。成分２は、米国特許第４３１２７２７号 の実施例１に記載されたアガロースの１．２−ジヒドロキシプロピル誘導体（グ リセレート化アガロース）であった。

成分１及び２０両者を５０　／　５０　（ｗ／ｗ　）の比でブレンドし、ＨＣＩ によりｐＨ８，５に調節した０、５Ｍ）リス及び０．１６Ｍホウ酸を含む緩衝液 ９４ゴに溶解した。７５℃における得られる溶液の粘度は、４００　４５　Ｏｃ ｐｓ内であった。さらに、得られるアガロースブレンドは、取扱い可能なゲルの 注型及び蛋白の採取のための方法を可能にする低いゲル化（２４−２８℃）及び 再溶融（６５℃）温度をともに有した。

Ｂ、積層ゲル 大きな孔のアガロース積層ゲルは、米国特許第３５０７８５１号の実施例ＩＫ記 載されたジエチルアミノエチルアガロース誘導体から製造され、それは、水酸化 ナトリウムの存在下アガロースと１−クロロ−２−ジエチルアミノエタンとの反 応により製造される。１％溶液を、約１００ｍｔの０．２５Ｍ）リスーＭＣＩ緩 衝液ｐＨ８，８中に１２のこのアガロース誘導体を溶解することにより製造した 。得られた積層ゲルは、適用した蛋白をして小孔のアガロース分割ゲルに入る前 に狭いバンドに濃縮させた実施例２゜ 標準蛋白マーカー及びＥ、　ｃｏｌｔ蛋白の電気泳動ゲルの液化：実施例１にそ れぞれ記載された小孔アガロース分割ゲル及び大孔積層ゲルを含む別々の可撓性 成を、それらの内容物を液化するために、５−１Ｏ分間９５℃の水浴に入れた。

各版は、注型前に攪拌された。

カセット・アセンブリー二垂直の注型カセットを次のやり方で組立てた。ｌ　ｒ ｎｔの脱イオン化蒸留水を、注型カセットのガラスバッキングプレート（１４０ ｍｓＸ１６０１翼）においた。１面の親水性面を有する一片のプラスチック支持 フィルム（Ｇｅ１Ｂｏｎｄ、　ＦＭＣＣｏｒｐｏｒａｔｊｏｎｌＢｉｏＰｒｏｄ ｕｃｔｓ　Ｇｒｏｕｐ、　Ｒｏｃｋｌａｎｄ、　Ｍａｉｎｅ　Ｏ４８４１、米国 の製品）を頂部に置き、ゴムローラーを用いて平らにした。２面のスペーサー（ １４０ｉａａＸ　Ｉ　Ｑ＋ｎ＋Ｘ　１　ｔｘ　）を次にＧｏ　Ｉ　Ｂａｎｄフィ ルムに置いた。ノツチ付トップブレートをスペーサーの頂部に置き、カセットを その縁で１′の静止クランプにより締めつけた。積層スペーサー（１４Ｑｓ＋ｘ Ｘ　３５０Ｘ　１關）を、最適の積層効果のためＫ、サンプル穴の底と分割ゲル と積層ゲルとの界面との間に積層ゲルを注型するのに１０鶴の最小の空間を占め るようにそう人した。一度組立てると、カセットを赤外線ランプの６−８インチ （１５，２５Ｘ　２０．３ｃｍ）下に置くことにより６５−７０°Ｃに加温した 。

分割ゲルの汗型：カセットの両側の頂部のクランプを取り去った。ミクロスパチ ュラを注意深くそう人し、カセットの開口を僅かに拡げるようにひねった。液化 分割ゲル溶液を、瓶から液化混合物をおだやかにしぼり出すことにより、加温し たカセットに注意深く導入した。気泡の生成を避けるために注意した。スパチュ ラを取り出し、頂部のクランプを戻した。ゲルを室温で３０分間冷却した。冷却 後、大きな底部のクランプをカセットの頂部に置き、カセットを１８０°逆にし た。頂部の側のクランプを次に取り去り、積層スペ−サーを取り去った。頂部の 側のクランプを次に元に戻した。

積層ゲルの注型：０．００６〜／　ｍｌのフェノールレッド追跡染料（リーディ ングイオン先端と移動する）を含む０．１２５Ｍ）リス緩衝液ｐＨ８，８中のア ガロース積層ゲルを用（・た。液化積層ゲル溶液を、瓶からゲル溶液をおだやか Ｋしぼり出すことにより、カセット中の積層ゲルのスペース中に注意深く導入さ れた。気泡の生成を避けた。直ちに、鶏冠を深さ５龍で積層ゲル中にそう人した 。積層ゲルを室温で５分間置き、全カセットを次に３０分間４℃で冷凍した。冷 却後、ゲルを約２０分間室温で加温させ、次にすべてのクランプを取り去りそし てカセットを逆を頂部にして平らに置いた。鶏冠をおだやかに取り出した。

サンプルの調製：蛋白のサンプルを、０．０６Ｍ）リス緩衝液ＨＣＩ、　ｐＨ６ ，８；　２％ＳＤＳ、１０％グリセロール；１％２−メルカプトエタノール；０ ．０２５％フェノールレッド；０．２５％ブロモフェノールブルーよりなるトリ ス−３ＤＳ−蛋白サンプル緩衝剤中に懸濁した。マーカー蛋白の原料溶液は、１ −の蒸留水中それぞれの蛋白１０■よりなる。処理溶液は、１０Ａｌの合わせた 原料溶液±１００μ杉のサンプル緩衝剤＋２８０μｌの蒸留水を希釈し、４分間 ９０℃で加熱し、冷却しそして室温で貯蔵することにより製造した。１０μｌを １穴当り用いた。１大当りに用いられる全蛋白は、２５０　ｎｆに等しかった。

下記の蛋白を分子量マーカーとして用いた（ダルトン）。ミオシン（２１２００ ０）、Ｉ−ガラクトシダーゼ（１１６０００）、ホスホリラーゼｂ（９２５００ ）、ウシ血清アルブミン（６８０００）、カタラーゼ（５７５００）、オバルブ ミン（４３０００）、炭酸脱水酵素（２９０００）、大豆トリプシン阻害剤（２ ０１００）、ミオグロビン（１６９５０）、リゾチーム（１４３００）、チトク ロームＣ（１１７００）及びアプロチニン（６５００）。Ｅ、　ｃｏｌｉ水溶性 蛋白の全細胞標品も又製造した。１００ｍ１のＬＢグロス（Ｄ目ｃｏｆ）ｐ品） を作り、新しく調製した単離プレートからＥ、ｃｏｌｉを接種した。ブロス培養 物を２４時間インキュベートし、次に５００Ｏｒｐｍ１５分間の遠心分離により 採取し、ペレットを蒸留水により洗い、再懸濁し、ＩＱｍＪの蒸留水中で４×１ ５秒間超音波処理した。１５分間５０００ｒｐｍで遠心分離し、上澄み液を１バ イアル当り３００μΔずつ分け、冷凍した。用いるに当って、冷凍物を解凍し、 １００μｊのサンプル緩衝剤（前記）を加えた０バイアルを次に４分間９０℃で 加熱した。バイアルの内容物は、室温で１週間貯蔵可能であった。

利用した電気泳動法二カセットを５ｔｕｄｉｅｒタイプ垂直電気泳動装置にクラ ンプした。電気泳動は、２−３時間２５ｍＡの定常電流で、トリス−ボレート電 極緩衝剤〔０，０５Ｍ）リス、ベース；０．０９Ｍホウ酸；０．１％ＳＤＳ、Ｐ Ｈｓ３）で行われた。積層ゲル中に含まれたフェノールレッド追跡染料が分割ゲ ルの底部に達したとき、電気泳動は完了した。サンプル緩衝剤に存在する参考追 跡染料（ブロモフェノールブルー）を通常用いて、サンプル蛋白の相対的移動度 （Ｒｔ）を計算した。

染色及び乾燥：蛋白を固定し、室温で４時間又は１晩水性Ｃｏｏｒｎａｓｓｉｅ 染色溶液（４０％メタノール及び１０％酢酸中０．０５％Ｃｏｏｍａｓｓｉｅブ リリアントブルーＲ−２５０よりなる）により染色した。それらを次に４０％メ タノール、１０％酢酸中で２−４時間脱色した。それらを次に１時間保存浴、５ ％グリセロールに置き、ゲルをガラスプレートにクランプし、ゲルを外に出し、 それを１晩風乾させることにより、乾燥させた。

乾燥したゲルは、蛋白標準及びＥ、　ｃｏｌｔ蛋白の両者の非常に分割された蛋 白パターンを含み、従って本発明のゲル組成物が低分子量蛋白のふるい分けに有 効であったことを示した。

実施例３゜ 本発明のアガロースブレンド積層ゲルシステムの製造Ａ、小孔分割ゲル（照射解 重合）： 成分１は、ヒドロキシ−〇〇−アルコキシル化アガロース粉末（５ｅａＰ１ａｑ ｕｅ、　ＦＭＣＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎｌＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ　Ｇｒｏｕｐ 、　Ｒｏｃｋｌａｎｄ、　Ｍａｊｎｅ　０４８４１、米国の表品）であった。

成分２は、１，２−ジヒドロキシプロピルアガロース粉末（米国特許第４３１２ ７２７号実施例１に記載されたグリセレート化アガロース）であって、次に照射 重合された。解重合は、粉末を６００ｍＲの照射量でガンマ線照射することによ り行われ、それは３％溶液の粘度を７５℃で３Ｏ−４０ｃｐｓに低下させた。

成分ｌ及び２をｌ　：　ｌ　ｗ／ｗの比でブレンドし、６ｆのブレンドを０．４ Ｍホウ酸を含む０．５Ｍトリスペース緩衝液ｐＨ８，５の１００ｍ１に溶解した 。７５℃における得られたブレンド溶液の粘度は、４００　６００ｃｐａ内であ った。アガロースブレンドは、低いゲル化（２４−２８℃）及び低い再溶融（６ ５−７０°Ｃ）温度の両者を有し、取扱い可能なゲルの注型及び蛋白採取のため の製造を可能に１．た。

Ｂ、太孔積層ゲル 実施例１のゲルシステムの組合わせの変法として、ｐＨ６，８の０．１２５Ｍ） リスーＭＣＩ緩衝液中の１．５％ＥＤＡＣアガロースを積層ゲルとして用いた。

ｐＨにおける不連続性は、希釈蛋白サンプルの「積層」を改善した。アガロース の％の増大は、ゲル強度を増大テセそしてサンプル鶏冠の容易な取り出しを行う ために実施され、積層ゲルＢは、上記の実施例２に似たやり方で分割ゲルＡＫ隣 接して重ねられた。得られるゲルＢは積層ゲルであり、それはその中に導入され る蛋白をして小孔アガロース分割ゲルＡに入る前に狭いバンドに！ＩＪｌｉｆＬ だ。ＥＤＴＡを１ｒｎＭの最終濃度になるように、分割ゲル及び積層ゲルの両者 の緩衝液に加えて、貯蔵中機生物の生長に対する阻害剤として働いた。この低い 濃度で、ＥＤＴＡは、本発明のゲルシステムを用いる蛋白の分離に効果がなかっ た。

実施例４゜ 本発明のアガロースブレンド積層ゲル／ステムの製造Ａ、小孔分割ゲル（熱解重 合） 成分ｌは、ヒドロキシ−Ｃ２，４−アルコキシル化アカロース粉末（５ｅａＰ１ ａｑｕｅ、　ＦＭＣＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、　ＢｉｏＰｒ。

ｄｕｃｔｓ　Ｇｒｏｕｐ、　Ｒｏｃｋｌａｎｄ　、　Ｍａｉｎｅ　Ｏ４８４１ｒ 米国の製品）であって、それはそれを密封瓶に入れ、それを５２時間１００℃で 乾熱することにより熱解重合した。

解重合は、３％溶液の粘度を７５℃で５−１５ｃｐｓに低下させた。

成分２は、１，２−ジヒドロキンプロピルアガロース（米国特許第４３１２７２ ７号実施例１に記載したようなグリセレート化アガロース）であった。

成分１及び２をｌ：１ｗ／ｗの比でブレンドし、６１のブＶンド乞実施例３のパ ートＡで用いた緩衝剤ベース１００ｒｒＬｔに溶解した。得られた溶液の粘度を 工、７５℃で４００−６００　ｃｐｓであった。アガロースのブレンドは、低い ゲル化（２４−２８°Ｃ）及び低い再溶融（６５−７０℃）温度の両者を有し、 取扱い可能なゲル注型及び蛋白採取の方法を可能にした。この小孔分割ゲルそれ 自体に１本発明の一つの態様を構成し、そして大孔積層ゲルと組合わせて利用し たとき、他の態様を画成する。

Ｂ、大孔積層ゲル 上記の実施例３パートＢに似たやつ方で、ＥＤＡＣアガロース積層ゲルを製造し た。１５％浴液は、１００ｍ１の０．１２５Ｍトリｙ、　−ＨＣｌ緩衝液ｐＨ６ ，８中１１１Ｃ１，４Ｍ’ｆ７）このアガロース誘導体を溶解することによつ製 造された。得られるケルＢは、積層ゲルであり、それはそれに導入される蛋白を 、小孔アガロース分割ゲルＡに入る前に狭いバンドに濃縮した。１ｍＭの最終濃 度１ＣＥＤＴＡを、分割ゲル及び積層ゲルの両者の緩衝液に加えて、貯蔵中の微 生物の生長に対する阻害剤として働いた。この低い濃度で、ＥＤＴＡは、本発明 のゲルシステムを用いる蛋白の分離に効果がなかった。

実施例５ 実施例生成物の比較 各生成物について相対的移動度（範囲０．０−１．０　）　Ｋ対する分子量（範 囲ｌＸｌ０”）を比較することにより、実施例１．３及び４の分割ゲル生成物間 の比較を行った。成分１として照射解重合したヒドロキシ−Ｃ２−２−アルコキ シル化アガロースを含む組成物について８個の値〔実施例１〕；成分１として熱 解重合したヒドロキシ−Ｃ２−４−アルコキシル化アガロースを含む組成物につ （・て１０個の値〔実施例４〕並びに成分２として照射解重合した１、２−ジヒ ドロキシプロピルアガロースを含む組成物について１０個の値〔実施例３〕をプ ロットすると、得られる曲線は統計上同じであった。すべての実施例の小孔分割 ゲルに関する物理的特性の重複も又注目された。

上記の分析に基づいて、本発明の小孔分割ゲル組成物は、１種の成分の解重合の やり方にかかわらず、そして２種の成分の何れかが解重合したか罠かかわらず、 等しく有効であったと結論された。

実施例６゜ 本発明の分割ゲルからの蛋白の溶離 １４Ｃラベルしたウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）　を、実施例ＩＡに従って製造 した分割ゲル組成物中で電気泳動した。ゲルサンプルを次にゲルの固定又は染色 なしに切り出し、次いでｌ　：　９　ｖ／ｖの比の５０　ｍ　Ｍ　）リス−ＨＣ ｌ、１ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ８を含む水溶液と混合した。それを次に周知の技術に より「凍結／圧搾」し、その結果９０％より多い放射能をラベルしたＢＳＡを液 体上澄み液中で回収した。これは、１００μ２の蛋白についても同じであり、希 釈緩衝液へのＩＭＮＪＬＣＩ又は１％ＳＤＳの添加の有無にかかわらず同じであ った。

利用したＦ凍結／圧搾Ｊ法において、ゲル組成物の希釈は、−２０又は−７０℃ の凍結をともない、さらに４℃で１０−２０分間１３０００Ｇでの遠心分離をと もなった。これは、大体直線的関係でゲル組成物の希釈をともなう容量を含んだ 液体上澄み液を生じた。即ち、１：１の希釈（３％のゲルを生成）では、大体５ ０％の容積が、凍結／圧搾後液体として回収された。１：９の希釈（０２６％の ゲルを生成）では、約９０％の容積が、凍結／圧搾後液体として回収された。

蛋白がゲル組成物に固定しく４５％メタノール、１０％酢酸）、Ｃｏｏｍａｓｓ ｉｅブルーにより染色し、次に脱色したとき、その何れもこのやり方によりゲル 組成物から溶離しなかった。しかし、希釈緩衝液にＳＤＳを加えることにより、 ９０％迄の蛋白が回収できた。最後に、固定されていない蛋白が凍結／圧搾法に より回収され次にアセトン沈澱により濃縮されたとき、それらは未回収の「普通 のＪ蛋白と同様に電気泳動した。１００ｋＤ以下の蛋白は、特にこのやり方でう まく行われた。

実施例７゜ ゲル組成物の貯蔵安定性 実施例ＩＡによる本発明の分割ゲル組成物の安定性の５個月の研究が行われた。

ゲル組成物を４℃及び２３°Ｃ（外界）の温度で貯蔵した。４℃における貯蔵が 最適に見えたが、貯蔵５個月後、同様にして製造した新鮮なサンプルと比較した とき、２種のゲル組成物のふるい分は性に、もしあるとしても差は殆んど観察さ れなかった。

実施例８−１２゜ 分割ゲル組成物における変動 下記のそれぞれ単一の成分のアガロース分割ゲル組成物６７をｐＨ８，５の０． ５Ｍ１−リス及び０．４Ｍホウ酸を含む緩衝液１００１ｄに溶解した。７５℃に おける得られた溶液の粘度は、４００　６００ｍＰａ　の範囲内であった。単一 の成分ゲルを実施例３に記載したゲルシステム中の分割ゲル成分として用（・た 。得られる分割ゲルは、低いゲル化（２４−２８°Ｃ）及び再溶融（６５−７０ °Ｃ）の両者の温度を有したが、ただし実施例９０分割ゲルは、約８５−９０℃ の融点及び約３５−４０℃のゲル化温度を有した。実施例９．１１及び１２の分 割ゲルは、本発明の範囲内にあり、それらは取扱い可能なゲル注型ができ、それ 故蛋白採取の方法を助げた。

実施例８．（比較） 分割ゲル組成物の製造（単一の解重合した本来のアガロース） 一成分分割ゲルを、低い電気内方浸透アガロース粉末（Ｓｅａｋｅｍ　ＬＥ　＋ 　ＦＭＣＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ　＊　ＢｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓＧｒｏｕｐ　、 　Ｒｏｃｋｌａｎｄ　、　Ｍａｉｎｅ　Ｏ４８４１米国の製品）に６００ｍＨの ガンマ線照射を行うことにより製造した。この処理は、３％溶液の粘度を７５℃ で３０−４０　ｍＰａに低下させた。この分割ゲルは、それが少くとも１種の誘 導体化多糖類成分を含まず、そして本発明の範囲内の分割ゲルよりも明らかにふ るい分けできないことから、本発明の範囲外にあった。

実施例９゜ 分割ゲル組成物の製造（解重合前に誘導体化された単一のアガロース） 一成分分割ゲルｉ、１．２−ジヒドロキシ−プロピルアガロース粉本（前記の米 国特許第４３１２７２７号の実施例１に記載されたグリセレート化アガロース） に６００ｍＨのガンマ線照射を行５ことにより製造した。この処理は、３％溶液 の粘度を７５℃で３０−３０−４Ｏに低下させた。

実施例１ｏ、（比較） 分割ゲル組成物の製造（解重合後誘導体化された単一のアガロース） 一成分分割グルを、ヒドロキシ−Ｃ２−１−アルフキモル化アガロース粉宋（５ ｅａｐｌａｑｕｅ　、　ＦＭＣＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ。

Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ　Ｇｒｏｕｐ　、Ｒｏｃｋｌａｎｄ　、Ｍａｉｎｅ　Ｑ ４８４１　。

米国の製品）に６００ｍＨのガンマ線を照射することにより製造した。この処理 は、３％溶液の粘度を７５℃で３０−４０　ｍＰａＫ低下させた。実施例１Ｏは 本発明の範囲外であるが、実施例９及び１０は、−緒になって粘度のコントロー ル（解重合により達成）及びふるい分けのコントロール（誘導体化により達成） ｌＣ関係ないことを示す。

実施例１１゜ 分割ゲル組成物の製造（解重合後誘導体化した単一のアガロース） 一成分分割ゲルを、低い電気内部浸透アガロース粉宋（Ｓｅａｋｅｍ　ＬＥ　、 　ＦＭＣＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ＢｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓＧｒｏｕｐ　、　Ｒ ｏｃｋｌａｎｄ　、　Ｍａｉｎｅ　０４８４１米国の製品）に６００　ｍＲのガ ンマ線を照射することにより製造し、その処理は、３％溶液の粘度を７５℃で３ ０−４０　ｒｒＰａに低下させ、１，２−ジヒドロキシ−プロピル部分を付加し た。

実施例１２゜ 分割ゲル組成物の製造（解重合後誘導体化した単一アガロース） 一成分分割ゲルを、低い電気内部浸透アガロース粉本（Ｓｅａｋｅｍ　ＬＥ　、 　ＦＭＣＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ＢｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓＧｒｏｕｐ、Ｒｏｃ ｋｌａｎｄ、Ｍａｉｎｅ　Ｏ４８４１、米国の製品）に６００ｍＲのガンマ線を 照射しくこの処理は、３％溶液の粘度を７５℃で３０−３０−４Ｏに低下させる ）次にヒドロキシ−Ｃ！−４−アルコキシル化部分の付加により製造した。

実施例１３゜ 分割ゲル組成物の製造（解重合した本来のアガロース＋誘導体化アガロース） 成分１は、低い電気内部浸透の本来の（誘導体化されていない）アガロース粉本 （Ｓｅａｋｅｍ　、　ＦＭＣＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ　、　Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃ ｔｓ　Ｇｒｏｕｐ　、　Ｒｏｃｋｌａｎｄ　、　Ｍａｉｎｅ０４８４１　、米国 の製品）に６００ｍＲのガンマ線照射により製造した。この処理は、３％溶液の 粘度を７５℃で３０−３０−４Ｏに低下させた。

成分２は、１，２−ジヒドロキシ−プロピルアガロース（グリセレート化アガロ ース、前記の米国特許第４３１２７２７号の実施例１に記載）であった。

両方の成分を１：１（ｗ／ｗ）の比でブノンドし、６１を１００ｒｆＬｔのｐＨ ８，５の０．５Ｍ）リス及び０．４Ｍホウ酸を含む緩衝液に溶解した。７５℃の 得られた溶液の粘度は、４００−６００　ｍＰａの範囲内であった。さらに、得 られるアガロースブレンドは、低いゲル化（２４−２８℃）及び再溶融（６５− ７０℃〕の両方の温度を有し、取扱い可能なゲルの注型及び蛋白採取の方法を可 能にした。

実施例１４゜ 分割ゲル組成物の製造（解重合した本来のアガロース＋誘導体化アガロース） 成分ｌは、低い電気内部浸透の本来（誘導体化されていない）のアガロース粉本 （Ｓｅａｋｅｍ　＋　ＦＭＣＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ 　Ｇｒｏｕｐ、Ｒｏｃｋｌａｎｄ　、Ｍａｉｎｅ　０４８４１、米国の製品）Ｉ Ｃ６００ｍＲのガンマ線を照射することにより製造された。この処理は、３％溶 液の粘度を７５℃で３０−３０−４Ｏに低下させた。

成分２は、ヒドロキシ−Ｃ２−４−アルコ粉本ース粉宋（５ｅａｐｌａｑｕｅ　 、　ＦＭＣＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ　、　Ｂｉ。

ｐｒｏｄｕｃｔｓ　Ｇｒｏｕｐ　、　Ｒｏｃｋｌａｎｄ　、　Ｍａｉｎｅ　Ｏ４ ８４１ｒ米国の製品）であった。

両者の成分を１：１（Ｗ／Ｗ）の比にブレンドし、６２をｐＨ８，５の０．５Ｍ トリス及び０．４Ｍホウ酸を含む緩衝液１００ｍｔｖｃ溶解した。７５℃に２け る得られた溶液の粘度に、４００−６００ｍＰａ　の範囲内であった。さらに、 得られたアガロースブレンド（工、低いゲル化（２４−２８℃）及び再溶融（６ ５−７０℃）の両方の温度を有し、取扱い可能なゲルの注型及び蛋白採取の方法 を５Ｔ能にした。

実施例１５゜ 分割ゲル組成物の製造（解重合後の誘導体化したアガロース） 成分ｌは、低い電気内方浸透の本来（誘導体化されていない）アガロース粉本（ Ｓｅａｋｅｍ　、　ＦＭＣＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ＋Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ　 Ｇｒｏｕｐ、Ｒｏｃｋｌａｎｄ、Ｍａｉｎｅ　０４８４１、米国の製品）に６０ ０ｍＨのガンマ線照射を行い（この処理は３％溶液の粘度を７５℃で３０−３０ −４Ｏに低下させる）、次に１，２−ジヒドロキシ−プロピル部分の付加により 製造された。

成分２は、ヒドロキシ−０２−４−アルコキシル化アガロース粉本（５ｅａｐｌ ａｑｕｅ　、　ＦＭＣＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｂｉ。

ｐｒｏｄｕｃｔｓ　Ｇｒｏｕｐ、Ｒｏｃｋｌａｎｄ、Ｍａｉｎｅ　０４８４１、 米国の製品）であった。

両方の成分を１：１（ｗ／ｗ）の比でブレンドし、６２をｐＨ８，５の０．５Ｍ ）リス及び０．４Ｍホウ酸を含む緩衝液ｌＯＯｍｔに溶解した。７５℃における 得られた溶液の粘度は、４００−６００ｍＰａの範囲内であった。さらに、得ら れたアガロースブレンドは、低いゲル化（２４−２８℃）及び再溶融（６５−７ ０℃）温度の両者を有し、取扱い可能なゲルの注型及び蛋白採取の方法を可能に した。

実施例１６゜ 分割ゲル組成物の製造（解重合後の誘導体化）成分ｌは、低い電気内方浸透の本 来（誘導体化されていない）アガロース粉本（Ｓｅａｋｅｍ　、　ＦＭＣＣｏｒ ｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｒｏｃｋｌａｎｄ、Ｍａｉｎｅ　Ｏ４８４１＋米国の製品） に６００ｍＲのガンマ線の照射を行い（この処理は３％溶液の粘度を７５℃で３ ０−３０−４Ｏに低下させた）、次にヒドロキシエチル部分の付加により製造さ れた。

成分２は、１．２−ジヒドロキシ−プロピルアガロース（グリセレート化アガロ ース、前記の米国特許第４３１２７２７号の実施例１に記載）であった。

両方の成分を１　：　１　（Ｗ／Ｗ）の比でブレンドし、６２をｐＨ８，５の０ ．５Ｍ）リス及び０．４Ｍホウ酸を含む緩衝液１００＋＋＋ＪＶｃ溶解した。７ ５℃における得られた溶液の粘度は、４００−６００ｍＰａの範囲内であった。

さらに、得られるアガロースブレンドは、低いゲル化（２４−２８℃）及び再溶 ＠（６５−７０℃）温度の両者を有し、取扱い可能なゲルの注型及び蛋白採取の 方法を可能にした。

実施例１７ 分割ゲル組成物の製造（解重合した全成分）成分１は、１．２−ジヒドロキシ− プロピルアガロース粉本（グリセＶ−）化アガロース、前記の米国特許第４３１ ２７２７号の実施例１に記載）に６００ｍＲのガンマ線を照射することにより！ ＪＡ造された。この処理は、３％溶液の粘度を７５℃で３０−３０−４Ｏに低下 させた。

成分２は、ヒドロキシ−Ｃ２−４−アルキルアガロース粉末（５ｅａｐｌａｑｕ ｅ　、　ＦＭＣＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ　Ｇｒｏｕｐ 、Ｒｏｃｋｌａｎｄ、Ｍａｉｎｅ　Ｏ４８４１、米国の製品）に６００ｍＨのガ ンマ線を照射することによりａ！遺された。

両方の成分をｉ：ｉ（Ｗ／Ｗ）の比でブレンドし、６１をＩ）Ｈ８，５の０．５ Ｍ）リス及び０．４Ｍホウ酸を含む緩衝液１００ゴに溶解した。７５°Ｃにｉｊ ＋する得られた溶液の粘度は、４００−６００ｍＰａの範囲内であった。さらに 、得られたアガロースブレンドは、低いゲル化（２４−２８℃）及び再溶融（６ ５−７０℃）温度の両者を有し、取扱い可能なゲルの注型及び蛋白採取の方法を 可能にした。

実判例１８゜ 分割ゲル組成物の製造（三成分、−成分解重合）成分１は、ヒトαキシ−Ｃ２− ２−フルコキンル化アガロース粉末（５ｅａｐｌａｑｕｅ　、　ＦＭＣＣｏｒｐ ｏｒａｔｉｏｎ　Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ　Ｇｒｏｕｐ　、　Ｒｏｃｋｌａｎｄ 、Ｍａｉｎｅ　Ｏ４８４１、米国の製品）に６００ｍＲのガンマ線を照射して製 造した。この処理は、３％溶液の粘度を７５℃で３０−３０−４Ｏに低下させた 。

成分２は、１，２−ジヒドロキシ−プロピルアガロース（グリ化）−ト化アガロ ース、前記の米国特許第４３１２７２７号の実施例１に記載）であった。

成分３は、米国特許第３５０７８５１号の実施例２に記載されたような、水酸化 ナトリウムの存在下アガロースとモノクロロ酢酸との反応により調造したカルボ キシメチルアガロースであった。

すべての３種の成分を１：１：１（ｗ／ｗ）の比でブレンドし、６１をｐＨ８， ５の０．５　Ｍ　トリス及び０．４Ｍホウ酸を含む緩衝液１００Ｍに溶解した。

７５℃における得られた溶液の粘度は、　４００−６００ｍＰ　ａの範囲内であ った。さらに、得られたアガロースブノ／ドは、低いゲル化（２４−２８℃）及 び再溶融（６５−７０℃）温度の両者を有し、取扱い可能なゲルの注型及び蛋白 採取の方法な可能にした。

国際調査報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．（Ａ）１種以上のヒドログルであつて、その少くとも１種は誘導体化されて おり、そして独立してその少くとも１種は全分割グル組成物の注型に有効な粘度 を十分に低下させるように解重合され、そして（ｉ）次いで解重合されたヒドロ キシエチルアガロース及び（ｉｉ）１，２−ジヒドロキシプロピルアガロース以 外であり；（Ｂ）水及び （Ｃ）分割グル緩衝剤 を含む水性電気泳動分割グル組成物。 ２．（Ｉ）（Ａ）１種以上の熱及び／又はｐＨ可逆性ヒドロゲルであつて、その 少くとも１種は誘導体化されておりそして独立してその少くとも１種は該分割グ ル組成物の注型に有効な粘度を十分に低下させるために解重合されており； （Ｂ）水； （Ｃ）分割ゲル緩衝剤そして （Ｄ）任意に、約１−５％Ｗ／Ｗの該分割グルであつて、その少くとも１種は低 分子量ポリオールであるを含む分割ゲル組成物； 並びにそれと電気泳動グル操作の組合わせの（ＩＩ）（Ａ）１種以上の誘導体化 されたか又は本来の熱及び／又はｐＨ可逆性ヒドログル； （Ｂ）水及び （Ｃ）積層グル緩衝剤 を含み、孔径、イオン強度、イオン組成又はｐＨの少くとも１種に関して該分割 ゲルから不連続である重ねられた又は隣接の積層ゲル を含む電気泳動不運続積層グルシステム。 ３．（Ａ）（１）少くとも１種の熱及び／又はｐＨ可逆性ヒドロゲル又はその水 性グル溶液又はグル粉末であつて、そのゲルの少くとも１種は誘導体化されてお り、そして独立してそのグルの少くとも１種は分割ゲル組成物の注型に有効な粘 度を十分に低下させるように解重合されており； （２）分割ゲル緩衝剤；そして （３）任意に、少くとも１種の低分子量ポリオールを含む分割グル組成物；並び に （Ｂ）（１）１種以上の熱及び／又はｐＨ可逆性ヒドログル又はその水性ゲル溶 液又はゲル粉末； （２）積層グル緩衝剤；そして任意に （３）色指示薬 を含む孔径、イオン強度、イオン組成又はｐＨの少くとも１種に関して該分割グ ルから不連続な積層グル組成物；並びに （Ｃ）任意に、別のコンテナー中の電極緩衝剤の別々のコンテナー中の組合わせ を含む請求項２の熱又はｐＨ可逆性不連続電気泳動グルンステムを製造するキッ ト。 ４．それぞれの該ヒドロゲルが多糖類である請求項１−３の何れか一つの項の組 成物。 ５．それぞれの該ヒドログルが、アガー、アガロース、アルギネート、カラギー ナン、カードラン、グラン、コンニャク、ペクチン，プルーラン、又はそれらと 、それが電気泳動の条件下で顕著に解離しないようにグル形成重合体と強固に結 合している他の多糖類又は非多糖類重合体の何れかとの組合わせにより形成され るヒドロゲルである請求項１−４の何れか一つの項の組成物。 ６．それぞれの該ヒドログルがアガロースである請求項１−５の何れか一つの項 の組成物。 ７．少くとも２種の該ヒドロゲルが該分割ゲルに存在する請求項１−６の何れか 一つの項の組成物。 ８．該分割ゲルヒドロゲルが、 （ａ）ヒドロキシアルコキシル化アガロース、（ｂ）ジヒドロキシアルキルアガ ロース又は（ｃ）本来のアガロース の１種以上であり、さらに誘導体化されたアガロースのとき、それはその誘導体 化の前又は後の何れかで解重合されている請求項１−７の何れか一つの項の組成 物。 ９．該分割グルヒドログルが、 （ａ）ヒドロキシ−Ｃ２−４−アルコキシル化アガロース及び（ｂ）１，２−ジ ヒドロキシプロピルアガロースの混合物であつて，その少くとも１種がその誘導 体前に解重合されている請求項１−８の何れか一つの項の組成物。 １０．該分割ゲルヒドログルが、 （ａ）ヒドロキシ−Ｃ２−４−アルコキシル化アガロース及び（ｂ）１，２−ジ ヒドロキシプロピルアガロースの混合物であつて、その少くとも１種がその誘導 体化後に解重合されている請求項１−９の何れか一つの項の組成物。 １１．ヒドロキシエチルアガロースが解重合されたヒドログルである請求項１− １０の何れか一つの項の組成物。 １２．１，２−ジヒドロキンプロピルアガロースが解重合したヒドロゲルである 請求項１−１１の何れか一つの項の組成物。 １３．該分割グルの粘度が、３％水溶液中で７５℃で測定したとき、約５−４０ ｃｐｓに低下する請求項１−１２の何れか一つの項の組成物。 １４．前記の粘度低下が、酸加水分解；アルカリ加水分解；接触加水分解；酵素 加水分解；ガンマ線照射；ガンマ線以外の照射；機械的せん断；又は熱解重合の 少くとも１種により行われる請求項１−１３の何れか一つの項の組成物。 １５．前記の粘度低下か、酸加水分解；ガンマ線への照射；又は熱解重合の少く とも１種により行われる請求項１−１４の何れか一つの項の組成物。 １６．該粘度がガンマ線照射により低下する請求項１−１５の何れか一つの項の 組成物。 １７．該粘度が熱劣化により低下する請求項１−１６の何れか一つの項の組成物 。 １８．分割グルの全ヒドロゲル含量が、分割グルの約２−１２％Ｗ／Ｖである請 求項１−１７の何れか一つの項の組成物。 １９．分割グルの全ヒドログル含量が、分割ゲルの約４−８％Ｗ／Ｖである請求 項１−１８の何れか一つの項の組成物。 ２０．重量比ａ：ｂが１：０．１１−９である請求項８−１９の何れか一つの項 の組成物。 ２１．重量比ａ：ｂが約１：１である請求項２０の組成物。 ２２．該分割グル緩衝剤がＨＥＰＥＳ、クリシン、トリス、トリエタノールアミ ン又はトリエチルアミンの少くとも１種を含む請求項１−２１の何れか一つの項 の組成物。 ２３．該分割ゲル後衛剤がホウ酸塩化合物又はコンプレックスを含む請求項１− ２２の何れか一つの項の組成物。 ２４．該分割グル緩衝剤はトリスーボレートであり、該積層ゲル緩衝剤は存在す るときトリスーグリシンであり、そして該電極緩衝剤は存在するときトリスーＨ Ｃｌである請求項１−２３の何れか一つの項の組成物。 ２５．前記の不連続性が、該積層グルの孔より小さい該分割ゲルの孔に少くとも 一部基づく請求項１−２４の何れか一つの項の組成物。 ２６．前記の不連続性が、イオン強度、イオン組成又はｐＨの少くとも１種につ いて、該分割グル組成物と該積層ゲル組成物との間の差に少くとも一部基づく請 求項１−２５の何れか一つの項の組成物。 ２７．該積層グルが、高いグル強度及び低いＥＥＯ値を有するアガロース又は誘 導体化アガロースを含む請求項１−２６の何れか一つの項の組成物。 ２８．該ＥＥＯ値が、（−）０．１５−（＋）０．０５のｍｒを有する請求項２ ６の組成物。 ２９．該ＥＥＯ値が、（−）０．１０−（＋）０．０５のｍｒを有する請求項２ ６の組成物。 ３０．該ＥＥＯ値が、（−）０．０３−（＋）０．０３のｍｒを有する請求項２ ６の組成物。 ３１．該ＥＥＯ値が、零に近ずくｍｒを有する請求項２１の組成物。 ３２．該不連続積層グルが，ＥＤＡＣ−アガロース又はＤＥＡＥ−アガロースで ある請求項１−３１の何れか一つの項の組成物。 ３３．該ポリオールが、分割グル組成物の約１−５重量％で存在する請求項１− ３２の何れか一つの項の組成物。 ３４．該ポリオールが存在し、そしてエチレングリコール、グリセロール、砂糖 、ソルビトール、２００−６００Ｄのポリオキシエチレングリコール又はこれら の混合物である請求項１−３３の何れか一つの項の組成物。 ３５．（Ａ）分割グル組成物が、約８．５のｐＨのトリスーボレート緩衝剤中の ２種のアガロースヒドログルの混合物の６％（分割グルのＷ／Ｖ）よりなり；そ して（Ｂ）積層グル組成物が、約６．８のｐＨのトリスーＨＣｌ緩衝剤中のアガ ロースヒドログルの１．５％（積層グルのＷ／Ｖ）よりなる 請求項３のキツト。 ３６．該分割グル組成物は、さらに約１−５％（分割グルのＷ／Ｖ）で存在する 低分子量ポリオールを含む請求項３６のキット。 ３７．該積層グル組成物は、さらに色指示薬を含む請求項３、３５又は３６の何 れか一つの項のキット。 ３８．注型時分割ゲルと積層グルとの間の滑かな界面を作るのに用いられるよう に適合された種々の厚さの積層グルスペーサーをさらに含む請求項３、３５、３ ６又は３７の何れか一つの項のキット。 ３９．別の分割グル水性組成物及び別の積層グル水性組成物を両者が液化するま で加熱し；一つの液化したグル組成物を注型の型に注ぎ；第一の注いだグルが固 化するとき、残りの液化したグル組成物を同一の型に注いで、グルを電気泳動積 層グルが有効な結合で存在させ；そして前記の残ったグルを固化させることより なる請求項３のキットを用いて電気泳動グルを注型する方法。