JPH04501803A - Ｔａｔタンパク質の阻害剤を検出するための方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ＴＡＴタンパク質の阻害剤を検出するための方法序　論 ＨＩＶ遺伝子発現がｔａｔとして知られろウィルストランス制御タンパク質によ り制御されることは示されていた。本明細書に教示されるように、ｔａｔイナク チベーターとして使用するための物質を選別するための結合アッセイにおいてｔ ａｔタンパクは今使用され得る。そのようなイナクチベーターは後天性免疫不全 症候群〔エイズ（ＡＩＤＳ））の治療に有用であろう。

発明の背景 ＨＩＶ−１遺伝子発現はウィルストランス制御タンパク質、ｔａｔにより正に制 御されることが知られていた（　Ａｒｙａ等、１９８５年、　５ｏｄｒｏｓｋｆ 等、１９８５年）ｏ　ｔａｔタンパク質は１個の５１非コード性エキソンと２個 のコード性エキソンを含む二重にスプライシングされたｍＲＮＡから翻訳される ８６個のアミノ酸のポリペプチドである。

ｔａｔを欠く突然変異体が顕著なレベルのウィルスタンパク質およびｍＲＮＡを 産生じないから、ｔａｔ発現はＨＩＶ複製に必須であると信じられている。ｒｔ ａｔ活性化応答」エレメントはＴＡＲと呼ばれ、長い末端反復（ＬＴＲ）内に位 置し、欠失分析により、転写開始部位に対して領域−１７ないし＋８０ヌクレオ チドに位置しく　Ｒｏｓｅｎ等、その他）、そして低められたレベルまでである が、異種プロモーターにｔａｔ誘導性を付与し得る。

発明の説明 本発明の目的は、ｔａｔタンパク質のＴＡＲへの結合の内在を示すであろうアッ セイを提供することである。

本発明の別の目的は、有用な治療剤を同定する手段としてｔａｔを結合する薬剤 を評価するための方法を提供することである。

本発明のその他の目的は、大量のｔａｔタンパク質を製造するための信頼できる 方法を提供することである。

図面： 図１は、バキュロウィルストランスファーベクターｐＡｃＹＭ１−ｔａｔの構築 の説明図である。ｐ　Ａ　ｃ　ＹＭｌ−ｔａｔを構築するために使用される、ｐ ｌＢＭｌｌ−ｔａｔから誘導されたＢａｍＨ１断片が、参照により本明細書に編 入される米国特許第４７２１６７１号におけるような大腸菌発現ベクターｐＲＥ Ｖ内に挿入された。

図２は、ｔａｔタンパク質を含む大腸菌およびバキュロウィルス系の抽出調製物 がウェスタンプロット分析により決定された結果を示す。

図３は、バキュロウィルスおよび大腸菌調製物の機能的活性がＣＡＴ活性の誘導 化レベルにより決定されるような機能的活性に対して評価された結果を示す。

図４は、上流のＬＴＲ配列をバクテリオファージＴ７ボリメラーゼプロモーター で置換した構築物の説明図である。

図５は、直接結合アッセイが組換えｔａｔのＲＮＡゲル移動度シフト実験におい て′３Ｐ標識８０ｎｔ転写物を用いて示される図面である。遅れたバンドは大腸 菌ｔａｔおよびバキュロウィルスｔａｔ抽出物でのタンパク質−ＲＮＡ複合体を 示す。ｇｐ１６０およびｒｅｖのバキュロウィルス調製物での活性との比較に注 意せよ。

図６は、結合反応の特異性が野生型および突然変異転写物を用いるＲＮＡゲル移 動度シフトアッセイで決定される図面である。

図７はＲＮＡへの結合が過剰の非標識ｗｔ　ＴへＲＲＮＡにより完了されること を示す図面である。

ｔａｔに応答性である配列が転写開始部位のすぐ下流に存在するから、ｔａｔは これらの配列とＤＮＡもしくはＲＮＡレベル、または両方のＩノベルのいずれか で直接または間接に相互作用すると信じられた。ＨＩＶ−１ｍＲＮＡの５′非翻 訳領域が高度に安定なステムループ構造を形成することが予測された（　Ｏｋａ ｍｏｔｏおよびｌｏｎｇ−Ｓｔａａｌ、　１９８６年、　ＦｅｎｇおよびＨｏ１ ｌａｎｄ、１９８８年）、ＨＩＶ−１およびＨＩ　Ｖ−２ＲＮＡ内（７）ＴＡＲ （７）区域はそれぞれ１個および３個のステムループを包含する。全体の配列相 同性＋１ＨＩＶ−１とＨＩＶ−Ｉ　ＴＡＲ（７）間ニホトんど存在せず、そして 予測されたループ内のペンタヌクレオチド反復配列ＣＴＧＧＧが保持されている ことは知られていた。ペンタヌクレオチドモチーフの部位特異的突然変異誘発は ｔａｔ）ランス活性化に前記配列（ＣＴＧＧＧ）が必要であることを示した。予 測されたＴＡＲループ内の配列の認識の必要性の他に、ステムを形成する塩基の 相補性が必須であることが明らかとなった。これは、ＴＡＲ領域の３′境界が進 行性欠失により決定されるように＋４４まで地図作成された理由であると信じら れている。他の５′に伸びる欠失は、ＲＮＡステムループ構造の形成に必要な重 要なレベルを越えて塩基相補性を消失するであろう。（これらの発見の一方で、 ＲＮＡがｔａｔ）ランス活性化における標的であるという認識の支持を総合して 、ＴＡＲ内の配列が十字架構造の形成を介してトランス制御因子とＤＮＡレベル で相互作用するのに必要とされる可能性がまだ残っている。）実施例１ ｔａｔ活性化の機構を調べるために、組換えｔａｔが大腸菌およびバキュロウィ ルスの両方の発現系において・製造された。バキュロウィルス移送ベクターｐＡ ｃＹＭ１−ｔａｔの構築は図１に示されている。ｐ　Ａ　ｃ　Ｙ　Ｍ　１−ｔａ ｔを構築するために使用される、Ｉ）ＩＢＩ３１−ｔａｔから誘導された同一の ＢａｍＨ１断片が大腸菌発現ベクターｐＲＥＶ　（米国特許第４７２１６７１号 ）内に挿入された。この構築において、ｔａｔは、ｔａｔの全体のコード性配列 が続（アミノ末端に大腸菌βグルクロニダーゼの３６個のアミノ酸を含む融合タ ンパク質として発現された。これらの付加的な配列は、大腸菌中に発現された種 々の真核生物の遺伝子産物にタンパク質ならびにＲＮＡレベルで安定性を付与す ることが示されていた（参照した特許参照）。

実　施　例　２ ｔａｔタンパク質を含存する大腸菌およびバキュロウィルスの両方の系からの抽 出物がＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（示していない）ならびにウェス タンプロット分析（図２）により決定された。バキュロウィルスｔａｔは１４． ５および１５．５ｋＤａのダブレットとして移動した。大腸菌は、１５．５ｋＤ ａのマイナーバンドにおいて１７ｋＤａに移動するわずかに大きい融合タンパク 質を産生じた。バキュロウィルスｔａｔｌｌ製物において観察されたダブレット は制限されたタンパク質分解を示すか、またはコンホメーションレベルでのｔａ ｔタンパク質の２形態を示すか、または共有結合修飾（例えば、リン酸化）に起 因する可能性がある。このことは、大腸菌調製物における１５．５ｋＤａポリペ プチドに当てはまり得るが、このより速い移動種は真のｔａｔ　ＡＵＧコドンの 内部開始に相当し得る。バキュロ・ウィルスｔａｔおよび大腸菌ｔａｔ調製物の 純度は、染色されたポリアクリルアミドゲルの可視化（データは示していない） により決定されるように、それぞれ５および５０％と見積もられる。

実　施　例　３ ＨＩＶ−Ｉ　ＬＴＲ関連遺伝子発現をトランス活性化する組換えｔａｔタンパク 質の能力を試験するために、大腸菌およびバキュロウィルスタンパク質調製物を 、細菌のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子に連結したＨ ＩＶ−Ｉ　ＬＴＲを安定に組み入れたヒーラ細胞（ヒーラ／ＬＴＲ−ＣＡＴ）中 に「スクレーブーローディング」操作により導入した。バキュロウィルスおよび 大腸菌の両方のｔａｔ調製物はＣＡＴ活性の誘導化レベルにより決定されるよう に機能的に活性だった（図３）。対照として、ヒーラ／ＬＴＲ−ＣＡＴ細胞で処 理されたバキュロウィルスｔａｔ調製物およびｍｏｃｋと同様に調製されたバキ ュロウィルスｇｐｔｅ。

感染細胞抽出物はＬＴＲ関連遺伝子発現において顕著な増加を示さなかった。

実　施　例　４ ＨＩＶ　ｍＲＮＡの５′領域に存在するＴＡＲ配列とｔａｔの結合の可能性を研 究するために、上流のＬＴＲ配列をバクテリオファージＴ７ボリメラーゼプロモ ーターで置換した構築物が設計された（図４）。プラスミドＴ７−ＴＡＲ−ＣＡ ＴはＨｉｎｄｌｌｒで消化された。このプラスミドはＴ７ポリメラーゼおよびヌ クレオシド三リン酸塩を用いた試験管内での８０ヌクレオチド転写物の合成に関 する。試験管内合成されたＲＮＡのプライマー伸長（データは示していない）に より決定されるように、Ｔ７酵素はＨＩＶ−１キャップ部位で正確に開始する。

実施例５ ＲＮＡゲル移動度シフト実験における３２Ｐ標識８０ｎｔ転写物が組換えｔａｔ の直接結合をアッセイするために使用された。タンパク質−ＲＮＡ複合体を示す 遅れたバンドは大腸菌ｔａｔおよびバキュロウィルスｔａｔ抽出物を用いて検出 されたが、バキュロウィルスｇｐ１６０またはバキュロウィルスｒｅｖｍ製物で は検出されなかった（図５）。大腸菌ｔａｔを用いて形成されたＲＮＡ複合体は バキュロウィルスｔａｔと形成された複合体の一つと正確に同じ位置に移動した 。付加的な複合体はプローブと上部バンドとの間の中間距離を移動するバキュロ ウィルスｔａｔに見られた。（２つの複合体の性質は明らかでないが、ウェスタ ンプロット中のバキュロウィルスｔａｔに観察された２つのバンドに相当し得る 。

また、付加的なバンドはＲＮＡ−タンパク質複合体においである変形を示すか、 またはモノマーもしくはダイマー構造を示し得る。）キャップ化および非キャッ プ化ＲＮＡを用いた結合性試験において相違は観察されなかった（データは示し ていない）。

実　施　例　６ 結合反応の特異性が野生型および突然変異転写物を用いてＲＮＡゲル移動度シフ トアッセイで決定された（図６）。４つの塩基対欠失が、Ｔ７−ＴＡＲ−ＣＡＴ プラスミド内の転写開始部位に関して＋３５ないし＋３８ヌクレオチドである５ ＳＴＩ部位に生成された。生成するプラスミドはループとステムを重複する欠失 を含んでいた。この突然変異体はＨＩＶ−Ｉ　ＬＴＲ−ＣＡＴバックグランドに おいてトランス活性を失っていることが示された。野生型転写物と異なり、欠失 した（ΔＳ）転写物はゲル移動度シフトアッセイにおける組換えｔａｔタンパク 質と安定な複合体を形成しなかった。ＲＮＡへの結合は過剰な非標識ｗｔ　ＴＡ ＲＲＮＡにより完了した（図７）。

考察： 結合に対する配列の必要条件はトランス活性化に対する配列の必要条件と相互に 関連し、これはｔａｔタンパク質とＴＡＲとの結合間の相互関連を示唆する。ｔ ａｔタンパク質のＴＡＲへの結合はトランス活性化に影響を及ぼすから、ｔａｔ タンパク質−ＴＡＲＲＮＡ結合への影響に対する化合物の比較試験は、ｔａｔに より制御されるＨＩＶ−１遺伝子発現に対する活性に対し組成物を評価するため の選別手段として使用され得る。それ故に、物質の阻害効果を評価するための方 法は以下の段階＝１）試験物質およびｔａｔタンパク質の混合物を調製し、 ２）段１１ｉ１）の生成物である調製物にＴＡＲＲＮＡを含存する材料の組成物 を添加し、そして３）ＴＡＲＲＮＡとｔａｔタンパク質との間の結合の確証のた めに段階２）で調製した生成物を観察するからなる。ＲＮＡゲル移動度シフト実 験におけるｓｔｐ標識８０ｎｔ転写物が組換えｔａｔの直接結合をアッセイする ために使用されるが、本発明はその実施態様に制限されるものではない。例えば 、タンパク質またはＴＡＲＲＮＡのいずれかが当業者には公知の標識でラベルさ れてもよい。

結合を試験するためのアッセイが操作される条件は、ｔａｔ　ＴＡＲＲＮＡ結合 への効果が試験される物質に応じて調整されるであろう。例に示したように、ｔ ａｔまたは該タンパク質のあらゆる複合体がゲル上を移動する速度は成分が産生 されたベクター系に依存し得る。

データはｔａｔのＴＡＲＲＮＡへの特異的で安定な結合を明らかに示した。トラ ンス活性化を喪失したＴＡＲ内での突然変異はまた、安定な複合体構造を産生じ 、これはｔａｔのＲＮＡへの結合がトランス活性化経路における機能的段階であ ることを示唆する。アッセイ系は、ｔａｔ応答のための配列の必要条件の分析に おける道具、ならびにＨＩＶ遺伝子発現のｔａｔ活性化を阻害するであろう化合 物のスクリーニングのための便利な系として使用され得る。

ＲＮＡとのｔａｔ′ｌｖｉ互作用の特異性は、天然の環境において、転写複合体 、その他の細胞因子、またはＲＮＡポリメラーゼ■との相互作用によりさらに高 められ得る。

特表千４−５０１８０３　（４） ｔａｔ　ＮＲＳ ６９ｋ ｌ　−４６に 一一一−３０ｋ ＢＶ　ＥＣＢｖ　Ｅｃ ｔａｔ　ｔａｔ　ｔａｔ　ｔａｔ ＦＪＧ、　５ Ｂｖ　Ｓｖ　Ｅｅ　５ｖ Ｇｐ１６０　ｒｅｖ　ｔａｔ　ｔａｔ ＦＩＧ、　６ Ｌｖ１／１ＲＮＡ−！ＬΔｓ、ＲＮＡ−ＦＩＧ、　７ Ｅｃ　Ｅｃ　Ｅｃ　Ｂｖ　Ｂｖ　Ｓｖ ”””’　ｔａｔ　ｔａｔ　ｔａｔ　ｔａｔ　ｔａｔ　ｔａｔ国際調査報告

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. １．ＴＡＲ　ＲＮＡおよびｔａｔタンパク質からなる材料の組成物。
2. ２．ゲル中の請求項１記載の組成物。
3. ３．以下の段階： １）試験物質およびｔａｔタンパク質の混合物を調製し、 ２）段階１の調製物にＴＡＲ　ＲＮＡを含有する材料の組成物を添加し、そして ３）ＴＡＲ　ＲＮＡとｔａｔタンパク質との間の結合の確証のために段階２の調 製物を観察するからなるｔａｔタンパク質−ＴＡＲ　ＲＮＡ結合への前記物質の 阻害効果を評価する方法。