JPH04501264A - 移植前に移植体を処理する方法 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 移植前に移植体を処理する方法 本発明は、宿主に移植する前の移植体の処理に関する。さらに詳しくは、本発明 は、ＴＧＦ−βを用いて組織または器官などの移植体をインキュベートまたは潅 流し、この処理した移植体を適当な受容体に移植することに関する。宿主におけ る同種移植体の移植の成功は、受容体により外来と認識され拒絶反応を誘導しう る移植組織」二の抗原、拒絶に関与する受容体の免疫系の細胞、および外来抗原 の提示または細胞の応答を変える反応などの因子に依存している。

主組織適合性コンプレックス（Ｍ　Ｍ　Ｃ）が、移植抗原をコードしている最も 重要な免疫遺伝学的な系である。このＭＨＣは遺伝的に複雑であるが、これは、 それが多数の異なる遺伝子座を含み、そのそれぞれが別の細胞表面抗原をコード しているため、およびこれら遺伝子座が大きな多形性を有しているためである。

ＭＨＣの遺伝子座は、それらの組織分布、発現される抗原の構造、およびそれら の機能に基づいて２種類の型、即ちＩ型またはＩＩ型のいずれかに分類される。

全ての有核細胞に存在するＩ型抗原は細胞毒性Ｔ　（ＣＤ　８”）リンパ球の１ 次標的として作用する。ＩＩ型抗原は組織に広くは分布しておらず、ヘルパーＴ （ＣＤ４°）リンパ球の１次標的として作用する。

ヒト白血球抗原（ＨＬ　Ａ）の個々の遺伝子座の多形形態、ヒトのＭＨＣは、Ｔ −リンパ球の認識を測定する種々のインビトロでの方法によって、および抗体に よって認識されていた。受容体による供与体中の多形性の認識によって媒介され るこれら反応は、インビボで起こる強い拒絶反応と関係している。

インビトロおよびインビボでの細胞に基づく移植体拒絶の研究によって、ＣＤ４ ’およびＣＤ３”の両リンパ球が拒絶反応に関与していることが明らかになった 。

実験モデルおよび実際の医療において移植後の同種移植体および異種移植体の生 存を長くしようとする試みは、主として受容体の免疫機構の抑制にその中心が置 かれていた。この処置の目的は、予防的免疫抑制および／または移植体拒絶の処 置である。

免疫抑制に用いられる薬物の例には、細胞毒性薬物、代謝拮抗薬物、コルチコス テロイド類、および抗リンパ球血清が含まれる。予防的免疫抑制に特に有効であ ることが見い出された非特異的な免疫抑制薬物（アザチオプリン、ブロモクリプ チン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾン、および最も最近ではシクロスポリ ンＡ）は、臨床での移植の成功を有意に改善した。腎臓移植後のシクロスポリン Ａの腎毒性は、プレドニゾロンなどのステロイド類またはアザチオプリンと組合 せたプレドニゾロンを同時投与することによって減少した。さらに、抗リンパ球 グロブリンとそれに続いてシクロスポリンＡを用いて成功裏に腎臓が移植された 。別の評価されているプロトコールは、移植前の受容体の全リンパ系照射とそれ に続く移植後の最少の免疫抑制である。

拒絶の処置には、ステロイド類、２−アミノ−６−アリール−５−置換ビリミジ ン類、異種の抗リンパ球グロブリン、および０ＫＴ−３を含む種々の白血球集団 に対するモノクローナル抗体の使用が含まれる［全般的にはＪ、　Ｐｅｄｉａｔ ｒｉｃｓ　１１１　：　１００４−１００７（１９８７）を、具体的には米国特 許Ｎ　ｏ、　４．６６５．０７７を参照］。

免疫抑制薬物の主な合併症は感染である。さらに、全身性の免疫抑制には、望ま しくない毒性作用（例えば、腎臓移植後にシクロスポリンＡが用いられる場合の 腎毒性）および造血幹細胞レベルの減少が付随する。また、免疫抑制薬物は、肥 満、傷治癒の低下、ステロイド性高血糖、ステロイド性精神障害、白血球減少、 胃腸出血、リンパ腫、および高血圧を導くこともある。

これらの合併症に鑑みて、移植免疫学者は抗原特異的に免疫応答性を抑制する方 法を探していた（供与体の同種抗原に対する反応だけが失われるように）。通常 、このような特異的な免疫抑制は、移植しようとする組織の抗原性または拒絶に 介入しうる特異的な細胞のどちらかを修飾することによって達成される。ある場 合には、免疫または寛容が誘導されるか否かは、抗原が免疫系に提供される方法 に依存する。移植前に組織培養で増殖させることによって同種移植体組織を前処 理すると、２種類のネズミのモデル系において、ＭＨＣ障壁を越える永久容認が 得られることが見い出された［Ｌａｆｆｅｒｔｙら、Ｔｒａｎｓ　１ａｎｔａｔ ｉｏｎ　２２　：　１３８−１４９（１９７６）　；　Ｂｏｗａｎら、　Ｌａｎ ｃｅｔ　３　：　５８５−５８６（１９７９）］。このような処理によって通過 リンパ様細胞が減少することになり、従って組織免疫原性に必要な刺激細胞集団 が存在しなくなるとの仮説が立てられた［Ｌａｆｆｅｒｔｙら、Ａｎｎｕ、Ｒｅ ｖ、ｌ＠５ｕｎｏ１．１：　１４３（１９８３）］。また、Ｌａｆｆｅｒｔｙら ［５ｃｉｅｎｃｅ　１８１３　：　２５９−２６１（１９７５）コ（５１５９（ １９８１）］（移植前にネズミ抗Ｉａ抗血清および補体で処理された島細胞）を も参照。また、リンパ球毒性薬物とγ照射で前処理した供与動物から採取し、イ ンビトロで１０日間培養した甲状腺は、全ての正常な同種異系の受容体によって 拒絶されなかった［ＧｏｓｅおよびＢａｃｈ、　Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、　１ ４９　：　１２５４−１２５９（１９７９）］。これらの方法の全てに、供与体 のリンパ球の減少または除去が関係している。

血管および腎臓移植体などのいくつかのモデルにおいては、＋１型の適合と同種 移植体生存の延長の間にある関係が存在するが、皮膚移植体には関係は存在しな い［Ｐｅ５ｃｏｖｉｔｚら、Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、　１６Ｑ：　１４９５−１５ ０８（１９８４）　；　Ｃｏｎｔｉら、　Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ、　Ｐｒｏｃ、 １９　：　６５２−６５４（３，９８７）］。従って、供与体−受容体のＨＬＡ 適合が利用されている。さらに、移植前の血液注入、供与体−受容体のＨＬＡ適 合、および移植後の免疫抑制治療（シクロスポリンＡ）の組合せによって、移植 体生存の割合が有意に改善されることがわかり、この作用が加成性であることが わかった［０ｐｅｌｚら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ、　Ｐｒｏｃ、１７　：　２１ ７９（１９８５）］。

また、ＭＨＣ抗原の免疫リセブターに指向性の抗体によって移植の応答を変える ことができるＣＢｌｕｅｓｔｏｎｅら、　Ｉｎ＋ｍｕｎｏ１．　Ｒｅｖ、　９０ 　：　５−２７（１９８６）］。さらに、特異的な免疫抑制を与える宿主の反応 を導く抗移植体抗体の存在下に移植体の生存を延長させることができる［Ｌａｎ ｃａｓｔｅｒら、　Ｎａｔｕｒｅ　３１５　：　３３６−３３７（１９８５）］ 。器官移植の準備操作として骨髄移植を用いることによって、ＭＨＣ抗原に対す る宿主の免疫反応を特異的に変えることができる。即ち、抗Ｔ細胞モノクローナ ル抗体を用いて供与体の骨髄接種体に由来する成熟Ｔ細胞を激減させ、移植体と 宿主の障害を招くことなく骨髄移植を可能にすることができる画ｅｌｌｅｒ−Ｒ ｕｃｈｈｏｌｔｚら、Ｔｒａ　５ｐｌａ　ｔ　Ｐｒｏｅ、　Ｆｊ　：　５３７− ５４１（１９７６）］。さらに、骨髄移植に対して残存している宿主のリンパ様 細胞の成分は、完全に同種異系の移植体が用いられたときに発生する免疫不全の 問題を解決する。

皮膚移植体の生存時間は、実験動物に内植する前にコルチゾン、サリドマイド、 またはウレタンでインビトロ処理することによって２倍に延長された。皮膚に局 所的に適用した薬物の量は、薬物を全身的に注射することによって同様の効果を 得るのに必要とされる量より少なかった。別の研究において、供与体の皮膚が、 ストレプトキナーゼ／ストレブトドルナーゼで、または受容体のＲＮＡおよびＤ ＮＡ調製物でインビトロ処理された。さらに、移植前のグルタルアルデヒド溶液 による移植組織の処理によって、それらの抗原性が減少することが見い出された し米国特許Ｎ　ｏ、　４．１２０．６４９を参照コ。

これまで同定されたトランスフォーミング増殖因子−（ＴＧＦ−β）分子は、そ れぞれ、ジスルフィド結合によって結合した２つの同一の１１２残基のポリペプ チド鎖を含有する２量体である。これら２量体の分子質量は約２５ｋＤである。

生物学的に活性なＴＧＦ−βとは、補助因子であるＥＧＦまたはＴＧＦ−αと共 に加えられたときに、インビトロの細胞培養において標的セルラインまたはラッ ト線維芽細胞の足場非依存性増殖を誘導しうる分子と定義されている。

ＴＧＦ−βは、実質的に全ての細胞種により不活性形態で分泌される。この潜在 性の形態は、最初にその前駆体からの成熟ＴＧＦ−βのタンパク質加水分解切断 （２７８位のＡ　ｒｇ−Ａ　ｌａ結合のところ）によって活性化される。この成 熟ＴＧＦ−βと前駆体の残りの会合によって非共有結合コンプレックスが形成さ れる。一時的な酸性化への暴露または外因性プロテアーゼの作用のいずれかによ って、このコンプレックスが崩壊してＴＧＦ−βを活性化する。

現在、少なくとも３種の形態のＴＧＦ−β、即ちＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β１、 およびＴＧＦ−β、が同定されている。この群のＴＧＦ−βを血小板または胎盤 から精製するための、組換え細胞培養においてそれを産生させるための、および その活性を測定するための適切な方法が知られている。例えば、Ｒ，Ｄｅｒｙｎ ｃｋら［Ｎａｔｕｒｅ　３１６　：　７０１（１９８５）］　；欧州特許公開Ｎ 　ｏ、　１２８．８４９（１９８４年１２月１９日公開）、Ｎ　ｏ、　１０５． ０１４（１９８４年４月４日公開）、Ｎ　ｏ、　２００．３４１（１９８６年１ ２月１０日公開）、Ｎｏ、１６９、０１６（１９８６年１月２２日公開）、Ｎｏ 、　２６８．５６１（１９８８年５月２５日公開）、およびＮ　ｏ、　２６７、 ４６３（１９８８年５月１８日公開）；米国特許Ｎ　ｏ、　４．７７４．３２２ ４７１９（１９８８）］を参照。

ＴＧＦ−−βは多種多様の正常および新生の両細胞に多（の調節作用を有するこ とがわかっている。最近の研究によって、免疫系の細（１９３６）１および傷治 癒適用に対する結合組織および軟組織の増殖［順５ｐｏｒｎら、　５ｃｉｅｎｃ ｅ　２１９　：　１３２９（１９８３）　；　Ｒ，Ｉｇｎｏｔｚら、Ｊ、Ｂｉｏ ｌ、Ｃｈｅｔ　２６１４３３７（＋９８６）　；　Ｊ、　Ｖａｒｇａら、Ｂ、Ｂ 、Ｒｅｓ、Ｃｏａｉ　、１３８：　９７４（１９８６）　；　Ａ、Ｒｏｂｅｒｔ ｓら、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｅｔ、　ＵＳＡ　７８　：　 ５３３９（１９８１）　；　Ａ、　Ｒｏｂｅｒｔｓら、■■ ：　４１６７（１９８６）　Ｈ５ｅｙｅｄｉｎら、米国特許Ｎ　ｏ、　４．７７ ４．２２８］、ならびに上皮［Ｔ、　Ｍａｔｓｕｉら、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｉ 、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８３　：　２４３８（１９８６）　；　Ｇ 、　５ｈ奄垂撃■■ ら、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、　４６　：　２０６８（１９８６）］におけるＴ ＧＦ−βの重要な役割が示されている。また、ＴＧＦ−βはサイトカイン（例え ば、ＩＦＮ＝、ＩＦＮ−β）産生の抑制物質として記載されており、炎症性疾患 を治療するための免疫抑制物質として［Ｅｓｐｅｖｉｋら、　Ｊ、　Ｅｘｐ、　 Ｗｅｄ、　１８６：　５７１−５７６（１９８７）　；欧州特許公開Ｎ　ｏ、　 ２６９．４０８（１９８８年６月１日公開）およびＮｏ、　２１３．７７６（１ ９８７年３月１１日公開）］、および悪液質の促進物質として［Ｂｅｕｔｌｅｒ およびＣｅｒａｓｉ、　Ｎｅｗ　Ｅｎｇ、　Ｊ、　Ｍｅｄ、　３１６　：　３７ ９（１９８７）］、それを用いることが示されている。さらに、ＴＧＦ−βは、 ヒト線虹朋朋４す：　１０７ｇ（１９８６）］。

ＴＧＦ−βは、細胞の増殖、分化、およびその他の細胞機能に必須の過程を刺激 または抑制することができるので多機能性である［Ｍ、５ｐｏｒｎ、　５ｃｉｅ ｎｃｅ　２３３　：　５：（２（１９８６）］。ＴＧＦ−βの多機能活性は、Ｔ ＧＦ−βと共に存在する他の増殖因子の影響によって調節されている。ＴＧＦ− βは、ＴＧＦ−βと共に細胞中で効果を現す特定の組の増殖因子、例えばＥＧＦ またはＴＧＦ−αに依存して、足場非依存性増殖の阻害物質または促進物質のど ちらがとして機能することができる［Ｒｏｂｅｒｔｓら、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ ｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８２　：　１１９（１９８５月。さらに、 ＴＧＦ−βはＥＧＦと協力して作用して正常な（リウマチ様ではない）滑膜細胞 の増殖および蓄積を引き起こすことができる［Ｂｒ１ｎｋｅｒｈｏｆｒら、Ａｒ ｔｈｒｉｔｉｓ　ａｎｄ　Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ　２６　：　１３７０（１９８ ３）コ。

さらに最近になって、ＴＧＦ−βは、ヒトインターフェロン−によって誘導され るヒト細胞上の１１型組織適合性抗原の発現を抑制すること、およびこの細胞中 のＩＩ型抗原メツセージの構成性の発現を抑制することがわかった［Ｃｚａｒｎ ｉ、ｅｃｋｉら、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１４０　：　４２１７−４２２２ ３（Ｌ９８ｇ）　；　Ｃｚａｒｎｉｅｃｋｉら、　Ｊ、　Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ 　Ｒｅｓ、７　：　６９９（１９８７）　：　Ｐａ１ｌａｄｉｎｏら、　Ｊ、　 Ｃｅｌ　１．　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　ｒ増補１１Ａ（１９８７年１月１７日−２月 ５日）９分子および細胞生物学に関するＵＣＬＡシンポジウム、　Ａｌａｎ　Ｒ ，Ｌｉ５ｓ、　Ｉｎｃ、　＋Ｎ６ｗ　Ｙｏｒｋ＋アブストラクトＡＯ１６，ｐ、 　１０　；　Ｃｈｉｕら、３年毎のシンポジウム：成長因子の生物学、トロント 大学、オンタリオ、カナダ（１９８７年６月１７−１９日）　；　Ｐａ１ｌａｄ ｉｎｏら、　Ｉｎ＋ｓｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ　１７５　：　４２（１９８７）コ 。

ｔｕｒｅ　３３２　：　２１７−２１９（１９８８）］を参照。

当分野では、移植手術において移植体の生存を延長し、かつ大量の免疫抑制物質 を使用することにより発生する毒性およびその他の悪作用を最少にするための方 法がめられていた。

即ち、本発明の目的は宿主における一層長い移植体の生存を提供することである 。

別の目的は、成功裏の結果を得るために、投与するにしても比較的少量の免疫抑 制物質を宿主に投与することを必要とし、それによって免疫抑制薬物の全身投与 に付随する副作用を減少させる移植法を提供することである。

これらおよび他の目的は当業者には明らかであろう。

これらの目的は、移植体を治療学的有効量のＴＧＦ−βを含有する組成物で処理 し、そしてこの移植体を適合宿主に移植することからなる、宿主中に供与体由来 の移植体を移植する方法によって達成される。

別の態様では、本発明は、ＴＧＦ−βを単独または他の免疫抑制物質と組合せて 含有する組成物で処理した移植体を提供する。

さらに別の態様では、本発明はパーフルオロ化合物エマルジョン中にＴＧＦ−β を含む組成物を提供するものである。

本発明の方法によって、宿主中で免疫学的に安定な、生物学的に機能的な、そし て移植前に貯蔵しておくことができる移植体が得られる。

本発明は、短期または長期保存して利用できる処理移植体のバンクを設立するこ とを可能にする。さらに、この移植体は適当な宿主に移植されたときに拒絶され ることがない。本方法は同種および異種の両移植体に適用することができ、異種 移植体を使用すればヒト由来の組織の供給が限定されるという問題が克服される 。

本明細書で用いる「移植体」なる用語は、受容体への移植用に供与体から得た生 物学的材料を意味する。移植体には、例えば単離された細胞（島細胞など）、組 織（新生児の羊膜など）、骨髄、造血前駆体細胞、および器官（皮膚、心臓、肝 臓、肺臓、膵臓、甲状護葉、肺、腎臓、管状器官、例えば、腸、血管、食道など ）などが含まれる。管状器官を用いて食道、血管または胆管の損傷部分を置換す ることができる。皮膚移植体を火傷用にだけでなく、横隔膜ヘルニアなどのある 種の欠陥を閉じるため、または損傷を受けた腸への包帯としても使用することが できる。この移植体は、死体または生体供与体の由来を問わず、あらゆる供給源 から、好ましくは哺乳動物（ヒトを含む）から得られる。

本明細書で用いる「宿主」なる用語は、あらゆる適合性の移植受容体を意味する 。「適合性」なる用語は、供与された移植体を受容するであろう宿主を意味する 。この宿主は哺乳動物であるのが好ましく、さらに好ましくはヒトである。宿主 と移植体供与体の両者がヒトであるときには、ＨＬＡ　ＩＩ型抗原を一致させて 組織適合性を改善するのが好ましい。

本明細書で用いる「供与体」なる用語は、移植体を得る死亡または生存の種を指 す。この供与体は哺乳動物であるのが好ましい。ヒト供与体は主ＡＢＯ血液グル ープが同じであり、身体検査で正常なボランティアの血縁供与体であるのが好ま しいが、これは、主血液グループ境界が交差すると同種移植体の生存が害される 可能性があるためである。しかし、例えば０型供与体の腎臓をＡ、ＢあるいはＡ Ｂの受容体に移植することは可能である。

「移植」なる用語およびその変形表現は、移植がシンジェネイック（供与体と受 容体が遺伝的に同一である）、同種異系（供与体と受容体が異なる遺伝的起源を 有しているが、種が同じである）、あるいは異種（供与体と受容体が異なる種に 由来する）であるを問わず、宿主に移植体を挿入することを意味する。即ち、通 常のケースでは宿主はヒトであり、移植体は同一または異なる遺伝的起源のヒト から導かれる同系移植体である。別のケースでは、移植体は、その移植体を移植 する種とは異なる種（系統発生学的に広く分かれた種がらの動物を含む）から導 かれ、例えばヒトの心臓がヒト宿主に移植される。

ｒＴＧＦ−β」なる用語は、上に記した一群の分子を指す。本明細書中のＴＧＦ −βへの言及が、現在同定されている３つの形態、ＴＧＦ−β０、ＴＧＦ−β、 およびＴＧＦ−β３、ならびに、本明細書中に記載の方法において有効である限 り、この群のタンパク質に関連する他の分子、将来同定される分子、そのアレル 、およびその予め決定したアミノ酸配列変異体のいずれかを指すものであること は理解されよう。ＴＧＦ−βはあらゆる供給源、好ましくは哺乳動物、最も好ま しくはヒトから得るのが適切である。ヒト以外の動物、例えばブタまたはウシ供 給源からのＴＧＦ−βを、ヒトを処置するための移植体を浸漬するのに用いるこ とができる。同様に、家畜、輿望であるときには、ヒトＴＧＦ−βならびに他の 種に由来するＴＧＦ−βが適宜用いられる。

本明細書中で用いる「免疫抑制物質」なる用語は、移植体を移植しようとしてい る宿主の免疫系を抑制または遮蔽するように作用する物質を指す。これには、サ イトカインの産生を抑制するか、自己抗原の発現を下方調節もしくは抑制するか 、またはＭＨＣ抗原を遮蔽する物質が含まれよう。このような物質の例には、以 下に挙げる物質が含まれる：２−アミノー６−アリールー５−置換ピリミジン類 （上記の米国特許Ｎ　ｏ、　４．６６５；　０７７を参照）、アザチオプリン（ または、アザチオプリンに対して望ましくない反応が存在するときにはシクロホ スファミド）：ブロモクリプチン；グルタルアルデヒド（これは、上記の米国特 許Ｎ　ｏ、４．１２０．６４９に記載されているように、ＭＨＣ抗原を遮蔽する ）、ＭＭＣ抗原の抗イデイオタイプ抗体；シクロスポリンＡ：１またはそれ以上 のステロイド類、好ましくはコルチコステロイド類、最も好ましくはグルココル チコステロイド類（プレドニゾン、メチルプレドニゾロン、およびデキサメタシ ンなど）；抗インターフェロンー抗体；抗腫瘍壊死因子−α抗体：抗腫瘍壊死因 子−β抗体；抗インターロイキンー２抗体；抗サイトカイン受容体抗体（抗ＩＬ −２受容体抗体など）；異種の抗リンパ球グロブリン；　ｐａｎ−Ｔ抗体、好ま しくはＯＫ’ｒ−３モノクローナル抗体；　ＣＤ４に対スる抗体；ストレプトキ ナーゼ；ストレプトキナーゼ；または宿主由来のＲＮＡもしくはＤＮＡ。

本目的に好ましい物質は、行われる移植の種類ならびに患者の病歴を含む多数の 因子に依存するであろうが、全般的に好ましいのはシクロスポリンＡ、グルココ ルチコステロイド（最も好ましいのはプレドニゾンまたはメチルプレドニゾロン ）、０ＫＴ−３モノクローナル抗体、アザチオプリン、ブロモクリプチン、異種 の抗リンパ球グロブリン、またはこれらの混合物から選ばれる物質である。

ＴＧＦ−βはその活性化された形態で用いるのが適切である。即ち、適当な酵素 を用いて前駆体から成熟形態を切断し、得られたコンプレックスを酸、プロテア ーゼ（プラスミンまたはカテプシンＤなど）、アルカリ、またはカオトロピック 試薬で処理してＴＧＦ−βを活性化する。Ｋｅｓｋｉ−Ｏｊａら［Ｊ、Ｃｅ１ｌ 　ＢｉｏｃｈｅｔＳｕｐｐｌ、　ＩＩＡ：　６０（１９８７本明細書に記載した 治療法に用いる組成物は、治療しようとする疾患および移植の性質、宿主の種、 個々の患者の医学的状態、組成物中の他のいずれかの薬物の存在、ならびに実施 する者に既知のその他の因子を考慮に入れて、良好な医学的実施に合致するよう に投与されるであろう。本発明の目的に対しては、移植体を処理するのに用いる ＴＧＦ−βの「治療学的有効量」とは、宿主に適合し、拒絶されないように移植 体の免疫原性を減少させるのに有効な量を指す。この目的に対する通常の有効量 はｌｐｇ／ｍｌ〜１＋ｇ／ｅｉ１、より好ましくはｌ　Ｏｐｇ／ｍ１〜１　μｇ ／ｎｌ、最も好ましくは１０ｐｇ／ａ＋１〜１１００ｎ／ｍｌの範囲であるが、 実施者は上記因子を考慮に入れてどのような量を使用すべきかをより正確に知っ ているであろう。

ＴＧＦ〜βは所望により、移植体の免疫抑制作用を高めるために１またはそれ以 上の免疫抑制薬物と共に製剤化される。このような他の薬物の有効量は、製剤中 に存在するＴＧＦ−βの量、移植の種類、および上に記したその他の因子に依存 するが、通常は適当な終了点、即ち一層長い移植体の生存を達成するのに必要な 約０．１ｐｇ／　ｎ＋１〜０　、５１１１ｇ／　ｍｌの範囲である。通常、ＴＧ Ｆ−βは、周囲温度、適当なｐＨ，および所望の純度で、これを生理学的に許容 しうる担体、即ち使用される濃度および投与法で受容体に非毒性である担体と混 合するごとによって製剤化される。製剤のｐＨは主に特定の用途およびＴＧＦ− βの濃度に依存するが、約３〜約８の範囲内であるのが好ましい。ＴＧＦ−βを 酸性のｐＨ（例えば、約４〜約６）に維持して、それが入れられている容器への 付着（生理学的レベルに近いｐＨ値で起こる）を防止し、ＴＧＦ−β分子の活性 化を確実なものにするのが好ましい。即ち、ｐＨ５の酢酸緩衝液中の製剤が適切 な態様である。移植体を処理する容器にＴＧＦ−βが付着するときには、所望に より、ＴＧＦ−βの処理される移植体への付着あるいは潅流を妨げない量のアル ブミンなどの適当な成分を加える。

ＴＧＦ−β製剤が局所的に適用されるときには、例えばそれが移植前の皮膚移植 体に塗布されるときには、非粘性溶液の代わりにゲルなどの粘性溶液を用いるの が好ましい。これは、例えばＴＧＦ−βの溶液をゲル化試薬（ポリサツカリド、 好ましくは水溶性のポリサツカリド、例えばヒアルロン酸、デンプン、およびセ ルロース誘導体、例えばメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、およ びカルボキシメチルセルロースなど）と混合することによって達成することがで きる。最も好ましいゲル化試薬はメチルセルロースである。通常、ボリサ、カリ ドはゲル製剤中に１〜９０重量％ゲルの範囲で、より好ましくは１〜２０％で存 在する。この目的に適当な他のポリサツカリドの例、およびポリサツカリドの溶 解性の測定はＥ　Ｐ　２６７．０１５（１９８８年５月１１日公開）に記載され ている。

処理される移植体がいずれかの期間保存されるときには、移植体に到達する酸素 の濃度をより高くすることを可能にするため、ＴＧＦ−βをパーフルオロ化合物 エマルジョン（血液に代わるものとして作用する）中で製剤化するか、またはそ れに加えるのが好ましい。

このようなエマルジョンは、水中に界面活性剤で乳化されたパーフルオロ化合物 （例えば、パーフルオロデカリンおよび／またはパーフルオロトリプロピルアミ ン）を含有している。適当な界面活性剤ノ例ニハ、ホロキサマー（ｐｏｌｏｘａ ｍｅｒ）界面活性剤（エチレンオキシドとプロピレンオキシドのブロックコポリ マーである一連の分子）の単独またはリン脂質（卵レシチンなど）との混合物が 含まれる。このパーフルオロ化合物はヒトにおいて最も毒性が少ないように選択 される。このようなエマルジョンの例を１つ挙げると、Ｇｒｅｅｎ　Ｃｒｏｓｓ から市販されているＦｌｕｏｓｏｌ−ＤＡ　２０％であり、これはポロキサマー 界面活性剤Ｐｌｕｒｏｎｉｃ　Ｆ−６８で乳化されたパーフルオロデカリンおよ びパーフルオロトリプロピルアミンを含有している。哺乳動物におけるパーフル オロ化合物エマルジョンおよびその作用は、ＢｏｌｌａｎｄＢら［Ｊ、　Ｐｈａ ｒｍ、　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、３９　：　１０２１−１０２４（１９８７）］が さらに詳しく記載している。

治療投与に用いるＴＧＦ−βは滅菌されているのが好ましい。滅菌は（０，２ミ クロン）メンプランで滅菌濾過することによって行うのが容易である。ＴＧＦ− βは、通常、それが熱変性および酸化変性に対して安定性が高いので水溶液で保 存されるが、復元用の凍結乾燥製剤も可能である。

本発明方法によれば、移植体をＴＧＦ−β組成物と接触させる。

この接触は、器官を組成物とインキュベートもしくはそれで潅流させるか、また は１またはそれ以上の移植体の表面に組成物を適用することからなるのが適当で ある。通常、この処理は少なくとも１分間、好ましくは１分〜７２時間、最も好 ましくは２分〜２４時間行うが、これは、製剤中のＴＧＦ−β濃度、処理される 移植体、および特定の製剤型などの因子に依存する。潅流は任意の適当な方法に よって行われる。例えば、器官は、Ｄ　Ｄ　２１３．１３４（１９８４年９月５ 日公開）に記載されているように、器官とポンプの間に設置された排出口および 圧力調節器を有する一定圧の潅流を与える装置によって潅流させることができる 。別法では、Ｅ　Ｐ　１２５．８４７（１９８４年１１月２１日公開）の記載の ように、器官を密封扉から高比重室に入れ、容器から液体を汲み出すポンプで還 流液をこの室に供給し、消費された還流液をバルブによって容器に戻す。

皮膚移植体用には、本製剤を移植しようとする皮膚の下側表面に塗布するのが適 切であり、それによってこの移植体の下側表面と宿主の組織の間にＴＧＦ−βの 層を存在させる。別法では、全皮膚移植体を本組成物中に浸漬させる。

移植体を処理した後、これを長期間好都合に保存するか、または移植法で直ちに 使用する。製剤中に血液置換物を用いることによって（例えば、パーフルオロ化 合物エマルシコン）、またはＪ　Ｐ　６００６１５０１（１９８５年４月９日公 開）に記載されているように、冷却した等張試薬および抗凝固薬を含むＴＧＦ− β製剤で、続いて細胞の破壊を伴わずに摘出器官の凍結を可能にするグリセロー ルで移植体を潅流することによって、保存期間を上記のように長くすることがで きる。

さらに、米国特許Ｎｏ、　４．４６２．２１５および４．４９４．３８５の記載 のように、器官を凍結温度まで冷却しながら本製剤含有の異なる液体で器官を保 存して、細胞が壊死することなく半永久的に器官を保存することができる。

特に、心臓移植に関して、移植前の５°Ｃでの冷冠状動脈潅流によって内植の初 期での同種移植体の保護が高められたと記載されている［Ｐａｒｅｎｔら、　Ｃ ｒｙｏｂｉｏｌｏｇｙ　１８　：　５７１−５７６（１９８１）］。これらの操 作の全てまたはその他の操作は、移植体のＴＧＦ−β処理時または処理後に必要 と思われるなら本発明の範囲内である。

移植前に、ＴＧＦ−β組成物を含まないように、生理学的食塩溶液に浸漬するこ とによって、またはこの目的に適当な他の手段によって、移植体を洗浄するのが 好ましい。

また、移植前に所望により宿主に１またはそれ以上の供与体特異的な血液の輸血 を行って移植体の生存の助けとする。別の方法は、移植手術の前に宿主を全リン パ照射にかけることである。特定の移植受容体に膏益なあらゆる他の移植前操作 を本発明方法の一部として行うことができる。

移植法それ自体は、治療される特定の疾患、患者の状態などに依存するであろう 。医学的に実施する者は、あらゆるケースにおいて用いるに適当な方法を認識し ているであろう。所望により、あらゆる適当な方法を用いて必須の手術後期間（ 最初の３ケ月）中は移植を全身的にモニターする。このような方法の１つは、Ｔ ｈｏａｓｅｎら［＾ｅｔａ−Ｒａｄｉｏ１．２９　：　１３８−１４０（１９８ ８）］が記載しているような、９９Ｔｃ＋ｓ−パーテクネテート（ｐｅｒｔｅｃ ｈｎｅｔａｔｅ）を用いる放射性核種静脈内血管造影法である。さらに、本明細 書中に記載の方法は、同時の複数器官潅流および移植に適用し易い［Ｔｏｌｅｄ ｏ−ＰｅｒｅｙｒａおよびＭａｃＫｅｎｚｉｅ＋＾ｌ。

鍾１郵：　ｔ６ｔ−１６４（ｔ９８０）］。移植後にＴＧＦ−βおよび／または 他の免疫抑制物質を用いて、移植体の生存を確実なものにするのに必要な免疫抑 制療法を行う。

ある場合には、適当なアミノ酸またはポリマーを使用すること、あるいは荷電し た官能基の生理学的に許容しうる供給源を結合させることなどによって、移植体 の表面を修飾して正または負に荷電した基を付与するのが望ましい。例えば、負 に荷電した表面は血管の血液凝固を減少させるのに適している。また、ある種の 状況では、表面に例えばフェニルアラニン、セリンあるいはリジンを結合させる ことによって、表面を疎水性あるいは親水性にすることが望ましい。これら表面 修飾に特に有効な免疫抑制物質はグルタルアルデヒドである。

通常、免疫抑制療法には、ＴＧＦ−βそれ自体を含む免疫抑制物質の有効量を投 与することが含まれる。免疫抑制物質の組成物を配合し、良好な医学的慣例に合 致するように投与する。この場合に考慮される因子には、個々の患者の臨床状態 、移植の原因、この物質の投与部位、投与方法、投与スケジュール、および実施 者には既知のその他の因子が含まれる。このような考慮事項によって決定される この場合の「有効量」は、宿主による移植体拒絶の結果になる免疫反応を妨げる に必要な最少量である。このような量は、宿主に毒性であるか、または感染に対 して宿主をさらに有意に感受性にする量より少ないのが好ましい。本明細書に記 載した発明に必要とされる免疫抑制物質の量は、前処理されていない移植された 移植体に通常必要とされる量より少なく、使用される免疫抑制物質の種類および 移植を取り巻く個々の状況に依存する。

一般的に言うと、１投与あたりに非経口的に投与される免疫抑制物質シクロスポ リンＡの合計の薬学的有効量は１日あたり約０．１〜２０　ｍｇ／　ｋｇ患者体 重の範囲内であり、免疫抑制療法で現在用いられているンクロスボリンＡの通常 の範囲は５〜１５　ｌａｇ／　ｋｇ／日である。腎臓移植のためには、グルコフ ルチコステロイドの短期間の大量投与が有用である。例えば、１日あたり数ｇ用 量のメチルプレドニゾロンを３〜５日間投与し、続いて６０〜ｌｏＯｍｇのプレ ドニゾンを投与する（移植体のＴＧＦ−β前処理なし）。このような前処理を行 ったときには、さらに低い用量が有用であると予想されよう。

しかし、上記のように、これらの免疫抑制物質の計画用量は多数の治療的判断の 対象である。適当な用量およびスケジュールを選択する際の重要な因子は得られ る結果、即ち移植体の生存である。例えば、比較的高い用量が、初めの抗体関与 の移植体破壊に起因すると考えられる超急性移植体拒絶の処置に対して、または 比較的遅い段階の移植体機能の突然の低下を特徴とする急性拒絶の処置に対して 必要とされるであろう。

免疫抑制物質は、非経口投与および所望なら局所的な免疫抑制処置のための損傷 内投与を含むあらゆる適当な手段によって投与される。非経口注入には、筋肉内 、静脈内、動脈内、腹腔内、または皮下投与が含まれる。さらに、免疫抑制物質 はパルス注入（特に、免疫抑制物質の量か減少する注入）によって、または持続 注入によって好都合に投与される。

本発明は、以下に挙げる実施例を参照することによってさらに完全に理解される であろう。しかし、これら実施例は本発明の範囲を限定するものとみなされるべ きではない。

ら得る・（１）凍結乾燥形態で購入し、使用前に４ｍＭＨＣｌおよびリン酸緩衝 食塩水（ＰＢＳ）溶液に懸濁させた９６％純度のブタ血小板に由来するＴＧＦ− β、　；　（２）上記のＥＰ　２００，３４１に記載の組換え法によって調製し たＴＧＦ−βＩ　；　（３）上記の米国特許Ｎｏ、４．７７４．３２２の記載の ように調製したＴＧＦ−β、；または（４）上記のＥＰ　２６７．４６３に記載 の組換え法によって調製したＴＧＦ−βｓＣＥ　Ｐ　２６７、４６３のＦｉｇ、 ２９および添付の本文を参照）。これら供給源のいずれか由来のＴＧＦ−βを回 収し、水性酢酸緩衝液中、ｐＨ５，１１００ｎ／ｍｌで配合した。得られた溶液 を０．２ミクロンのポリスルホンフィルターで滅ｍＩｓ過した。

些亘体・Ｂ　Ａ　ｉ、　Ｂ／　ｃ　（Ｈ−２つマウスから皮膚の同種移植体（１ ｘ２ｃ＋ｎ平方）を得る。

御玉：使用した宿主はＣ５７Ｂ　Ｌ／６　（Ｈ−２ｂ）マウスである。

ｕ汰：皮膚移植体を、室温で１分〜２４時間、滅菌ガラス製バイアル中の上記Ｔ ＧＦ−β溶液の１つの中でインキュベートし、次いでＰＢＳ溶液で２回洗浄して 全ての遊離ＴＧＦ−βを除去する。このように処理した皮膚をマウス受容体に適 用し、ワセリンガーゼで覆い、次いで焼石膏で覆い、これを１０日後に除去する 。この処理した移植体は受容体に１２つかつと結合される。これらは始めは柔ら かいが、徐々に堅くなり、サイズの縮小は極めて少なく、感染はないままである 。組織学によればこの移植体が生存しており、血管化されていることが示され、 皮膚の全般的な構造（表皮、付属器、および真皮）は少なくとも３ケ月間保存さ れる。視覚的な測定も行うことができる（例えば、黒マウス上の白い皮膚を捜す など）。

実施例２　ラｙ）の皮膚移植体モデル メチルセルロース（ＤｏｔからのＭｅｔｈｏｃｅｌ　Ａ　４　Ｍ）を２０重量％ の濃度で水と混合し、局所皮膚適用に使用しうる粘度を得ることにより、その水 性ゲルを調製する。実施例１の記載のように組換えによって調製したＴＧＦ−β １をこのゲルと混合して１ｍｇ／ｅｌの濃度にする。

このＴＧＦ−βゲルを、Ｆ　Ｉ　Ｌｅｗｉｓ／Ｂｒｏｗｎ　Ｎｏｒｗｅｇｉａｎ ラットから採取した皮膚の下側（裏側）に塗布する。２４時間後に、この皮膚を Ｌｅｗｉｓ親ラットの移植体床に置き、ガーゼに次いで焼石膏で覆い、そして１ ０日後に除去する。別法では、機械的にクリップする装置を用いることにより金 属クリップでこの移植体をその場に保持する。この結果は北記のマウスで観察さ れた結果と同様である。

１％＋３−　ネズミおよびラットの胚細胞移植モデル島細胞をＢＡＬＢ／Ｃマウ スの膵臓から抽出し、実施例１に記載のＴＧＦ−β組成物の１つの中に４８時間 浸漬し、Ｃ５７Ｂ　Ｌ／６雄性マウスなどのストレプトシトシン処理した同種異 系マウスの腎臓下色内腔に移植する［例えば、Ｆａｕｓｔｍａｎら（上記）を参 照］。同様に、島細胞をＦ　Ｉ　Ｌｅｖｉｓ／　Ｂｒｏｗｎ　Ｎｏｒｗｅｇｉａ ｎラットの膵臓から抽出し、実施例１に記載のＴＧＦ−β組成物の１つの中で２ ４〜４８時間インキュベートし、ストレプトシトシン処理したＣ５７ＢＬ／６マ ウスの腎臓下色内腔に移植する。この結果、島細胞は３ケ月後に宿主によって拒 絶されていないことが示される。

実施例４　ネズミおよびラットの心臓移植モデル犠牲にしたＢＡＬＢ／ｃマウス および犠牲にしたＦ　Ｉ　Ｌｅｗｉ８／Ｂｒｏｗｎ　Ｎｏｒｖｅｇｉａｎラット から心臓を取り出す。それぞれの心臓を実施例１のＴＧＦ−β溶液のいずれかに より室温で直ちにインキュベートする。このインキュベートは２４〜４８時間行 う。この心臓をＰＢＳで２回洗浄してＴＧＦ−β溶液を含まないようにし、直ち に通常の心臓移植手術によってＣ３Ｈ／ＨｅＪ　ＢＡＬＢ／ｃマウスの耳および Ｆ　Ｉ　Ｌｅｗｉｓ／Ｂｒｏｗｎ　Ｎｏｒｗｅｇｉａｎラット（これから心臓を 取り出した）の大動脈に移植する（マウスの心臓は別の同種異系マウスに供し、 ラットの心臓は別の同種異系ラットに供する）。これらの移植体は移植の３ケ月 後に拒絶されない。

別法では、抽出後に心臓を、Ｆ　１ｕｏｓｏｌＤ　Ａ　２０％（Ｇｒｅｅｎ　Ｃ ｒ。

ｓｓ；日本）などのパーフルオロ化合物エマルジョン中で保存し、移植前にＴＧ Ｆ−β溶液の１つを最終エマルジョン中のＴＧＦ−βが少なくともｌｎｇ／ａｔ になるに十分な量で加える。

国際調査報告 国際調査報告

Claims (51)

【特許請求の範囲】
1. １．治療学的有効量のトランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）を含有 する組成物で移植体を処理し、そしてこの移植体を適合宿主に移植することから なる方法。
2. ２．移植体が組織である請求項１記載の方法。
3. ３．移植体が皮膚である請求項１記載の方法。
4. ４．処理が皮膚の下側表面に組成物を塗布することからなる請求項３記載の方法 。
5. ５．組成物がポリサッカリドを含有する請求項４記載の方法。
6. ６．移植体が単離細胞からなる請求項１記載の方法。
7. ７．移植体が島細胞からなる請求項６記載の方法。
8. ８．移植体が器官である請求項１記載の方法。
9. ９．器官が心臓、肝臓、脾臓、膵臓、甲状腺葉、肺、腎臓、腸、血管、および食 道からなる群から選ばれる請求項８記載の方法。
10. １０．宿主が哺乳動物である請求項１記載の方法。
11. １１．哺乳動物がヒトであり、移植体がヒト供与体から得られるものである請求 項１０記載の方法。
12. １２．ＴＧＦ−βがヒトＴＧＦ−βである請求項１記載の方法。
13. １３．ＴＧＦ−βがＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２またはＴＧＦ−β３である請求 項１２記載の方法。
14. １４．処理工程がインビトロで少なくとも約１分間行われる請求項１記載の方法 。
15. １５．処理工程がインビトロで約１分〜約７２時間行われる請求項１記載の方法 。
16. １６．組成物が有効量の免疫抑制物質をさらに含有している請求項１記載の方法 。
17. １７．免疫抑制物質が、２−アミノも−６−アリール−５−置換ピリミジン、グ ルタルアルデヒド、アザチオプリン、ブロモクリプチン、シクロホスフアミド、 主組織適合性コンプレックス抗原に対する抗イディオタイプ抗体、シクロスポリ ンＡ、ステロイド、抗インターフェロン−抗体、抗腫瘍壊死因子−α抗体、抗イ ンターロイキン−２抗体、抗サイトカイン受容体抗体、抗腫瘍壊死因子−β抗体 、抗Ｉａ抗体、異種の抗リンパ球グロブリン、ｐａｎ−Ｔ抗体、ＣＤ４に対する 抗体、ストレプトキナーゼ、ストレプトドルナーゼ、または宿主由来のＲＮＡも しくはＤＮＡである請求項１６記載の方法。
18. １８．免疫抑制物質が、シクロスポリンＡ、グルココルチコステロイド、ＯＫＴ −３モノクローナル抗体、アザチオプリン、ブロモクリプチン、異種の抗リンパ 球グロブリン、またはその混合物である請求項１７記載の方法。
19. １９．組成物が酸性である請求項１記載の方法。
20. ２０．組成物のｐＨが約４〜約６である請求項１９記載の組成物。
21. ２１．組成物が該物質のパーフルオロ化合物エマルジョンである請求項１記載の 方法。
22. ２２．処理工程の後、移植工程の前に、該物質を含まないように移植体を洗浄す る工程をさらに含有する請求項１記載の方法。
23. ２３．治療学的有効量が１ｐｇ／ｍｌ〜１ｍｇ／ｍｌである請求項１記載の方法 。
24. ２４．宿主が、移植前に供与体特異的な血液の輸血または全リンパ照射を受ける 請求項１記載の方法。
25. ２５．移植体供与体と宿主のＨＬＡＩＩ型抗原が一致している請求項１１記載の 方法。
26. ２６．宿主が、移植前に供与体特異的な血液の輸血または全リンパ照射を受ける 請求項２５記載の方法。
27. ２７．移植後に有効量の免疫抑制物質を宿主に投与する工程をさらに含有する請 求項１記載の方法。
28. ２８．移植後に有効量の免疫抑制物質を宿主に投与する工程をさらに含有する請 求項２６記載の方法。
29. ２９．免疫抑制物質が、ＴＧＦ−β、２−アミノ−６−アリール−５−置換ピリ ミジン、グルタルアルデヒド、アザチオプリン、ブロモクリプチン、シクロホス フアミド、主組織適合性コンプレックス抗原に対する抗イディオタイプ抗体、シ クロスポリンＡ、ステロイド、抗インターフェロン−抗体、抗腫瘍壊死因子−α 抗体、抗インターロイキン−２抗体、抗サイトカイン受容体抗体、抗腫瘍壊死因 子−β抗体、抗Ｉａ抗体、異種の抗リンパ球グロブリン、ｐａｎ−Ｔ抗体、ＣＤ ４に対する抗体、ストレプトキナーゼ、ストレプトドルナーゼ、または宿主由来 のＲＮＡもしくはＤＮＡである請求項２７記載の方法。
30. ３０．免疫抑制物質が、ＴＧＦ−β、シクロスポリンＡ、グルココルチコステロ イド、ＯＫＴ−３モノクローナル抗体、アザチオプリン、ブロモクリプチン、異 種の抗リンパ球グロブリン、またはその混合物である請求項２９記載の方法。
31. ３１．宿主に免疫抑制物質を継続的に注入する請求項２７に記載の方法。
32. ３２．免疫抑制物質のパルス注入を宿主に行う請求項２７に記載の方法。
33. ３３．免疫抑制物質の投与量が減少するようにパルス注入を行う請求項３２記載 の方法。
34. ３４．元の移植体を得た哺乳動物種とは異なる哺乳動物種に移植体を移植する請 求項１記載の方法。
35. ３５．移植体がヒト以外の哺乳動物種から得たものであり、これをヒトに移植す る請求項３４記載の方法。
36. ３６．処理工程の後、移植工程の前に、処理した移植体を保存する工程をさらに 含有する請求項１記載の方法。
37. ３７．トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ−β）を含有する組成物で処理し た移植体。
38. ３８．組織、単離細胞、骨髄、または器官である請求項３７記載の移植体。
39. ３９．組成物が、免疫抑制物質ならびに移植体上の自己抗原を遮蔽するかまたは その発現を下方調節する物質をさらに含有する請求項３７記載の移植体。
40. ４０．免疫抑制物質が、２−アミノ−６−アリール−５−置換ピリミジン、グル タルアルデヒド、アザチオプリン、プロモクリプチン、シクロホスフアミド、主 組織適合性コンプレックス抗原に対する抗イディオタイプ抗体、シクロスポリン Ａ、ステロイド、抗インターフェロン−抗体、抗腫瘍壊死因子−α抗体、抗イン ターロイキン−２抗体、抗サイトカイン受容体抗体、抗腫瘍壊死因子−β抗体、 抗Ｉａ抗体、異種の抗リンパ球グロブリン、ｐａｎ−Ｔ抗体、ＣＤ４に対する抗 体、ストレプトキナーゼ、またはストレプトドルナーゼである請求項３９記載の 移植体。
41. ４１．免疫抑制物質が、シクロスポリンＡ、グルココルチコステロイド、ＯＫＴ −３モノクローナル抗体、アザチオプリン、ブロモクリプチン、異種の抗リンパ 球グロブリン、またはその混合物である請求項４０記載の移植体。
42. ４２．組成物が酸性である請求項３９記載の移植体。
43. ４３．移植体が皮膚であり、宿主に適用しようとする皮膚の下側表面に組成物を 塗布する請求項３７記載の移植体。
44. ４４．組成物がポリサッカリドを含有する請求項４３記載の移植体。
45. ４５．組成物がパーフルオロ化合物エマルジョンである請求項３７記載の移植体 。
46. ４６．移植体を組成物で灌流する請求項３７記載の移植体。
47. ４７．哺乳動物から得られる請求項３７記載の移植体。
48. ４８．ヒトから得られる請求項４７記載の移植体。
49. ４９．ＴＧＦ−βがヒトＴＧＦ−βである請求項３７記載の移植体。
50. ５０．ＴＧＦ−βがＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、またはＴＧＦ−β３である請 求項３７記載の移植体。
51. ５１．パーフルオロ化合物エマルジョン中にＴＧＦ−βを含有する組成物。