JPH04501135A - ゲルのキャスティング方法及び装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ゲルのキャスティング−”　び 」１：旦■且立互 本発明はゲルキャスティングの分野であり、特にゲル電気泳動のための狭い毛管 システム中のゲルをキャスティングするための装置及び方法に関し、システムは ＤＮＡ及びタンパクなどの高分子の分析及び分離のための装置での使用に特に適 している。

及五立！景 電気泳動法を用いる生物学的サンプルからの高分子の分離は、少な（とも２０年 間比較的普通に行われており、多くの異なった装置及び技術が開発され、種々の 所望の目的が達成されてきた。初期の技術では、薄いゲル平板に電界を作り、分 析される材料のサンプルをゲルの一端に置いていた。高分子は、電荷、大きさ及 び異なる種の相対質量及び高分子種の形状などの多くの変数に依存する適切に調 製されたゲル中では変化のある動きを示すが、この動きは強い電界によって影響 を受け得る。この変化のために、異なる種は異なる速さでゲルの中へ及びゲルを 通って動き、ゲルを通って動く場合に明瞭な帯（ｂｉｎｄｓ）を形成して分離が 達成される。この分離帯はそれぞオリジナルのサンプルの一部であるのでフラク シヨンと呼ばれることもある。

ゲル中で分離が達成された後、電界は中止され、ゲルは使用されるあらゆる支持 から取り除かれることができる。フラクシヨンを識別可能とするための技術とし て、染色及び放射性標識付けなどがあり、スペクトルが記録され得る。そのよう なスペクトルを、そのような材料の既知の混合物及び濃度から生成された経験に 基づ（スペクトルと比較することによって、実験サンプルからのフラクシヨンご との材料が識別されることができる。ゲル柱の端部まで動いても分離されたフラ クシヨンの帯の連続溶出のための技術も発達してきた。

当該分野において、ゲル装置は多くの異なった形を取ることができ、各種の異な るデザインの中でもゲル領域の最も一般的な外形は、ゲル平板及びゲル柱である 。これらの構造は、液状材料の若干のゲル化された状態への硬化を促進する１種 またはそれ以上の反応剤を含む化学薬品を最初に混合することによって通常調製 される。その後、チューブ等の支持構造がこの混合物によって満たされ、反応が 起こって支持構造中でゲルが形成される。典型的には、出発材料はモノマー、１ 種又はそれ以上の様々な架橋剤、及び界面活性剤である。典型的には、水溶性バ ッファが含まれており、電気泳導システムにおいてゲルの外側で使用され得るバ ッファに適合した電導媒体をゲルに提供する。変性用薬剤として尿素などの他の 化学薬品も同様に含まれることができる。ゲルは翼なる組成でもよく、２種の一 般的な組成物はポリアクリルアミド及びアガロースである。但し、アガロースは 厳密にはポリマーゲルではない。

ゲル電気泳動において、ゲルはイオン性バッファを含む水性溶液中でキャストさ れるのが一般的であり、電位がゲルを横切ってかけられる。電位はゲルを通して 分子を移動させる力であり、電流も含む。従来のシス“テムにおける電流の流れ は、数ミリメートル以上の厚さ及び直径を有するゲル平板及びゲル柱を用いる場 合、ジ品−ル熱のために多くの点で問題であった。例えば、そのような熱はゲル 構造の歪み、及びその後の分離工程の妨げの原因となり得る。ジュール熱の影響 を克服するために、熱を取り除くための精巧な要素及び構造を備えているので、 電気泳動装置は複雑で巨大になりがちである。

当該分野において、熱の問題は装置構成の小型化及びゲル構造の小型化に向けら れている。現在のところ、当該産業はゲルを満たした極薄平板及び矩形の筒型毛 管の使用を目指している。原理的には、ゲルの容積に対する支持構造の表面積は 従来の構造におけるものよりも大きいので、薄壁で直径の小さい構造が非常に効 果的であると証明されるはずである。

単位体積ごとに発生される熱は同じであるが、ゲルからの熱の移動は促進される はずである。これらの薄い構造において、平板の好ましい厚さ及び毛管の好まし い直径は数十から数百ミクロンの範囲である。最近の多くの刊行物はゲルの電気 泳動のための小さい大きさの毛管の優劣を論じている。例えば讐Ａ、Ｓ、Ｃｏｈ ｅｎ及びＢ、Ｌ、ＫａｒｇｅｒによるＪ、Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、３９ ７．４０９　（１９８７）並びにＳ、ＨＪｅｒｔｅｎらによるＪ、Ｃｈｒｏｍａ ｔＯｇｒａｐｂｙ、４０３．４７　（１９８７）を参照されたい。

生物医学的な分離手法のためのキャストゲルの有用性は多くの変数に依存する。

例えば、相対的な架橋度は高分子の移動に重要であり、ゲルの均一性も！要であ るかもしれない。

多くの場合、ゲルは、典型的にはガラス又はプラスチックである支持構造の壁に しっかりと密着されなくてはならず、ゲル材料は電気浸透のためにシステム中に おいて移動しない。

この分野において、Ｈｊｅｒｔｅｎら（同書）に報告されているようにいくらか の研究がなされている。ＨＪｅｒｔｅｎらはサンプル溶質を井戸に押し付は密着 する際の壁の処理のメチルセルロース又は線状ポリアクリルアミドを含んでいる 。

また、ゲルは連続していな（ではならない。特に全体の直径及び厚さが小さい毛 管の場合、空隙が現れるとゲル構造が役に立たなくなる可能性がある。空隙は電 気回路の連続性の異常を引き起こし得るか、又は移動によって高分子帯の性質が 大きく変化し得る。ポリマー化の動力学及び生成ゲルの性質に関する詳細な基本 的研究が文献中に報告されているにもかかわらず、そのような空隙の出現は、毛 管システムにおいてそのようなゲルを調製する際に特に困難な問題である。（例 えば、Ａ、Ｃｈｒａｍｂａｃｈ及びＣ，Ｒｏ　ｄ　ｂ　ａ　ｒ　ｄ。

５ｅｐａｒａｔｉｏｎ　５ｃｉｅｎｃｅ、７，２１３　（１９８１）、Ｃ，Ｇｅ １ｆｉ及びＰ、Ｇ、Ｒｌｇｈｅｔｔｌ、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ、２， ２１３及び２２０（１９８１）、並びにＰ、Ｇ、Ｒｌｇｈｅｔｔｌ、Ｅｌｅｃｔ ｒｏｐｈｏｓｉｓ、２，２９１　（１９８１）を参照。）これらの問題全てはゲ ル構造のキャスティングにおいて克服される必要がある。必要なのは、信頼性が あるゲル構造を調製するための装置及び方法であり、そこでは架橋の程度が制御 され、最も重要なのは結果として空隙のない構造を生ずることである。

Ｒ朋ヱロ」巨 本発明の好ましい実施例に従って、方法及び装置は、実質的に低減された応力を 有し空隙のないゲルを、閉じ込められた支持構造においで、特に、狭い孔の毛管 及び薄い平板形構成においてキャスティングするためのものである。好ましいモ ードにおいて、ゲルを含むための支持構造はエネルギーを透過する材料から成る 壁を有する。

この方法に従って、ゲルをキャスティングする工程はゲル化材料を含む混合物で 支持構造を満たす工程を包含しているので、支持構造において混合物は第１の位 置から第２の位置まで連続している。その後ゲル混合物は第１の位置から第２の 位置へ順次ポリマー化される。

好ましいモードにおいて、支持構造はエネルギーを透過する壁を有し、混合物は エネルギーを吸収することによってゲル化を促進する。支持構造が満たされると 、エネルギーが壁の位置の一局部に与えられる。支持構造及びエネルギー供給源 はその後、互いに相対して移動されるので、供給源からエネルギーを受け取る局 部は壁の第１の位置から第２の位置へ向かう方向に壁に沿って移動される。これ によって、局部が移動するにつれて局部に順次隣接する移動ゾーンのゲル化混合 物中でゲル化が引き起こされる。

好ましいモードにおいて、ゲルは主として多くの架橋剤のいずれかによって架橋 されたポリアクリルアミドである。また、ゲルは、バッファ（例えば、トリスフ ォスフェート又はホウ酸）、表面活性剤及び生体高分子の分離において有用な他 の機能的化学薬品から選択されたものを含んだ水性溶液中でキャストされること ができる。好ましいモードにおいて、キャストされたゲルは表面カップリング剤 によって支持構造の壁と共有結合してしっかりと密着される。

この方法は、ゲル前駆体混合物の微分スライス（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ　５ ｌｉｃｅｓ）の連続したポリマー化によるものである。従って、ゲル前駆体混合 物の隣接部分は、支持構造の壁の第１の位置から始まり支持構造の壁の第２の位 置まで連続的にポリマー化され、最終的にはその間にある混合物全体がゲル化さ れる。

支持構造のうち、この微分キャスティング（ｄＩｆｆｅｒｅｎｔｌａｌＢｓｔｌ ｒＬｇ）工程の間にポリマー化されない部分又はわずかじかポリマー化されない 部分は、粘着性が低く高移動性液体で満たされている。その後、ポリマー化され た部分及びポリマー化する部分による収縮は、粘着性の低い材料が徐々に流れ込 み収縮による体積損失を再充填することによって埋め合わせられる。壁コート剤 とのカップリングによってつなぎ留める反応は、ゲル化の前部がチューブに沿っ て進むにつれて同時に起こる。

好ましい実施例において、この微分活性化工程には詳しくは２つのアポローチが ある。第１の実施において、ポリマー化は熱によって、例えば、促進剤を用いて 過硫酸（過硫酸アンモニウム又は過硫酸カリウム）などのベルオキソ化合物の遊 離基分解によって開始される。、好ましいモードにおいて、熱の勾配に曝されて いない支持構造の部分は冷た（保たれて、ポリマー化されない反応混合物は可動 状態に保たれる。加熱されるとすぐに、反応が急速に起こりゲル化が誘発される （収縮を伴う）。熱の前部の移動速度は制御されるので、冷たい部分からの低変 質材料の移動の速度は、収縮によって引き起こされる体積補充の要求の速さと揃 えることができる。

第２の実施において、熱活性化工程を使用せずに、反応混合物は光活性化剤、例 えば、リボフラビンを含む。その後、エネルギー供給源は光活性化のために必要 な周波数を有する電磁放射の供給源を備えている。前述の実施例のように、供給 源及び支持構造は互いに相対的に移動され、微分活性化工程を達成する。

図面の簡単な説明 第１Ａ図は、ゲル化される液体を充填した毛管の断面図である。

第１Ｂ図は、液体混合物がゲル化された後の第１Ａ図のチューブの断面図である 。

第２Ａ図は、移動前部でゲル化が起こつている毛管の断面図である。

第２Ｂ図は、ゲル化が完了した後の第２Ａ図のチューブの断面図である。

第３Ａ図は、処理が開始される前の、加熱によって支持構造内の液体混合物をゲ ル化するための装置を示している。

第３Ｂ図は、処理の後の第３Ａ図の装置を示している。

第４図は、紫外線放射によって支持構造内の液体混合物をゲル化するための装置 を示している。

第５図は、平板ゲルをキャストするための支持構造を示している。

しい　の１１日 前に示したように、ゲル構造のキャスティングにおいて、特に体積比に対して高 い表面積を有する毛管装置などの極端に小さい構造において共通して現れる問題 の中でも、空隙の出現が特に重大である。キャスティング手法において現れる空 隙は液体混合物中に混入したガスを放出した結果であると多くの人によって考え られてきたので、それらの装置及び手法は、硬化する前又は硬化中に混合物のガ ス抜きをして、そのような油溶性又は混入ガスの全てを取り除くように具体化さ れてきた。また、ガスはポリマー化反応の間に生成されると考えられてきた。ガ ス抜きをするそのような装置は、排気装置及び容器が組み込まれているのでしば しば高価であり、手順は時間もかかりコストもかかる。本発明を目指す調査にお いて、ゲルキャスティングの工程で出現する泡状の空隙はガス抜きによって起こ る空隙ではなく、ゲル化工程での材料の収縮による空隙であることが最も通例で あることが分かった。ゲル化以前の液体混合物の重量及び体積測定、及びゲル化 が起こった後の同一混合物の重量及び対積測定など比較的簡単な分析技術から、 ポリマー化の結果として重大な収縮は、例えば、純粋なゲルに対しては２０％以 上、１０％ゲルに対して２％起こることが分かる。材料の収縮は、特に材料が毛 管の壁又は他のチューブ又は表面に密着される場合、引っ張り応力を引き起こし 、それが充分に大きいと空隙が発生する。

発生した空隙はゲル化された材料の張力を軽減する。

第１Ａ図は、混合物の主な成分要素をゲル化させるゲル化剤を含む材料の液体混 合物１３で充填された毛管１１の部分断面の側面図である。先ず、チューブの両 端に小さなメニスカス１５及び１６をもって液体はチューブを満たす。液体の体 積は、はぼ毛管の内孔の体積（メニスカスは無視する）であり、孔の面積をチュ ーブの長さ倍したものである。

第１Ｂ図は、液体混合物がゲル化された後の同一チューブを示している。ゲル１ ７は固形材料に使われる斜線で示されている（実際はゲルは相当に可撓性を有す る物質である）。

ゲル化の工程で収縮が起こり、収縮が起こらないように強制されていても、ゲル １７は当初の液体よりも占める体積が小さくなる。実際、１つのそのような強制 がある。ゲルは毛管の孔の壁に密着されている。

この例において、材料の全てはほぼ同時にゲル化され、壁への密着はゲル化の時 点で行われた。材料がゲル化し、その結果収縮するにつれて、壁にある材料は壁 に対して移動できなくなり、その材料は隣接する材料との柔軟な密着を形成した 。それ故に、壁にある材料は壁から離れた材料よりも比較的高く応力が加わって いる。最も動きの自由度がない孔の中心付近の材料は圧力が最も低い。中心付近 の材料に対する圧力の低さの一部は、末端抑制がないという事実の結果であるの で、チューブの両端のゲル化された材料は末端側面１９及び２０によって実質的 に示される逆の形となる。

非常に短いチューブ、及び相対的に直径が大きいチューブでは、末端の動きは工 程において唯一の応力軽減の形態であり得る。しかしながら、毛管における直径 に対する長さの比は非常に大きく、末端の動きは、応力低減のために必要な全体 積収縮の極少量を補充することができるのみである。例えば、抑制されないシス テムにおける体積収縮のパーセントが５％であれば、応力のないゲルを作るため には、末端の動きは孔の全体積の５％でなくてはならない。しかしながら、典型 的な場合には、毛管内の末端の動きは収縮体積を補充するために必要な動きより も非常に少ないので、得られるゲルは高く応力がかかっているか、又は他の応力 低減機構が現れる。

一般に、結果は、ゲル中の応力は材料の分子間の凝集力に打ち勝って空隙が現れ 、多くの泡のように見える空隙は、ゲル化が起こるにつれてガスが材料に放出し たように見える。

第１Ｂ図に示される空隙２１及び２３はこの引き裂きの効果を示している。典型 的には、この空隙はゲル化の後よりもゲル化の進行時に現れる。これは、ゲルが ポリマー化進行時に張力を得るために起こると考えられており、張力が強いほど 、引き裂かれて空隙を作ることなく、より高い引っ張り応力を支えることができ るからである。また、空隙形成時に材料のこのやり方における空隙の形成が圧力 をすべて低減するわけではないことも事実である。

本発明において、毛管及び平板形システムのためのプレートの間の液体システム は、移動前部に沿って微分的なやり方でゲル化させるので、移動するゲルゾーン の材料の先端は液体のままであり、前部が通過した材料はゲル化される。移動す るゲルゾーンのまだ液体である材料の先端は、その後そのゾーンに収縮の速度と 同じ速度で流れることができ、空隙のない圧力のかからないゲルが作られる。

第２Ａ図は、第１Ａ図に示されるものと類似した毛管２５である。先ず、第２Ａ 図のチューブは、第１Ａ図においてチューブを充填した液体混合物と同じ液体混 合物２７で満たされるので、混合物は、チューブの壁に沿った第１ポイントから 第２ポイントまで連続して、この場合は一端から他端までチューブに満たされる 。長さが直径よりも長いことを示すために毛管は分断して示されている。ゲル電 気泳動のための毛管の典型的な長さは１５ｃｍであり、典型的な孔はｔｏｏｔク ロンである。

第２Ａ図に示されるシステムにおいて、液体混合物はほぼ同時にゲル化されるわ けではない。むしろ、ゲル化は面２９で示される薄い移動する前部で起こり、矢 印３１の方向に移動する。ゲル化前部は液体を充填された毛管の一端、この場合 は端部３３から開始され、他端部３５へ所定の速さで進む。

ゲル化前部が通過すると、液体材料はゲル化し、ゲル化前部の“後ろ”になる材 料３７はゲル化された材料である。毛管の内壁への密着はゲル化が起こるのとほ ぼ同時に起こる。

ゲル化が収縮を伴って起こるという事実は、移動前部の“前方”の液体材料２７ は前部に向かって、つまり矢印３９の方向へ流れて体積損失を補充しなくてはな らないことを示している。前部の前方の材料は液体であるという事実によってこ の流れが起こることが可能であり、従って、圧力が低減され液体材料をすべて同 時にゲル化する場合に現れる泡状の空隙が解消される。

第２Ｂ図は、ゲル化前部がチューブの全長を通過した後の第２Ａ図の毛管の状態 を示している。液体混合物のすべてがゲル化されており、ゲル化が最後に起こっ たチューブの端の充填されていない長さＤ２で表される空間はゲル化工程のため の体積収縮である。当初は液体混合物で充填されていたチューブの長さＤｌに対 するＤ２の比は、ゲル化工程におけるフラクションの収縮と同じである。言い換 えると、ゾーンゲル化工程の間、毛管の一端を、ゲル化する混合物の容器と接触 するように保たなければ、ゲル化において混合物の収縮が３％の場合にはＤ２は Ｄｌのほぼ３％である。

ゲル化が移動前部で引き起こされ得る１つの方法は、ゲル化の速度が温度の関数 である液体混合物を使用することである。毛管の長さ又は２枚の平らな表面間の 空間は混合物で満たされ、液体混合物を充填された支持構造は、処理が始まるま では水槽への浸漬などによって低い温度に保たれる。支持構造はその後加熱ゾー ンを通して引き出され、第３Ａ図及び第３Ｂ図に実質的に示される方法で、移動 前部でゲル化が起こる。実際には、加熱ゾーンの長さは典型的には約２．５ｃｍ から５ｃｍ（１インチから２インチ）であり、その理由は、この大きさが抵抗ヒ ーターの都合のよい大きさであるからである。しかし、加熱ゾーンとしてはこれ より長さが長くても短くても使用できることは勿論である。必要なこと１よ、ゲ ル化ゾーンが、ゾーンがチューブ長に沿りて移動される時に収縮の補充ができな い程良（ないことである。

第３Ａ図は本発明の好ましい実施例としての装置４１であり、移動前部で液体混 合物のゲル化が起こるように熱が使用される。毛管４３の長さは液体混合物で満 たされており、ゲル化の速さは温度の関数である。プラスチック毛管も使用され 得るが、典型的な場合には、溶融石英又はガラス製で孔の直径１０ミクロンから １０００ミクロンの毛管が使用され、本発明の概念は特定の孔の大きさに制限さ れないようである。

説明された装置中及び方法を用いてよく機能する混合物の例は、以下の通りであ る。

（１）モノマー：アクリルアミド（１０％Ｗ／Ｖつまり１０１ｍ５／１００ｍ１ ） （２）コモノマー／架橋剤：ＮＳＮ’−メチレンビス−アクリルアミド（ビス、 ３％Ｗ／総固体重量）（３）イニシエータ：アンモニウム過ｉｔ酸（ｏ、０５％ Ｗ／■） （４）コイニジエータ／促進剤：　ＮＳ　ＮＳＮ’、Ｎ′−テトラ−メチル−エ チレン−ジアミン（ＴＥＭＥＤ％　０．０６％ｖ／ｖ、ツまり０．０００８ｍＪ ／ｍ１）（５）表面活性剤：　ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ、Ｏ。

１％Ｗ、／Ｖ） （６）バッファ：　トリス／フォスフェート（０，１Ｍ）（７）改質剤：尿素（ ７Ｍ） この具体例としての混合物に対して、１００ミクロンの溶融石英製の毛管が使用 され、加熱ゾーンの温度は摂氏４３度であり、引く速度は０．８ｃｍ／分、及び 加熱ゾーンの長さは５ｃｍ（２インチ）である。

当業者には、本発明の概念が、ゲル前駆体の混合物を形成する上記特定の混合物 には制限されないことは分かるであろう。一般に、ポリマー化の際に収縮するモ ノマーはどれでも使用されることができる。従って、最小限のセットとして、必 要なものは、モノマー、及びステップ工程によって又は添加によってモノマーの 鎖を長くさせるように活性化する活性化剤である。この例において、活性化剤は モノマーの二重結合を切るイニシエータであり、その工程は遊離基による開始の 手段によってポリマー化され得るこれらのモノマーによって特徴付けられる。こ の実施例において、遊離基による開始は熱分解イニシェークによって引き起こさ れる。ゲル電気泳動を泪いる生体分子の分離のために、水溶性ビニルモノマーが 特に有用であり、他の例には、アクリルアミド、メタクリル酸、ビニルアルコー ル、ビニルアセテート、メタクリルアミド、２−オキサプリン及びビニルピロリ ドン又はメチルピロリドンなどのピロリドン誘導体が含まれる。好ましい実施例 のアクリルアミドモノマー及びこれらの水溶性モノマーに対して、典型的な濃度 は、３から２０％Ｗ／Ｖの範囲である。

ラテックスなどの他のモノマーに対しては、典型的なモノマー濃度は５０％Ｗ／ ｖはどの高さで有り得る。（上記の好ましいモードの例の１０％Ｗ／Ｖ以上は、 分離されるべきサンプルに含まれた高分子のタイプに基づいて選択されたもので ある）。他の溶剤、例えば、メタノール及びアセトニトリルも使用されることが できる。同様に、非水溶性モノマーの中にはスチレン、メチルメタクリレート及 びシランが含まれる。

概して、ゲルの基本構造はモノマーによって決定される。

従って、この適用において、ポリマーゲルを用いる他の適用のように、本願に於 いては、コモノマー又は架橋剤が、分離される高分子の性質に基づいて、ゲルの 基本構造を変えるために使用される。ポリアクリルアミドゲルに対して、Ｎ、　 Ｎ゛−ビスアクリリルシスタミン（ＢＡＣ）、Ｎ、、Ｎ’　−ジアリル酒石ジア ミン（Ｄ　Ａ　Ｔ　Ｄ）、Ｎ、Ｎ’　−（１，２−ジヒドロキシエチレン）ビス アクリルアミド（ＤＨＥ　ＢＡ）　、エチレンジアクリレート（ＥＤＡ）などの 他の周知の架橋剤も効果がある。これら全ての架橋剤に対して、典型的な濃度の 範囲は２〜５％重量／総固体重量である。当業者は、所望の構造及び行われる分 離の性質に応じて他の濃度も使用され得ることは理解されるであろう。

他のイニシェークも、使用されたモノマー／架橋剤の組合せに適当であれば使用 されることができる。上記組合せに対して、例えば、過硫酸カリウムがイニシエ ータとして過硫酸アンモニウムに置き換えられることができる。しかしながら、 概して、一般のポリマー化反応のための熱分解イニシエータとして有用な化合物 の種類は幾分限られ、典型的に使用される他の種類はｏ−ｏ、ｓ−ｓ、又はＮ− ０結合を有するものである。なぜなら、これらの化合物の種類は１００−１７０ ＫＪ１モルの範囲の結合解離エネルギーを示すからである。

より高い又はより低い結合解離エネルギーを有する化合物は典型的に解離が遅す ぎるか又は速すぎる。この一般法則の顕著な例外は、２．２’　−アゾビスイソ ブチロニトリル（ＡＩＢＮ）などのいくつかのアゾ化合物であり、これは約２９ ０ＫＪ１モルのＮ＝Ｎ結合の解離エネルギーを有するが、ホモリシスのための推 進力は安定性の高い窒素分子の形成にある。

これらの化合物は、分離の目的のためのポリマーゲル形成のために使用される場 合に同様に働くことが予期される。熱開始ポリマー化が使用されるより一般的な ポリマーシステムに対して、典型的にはペルオキシドが選択されたイニシェーク である（例えば、アセチルペルオキシド及びベンゾイルペルオキシドなどのアシ ルペルオキシド、クミルペルオキシド及びｔ−ブチルペルオキシドなどのアルキ ルペルオキシド、ｔ−ブチル及びクミルヒドロペルオキシドなどのヒドロペルオ キシド、及びｔ−ブチルベルベンゾエートなどのベルエステル）。

同様に他の促進剤も架橋のための触媒として、特に架橋反応をより強い温度の関 数とする触媒として使用される。架橋剤の使用は、ゲルを使用期間中より安定に する傾向があり、ゲルのために有効なボアの大きさを作ることに貢献する。Ｔｒ 　１　ｔ　ｏ　ｎ−ｘ％Ｔｗｅ　ｅ　ｎ−ｘ及びＢｒ１Ｊ−ｘなどの表面活性剤 としてもよ（機能する広範囲の石鹸状の分子もある。

これらの表面改質剤が使用されて水と高分子との相互作用、高分子同士の相互作 用、その環境と高分子との相互作用の性質を変える。なぜなら、これらの分子は しばしば疎水性であり水溶液中では互いにくっつく傾向があるからである。表面 活性剤は、溶質がゲルを下方に移動し得る個々の分子に分れるのを助ける。同様 に、いくつかの分子は特定のイオンと結合する傾向があるので、他の適当なバッ ファもｐＨ安定化のために使用されることができるか、又はイオン化の強さを制 御するために使用されることができる。他のバッファのいくつかの例はホウ酸塩 、フォスフェート、クエン酸塩、炭酸塩などが含まれる。

各種改質剤もまた使用されることができ、それらは概して分析されるモノマーの タイプに依存し、ゲル材料中の他の化合物と溶質との相互作用がどれほど変化さ れるかに依存する。

めることであり、これは毛管に注入された全てのタンパク溶質の変性を確実にす ることを助ける。一般法則として、生体分子が分離されることが予想されていな （ても尿素は不必要であり、その場合でさえ分離はそれを用いずにしばしば達成 され得る。生体分子分離のための他の有用な改質剤は、グアナジンであり、典型 的に５Ｍであり、それは時には尿素と組み合わせて使用される。当業者は分離工 程の性質を制御または変化させるために使用され得る他の有用な改質剤が多くあ ることは分かるであろう。例えば、他の有用なモディフィアはアルコール及びア セトニトリルを含む。

壁カップリング剤の使用は、ゲルがその後壁によって正しい位置にしっかりと保 持されるので、生成されるゲルの安定性を非常に高めることが分かっている。そ のような壁カップリング剤の使用は当該分野において共通に行われている。しか しながら、本発明の付加的な利点は、使用された好ましい壁カップリング手法の 簡素化である。特にゲルとなる上記材料の混合物で毛管を満たすに先だって、ス トレートな（純粋な）又は、希釈された３−メタクリルオキシ−プロピルトリメ トキシシラン（ＭＡＰＴＭＳ）（、アセトン溶液中）が毛管を被覆するのに使用 される。毛管はその後空気乾燥され、摂氏１３０度で３時間オーブンで加熱され 、ＭＡＰＴＭＳの毛管の壁表面へのカブプリングが行われる。ＭＡＰＴＭＳは強 い壁への密着と、壁に隣接した高密度で高度に架橋したゲルの密着を促進する。

簡単ではないが、他の壁カブプリング剤及び手法もまた使用されることができる 。例えば、他の方法は、アミノプロピルトリメトキシシラン又はアミノプロピル トリエトキシシランを壁と共有結合させる方法である。その後、Ｎ−アクリルオ キシスクシミドが置換反応を引き起こすために使用される。これに続いて、ジエ チルアクリルアミドを用いて処理がなされ、壁土の材料の架橋が引き起こされる 。

上記手法のすべてにおいて、壁の表面を化学結合によって壁と直接カップリング した２重結合で覆われたままにしておくことが目的である。これらの２重結合は 、微分ゲル化工程においてアクリルアミドモノマー及び架橋結合と反応すること ができる。

ひとたび壁が処理されると、その後毛管はゲル化する混合物を充填され、キャス ティング工程が始められる。好ましいモードにおいて、毛管内でゲル化されるべ き材料からなる液体混合物は、調製の間（図示されない）及び毛管４３への注入 の間中（これも図示されない）は水槽部ｆ１１．（摂氏０度）に保たれる。注入 はシリンジなどの圧力装置によって、又は毛管の一端を液体混合物に浸して他端 に真空を作る等の、圧力差を生ずる方法によって行われる。チューブが満たされ ると、チューブは冷室４５に冷室の開口部４６を通して置かれる。

リーダー４７が毛管に取り付けられ、ひとたび工程が開始されると冷室から毛管 を引き出すためのアタッチメントとして働く。リーダーは満たされない毛管の長 さ、又は毛管とほぼ同じ外径の固形ロッドであり得、リーダーを毛管に取り付け る適当な方法はい（つかある。例えば、可撓性の短いチューブで外径を覆う又は 内径内に可撓性の短いロッドを取り付けるなどである。説明された実施例におい て、取り付はポイントはリーダーと毛管との間のポイント４４である。代わりに 、より長い毛管を用いればリーダーを用いなくてもよい。

好ましい実施例において、リーダー４７は支持スライド４９を越えて、活性化シ ステム５１を通り、第２支持スライド５３を越えて、推進ローラ５５とアイドラ ーローラ５７とからなる１セツトのローラ内を通過する。推進ローラはベルト６ ３を通して電気モーター６１によって駆動される。好ましいモードにおいて、モ ーターはスピードコントロール（図示されない）を有する。

好ましい実施例において、活性化システム５１は抵抗ヒーターを有する熱リング であり、電気コントローラー５９は熱リングに接続されている。他の活性化シス テムも熱活性化ゲル化のために使用され得、例えば、抵抗ヒーターにより加熱さ れサーモスタットで制御された流体も便利であり、又はレーザも使用され得る。

また、熱による活性ゲル化を用いない実施例では、ゲル化が光により活性化され る場合は活性化システム５１は光システム又はレーザであり得、又はゲルが輻射 よって活性化される場合は輻射ビームでさえあり得る。

全ての工程がなされると、熱リングは温度を上げられ、推進駆動が始められる。

液体を満たされた毛管が冷室から加熱ゾーンを通して引き出される。第２Ａ図及 び第２Ｂ図を参照して説明されたように、毛管４３中の液体材料は移動前部のみ でゲル化され、毛管中の液体のままの材料は反応（ゲル化）面へ向けて流れてゲ ル化のために起こる体積収縮を補充する。

第３Ｂ図は熱リングを完全に引き抜かれた毛管を示しており、毛管中のゲル化工 程は完了している。

前述のとおり、熱リングの温度は制御され、使用される温度は経験により決定さ れ、概して液体材料の組成、毛管からリングまでの距離、材料、孔及び毛管の壁 の厚さ及び毛管が加熱ゾーンを通って引かれる速度に依存する。説明された好ま しい実施例において、約摂氏４３度の温度が使用された。

他の状況では３０度はどの低さの温度が適切であり、好ましい温度の範囲は約摂 氏２５〜５０度である。

チューブが引かれ得る速さも同様に制御される。使用される毛管は２０〜５００ ミクロンの小さな孔を有しているので、送流が非常に困難であり、引く速度が速 すぎると液体送流が収縮を補充できなくなる。収縮による流量は実際の収縮パー セント、チューブの横断面面積及び引く速度の積であり、比較的容易に算出され る。収縮体積を補充するために充分な速度で移動前部へチューブを通して液体を 流す能力はチューブの開放端からゲル化前部への圧力差に関連する。圧力差は周 知の流体送流等式によって算出されることができ、粘度、液体送流のためのチュ ーブの長さ及び流速の積に正比例し、チューブの半径の第４の力に反比例する。

従って、毛管システムに関しては、混合物がゲル化中の収縮による体積損失を補 充するために充分流れることができるように、チューブの直径が小さくなるにつ れて送流する材料の粘度を充分低く保つことが重要である。操作上では、上記の 例において選択された特定の混合物に対しては、このことは、加熱反応ゾーンへ 導入される前に、毛管の未反応部分の混合物の温度はゲル化のための反応温度以 下によ（維持されるべきであることを意味している。実際には、これは、上記好 ましい混合物のための氷槽によって達成される。しかしながら、材料及び反応温 度の他の組合せに対しては、そのような温度は温度制御冷却システムによってよ りよく維持されることができ、又は反応温度が充分高く反応ゾーンのヒーターが 充分に制限されている場合には、環境温度以外では制御される必要がないことも あり得る。また、圧力差はチューブの冷却端部の流体を加圧することによって増 大されることができる。

上記混合物及び摂氏０度に維持された冷却ゾーン（氷）を用い、孔の直径、００ ５ｃｍのガラス毛管を用いる好ましい実施例において、混合物の液体部分にかか る圧力差の１つの制限として大気圧を頼りにしながら、引く速さは１分につき約 １ｃｍに維持され得る。

前述のように、感熱性混合物を用いて、チューブと加熱ゾーンとを相対的に動か しながら狭い部分で加熱することは、移動するゲル化前部を作る１つの方法でし かない。他の好ましい実施例においては、電磁放射の暴露の強い関数であるゲル 化速度を有する液体混合物が調製される。この実施例においては、ポリマー化は 光によって開始される。一般に、光開始は光吸収によってラジカルが生成される 場合に起こり、典型的には以下の２つの経路うち１つによって起こる。ａ）シス テム中１種またはそれ異常の化合物がエネルギー吸収つまり電子遷移によって励 起され、それに続いてラジカルへ分解によって励起される。及び／又はｂ）ｌｌ ｉまたはそれ以上の化合物が励起され、励起された種は第２の化合物と（エネル ギー移動又は酸化還元反応によって）相互作用して前者及び／又は後者の化合物 に由来するラジカルを形成する。この光開始工程に適応させるために、混合物は 、熱によって開始されるポリマー化のための上記混合物と同種である。但し、ス ペクトルの紫外線部分の光を吸収するリボフラビンなどの光イニシェークが、感 温性のイニシエータ及び促進剤の代わりに用いられている。使用され得る他の水 性光イニシエータもまた当該分野では周知であり、アゾ−ジカルボンアミド、１ ％１′−アゾビス（Ｎ、Ｎ−ジメチルフォルムアミド）、及び４．４′−アゾビ ス（４−シアノバレリアン酸）のナトリウム塩を含んでいる。

光開始工程のために使用され得る混合物の特定の例として、構成要素の組合せは 熱によって開始される上記混合物及び論じられたその等偽物の例のものと同じで あるが、イニシエータの代わりにリボフラビンが置かれている。好ましいモ・− ドにおいて、リボフラビンは０．００５ｍｇ／ｍｌの濃度で使用され、一般には ０．０００５ｍｇ／ｍｌから０．０４ｍｇ／ｍｌまで又はそれ以上に変えること ができ、上記他の光イニシエータも同様である。

第４Ａ図は熱による開始反応のための装置と類似した装置であり、感光混合物を 用いて使用される。毛管６５はイニシエータが感光性であることを除いては熱に よる開始反応のために説明された混合物と同じ液体混合物で満たされる。調製は 紫外線照射なしで行われ、混合され充填された後チューブは接合面６９でリーダ ー６７に取り付けられる。孔の内側のＭＡＰＴＭＳを用いた被覆は、最初に説明 された好ましい実施例のように典型的に行われ、壁密着性を促進する。満たされ た毛管はポリマー化及び架橋を開始させる紫外線の照射を避けるために、覆い７ １内に置かれる。リーダー６７は駆動推進ローラー７３とアイドラーローラー７ ５の間を通過する。

ローラー７３はベルト７９を介して電気モーター７７によって駆動される。紫外 線照射ゾーン８１は電源８３によって駆動される紫外線ランプを備えている。操 作において、ランプがつけられ、モーターが開始され、液体を満たされたチュー ブは制御された速度で照射ゾーンを通って引かれる。ゲル化は、導管の長さに対 して移動する前部、即ち、照射ゾーンで起こり、ゲル化ゾーンを通過していない 導管部分のまだ液体である材料は、導管内を収縮による体積損失を補充するため に流れる。

熱による開始工程及び光による開始工程の実質的な違いは、開始と、混合物に加 えられる化学薬品が感熱性を与えるか、感光性を与えるかという点とにある。ど ちらの場合でも、引く速度を制限する同一の流れ及び圧力の関係が保持される。

光による開始の場合の重大な利点は、ゲル化速度が抑制される冷却された混合物 とは違って、照射されない混合物は暗い中ではゲル化しないということである。

このことは照射されるまでの液体混合物に長い保存期間を提供し、これは商業製 品としての長所である。さらに、光開始では、制御が困難な熱による活性化とは 違って、ゲル化工程のシャープな“オン／オフ”スイッチを提供する。

有用で効果的な引く速度を厳しく制限する毛管の孔の直径及びチューブの長さに 関する制限は、商業製品の目的に対しては明かな欠点である。これらの制限は、 大気圧に依存するよりもむしろ、ゲル化ゾーンを最後に通過する液体を満たされ た毛管の端の圧力を上げることによってかなり克服することができる。このこと は圧力差を増大させ、ゲル／溶液界面での硬化しないキャビテーションのない他 の効果的な方法よりもより速い引（速度が用いられ得る。典型的には、圧力は、 ゲル／溶液界面が約１気圧（１ｘｌＯ’ダイン／ｃｍ２）である工程の開始時点 では充分高くするべきである。加圧はシリンジによって、可撓性のチューブを取 り付けて窒素などのガスで加圧することによって、又は他の種類の装置によって 供給されることができる。加圧する場合、液体を充填された毛管の他端は栓をさ れ（閉じられ）、ポリマー化及び壁密着が開始される前に圧力によって液体がそ の端から押し出されるのを防ぐ。そのような圧力補助は長い毛管には特に重要で ある。周知の流体の流動方程式に基づ（圧力計算は、孔、００５ｃｍ長さ１００ ｃｍに対して約２０ＰＳＩ　（ｉ、３ｘｉＯｅダイン／ｃｍ２）であることを示 している。

移動前部に沿った混合物のゲル化は、丸い孔の毛管に限らず、横断面が矩形つま り平板構造の細い毛管をキャストするためにも有効である。そのような平板構造 は第５図に示され、これはプレート８７及び８９並びにエツジシール９１及び９ ３を備えている支持構造８５を示している。この図はスケール通りではな（、プ レート間の間隔Ｓｌは説明のため拡大されている。好ましいモードにおいては、 間隔ｓ１は約１ｏ。

ミクロンであるので、非常に薄い平板ゲルがプレート間でキャストされることが できる。さらに、いくつかの例において、間隔はより小さく、例えば５０ミクロ ンまたは２５ミクロンはどの小ささでもよい。但し、そのように小さな間隔では 装置の寸法安定性を保つのが困難である。他のより大きい間隔、例えば５００ミ クロンはどの大きさでも使用されることができる。というのは、ある点で、収縮 によるゲルの平均の応力が、キャビテーション形成を引き起こすのに十分なほど 太き（ないプレート間の十分な距離があるからである。

平板構造を作るために、液体混合物は２辺に沿ってシールされた近接したプレー ト間に注入される。多くの場合、液体混合物は液体導管内の間隔をあけた２つの プレートの１つの開放端を浸すことによって簡単に注入されることができ、液体 は毛管の作用の結果としてプレートの間を上がる。１ｏ。

ミクロン離れたプレートでは毛管作用は約１５ｃｍまで液体を上昇させると計算 され、これはたいていの薄い平板ゲル構造にとっては充分である。加熱及び引っ 張る装置は丸い毛管の代わりに平板構造を扱うように適応される。感熱性混合物 の平板は、線形ヒータとして加熱ランプ又は加熱ワイヤによって与えられ得る線 形の加熱ゾーンを通過される。感光性混合物の平板は平板の全幅を照射する照射 ゾーンを通過される。

当業者には、本発明の精神及び範囲から本質的に離脱せずになされ得る非常に多 くの変化があることは明らかであろう。

例えば、非常に多くの種類の化学混合物が、前部でエネルギーを与えられること によって移動前部でゲル化が行われ得る液体を提供するのに用いられ得る。本発 明の装置の構造及び詳細も同様に変更することができる。例えば、有用な冷室又 は暗室を構成するには多くの方法があり、ゲル化を開始し影響を与えるためにエ ネルギーを加えるには多くの方法がある。

加熱は、例えば、レーザ、電子ビーム他の粒子ビーム、電気抵抗、及び非常に強 い赤外線などによって行われることができる。また、解離してフリーラジカルを 形成する混合物中で陽イオンを作るために電離放射線が使用され得るので、電離 放射線が直接使用されることもできる。また、エネルギーはイオンビームによっ て又はマイクロ波などの電磁放射の他の周波数によって加えられることができ、 他の方法では例えば、周囲室温が活性化のために適当であり得る。毛管及びプレ ート構造及び他のゲル支持構造のための引く装置は広く様々な方法で構築され得 る。当業者に明らかであるこれらの全ての変形及び他の変形は、添付の請求の範 囲に記載されたような本発明の範囲及び精神内であると考えられる。

Ｆｌ（ｉＪＡ。

Ｆｌ（ｉＪＢ。

ＦＩＬ２Ａ。

ＦＩＧｊｌｌ。

Ｆｌに＝３Ａ。

Ｆｌ（ｉ−３８ 国際調査報告 １ｍｕｅ＊＋、６ｎｍｌ　ＡＯＢｌ、１ａｈｅＲＮ。■ゴ／ＵＳ頭１０２３７６

Claims (28)

【特許請求の範囲】
1. １．ゲルを含む支持構造中のゲルをキャスティングする方法であって、該支持構 造はエネルギーを透過する材料によって構成される少なくとも１つの壁を有し、 エネルギーを吸収することによってゲル化を促進されるゲル化材料を含む混合物 によって該支持構造を満たし、該壁の第１の位置から該壁の第２の位置まで該混 合物が連続的になるようにすることと、 エネルギー供給手段によって該壁の位置の局部にエネルギーを与えることと、 該支持構造と該エネルギー供給源とを相対的に動かして、該供給源からエネルギ ーを受け取る該局部を、該壁の第１の位置から第２の位置の方向へ該壁に沿って 移動させ、それによって、該局部が移動するにつれて該局部に実質的に隣接する 移動ゾーン内の該ゲル化混合物中でゲル化を引き起こすことと、 を包含する方法。
2. ２．請求項１に記載の方法であって、前記エネルギー供給源はヒーターであり、 前記混合物は加熱によってゲル化を促進される、方法。
3. ３．請求項２に記載の方法であって、前記エネルギー供給源及び該支持構造の前 記相対的な動きの間に、前記移動ゾーン及び前記第２の位置に間に位置する前記 混合物を含む該支持構造の部分を冷却する工程をさらに包含する、方法。
4. ４．請求項１に記載の方法であって、前記エネルギー供給源は放射線の供給源で あり、前記混合物は該放射線によって引き起こされる電子遷移によってゲル化を 開始される、方法。
5. ５．請求項４に記載の方法であって、前記エネルギー供給源は電磁放射線であり 、前記ゲルは光イニシエータを含み、該放射線の照射に反応する光イニシエータ の分解によってゲル化を開始する、方法。
6. ６．請求項５に記載の方法であって、前記エネルギー供給源と前記支持構造の前 記相対的な動きの間に、前記移動ゾーンと前記第２の位置との間の前記混合物を 含む該支持構造の部分を電磁放射線から覆うことをさらに包含する、方法。
7. ７．請求項１に記載の方法であって、前記ゲルの壁への密着力を増大するために 前記支持構造の前記壁を、密着強化コーティングによって被覆することを包含す る、方法。
8. ８．請求項７に記載の方法であって、密着強化コーティングはＭＡＰＴＭＳであ り、壁を被覆する工程は、前記混合物が前記支持構造に導入される前に、該支持 構造を加熱して該壁に該ＭＡＰＴＭＳを結合させることを包含する、方法。
9. ９．請求項１に記載の方法であって、前記支持構造は毛管を有する、方法。
10. １０．請求項１に記載の方法であって、前記透過性の壁は平面であり、前記支持 構造は該透過性の壁から離れてシールされて前記混合物を含むための体積を提供 する第２の平たい壁をさらに備えている、方法。
11. １１．請求項１０に記載の方法であって、前記壁への前記ゲルの密着力を増大さ せるために、前記支持構造の両方の壁を密着強化コーティングで被覆する工程を 包含する、方法。
12. １２．請求項１１に記載の方法であって、密着強化コーティングはＭＡＰＴＭＳ であり、壁を被覆する工程は、前着混合物が前記支持構造に導入される前に、該 壁を加熱して該壁に該ＭＡＰＴＭＳを結合させる工程を包含する、方法。
13. １３．請求項１に記載の方法であって、前記混合物はゲル化の間に収縮する、方 法。
14. １４．請求項１３に記載の方法であって、前記壁の前記第２の位置付近の混合物 に圧力を加えて、該混合物を前記移動ゾーンへ流動させる工程をさらに包含する 、方法。
15. １５．請求項１に記載の方法による支持構造中のゲルキャスト。
16. １６．請求項１５に記載の支持構造中のゲルキャストであって、該支持構造は毛 管を有するゲルキャスト。
17. １７．請求項１６に記載の支持構造中のゲルキャストであって、前記毛管の前記 壁は密着強化層で被覆されているゲルキャスト。
18. １８．請求項１５に記載の支持構造中のゲルキャストであって、前記支持構造は 、前記ゲルを含むための体積を形成するように互いにシールされた間隔を置いた ２枚のプレートを有し、該プレートのうち少なくとも１枚はエネルギーを透過さ せる前記壁であるゲルキヤスト。
19. １９．請求項１８に記載の支持構造中のゲルキヤストであって、前記プレートは 密着強化層で被覆されているゲルキヤスト。
20. ２０．支持構造中のゲルをキャストするための装置であって、該支持構造はエネ ルギーを吸収することによってゲル化を促進されるゲル化材料を含み、エネルギ ーを透過させる材料から構成される壁を有し、該壁は互いに対向する第１及び第 ２の端部を存しており、 該壁の位置の局部にエネルギーを供給するエネルギー供給手段と、 該供給源からエネルギーを受け取る該局部を該壁の第１の端部から第２の端部へ の方向に該壁に沿って動かすことによって、該局部が動くにつれて該局部に実質 的に隣接する移動ゾーンの該ゲル化混合物中でゲル化を引き起こすための、該支 持構造と該エネルギー供給手段との相対的な動きを生じさせる移動手段と、 を備えている装置。
21. ２１．請求項２０に記載の装置であって、前記エネルギー供給源手段はヒーター を備えている装置。
22. ２２．請求項２１に記載の装置であって、前記局部の移動の間に、前記ゲル化混 合物を含んでいる前記支持構造の前記エネルギー供給手段からエネルギーをまだ 受け取っていない部分を冷却するための冷却手段をさらに備え、該冷却手段は該 部分が前記ヒータに曝されるまで該部分の混合物のゲル化を遅らせるための手段 である、装置。
23. ２３．請求項２１に記載の装置であって、前記ヒータは電気抵抗によって加熱さ れる放射線ユニットを備えている、装置。
24. ２４．請求項２１に記載の装置であって、前記ヒータは熱を照射するためのラン プを備えている、装置。
25. ２５．請求項２１に記載の装置であって、前記熱供給源はサーモスタットによっ て制御される循環流体を備えている、装置。
26. ２６．請求項２５に記載の装置であって、前記循環流体は電気抵抗ヒータによっ て加熱される、装置。
27. ２７．請求項２０に記載の装置であって、前記エネルギー供給手段は紫外線光と して特徴付られる波長の範囲の電磁エネルギーを放射する、装置。
28. ２８．請求項２７に記載の装置であって、前記混合物を含んでいる前記支持構造 の、前記移動ゾーンと前記壁の前記第２の端部との間に位置する該混合物を含ん でいる該支持構造の部分を、前記紫外線光から覆うためのシールド手段をさらに 備えている、装置。