JPH043954B2 - - Google Patents
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Description
アルコール発酵法は回分法、連醸法および連続
法に分けられるが、バクテリヤ及び野生酵母によ
る汚染が少いという点で工業的には回分法が広く
行われている。連醸発酵、連続発酵によるアルコ
ールの生産法としては、いくつかの方法がある
が、熟成醪より遠心分離器で酵母を回収し再使用
するメルボイ法では、バクテリヤの汚染に対して
は、PHを低くしたり抗生物質の添加で防止してい
るが、野生酵母の汚染に対しては有効な防止方法
がなかつた。最近連続発酵法の改良法として固定
化酵母による方法が研究され実施されつつある
が、この方法においても供給糖液が完全に殺菌さ
れている場合、バクテリヤおよび野生酵母の汚染
はなく、適当な温度、栄養で発酵を長期間継続す
ることが出来る。しかし供給糖液を熱殺菌等で殺
菌しない場合は細菌汚染を防止する目的で供給糖
液を酸でPH2.8〜4.2に調整して発酵させることに
よつて、30日から60日間は正常に発酵を続けるこ
とが出来るが、長期間連続発酵すると供給糖液中
に生存する各種野生酵母は順次繁殖し始め遂には
固定化粒内まで汚染し、本来のアルコール酵母の
働きを妨害するため、アルコール収率及びアルコ
ール発酵速度が低下するという問題点を有する。 そこでアルコールを無蒸煮の糖液を用いて連続
発酵法により収率良く得るためには、野生酵母を
殺す事が必要となり、このような特性を備えたキ
ラーアルコール酵母を造成することが重要な課題
となる。 本発明の目的は新型のアルコール発酵能の強い
キラーアルコール酵母を用いることによつて、発
酵過程で糖液中の野生酵母を殺し、野生酵母の影
響をなくすことにより発酵速度を低下させずに収
率良くアルコールを製造する方法を提供すること
にある。 近年サツカロミセス属の中に相手の酵母を殺す
作用のあるものが知られ、キラー酵母と呼ばれて
いる。そしてキラー酵母の実用化は、アントニー
ヴアンレーベンフツク（Antonie van
Leeuwenhoek）44，59−77（1978）に記載されて
公知のK1キラー酵母を用いて、清酒やワインの
製造において行われてきたが、糖液を原料とする
アルコールの製造にはまだ応用されていない。な
ぜならば糖液によるアルコール発酵は清酒やワイ
ンよりも発酵温度が高く30℃以上で行われるた
め、該温度ではK1キラー酵母は活性を示さない
からである。 そこで本発明者らはK1キラー酵母より高温で
しかも至適PHの低い前記文献に記載されて公知の
K2キラー酵母のアルコール発酵能への影響を試
験し、アルコール製造に該キラーアルコール酵母
を用いた場合のキラー活性の持続性等について研
究した結果、広範囲の野生酵母に対して殺菌効果
のあるK2キラートキシンを有し、アルコール発
酵能の強いK2キラーアルコール酵母を発明する
に至つた。 本願のK2キラーアルコール酵母はサツカロミ
セスセルビシエ（Saccharomyces cerevisiae）
に属するアルコール酵母とK2キラー酵母との細
胞融合により造成されるが、K2キラープラスミ
ドの受容菌としてのアルコール酵母は例えばサツ
カロミセスセルビシエ（Saccharomyces
cerevisiae）IFO0224、IFO0216およびその耐塩
性変異株M111株が挙げられ、特にM111株は高発
酵能及び耐塩性を有するため受容菌として優れて
いる。 またK2キラープラスミドの供与菌としてのK2
キラー酵母は例えばサツカロミセスセルビシエ
（Saccharomyces cerevisiae）NCYC738，1001，
1385，1387，1428株およびサツカロミセスデイア
スタテイカス（Saccharomyces diastaticus）
NCYC713株が挙げられ、特に前記K2キラー酵母
である1387株とサツカロミセスセルビシエ1020株
より造成した核融合欠損変異を持つサツカロミセ
スセルビシエ5170株は、K2キラープラスミドの
みをアルコール酵母に導入するため特に有効であ
る。上記のアルコール酵母M111株およびK2キラ
ー酵母5170株より造成したキラーアルコール酵母
はキラーアルコール酵母サツカロミセスセルビシ
エ（Saccharomyces cerevisiae）K2−M111株
（微工研条寄第842号（FERM BP−842））とし
て工業技術院微生物工業技術研究所に寄託してあ
る。 従来のアルコール発酵酵母と本願のK2キラー
アルコール酵母とのアルコール発酵における炭酸
ガス減量の比較、アセトアルデヒドおよび酢酸エ
チルなどの副生物生産の比較実験より、アルコー
ル発酵能および副生物生産において、本願のキラ
ーアルコール酵母と従来のアルコール酵母との間
に差は見られないことが、第１図および第１表か
ら明らかである。
法に分けられるが、バクテリヤ及び野生酵母によ
る汚染が少いという点で工業的には回分法が広く
行われている。連醸発酵、連続発酵によるアルコ
ールの生産法としては、いくつかの方法がある
が、熟成醪より遠心分離器で酵母を回収し再使用
するメルボイ法では、バクテリヤの汚染に対して
は、PHを低くしたり抗生物質の添加で防止してい
るが、野生酵母の汚染に対しては有効な防止方法
がなかつた。最近連続発酵法の改良法として固定
化酵母による方法が研究され実施されつつある
が、この方法においても供給糖液が完全に殺菌さ
れている場合、バクテリヤおよび野生酵母の汚染
はなく、適当な温度、栄養で発酵を長期間継続す
ることが出来る。しかし供給糖液を熱殺菌等で殺
菌しない場合は細菌汚染を防止する目的で供給糖
液を酸でPH2.8〜4.2に調整して発酵させることに
よつて、30日から60日間は正常に発酵を続けるこ
とが出来るが、長期間連続発酵すると供給糖液中
に生存する各種野生酵母は順次繁殖し始め遂には
固定化粒内まで汚染し、本来のアルコール酵母の
働きを妨害するため、アルコール収率及びアルコ
ール発酵速度が低下するという問題点を有する。 そこでアルコールを無蒸煮の糖液を用いて連続
発酵法により収率良く得るためには、野生酵母を
殺す事が必要となり、このような特性を備えたキ
ラーアルコール酵母を造成することが重要な課題
となる。 本発明の目的は新型のアルコール発酵能の強い
キラーアルコール酵母を用いることによつて、発
酵過程で糖液中の野生酵母を殺し、野生酵母の影
響をなくすことにより発酵速度を低下させずに収
率良くアルコールを製造する方法を提供すること
にある。 近年サツカロミセス属の中に相手の酵母を殺す
作用のあるものが知られ、キラー酵母と呼ばれて
いる。そしてキラー酵母の実用化は、アントニー
ヴアンレーベンフツク（Antonie van
Leeuwenhoek）44，59−77（1978）に記載されて
公知のK1キラー酵母を用いて、清酒やワインの
製造において行われてきたが、糖液を原料とする
アルコールの製造にはまだ応用されていない。な
ぜならば糖液によるアルコール発酵は清酒やワイ
ンよりも発酵温度が高く30℃以上で行われるた
め、該温度ではK1キラー酵母は活性を示さない
からである。 そこで本発明者らはK1キラー酵母より高温で
しかも至適PHの低い前記文献に記載されて公知の
K2キラー酵母のアルコール発酵能への影響を試
験し、アルコール製造に該キラーアルコール酵母
を用いた場合のキラー活性の持続性等について研
究した結果、広範囲の野生酵母に対して殺菌効果
のあるK2キラートキシンを有し、アルコール発
酵能の強いK2キラーアルコール酵母を発明する
に至つた。 本願のK2キラーアルコール酵母はサツカロミ
セスセルビシエ（Saccharomyces cerevisiae）
に属するアルコール酵母とK2キラー酵母との細
胞融合により造成されるが、K2キラープラスミ
ドの受容菌としてのアルコール酵母は例えばサツ
カロミセスセルビシエ（Saccharomyces
cerevisiae）IFO0224、IFO0216およびその耐塩
性変異株M111株が挙げられ、特にM111株は高発
酵能及び耐塩性を有するため受容菌として優れて
いる。 またK2キラープラスミドの供与菌としてのK2
キラー酵母は例えばサツカロミセスセルビシエ
（Saccharomyces cerevisiae）NCYC738，1001，
1385，1387，1428株およびサツカロミセスデイア
スタテイカス（Saccharomyces diastaticus）
NCYC713株が挙げられ、特に前記K2キラー酵母
である1387株とサツカロミセスセルビシエ1020株
より造成した核融合欠損変異を持つサツカロミセ
スセルビシエ5170株は、K2キラープラスミドの
みをアルコール酵母に導入するため特に有効であ
る。上記のアルコール酵母M111株およびK2キラ
ー酵母5170株より造成したキラーアルコール酵母
はキラーアルコール酵母サツカロミセスセルビシ
エ（Saccharomyces cerevisiae）K2−M111株
（微工研条寄第842号（FERM BP−842））とし
て工業技術院微生物工業技術研究所に寄託してあ
る。 従来のアルコール発酵酵母と本願のK2キラー
アルコール酵母とのアルコール発酵における炭酸
ガス減量の比較、アセトアルデヒドおよび酢酸エ
チルなどの副生物生産の比較実験より、アルコー
ル発酵能および副生物生産において、本願のキラ
ーアルコール酵母と従来のアルコール酵母との間
に差は見られないことが、第１図および第１表か
ら明らかである。
【表】
次にK2−キラー酵母による糖液中での野生酵
母の殺菌を試み、以下の様な実験結果を得た。 (イ) キラーアルコール酵母を使用した回分発酵に
おける生存野生酵母数の変化は、全糖15％、PH
4.2に調整した糖蜜醪に先のアルコール酵母
M111株又はキラーアルコール酵母K2−M111
株を107コ／ml植菌し、さらに薬剤（シクロヘ
キシミド）耐性を与えた野生酵母MCA株を105
コ／ml、106コ／mlおよび107コ／mlそれぞれ追
加植菌し、30℃にて培養し野生酵母MCA株の
生菌数を経時的に測定したところ、アルコール
酵母M111株と野生酵母MCA株との混合系で
は、野生酵母MCAN株は各濃度で増殖したの
に対し、キラーアルコール酵母K2−M111株と
MCA株との混合系では、野生酵母MCA株は各
濃度で減少し、キラートキシンの効果を示し
た。（第２図参照） (ロ) 固定化キラーアルコール酵母を使用した連続
発酵における生存野生酵母数の変化は、アルコ
ール酵母M111株およびキラーアルコール酵母
K2−M111株のそれぞれのアルギン酸アルミニ
ウム包括固定化酵母を充填率40％でリアクター
につめ、滞留時間10時間で、全糖15％、PH4.2
に調整した糖蜜を供給し、30℃で発酵を行な
い、定常状態になつたところで、野生酵母
MCA株を104コ／ml、105コ／ml又は106コ／ml
になる様植菌し、その後の流出液中の野生酵母
MCA株の生菌数の変化を測定すると、アルコ
ール酵母M111株固定化リアクターでは野生酵
母MCA株を104コ／ml植菌した場合144時間後
でも103コ／ml残存してのに対し、キラーアル
コール酵母K2−M111株固定化リアクターでは
野生酵母MCA株を104コ／ml植菌した場合24時
間後に、105コ／ml植菌した場合48時間後に、
106コ／ml植菌した場合でも144時間後に不検出
となつた。 （第３図参照） (イ)の回分培養と比較すると酵母が常に増殖す
る連続発酵の方がキラートキシンがより効果を
示す事が明らかになつた。 (ハ) 固定化キラーアルコール酵母を使用した連続
発酵におけるPHおよび温度のキラートキシンに
及ぼす影響は、30℃にて、PH3.2、4.2、5.2およ
び全糖15％に調整した糖蜜を用い連続発酵を行
ない、MCA株を植菌しその後の生菌数の変化
を調べた結果、PH5.2の供給液を通液した場合
K2−M111株固定化リアクターの方がM111株
固定化リアクターMCA株の生菌数減少が著し
く、低PH3.2でも48時間後にMCA株は不検出と
なり、供給液のPHによつて時間的に違いはあつ
たが、一様に効果を示した。（第４図参照） 次に35℃にて連続発酵を行ない、野生酵母
MCA株を106コ／ml植菌し野生酵母MCA株の
生菌数の変化を調べた結果35℃においても効果
を示した。（第５図参照） これと同じ現象は、前記アルコール酵母、
K2キラーアルコール酵母および5170株以外の
K2キラー野生酵母においても認められた。 以上の結果より本願のK2キラーアルコール酵
母を使用すれば従来のアルコール発酵至適条件で
あるPH4.0〜5.0、30℃よりも広範囲のPHでしかも
高温でのアルコール発酵が可能となり、特に野生
酵母の汚染のおそれが多い連続発酵において有効
であることが明らかとなつた。 本発明はアルコール発酵能が強く、しかもK2
キラートキシン耐性およびK2キラートキシン生
産能を有し、該キラー株と同一のキラー形質を有
するキラーアルコール酵母サツカロミセスセルビ
シエを用いて糖液よりアルコールを製造する方法
に関する。 本願方法は回分発酵、運醸発酵及び連続発酵の
いずれの方法にも適用できるが、野生酵母の汚染
の多い連醸発酵及び連続発酵法において特に有効
であり、発酵温度25〜38℃好ましくは30〜35℃の
高温で、発酵PH3.0〜5.2の広範囲のPH下で、キラ
ートキシンを生産し、広範囲の野生酵母を殺し、
良好なアルコール発酵を持続できる。 これは当分野において画期的な効果である。 連続発酵においては本願のキラーアルコール酵
母は、アルギン酸塩、カラギーナン、ポリアクリ
ルアミドおよびグルタールアルデヒドなどで固定
化して使用することにより、よい結果を得ること
が出来る。 本願方法で使用する原料糖液としては砂糖きび
又はてん菜糖などに由来するもの、殿粉質をアミ
ラーゼ又は酸で糖化したもの、本質物をセルラー
ゼ又は酸で糖化したものが挙げられる。 次に参考例および実施例を挙げて本発明を説明
する。 参考例 キラーアルコール酵母の造成 (イ) K2キラープラスミド供与菌の造成 細胞融合法により、受容菌M111に供与菌K2
キラープラスミドを導入する際に、両者の核融
合を極力抑え、K2キラープラスミドを持つが、
核にはアルコール発酵能の高いM111の核のみ
を持つ株を造成することが必要である。そこ
で、核融合欠損変異及び受容菌と区別できる遺
伝標識を持つK2キラープラスミド供与菌5170
（遺伝子型：ａ karl−１、his4〔KIL−K2〕
〔NEX−Ｏ〕）の造成を以下の方法で行なつた。
まず、K2キラー（〔KIL−K2〕）及びヒスチジ
ン要求性（his ４）を持つａ接合型株を得るた
めに、サツカロミセスセルビシエ
（Saccharomyces cerevisiae）1020（遺伝子：
α、his4、karl−ｌ、〔KIL−Ｏ〕〔EXL−Ｏ〕）
とサツカロミセス セルビシエ 1387（遺伝子
型：ａ ura １〔KIL−K2〕〔NEX−Ｏ〕をそ
れぞれ５mlYEPD培地（２％グルコース、２％
ポリペプトン、１％酵母エキス）に植菌後、30
℃１日静置培養し、各々の培養液100μを５
mlYEPD培地に一緒に加え、30℃１日静置培養
した。この培養液を無菌水で２回洗浄後、最少
培地（0.67％Yeast Nitrogen Base Ｗ／Ｏ
Amino Acid ２％グルコース、２％寒天）に
塗布し、増殖してきたコロニーを交雑株として
選択し、胞子形成培地（0.5％酢酸カリウム、
２％寒天）に塗布し、30℃３日間培養し胞子形
成させた。 次に４胞子形成した子のうをマイクロマニユ
ピレーターで４分子分解し、YEPD平板で発芽
させ、最少培地上で増殖できないが、最少培地
にヒスチジンを加えた培地上で増殖出来る株を
ヒスチジン要求性株として選択し、その中から
ａ接合型細胞を選択した。 以上のようにして選択したａ接合型でK2キ
ラー、ヒスチジン要求性をもつ株の中から、核
融合欠損変異（karl−１）を持つ株を選択する
為に、これらの株をロイシン要求性、カナバニ
ン耐性及び呼吸欠損を有するα型株と交配し、
最少培地にロイシン、カナバニン及びグルコー
スのかわりにグリセリンを加えた培地上で高頻
度にコロニーが出現し、最少培地上でコロニー
出現頻度の極めて低い株を核融合欠損株サツカ
ロミセスセルビシエ5170（遺伝子型：ａ karl
−１ his ４〔KIL−K2〕〔NEX−Ｏ〕）として
選択した。さらにこの株をK2キラー感受性株
を塗沫したメチレンブルー0.003％含有YEPO
培地（PH4.2）に画線培養し、キラー活性を有
することを確認した。 (ロ) キラーアルコール酵母K2−M111の造成 受容菌のアルコール酵母であるサツカロミセ
スセルビシエM111株と供与菌K2キラー酵母サ
ツカロミセスセルビシエ5170株をそれぞれ
YEPD培地で培養後対数増殖期の菌体を集菌水
洗した。両菌体をそれぞれ2.5mlのソルビトー
ル、トリス緩衝液（IMソルビトール、10ｍＭ
Tris−Hcl、PH7.4以下ST溶液と呼ぶ）に懸
濁し、0.5MEDTA（PH7.5）を0.1mlさらに２−
メルカプトエタノール50μを加え30℃、10分
間培養し、2.5mlのST溶液で洗浄し、さらに2.5
mlのST溶液に再懸濁した。50μの
0.5MEDTA（PH7.5）及び100μの
Zymolyase6000（2.5mg／μ）を加え、30℃、
150分培養し、両菌のプロトプラストを調製し
回収した。調製したプロトプラスト サツカロ
ミセス セルビシエM111株１に対してプロト
プラスト サツカロミセス セルビシエ5170株
10をIMソルビトール、10ｍＭ Tris−Hcl、
10ｍＭ塩化カルシウムを含む溶液（以下STC
溶液と呼ぶ）0.5mlに懸濁した。30℃、15分培
養後菌体を回収しPTC溶液（35％PEG4000、
10ｍＭ Tris−Hcl、10ｍＭ CaCl2、PH7.4）
0.5mlに懸濁し30℃、20分間培養し、STC溶液
で１回洗浄後0.2mlのSTC溶液に再懸濁した。 この懸濁液をIMソルビトールを含む最少寒
天培地上に塗沫し、IMソルビトールを含む最
少寒天培地を重層し、30℃、１週間培養した。 コロニーの現われた最少寒天培地をYEPD液
体培地（PH4.2）中に寒天をつぶしながら加え、
25℃、２日間培養した。この培養液１mlを
YEPD液体培地（PH4.2）100mlに加え、さらに
K2キラー酵母サツカロミセスセルビシエ5170
株の培養液0.1mlを加え、25℃、３日間培養し
た。この培養液50μをYEPD培地（PH4.2）５
mlに加え、25℃、２日間培養し、0.1mlを最少
寒天培地上に塗沫し、30℃、２日間培養し、増
殖した株を感受性株を塗沫したメチレンブルー
0.003％含有YEPD培地（PH4.2）にレプリカし
キラー活性を有した株をキラーアルコール酵
母、サツカロミセス セルビシエK2−M111株
として選択した。 これらの造成株と親株との諸性質の比較を第２
表に示した。さらに、造成株サツカロミセスセル
ビシエK2−M111株は、供与菌のK2キラー酵母サ
ツカロミセス セルビシエ5170株と同じ、K2キ
ラープラスミド（Ｌ−dsRNA、Ｍ−dsRNA）を
もち30℃においてもキラー活性を有する株である
ためアルコール発酵特に野生酵母の汚染の多い連
続発酵に利用すると多大な効果を発揮する。 なお、上記の造成株は微生物の名称キラーアル
コール酵母サツカロミセス セルビシエ
（Saccharomyces cerevisiae）K2−M111株（微
工研条寄第842号（FERM BP−842））として工
業技術院微生物工業技術研究所に寄託してある。 また、アガロースゲル電気泳動分析により受容
菌のアルコール酵母サツカロミセス セルビシエ
M111株にはＬ−dsRNA、Ｍ−dsRNAのバンド
はなく、造成株サツカロミセス セルビシエK2
−M111株には供与菌のキラー酵母サツカロミセ
スセルビシエ5170株と同一の分子量のＬ−
dsRNA、Ｍ−dsRNAをもつことが確認された。
母の殺菌を試み、以下の様な実験結果を得た。 (イ) キラーアルコール酵母を使用した回分発酵に
おける生存野生酵母数の変化は、全糖15％、PH
4.2に調整した糖蜜醪に先のアルコール酵母
M111株又はキラーアルコール酵母K2−M111
株を107コ／ml植菌し、さらに薬剤（シクロヘ
キシミド）耐性を与えた野生酵母MCA株を105
コ／ml、106コ／mlおよび107コ／mlそれぞれ追
加植菌し、30℃にて培養し野生酵母MCA株の
生菌数を経時的に測定したところ、アルコール
酵母M111株と野生酵母MCA株との混合系で
は、野生酵母MCAN株は各濃度で増殖したの
に対し、キラーアルコール酵母K2−M111株と
MCA株との混合系では、野生酵母MCA株は各
濃度で減少し、キラートキシンの効果を示し
た。（第２図参照） (ロ) 固定化キラーアルコール酵母を使用した連続
発酵における生存野生酵母数の変化は、アルコ
ール酵母M111株およびキラーアルコール酵母
K2−M111株のそれぞれのアルギン酸アルミニ
ウム包括固定化酵母を充填率40％でリアクター
につめ、滞留時間10時間で、全糖15％、PH4.2
に調整した糖蜜を供給し、30℃で発酵を行な
い、定常状態になつたところで、野生酵母
MCA株を104コ／ml、105コ／ml又は106コ／ml
になる様植菌し、その後の流出液中の野生酵母
MCA株の生菌数の変化を測定すると、アルコ
ール酵母M111株固定化リアクターでは野生酵
母MCA株を104コ／ml植菌した場合144時間後
でも103コ／ml残存してのに対し、キラーアル
コール酵母K2−M111株固定化リアクターでは
野生酵母MCA株を104コ／ml植菌した場合24時
間後に、105コ／ml植菌した場合48時間後に、
106コ／ml植菌した場合でも144時間後に不検出
となつた。 （第３図参照） (イ)の回分培養と比較すると酵母が常に増殖す
る連続発酵の方がキラートキシンがより効果を
示す事が明らかになつた。 (ハ) 固定化キラーアルコール酵母を使用した連続
発酵におけるPHおよび温度のキラートキシンに
及ぼす影響は、30℃にて、PH3.2、4.2、5.2およ
び全糖15％に調整した糖蜜を用い連続発酵を行
ない、MCA株を植菌しその後の生菌数の変化
を調べた結果、PH5.2の供給液を通液した場合
K2−M111株固定化リアクターの方がM111株
固定化リアクターMCA株の生菌数減少が著し
く、低PH3.2でも48時間後にMCA株は不検出と
なり、供給液のPHによつて時間的に違いはあつ
たが、一様に効果を示した。（第４図参照） 次に35℃にて連続発酵を行ない、野生酵母
MCA株を106コ／ml植菌し野生酵母MCA株の
生菌数の変化を調べた結果35℃においても効果
を示した。（第５図参照） これと同じ現象は、前記アルコール酵母、
K2キラーアルコール酵母および5170株以外の
K2キラー野生酵母においても認められた。 以上の結果より本願のK2キラーアルコール酵
母を使用すれば従来のアルコール発酵至適条件で
あるPH4.0〜5.0、30℃よりも広範囲のPHでしかも
高温でのアルコール発酵が可能となり、特に野生
酵母の汚染のおそれが多い連続発酵において有効
であることが明らかとなつた。 本発明はアルコール発酵能が強く、しかもK2
キラートキシン耐性およびK2キラートキシン生
産能を有し、該キラー株と同一のキラー形質を有
するキラーアルコール酵母サツカロミセスセルビ
シエを用いて糖液よりアルコールを製造する方法
に関する。 本願方法は回分発酵、運醸発酵及び連続発酵の
いずれの方法にも適用できるが、野生酵母の汚染
の多い連醸発酵及び連続発酵法において特に有効
であり、発酵温度25〜38℃好ましくは30〜35℃の
高温で、発酵PH3.0〜5.2の広範囲のPH下で、キラ
ートキシンを生産し、広範囲の野生酵母を殺し、
良好なアルコール発酵を持続できる。 これは当分野において画期的な効果である。 連続発酵においては本願のキラーアルコール酵
母は、アルギン酸塩、カラギーナン、ポリアクリ
ルアミドおよびグルタールアルデヒドなどで固定
化して使用することにより、よい結果を得ること
が出来る。 本願方法で使用する原料糖液としては砂糖きび
又はてん菜糖などに由来するもの、殿粉質をアミ
ラーゼ又は酸で糖化したもの、本質物をセルラー
ゼ又は酸で糖化したものが挙げられる。 次に参考例および実施例を挙げて本発明を説明
する。 参考例 キラーアルコール酵母の造成 (イ) K2キラープラスミド供与菌の造成 細胞融合法により、受容菌M111に供与菌K2
キラープラスミドを導入する際に、両者の核融
合を極力抑え、K2キラープラスミドを持つが、
核にはアルコール発酵能の高いM111の核のみ
を持つ株を造成することが必要である。そこ
で、核融合欠損変異及び受容菌と区別できる遺
伝標識を持つK2キラープラスミド供与菌5170
（遺伝子型：ａ karl−１、his4〔KIL−K2〕
〔NEX−Ｏ〕）の造成を以下の方法で行なつた。
まず、K2キラー（〔KIL−K2〕）及びヒスチジ
ン要求性（his ４）を持つａ接合型株を得るた
めに、サツカロミセスセルビシエ
（Saccharomyces cerevisiae）1020（遺伝子：
α、his4、karl−ｌ、〔KIL−Ｏ〕〔EXL−Ｏ〕）
とサツカロミセス セルビシエ 1387（遺伝子
型：ａ ura １〔KIL−K2〕〔NEX−Ｏ〕をそ
れぞれ５mlYEPD培地（２％グルコース、２％
ポリペプトン、１％酵母エキス）に植菌後、30
℃１日静置培養し、各々の培養液100μを５
mlYEPD培地に一緒に加え、30℃１日静置培養
した。この培養液を無菌水で２回洗浄後、最少
培地（0.67％Yeast Nitrogen Base Ｗ／Ｏ
Amino Acid ２％グルコース、２％寒天）に
塗布し、増殖してきたコロニーを交雑株として
選択し、胞子形成培地（0.5％酢酸カリウム、
２％寒天）に塗布し、30℃３日間培養し胞子形
成させた。 次に４胞子形成した子のうをマイクロマニユ
ピレーターで４分子分解し、YEPD平板で発芽
させ、最少培地上で増殖できないが、最少培地
にヒスチジンを加えた培地上で増殖出来る株を
ヒスチジン要求性株として選択し、その中から
ａ接合型細胞を選択した。 以上のようにして選択したａ接合型でK2キ
ラー、ヒスチジン要求性をもつ株の中から、核
融合欠損変異（karl−１）を持つ株を選択する
為に、これらの株をロイシン要求性、カナバニ
ン耐性及び呼吸欠損を有するα型株と交配し、
最少培地にロイシン、カナバニン及びグルコー
スのかわりにグリセリンを加えた培地上で高頻
度にコロニーが出現し、最少培地上でコロニー
出現頻度の極めて低い株を核融合欠損株サツカ
ロミセスセルビシエ5170（遺伝子型：ａ karl
−１ his ４〔KIL−K2〕〔NEX−Ｏ〕）として
選択した。さらにこの株をK2キラー感受性株
を塗沫したメチレンブルー0.003％含有YEPO
培地（PH4.2）に画線培養し、キラー活性を有
することを確認した。 (ロ) キラーアルコール酵母K2−M111の造成 受容菌のアルコール酵母であるサツカロミセ
スセルビシエM111株と供与菌K2キラー酵母サ
ツカロミセスセルビシエ5170株をそれぞれ
YEPD培地で培養後対数増殖期の菌体を集菌水
洗した。両菌体をそれぞれ2.5mlのソルビトー
ル、トリス緩衝液（IMソルビトール、10ｍＭ
Tris−Hcl、PH7.4以下ST溶液と呼ぶ）に懸
濁し、0.5MEDTA（PH7.5）を0.1mlさらに２−
メルカプトエタノール50μを加え30℃、10分
間培養し、2.5mlのST溶液で洗浄し、さらに2.5
mlのST溶液に再懸濁した。50μの
0.5MEDTA（PH7.5）及び100μの
Zymolyase6000（2.5mg／μ）を加え、30℃、
150分培養し、両菌のプロトプラストを調製し
回収した。調製したプロトプラスト サツカロ
ミセス セルビシエM111株１に対してプロト
プラスト サツカロミセス セルビシエ5170株
10をIMソルビトール、10ｍＭ Tris−Hcl、
10ｍＭ塩化カルシウムを含む溶液（以下STC
溶液と呼ぶ）0.5mlに懸濁した。30℃、15分培
養後菌体を回収しPTC溶液（35％PEG4000、
10ｍＭ Tris−Hcl、10ｍＭ CaCl2、PH7.4）
0.5mlに懸濁し30℃、20分間培養し、STC溶液
で１回洗浄後0.2mlのSTC溶液に再懸濁した。 この懸濁液をIMソルビトールを含む最少寒
天培地上に塗沫し、IMソルビトールを含む最
少寒天培地を重層し、30℃、１週間培養した。 コロニーの現われた最少寒天培地をYEPD液
体培地（PH4.2）中に寒天をつぶしながら加え、
25℃、２日間培養した。この培養液１mlを
YEPD液体培地（PH4.2）100mlに加え、さらに
K2キラー酵母サツカロミセスセルビシエ5170
株の培養液0.1mlを加え、25℃、３日間培養し
た。この培養液50μをYEPD培地（PH4.2）５
mlに加え、25℃、２日間培養し、0.1mlを最少
寒天培地上に塗沫し、30℃、２日間培養し、増
殖した株を感受性株を塗沫したメチレンブルー
0.003％含有YEPD培地（PH4.2）にレプリカし
キラー活性を有した株をキラーアルコール酵
母、サツカロミセス セルビシエK2−M111株
として選択した。 これらの造成株と親株との諸性質の比較を第２
表に示した。さらに、造成株サツカロミセスセル
ビシエK2−M111株は、供与菌のK2キラー酵母サ
ツカロミセス セルビシエ5170株と同じ、K2キ
ラープラスミド（Ｌ−dsRNA、Ｍ−dsRNA）を
もち30℃においてもキラー活性を有する株である
ためアルコール発酵特に野生酵母の汚染の多い連
続発酵に利用すると多大な効果を発揮する。 なお、上記の造成株は微生物の名称キラーアル
コール酵母サツカロミセス セルビシエ
（Saccharomyces cerevisiae）K2−M111株（微
工研条寄第842号（FERM BP−842））として工
業技術院微生物工業技術研究所に寄託してある。 また、アガロースゲル電気泳動分析により受容
菌のアルコール酵母サツカロミセス セルビシエ
M111株にはＬ−dsRNA、Ｍ−dsRNAのバンド
はなく、造成株サツカロミセス セルビシエK2
−M111株には供与菌のキラー酵母サツカロミセ
スセルビシエ5170株と同一の分子量のＬ−
dsRNA、Ｍ−dsRNAをもつことが確認された。
【表】
実施例
無殺菌糖蜜での連続アルコール発酵結果
アルコール酵母サツカロミセス セルビシエ
（Saccharomyces cerevisiae）M111株とキラー
アルコール酵母サツカロミセス セルビシエ
（Saccharomyces cerevisiae）K2−M111株とを
各々培養し、固定化造粒酵母を造り、110容バ
イオリアクターに充填し、全糖15％、PH3.7に調
製した加熱殺菌等を行なわない糖蜜供給液を11
／hr（τ＝10hrs）通液し、30℃で100日間連続
アルコール発酵を行なつた。その結果は第６図の
ようになり、アルコール酵母のバイオリアクター
の流出液中の野生酵母は40日目に全酵母数の20％
となり60日目で40％、80日目で90％に達し発酵歩
合は20日目で83％であつたものが順次低下し、60
日目で77％、80日目で69％に低下した。一方、キ
ラーアルコール酵母K2−M111株のバイオリアク
ターの流出液の野生酵母数は全期間検出されず、
発酵歩合83％の高発酵歩合を長期間継続すること
ができた。 このようにアルコール酵母M111株を使用した
場合、60日でアルコール製造を中止しなければな
らないが、キラーアルコール酵母K2−M111株を
使うことにより100日以上、連続生産を行なうこ
とができた。
（Saccharomyces cerevisiae）M111株とキラー
アルコール酵母サツカロミセス セルビシエ
（Saccharomyces cerevisiae）K2−M111株とを
各々培養し、固定化造粒酵母を造り、110容バ
イオリアクターに充填し、全糖15％、PH3.7に調
製した加熱殺菌等を行なわない糖蜜供給液を11
／hr（τ＝10hrs）通液し、30℃で100日間連続
アルコール発酵を行なつた。その結果は第６図の
ようになり、アルコール酵母のバイオリアクター
の流出液中の野生酵母は40日目に全酵母数の20％
となり60日目で40％、80日目で90％に達し発酵歩
合は20日目で83％であつたものが順次低下し、60
日目で77％、80日目で69％に低下した。一方、キ
ラーアルコール酵母K2−M111株のバイオリアク
ターの流出液の野生酵母数は全期間検出されず、
発酵歩合83％の高発酵歩合を長期間継続すること
ができた。 このようにアルコール酵母M111株を使用した
場合、60日でアルコール製造を中止しなければな
らないが、キラーアルコール酵母K2−M111株を
使うことにより100日以上、連続生産を行なうこ
とができた。
第１図は全糖22.5％、PH5.1、30℃の条件下で
造成株K2−M111株と親株（受容菌M111株）の
糖蜜培地における発酵力の比較を表わし、第２図
はキラーアルコール酵母を使用した回分発酵にお
ける生存野生酵母数の変化を表わし、第３図は固
定化キラーアルコール酵母を使用した連続発酵に
おける生存野生酵母数の変化を表わし、第４図は
30℃連続発酵におけるPHのキラートキシンへの影
響を表わし、第５図は35℃連続発酵におけるキラ
ートキシンの効果を表わし、第６図は無殺菌糖蜜
での連続アルコール生産における野生酵母におけ
る汚染度、生成エタノールおよび発酵歩合を表わ
す。
造成株K2−M111株と親株（受容菌M111株）の
糖蜜培地における発酵力の比較を表わし、第２図
はキラーアルコール酵母を使用した回分発酵にお
ける生存野生酵母数の変化を表わし、第３図は固
定化キラーアルコール酵母を使用した連続発酵に
おける生存野生酵母数の変化を表わし、第４図は
30℃連続発酵におけるPHのキラートキシンへの影
響を表わし、第５図は35℃連続発酵におけるキラ
ートキシンの効果を表わし、第６図は無殺菌糖蜜
での連続アルコール生産における野生酵母におけ
る汚染度、生成エタノールおよび発酵歩合を表わ
す。
Claims (1)
- １ アルコール発酵能が強いサツカロミセス セ
ルビシエ（Saccharomyces cerevisiae）と、K2
キラー酵母の細胞融合により得られる、アルコー
ル発酵能が強く、しかもK2キラー酵母と同一の
キラー形質を有するキラーアルコール酵母、サツ
カロミセス セルビシエ（Saccharomyces
cerevisiae）を用いて、糖液よりアルコールを製
造する方法。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58142321A JPS6034188A (ja) | 1983-08-03 | 1983-08-03 | キラ−アルコ−ル酵母を用いたアルコ−ル製造法 |
| FR8412188A FR2550221B1 (fr) | 1983-08-03 | 1984-08-01 | Procede de fabrication d'alcool a l'aide d'une levure alcoolique destructrice |
| BR8403837A BR8403837A (pt) | 1983-08-03 | 1984-08-01 | Processo de manufatura de alcool pelo uso de levedo exterminador no alcool |
| PH31056A PH20106A (en) | 1983-08-03 | 1984-08-01 | Method of manufacturing ethanol by the use of killer ethanol yeast |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58142321A JPS6034188A (ja) | 1983-08-03 | 1983-08-03 | キラ−アルコ−ル酵母を用いたアルコ−ル製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6034188A JPS6034188A (ja) | 1985-02-21 |
| JPH043954B2 true JPH043954B2 (ja) | 1992-01-24 |
Family
ID=15312631
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58142321A Granted JPS6034188A (ja) | 1983-08-03 | 1983-08-03 | キラ−アルコ−ル酵母を用いたアルコ−ル製造法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6034188A (ja) |
| BR (1) | BR8403837A (ja) |
| FR (1) | FR2550221B1 (ja) |
| PH (1) | PH20106A (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8334122B2 (en) | 2006-11-20 | 2012-12-18 | Yamaguchi University | Thermotolerant ethanol-producing yeast and ethanol production method utilizing the same |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS58212779A (ja) * | 1982-06-04 | 1983-12-10 | Sapporo Breweries Ltd | 酵母 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS57146571A (en) * | 1981-03-09 | 1982-09-10 | Mitsubishi Chem Ind Ltd | Killer yeast |
-
1983
- 1983-08-03 JP JP58142321A patent/JPS6034188A/ja active Granted
-
1984
- 1984-08-01 FR FR8412188A patent/FR2550221B1/fr not_active Expired
- 1984-08-01 PH PH31056A patent/PH20106A/en unknown
- 1984-08-01 BR BR8403837A patent/BR8403837A/pt unknown
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS58212779A (ja) * | 1982-06-04 | 1983-12-10 | Sapporo Breweries Ltd | 酵母 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| FR2550221B1 (fr) | 1987-01-30 |
| FR2550221A1 (fr) | 1985-02-08 |
| BR8403837A (pt) | 1985-07-09 |
| JPS6034188A (ja) | 1985-02-21 |
| PH20106A (en) | 1986-09-29 |
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