JPH04320957A - 毛管カラムを使用する被分析物の分離の実施方法 - Google Patents

毛管カラムを使用する被分析物の分離の実施方法

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JPH04320957A
JPH04320957A JP4001707A JP170792A JPH04320957A JP H04320957 A JPH04320957 A JP H04320957A JP 4001707 A JP4001707 A JP 4001707A JP 170792 A JP170792 A JP 170792A JP H04320957 A JPH04320957 A JP H04320957A
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siloxane polymer
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】発明の分野 本発明は、キャピラリーゾーン電気泳動（ｃａｐｉｌｌ
ａｒｙ　　ｚｏｎｅ　　ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉ
ｓ）に関する。更に詳細には、本発明は、不活性化され
た壁を有するヒューズドシリカ毛管カラム（ｆｕｓｅｄ
　　ｓｉｌｉｃａ　　ｃａｐｉｌｌａｒｙ　　ｃｏｌｕ
ｍｎｓ）であって、キャピラリーゾーン電気泳動用に更
に適するようにされた前記毛管カラムに関する。
【０００２】発明の背景 キャピラリー電気泳動またはキャピラリーゾーン電気泳
動は、本明細書においてはまたＣＺＥと称され、分離技
術分野における比較的新しい新参者である。それらは、
いくつかの領域において、特に生化学の領域において大
いに有望であることを示している。ＣＺＥは、従来の電
気泳動に関しているが、しかし極めて高い分離能力を示
し、かつ極めて小さい試料サイズを用いることができる
。ＣＺＥによる分離には、典型的にヒューズドシリカか
ら造られている小孔を有する毛管カラム中に、被分析物
（ａｎａｌｙｔｅｓ）の緩衝溶液を入れることが必要で
ある。次いで、カラムの一端から他端へ高電位差を設定
する。表面のシラノール基は、それらが低ｐＫａである
ので、ｐＨが２以上であるときに大部分がＳｉ−Ｏ−形
態になるのが見出される。緩衝溶液は、陽イオンが陰Ｓ
ｉ−Ｏ−基と一列に並ぶので、「電気浸透流（ｅｌｅｃ
ｔｒｏ−ｏｓｍｏｔｉｃ　　ｆｌｏｗ）」と称される流
れで流れ、そして電位差の末端の場所に引きつけられる
。 この流れは、その流れと一緒に、溶解している被分析物
のそれぞれの荷電：質量の比（ｃｈａｒｇｅ−ｔｏ−ｍ
ａｓｓ　　ｒａｔｉｏ）に依存した速度で、溶解被分析
物を押し流す。被分析物のこの荷電に関係した流れは、
被分析物の「電気泳動移動度（ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒ
ｅｔｉｃ−ｍｏｂｉｌｉｔｙ）」と称される。陽電荷の
物質は、電気浸透流と同じ方向に流れるが、しかし中性
電荷の分子は、同速度において、電気浸透流と同じ方向
に更にゆっくりと泳動し、そして陰電荷の物質は、電気
浸透流と反対の方向に溶液を通して流れる傾向にある。 しかしながら、電気浸透流は、しばしば、カラム内の陰
電荷の物質の正味の動きが、電気浸透流と同じ方向にあ
るには充分に強いことである。その結果として、単純な
電荷の流れが被分析物を流出させると予想される場合に
は、カラムの反対の末端に検出器を設置しておく必要が
ある。全部の分離は、個々の被分析物の相対的な電気泳
動移動度によって測定される。これらの移動度は、通常
はｐＨ調節の結果として、物質の荷電を変化させること
により変えることができる。これは、Ｊ．Ｊｏｒｇｅｎ
ｓｏｎの方法とされており、最初の出版物は、Ａｎａｌ
ｙｔｉｃａｌ　　Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．５３，ｐｐ．１
２９８−１３０２およびＪ．Ｃｈｒｏｍ．，Ｖｏｌ．２
１８，ｐ．２０９（共に１９８１年）である。この発見
の鍵は、微毛管カラム（ｍｉｃｒｏｃａｐｉｌｌａｒｙ
　　ｃｏｌｕｍｎｓ）を使用することによってカラムの
断面積を減少させることによりカラム内の電流密度を減
少させることができ、それによりいくつかの問題の原因
となる試料の加熱を減少させることができた。
【０００３】また、中性の被分析物は、ミセル状動電気
的毛管クロマトグラフィー（ｍｉｃｅｌｌａｒ　　ｅｌ
ｅｃｔｒｏｋｉｎｅｔｉｃ　　ｃａｐｉｌｌａｒｙ　　
ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）と称せられ、また本明
細書においてはＭＥＣＣと称されている、ＣＺＥの変法
によって分離することができる。この技術においては、
界面活性剤、通常はドデシル硫酸ナトリウムを中性の被
分析物の溶液に加える。ドデシル硫酸ナトリウムは陰電
荷であるので、それは電気浸透流に反対の方向に動く。 中性の被分析物は、電気浸透流と共に流し出され、界面
活性剤とそれを取り巻いている水性相との間の分配に基
づいて分離される。この技術は、Ｔｅｒａｂｅ〔Ａｎａ
ｌ．Ｃｈｅｍ．ｖｏｌ．５７，ｐｐ．８３４−８４１（
１９８５）およびｖｏｌ．５６，ｐｐ．１１１−１１３
（１９８４）〕によって紹介されている。
【０００４】ＣＺＥおよびＭＥＣＣの技術は、蛋白質お
よびＤＮＡフラグメント（ｆｒａｇｍｅｎｔｓ）を包含
する生物学上で関心のある巨大分子を分離するために有
望である。しかし、蛋白質のために使用することは厳し
く制限される。なぜなら、蛋白質はシリカの表面上に強
く吸収される傾向にあるからである。これは流出する被
分析物のピーク（ｐｅａｋｓ）を広げる原因になるし、
また全被分析物の損失にさえなるからである。この問題
は、Ｓｃｉｅｎｃｅ，ｖｏｌ．２２２，ｐ．２６６（１
９８３）においてＪｏｒｇｅｎｓｏｎによって議論され
ている。
【０００５】シリカ上に被分析物が吸収されるこの問題
に対する幾つかの解決方法が、ＣＺＥにおいても試みら
れた。しかし、これらは、移動相およびカラム用の被覆
において変化を伴った。それぞれの強さ、そして更に重
要なのは弱点、について以下にそれらの概要を述べる。
【０００６】移動相における変化には、高いｐＨおよび
低いｐＨの相または高イオン濃度（ｈｉｇｈ　　ｉｏｎ
ｉｃ　　ｓｔｒｅｎｇｔｈ）の相を使用することが包含
され、および相の中に有機変性剤を含有させることが包
含されている。これら技術の全ては、ある程度までは働
くが、しかしこれらは他の問題を発生させた。蛋白質被
分析物と表面との間の主要な相互作用は、蛋白質上の陽
電荷部位と陰電荷の表面との電荷の相互作用であるので
、ｐＨの変化は、（高いｐＨにおいて）蛋白質上の陽電
荷を除去するか、または（低いｐＨにおいて）表面上の
陰電荷を減少させる。不運にも、いずれの条件も蛋白質
を変性させる。 有機変性剤は、蛋白質を更に溶解させる働きをするが、
しかしそれらの条件は、蛋白質の不溶解を避けるために
注意深く選定されなければならない。また、これらの有
機変性剤も、蛋白質を変性させる。高イオン濃度の移動
相を使用することは、緩衝液カチオンで溶液を流し出す
働きをするが、これは、カチオンで表面を遮蔽すること
によって表面と蛋白との相互作用を妨げてしまう。ここ
での問題は、また、更に非常に導電性の液体にして、そ
れが電流の流れを増加させ、従って熱の発生を増加させ
ることである。この熱は分離することを破壊し、かつ移
動相を沸騰させることさえして、まったく分離を不可能
にする。
【０００７】この問題に対する他の解決方法は、シリカ
カラムの壁を不活性の被覆剤を用いて被覆することであ
る。いくつかのそのような被覆剤が試みられた。
【０００８】米国特許第４，６８０，２０１号およびＪ
．Ｃｈｒｏｍ．ｖｏｌ．３４７，ｐｐ．１９１−１９８
においてＨｊｅｒｔｅｎは、ガラスカラムの壁をＣＨ２
　＝ＣＨＣＯ２　ＣＨ２　ＣＨ２　ＣＨ２　Ｓｉ（ＯＭ
ｅ）３　と反応させ、次いでこれをアクリルアミドと共
重合させ、また、ガラスカラムの壁をメチルセルロース
で被覆し、次いでこの被覆をホルムアルデヒドを用いて
架橋させた。これらの被覆の両方は、電気浸透流を除去
することに指向されていた。これは、ＣＺＥおよびＭＥ
ＣＣの両方による分離を妨げた。なぜなら、これら両方
は、被分析物を分離するためには、電気浸透流に依存し
ているからである。更に、発表された結果は、相互作用
がまだ生起していることを示している。
【０００９】同様に、ＭｃＣｏｒｍｉｃｋは、Ａｎａｌ
．Ｃｈｅｍ．ｖｏｌ．６０，ｐｐ．２３２２−２３２８
においてポリ（ビニルピロリドン）による被覆を報告し
ている。彼の実施例においては、低ｐＨおよび比較的高
いイオン濃度を利用した。しかし、これらは、発熱の問
題および前述したような蛋白質の変性の問題を生じる。
【００１０】Ｐｏｐｐｅは、Ｊ．Ｃｈｒｏｍ．ｖｏｌ．
４７１，ｐｐ．４２９−４３６（１９８９）に開示され
ているように、ガラスカラムの壁を（ＭｅＯ）３　Ｓｉ
（ＣＨ２　）３　ＯＣＨ２　−エポキシドと反応させ、
次いでポリ（エチレングリコール）と反応させた。彼は
、これらは、そのように被覆したカラムを使用して分離
に利用するのを厳しく制限している、ｐＨ５以上で使用
するためには不適当であるのを見出した。Ｓｃｈｏｍｂ
ｕｒｇは、Ｊ．Ｈｉｇｈ　　Ｒｅｓ．Ｃｈｒｏｍ．１３
，ｐｐ．１４５−１４７（１９９０）において、ＭＥＣ
Ｃに使用するための架橋したポリ（エチレングリコール
）を報告しているが、小分子の分離が開示されているだ
けであり、蛋白質を分離するための適当性についての例
示はなく、かつカラムを用いる分離についての詳細も開
示されていない。
【００１１】また、Ｊ．Ｃｈｒｏｍ．，ｖｏｌ．４８０
，ｐ．ｐ．３３９−３４９（１９８９）において、Ｂｒ
ｕｉｎにより、カラム被覆剤として、マルトースおよび
エポキシジオールが報告されている。エポキシジオール
被覆剤は、前述したポリ（エチレングリコール）で被覆
したカラムよりも貧弱な結果を示し、かつまた３〜５の
非常に限定されたｐＨ範囲によって操作されている。マ
ルトースカラムは、広いｐＨ範囲にわたるがしかし比較
的貧弱な効率で操作されており、かつ貧弱な形状のピー
クを造っている。
【００１２】また、Ｊ．Ｃｈｒｏｍ．，ｖｏｌ．５１６
，ｐｐ．６９−７８（１９９０）において、Ｒｅｇｎｉ
ｅｒにより、ポリエチレンイミンカラムが報告されてい
る。このカラムは、その表面をポリエチレンイミンで被
覆し、次いで、このポリイミンをジエポキシドで架橋す
ることによって造られている。この被覆は、移動相ｐＨ
における電気浸透流への依存を減少させ、また、その流
れの方向を逆にする傾向にある。しかし、これは、カラ
ム表面に結合していない簡単な機械的被覆である。その
ような結合していない被覆の寿命は、結合した被覆の寿
命よりも有意に短かい傾向にある。
【００１３】Ｓｗｅｄｂｅｒｇは、ヨーロッパ特許公報
第３５４，９８４号およびＰＣＴ国際特許公報第ＷＯ　
　８９／１２２２５号において、（ＭｅＯ）３Ｓｉ（Ｃ
Ｈ２　）３　ＮＨ２　から造った被覆剤を開示している
。先ず、この物質をガラスカラムの壁と反応させる。前
記ヨーロッパ特許は、その物質を、そのままで、または
次いでグルタルアルデヒドと反応させ、次いで蛋白質、
ジペプチド、または“他の両性化合物”と反応させるい
ずれかにより、使用することを開示している。前記国際
特許出願は、アミン被覆剤と、複数のハロゲン原子を含
有する部分、好ましくはペンタフルオロアリール部分を
有する塩化アセチルとを反応させて、蛋白質と相互に作
用しない層を造ることを開示している。これらの特許の
それぞれの実施例には、それら全部において高イオン濃
度が使用されているが、良好な分離を示している。
【００１４】Ｓｅｐａｎｉａｋは、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ
．，ｖｏｌ．５９，ｐｐ．１４６６−１４７０（１９８
７）において、塩化トリメチルシリルを使用してシリメ
チルシリル被覆を与え、それを彼がＭＥＣＣにおいて使
用したことを開示している。この被覆は、電気浸透流を
低くする。
【００１５】前記被覆剤の全ては、第２のＳｗｅｄｂｅ
ｒｇおよびＳｅｐａｎｉａｋの報告を例外として、高性
能液体クロマトグラフィー〔ｈｉｇｈ−ｐｅｒｆｏｒｍ
ａｎｃｅ　　ｌｉｑｕｉｄ　　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａ
ｐｈ（ＨＰＬＣ）〕の目的のためのシリカゲルに使用し
た被覆剤のタイプに類似している親水性被覆剤である。
【００１６】Ｙｅｕｎｇは、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，ｖ
ｏｌ．６２，ｐｐ．２１７８−２１８２（１９９０）に
おいて、従来の架橋したジメチルシリコーン被覆剤を報
告した。これは、通常のＣＺＥに使用したときに、望ま
しくない低い電気浸透流を示したが、ＭＥＣＣにおいて
は合理的な流速を示した。また、前述のＳｃｈｏｍｂｕ
ｒｇは、増加した電気浸透流を示すＭＥＣＣのために使
用するシリコーン被覆剤を報告した。しかし、この流れ
は、また、良好なＣＺＥの分離のためには不適当であっ
た。
【００１７】Ｔｓｕｄａは、Ｃｈｒｏｍ．，ｖｏｌ．２
４８，ｐｐ．２４１−２４７（１９８２）において、カ
ラム表面とオクタデシルシランとの反応を報告したが、
カラムの性能については殆んど情報がないし、また生体
分子と使用することは開示されていない。
【００１８】また、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）用
の毛管カラムを処理して、そのカラム表面を不活性化す
ることもできる。この不活性化操作は、先ず、ガスクロ
マトグラフィーによる分離において、アミン類を、珪質
表面との相互作用および流出ピークを減少させることか
ら保護することに指向されており、そして現在までこれ
らの不活性化操作をＣＺＥカラムに適用するための理由
が存在していなかった。一般的に、ＧＣ用カラムの製造
は２工程の操作を使用する。第１の工程においては、カ
ラムの表面を次の最初の操作の１つを使用して不活性化
する：（１）　環状シロキサンとの高温反応、（２）　
シリコーン重合体またはジシロキサンとの高温反応、（
３）　Ｓｉ−Ｈ基を含有するシリコーン重合体との高温
反応、（４）　ジシラザンとの高温反応、（５）　塩化
シリルとの低温反応、および（６）　トリアルコキシシ
ランとの低温反応。次の不活性化においては、カラムを
シリコーン重合体で被覆する。この重合体は、遊離基開
始剤例えば過酸化物またはアゾ化合物を用いてその場で
架橋させる。
【００１９】ＧＣカラム用の不活性化方法は、塩化シリ
ルとの反応（５）　およびトリアルコキシシランとの反
応以外は、首尾よく使用された。トリアルコキシシラン
を用いて少なくともいくらかの成功は達成されたが、そ
れは好ましい方法ではない。しかし、これは、前述のＧ
Ｃの不活性化のための開示された方法である。重合体お
よび環状ポリシロキサンを必要とする方法が好ましい。 なぜなら、これらは、調節することが容易であるか、ま
たは更に都合よく不活性表面を造り出すからである。
【００２０】また、これらの同様な解決方法のいくつか
は、ＨＰＬＣ用のシリカベースの充填物を造るのに使用
された。塩化シリルとの反応およびトリアルコキシシラ
ンとの反応は、最もしばしば用いられるが、また、Ａｎ
ａｌ．Ｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．６２，ｐ．１３７９（１９
９０）にＬｅｅによって報告されているように、最近は
水素化シリル重合体との反応が用いられた。ＨＰＬＣの
ためには、その目標は、表面を不活性化することはそれ
ほど多くなくて、被分析物の相互作用のために表面官能
性を提供することであった。
【００２１】本発明の目的は、毛管カラムのヒューズド
シリカの壁を不活性化して、ＣＺＥ、ＭＥＣＣおよびそ
の他のクロマトグラフィーによる分離中において、前記
シリカ上に被分析物の吸着を減少させることである。そ
の他の目的は、本発明についての次の記載から明らかに
なるであろう。
【００２２】発明の概要 本発明者は、現在までにガスクロマトグラフィーだけに
使用されかつ別の結果を得るのに使用されたある種の表
面不活性化技術を、驚異的にも、ＣＺＥおよびＭＥＣＣ
の間にカラム内の電気浸透液を除去することなしに、Ｃ
ＺＥカラム表面を不活性化するのに使用できることを見
出した。更に、本発明者は、 （ａ）　　　約１００μｍより小さい孔径を有する小孔
のガラスまたはヒューズドシリカの毛管カラムであって
、水素化シリル重合体、シロキサン重合体−環状シロキ
サンが包含される−、シラザン重合体、およびシリコー
ン重合体から成る群から選ばれた重合体に共有結合され
たカラム内部表面を有し、かつ緩衝溶液で充たされたカ
ラムの前記小孔を有する前記カラム内に、被分析物の緩
衝溶液を導入し、 （ｂ）　　　前記カラムの一端から他端に高電位差を設
定し、（ｃ）　　　前記被分析物を前記カラム内にて分
離させ、そしてそれが電気浸透流によって前記カラムか
ら流出するように、前記カラムから緩衝溶液内に移行さ
せ、そして（ｄ）　　　前記カラムの端部または端部近
くにおいて、緩衝溶液内の被分析物を検出する 工程から成り、かつそれらの工程が出現する順序におい
て実施する、ＣＺＥによる分離およびＭＥＣＣによる分
離の実施方法、を見出した。
【００２３】発明の詳細 ＣＺＥカラムおよびＭＥＣＣカラムの壁を不活性化する
ための本発明に有用である重合体は、ポリシロキサンお
よびポリシラザンであり、これらには、ポリ（ジオルガ
ノシロキサン）、ポリ（ジオルガノシラザン）およびポ
リ（オルガノヒドロシロキサン）が包含される。有用な
重合体の例には、ポリ（ジアルキルシロキサン）、ポリ
（ジアルキルシラザン）、ポリ（アリールシロキサン）
、ポリ（アリールシラザン）、ポリ（アルキルアリール
シロキサン）、ポリ（ジアリールシロキサン）、および
環状のシラザンおよびシロキサン（ここに、アルキル基
は、１〜約２４個の炭素原子を含有し、更に好ましくは
、アルキル基の少なくとも１個は、約８〜約２０個の炭
素原子を含有し、そしてなお更に好ましくは、アルキル
基の少なくとも１個は、約１２〜約２０個の炭素原子を
含有し、そしてアリール基は、置換または非置換のフェ
ニル、ビフェニル、またはナフチルである）が包含され
る。アルキル基およびアリール基の置換基には、ヒドロ
キシル、ハロ、シアノ、ニトロ、アミノ、メルカプトお
よびグリシドキシが包含され、そしてアルキル基は、連
結基例えばエーテル、エステル、アミド、アミン、カー
バメート、およびチオを含有していてもよい。 ハロ置換基には、弗素、塩素および臭素が包含され、好
ましくは弗素である。好ましい重合体には、ポリ（ｎ−
オクチルメチルシロキサン）、ポリ（ｎ−オクタデシル
メチルシロキサン）、ポリ（ジメチルシロキサン）、ポ
リ（３，３，３−トリフルオロプロピルメチルシロキサ
ン）、ポリ（ジフェニルメチルヒドロシロキサン）、ポ
リ（３−シアノプロピルフェニルシロキサン）、ポリ（
ビス−３−シアノプロピルジメチルシロキサン）、ポリ
（ジメチルメチルヒドロシロキサン）、ポリ（メチルフ
ェニルシロキサン）、ポリ（ジフェニルシロキサン）、
およびそれらの共重合体、が包含される。
【００２４】ＣＺＥカラムの壁を不活性化するための本
発明において有用な重合体は、当業界において知られて
いる方法によって造ることができる。これらの重合体の
製造方法の例は、Ａｃａｄｅｍｉｃ　　Ｐｒｅｓｓ，Ｏ
ｒｌａｎｄｏ，ＦＬによって出版されているＮｏｌｌの
Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　　ａｎｄ　　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇ
ｙｏｆ　　Ｓｉｌｉｃｏｎｅｓ，２ｎｄ　　ｅｄｉｔｉ
ｏｎ（１９６８）に見出される。例えば、環状シロキサ
ン重合体は、酸化亜鉛の存在下でジクロロジオルガノシ
ランまたはジクロロオルガノシランの反応により、また
は水を用いてジクロロジオルガノシランまたはジクロロ
オルガノシランを調節しながら加水分解することにより
、生成させることができる。次いで、環状ポリシロキサ
ンの環を、酸加水分解によって開環させて水素およびヒ
ドロキシル末端基を有する線状ポリシロキサンを造るか
、またはトリメチルシラノールの塩例えばカリウムまた
はテトラアルキルアンモニウムの塩、と反応させること
によってトリメチルシロキサン末端基を有する線状ポリ
シロキサンを造ることができる。オルガノジシロキサン
を使用して結果的に得られる重合体の分子量を調節する
ことができる。
【００２５】本発明において有用な重合体は、当業界に
知られている静的または動的な被覆方法を使用してポリ
シロキサンまたはポリシラザンを付着させることにより
、ＣＺＥカラムの壁に共有結合させることができる。 静的な被覆方法においては、前記シロキサンまたはシラ
ザンを溶媒に溶解させ、得られた溶液でカラムを充填し
、カラムの一端を閉じそして他端を減圧源に連結する。 溶媒を蒸発させて重合体のフィルムをカラムの壁上に残
置する。
【００２６】動的な被覆方法においては、同様の溶液ま
たは未希釈の重合体を使用してカラムを部分的に充たし
、この溶液または重合体に、カラムを通してガス圧また
は減圧をかける。これにより、カラムの壁上に重合体の
フィルムを形成させる。
【００２７】いずれの被覆方法においても、重合体の最
被の被覆に続いて、カラムを不活性ガスにてパージ（ｐ
ｕｒｇｅ）し、次いで任意的に、減圧下で蒸発させ、そ
してカラムの末端を好ましくはフレームシーリング（ｆ
ｌａｍｅ　　ｓｅａｌｉｎｇ）によって閉じる。次いで
、このカラムを約２００℃〜約４５０℃の温度に加熱し
、その温度に保持して重合体をカラムと、好ましくは約
１０分間〜約１２時間において共有結合させる。次いで
、カラムを冷却し、末端の閉じられているところを除去
し、そしてカラムを有機溶媒で洗っていくらかの未結合
の重合体を除去する。結果的に得られたカラムは、典型
的には５０ｎｍ以下の厚さである安定な共有結合したフ
ィルムで被覆された不活性な表面を有している。更に、
カラムの任意的な処理には、カラムを水またはＣＺＥ緩
衝溶液で洗っていくらかの水溶性残渣を除去し、そして
カラムを通して不活性ガスを通しながらカラムを加熱し
、いくらかの残留揮発性物質を除去する。
【００２８】本発明によって不活性化された壁を有する
カラムは、ガラスまたはヒューズドシリカの内部表面に
、本発明に有用な重合体が共有結合している前記ガラス
またはヒューズドシリカの内部表面を有する毛管カラム
である。カラムの最大の内部の孔は、カラム内部の緩衝
溶液を通る電流の流れから結果的に生じる加熱される試
料によって制限される。この加熱は、カラムの孔の断面
積および緩衝溶液のイオン濃度の関数である。また、カ
ラムの最大の孔は、孔の内部への試料の拡散によって制
限され、小さい孔のカラムは、この拡散を最少にする。 カラムの最大の孔は、好ましくは約１００μｍ、更に好
ましくは約５０μｍ、そしてなお更に好ましくは約２５
μｍである。２５μｍ以下においては、表面：容量の比
は、ＣＺＥおよびＭＥＣＣによる分離のためには秀れて
いる。カラムの最少の孔は、検出器の制限によって限定
され、好ましくは約２μｍである。カラムの最大の長さ
は、分析時間についての実際上の制限によって限定され
、好ましくは約５ｍ、更に好ましくは約１ｍであり、一
方、カラムの最少の長さは、使用される特別な装置の形
状によって制限され、好ましくは約５ｃｍ、更に好まし
くは約１０ｃｍである。
【００２９】本発明によって不活性化された壁を有する
カラムを操作するための条件は、ＣＺＥおよびＭＥＣＣ
による分離に習熟した当業者にとっては容易に明らかで
あり、そしてそれらには、約１５℃〜約５０℃のカラム
および溶液の温度、および約２０００〜約３０，０００
ボルトのカラムを横切る電位差が包含される。また、本
発明のＣＺＥおよびＭＥＣＣによる方法に有用な緩衝溶
液は、ＣＺＥおよびＭＥＣＣによる分離に習熟している
当業者には容易に明らかであり、そしてイオン化可能な
塩の水溶液が包含される。これらには、リン酸、ホウ酸
、酢酸およびクエン酸のナトリウム塩およびカリウム塩
およびそれらの混合物が包含される。緩衝溶液には、任
意的に、生物緩衝溶液（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　　ｂｕ
ｆｆｅｒｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）、例えば塩化ナトリウム
または塩化カリウム、エチレンジアミン四酢酸のナトリ
ウム塩またはカリウム塩のような塩から造られた溶液、
およびテトラアルキルアンモニウム塩のハライド（ただ
し、アルキル基は１〜約５個の炭素原子を含有している
）；界面活性剤例えばセチルトリメチルアンモニウムブ
ロマイド、ツイーンＴＭ２０（ＴｗｅｅｎＴＭ２０）等
；有機変性剤（アルコール類、例えばメタノール、エタ
ノールおよびイソプロパノールが包含される）、および
アセトニトリル；およびその他の変性剤、例えば尿素、
ヒドロキシアルキルセルロース、エチレングリコール、
モルホリン、および胆汁の塩、を包含させることができ
る。他の可溶性金属イオンを特別な分離のために存在さ
せることができる。好ましいものは、リン酸、ホウ酸、
酢酸およびクエン酸のナトリウム塩およびカリウム塩、
およびこれらの混合物である。緩衝溶液のイオン濃度は
、好ましくは約２００ミリモル以下、更に好ましくは約
１０〜約５０ミリモルである。イオン濃度の実際上の低
限は、カラム中の溶液の過度の加熱の原因とならない電
流の流れを可能にする濃度である。
【００３０】シリカカラムを通して流れる電気浸透流は
、カラムの壁上で利用できるＳｉ−Ｏ−基またはＳｉ−
ＯＨ基の数に正比例する。不活性化されていないヒュー
ズドシリカのカラムは、約９×１０−４ｃｍ２　／ボル
ト・秒の電気浸透流を生ずるであろう。本発明のＣＺＥ
およびＭＥＣＣによる分離においては、この流れは、結
合した相によるシラノール基の効果的遮蔽によって低い
値に制限され、そしてカラムの壁が本発明によってよく
不活性化されたカラムにおいては０に近づいてゆく。
【００３１】本発明によってＣＺＥまたはＭＥＣＣによ
って分離することができる被分析物には、蛋白質、生重
合体（ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒ）、ペプチド、ＤＮＡフラ
グメント、アミノ酸、およびその他の小さい分子、およ
び１００ダルトン（Ｄａｌｔｏｎｓ）以下〜約１５０，
０００ダルトン、更に好ましくは約１００ダルトン〜約
１００，０００ダルトンの範囲のスパン（ｓｐａｎｓ）
、が包含される。そのような被分析物の例には、約６６
，０００ダルトンの典型的サイズを有するコンアルブミ
ン（ｃｏｎａｌｂｕｍｉｎ）、それぞれ約１８，４００
ダルトンのサイズを有するβ−ラクトグロブリンＡおよ
びβ−ラクトグロブリンＢ、および約１６，０００ダル
トンのサイズを有するミオグロビン、が包含される。本
発明の方法は、蛋白質、および加熱によって容易に変性
されるか、さもなければ分解される生物物質、および未
処理のＣＺＥカラムまたはＭＥＣＣカラムのシリカ表面
に特に親和性を有する物質に特に適している。被分析物
は、特別な検出器の制限に依存するが、約５μｇ／ｍｌ
以下〜約４ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度に亘って存在させる
ことができる。
【００３２】本発明によって不活性化されたカラムから
の被分析物の泳動中または泳動に続く被分析物の検出は
、ＣＺＥおよびＭＥＣＣによる分離に習熟した当業者に
よって容易に実施することができる方法である。容易に
明らかである検出方法には、紫外線および可視光線によ
る吸収法、電気化学的検出法、蛍光分光分析法および質
量分光分析法、が包含される。
【００３３】次の実施例は、本発明を例示することを意
図しており、特許請求の範囲に限定されている以外は、
これら実施例によって限定されることはない。全ての比
および％は、特にことわりがなければ、重量によってよ
り、また全ての物質は、特にことわりがなければ、市販
の良好な品質である。
【００３４】次の実施例において使用した蛋白質混合物
は、Ｓｉｇｍａ　　ＣｈｅｍｉｃａｌＣｌｍｐａｎｙ，
Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ　　６３１７８か
ら得られた親液性化した蛋白質の粉末（ｌｙｐｏｐｈｉ
ｌｉｚｅｄ　　ｐｒｏｔｅｉｎｐｏｗｄｅｒｓ）から造
ったものであり、各蛋白質の１ｍｇ／ｍｌを含んでおり
、水で最終濃度に希釈した。相応するｐＩ値を有する蛋
白質を次に示した。 　　　　　　　　　　蛋白質　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　ｐＩ　　β−ラ
クトグロブリンＡ　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　５．１　　β−ラクトグロブリンＢ　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　５．３　　カー
ボニック　　アンヒドラーゼＩＩ　　　　　　　　　　
　　　　５．９　　コンアルブミン　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　６．７　
　ミオグロビン　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　７．４　　トリプシノゲ
ン　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　９．３　　リボヌクレアーゼＡ　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　９．６　
　リソチーム　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　１１．０
【００３５】実施
例１ この実施例は、シロキサン重合体を用いて毛管カラムを
不活性化することを例示する。ポリイミドの外部被覆、
外径３５０μｍおよび内径（孔）５０μｍ（Ｐｏｌｙｍ
ｉｃｒｏ　　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｐｈｏｅｎｉ
ｘ，ＡＺ８５０１７）を有するヒューズドシリカ毛管を
、１０ｍの長さに切断し、毛管カラムのフレーム（ｆｒ
ａｍｅ）にコイル状に巻き、２６０℃に２時間保持して
微量の水分を除去した。ポリ（ｎ−オクチルメチルシロ
キサン）１００ｍｇをペンタン５０ｍｌに溶解させた溶
液を造り、この溶液の０．５〜１．０ｍｌを加圧可能な
貯蔵器に入れた。乾燥した毛管を貯蔵器と連結し、窒素
を用いて貯蔵器を加圧することにより毛管を通して溶液
を押し入れた。次いで、窒素を毛管を通して１時間通過
させ、その後、それを排気し、減圧下で３０分間保持し
た。次いで、毛管の両端をフレームシール（ｆｌａｍｅ
−ｓｅａｌ）し、そしてその毛管をオーブン（ｏｖｅｎ
）中で３６０℃に加熱し、その温度において６時間保持
した。次いで、毛管を冷却し、シールを切断し、ペンタ
ン１〜２ｍｌを貯蔵器中に入れ、毛管と貯蔵器を連結し
た。ペンタンを、４１４ｋＰａにおいて毛管を通して押
入れ、次いで毛管を窒素を用いて一夜パージ（ｐｕｒｇ
ｅ）した。この毛管を１ｍの長さに切断し、それぞれに
窓用に６５ｃｍにマーク（ｍａｒｋ）を付けた。これら
の窓は、毛管のマーク領域上に発煙硫酸をしたたらせて
ポリイミドの被覆を１〜２ｃｍ部分（ｓｅｇｍｅｎｔｓ
）溶解させ、溶解した被覆を水を湿らせた布でふき取り
、そして窓領域を水ですっかり洗って残留している酸を
除去した。これらのカラムは、以後、“Ｃ８　”カラム
と称する。
【００３６】同様な操作を用いて、ポリ（ｎ−オクチル
メチルシロキサン）の代りに、ポリ（ジメチルシロキサ
ン）を使用してカラムを造り（以後“ジメチル”カラム
と称する）、およびポリ（ｎ−オクタデシルメチルシロ
キサン）を使用してカラムを造った（以後“Ｃ１８”カ
ラムと称する）。
【００３７】実施例２ この実施例は、本発明における有用なカラム中の電気浸
透流の測定、およびその流れと未処理カラム中の流れと
の比較を例示する。使用した装置は、スペクトロフィジ
ィクス　　クロムジェット　　インテグレーター〔Ｓｐ
ｅｃｔｒｏＰｈｙｓｉｃｓ　　Ｃｈｒｏｍｊｅｔ　　Ｉ
ｎｔｅｇｒａｔｏｒ（ＳｐｅｃｔｒｏＰｈｙｓｉｃｓ　
　Ｉｎｃ．，Ｓａｎ　　Ｊｏｓｅ，ＣＡ）〕およびＭＳ
−ＤＯＳ操作システムおよびベックマン　　ゴールド　
　データリダクション　　ソフトウェアー（Ｂｅｃｋｍ
ａｎ　　Ｇｏｌｄ　　ｄａｔｅ−ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ　
　ｓｏｆｔｗａｒｅ）で走査するマイクロコンピュータ
ーに連結した２７０Ａ型自動毛管電気泳動システムであ
った。各カラムの電気浸透流は、ｐＨ７．０に調節した
リン酸ナトリウムの２５ミリモル（ｍＭ）溶液を使用し
て、中性マーカー（ｎｅｕｔｒａｌ　　ｍａｒｋｅｒ）
−ベンジルアルコールの０．０１％（容量／容量）水溶
液−の移動度を測定することにより決定した。緩衝溶液
は一塩基性または二塩基性のリン酸ナトリウムから造っ
た。全ての試料を、１７ｋＰａ（絶体）における減圧を
使用して１秒間に流体力学的に注入し、３ナノリットル
〔ｎａｎｏｌｉｔｅｒ（ｎｌ）〕の試料容量を導入した
。１ｍのカラムを横切る電位差は２００Ｖ／ｃｍであり
、注入の終りから検出用窓までの各カラムの長さは６５
ｃｍであり、そしてカラムは、実験を通して３０℃の温
度に維持した。被分析物は、２００ｎｍの波長において
測光的に検出した。
【００３８】各分離前に、カラムを０．１Ｍ水酸化ナト
リウム水溶液を用いて１分間洗い、次いで緩衝溶液を用
いて３分間すすいだ。本発明によって不活性化したカラ
ムのそれぞれについて状態調節時間（ｃｏｎｄｉｔｉｏ
ｎｉｎｇ　　ｐｅｒｉｏｄ）を観察した。その間に、電
気浸透流の速度は、２０〜３０分の時間の５つの実験の
間に着実に減少し、その後に流れは一定のままになった
。 この状態調節時間の後に、ベンジルアルコール中性マー
カーのための平均移動時間から電気浸透流を測定した。 次の第１表に、本発明の３種の結合した不活性化被覆を
有する不活性化したカラム、および不活性化されていな
いヒューズドシリカのカラムのこれらの測定の結果を示
した。各ケースにおいて、本発明の被覆は、電気浸透流
を減少させた。すなわち、Ｃ１８被覆は、この流れを３
７％減少させ、Ｃ８　被覆は、この流れを４３．４％減
少させ、そしてジメチル被覆は、この流れを４８．８％
減少させた。
【表１】 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　第　　１　　表　　　　　　　　　　　　　
　処理カラムおよび未処理カラム中の電気浸透流　　　
　　　　　　　　　　　カラム　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　電気浸透流　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　ｃｍ／分　　　
　　　　　　　　　　　　　未処理　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　７．６７　　
　　　　　　　　　　　　Ｃ１８　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　４．８４　
　　　　　　　　　　　　　Ｃ８　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　４．３４
　　　　　　　　　　　　　　ジメチル　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　３．９３
【０
０３９】実施例３ この実施例は、緩衝溶液のｐＨの関数としての、本発明
のＣ１８カラムおよびジメチルカラムにおける、および
未処理のシリカカラムにおける、ベンジルアルコール中
性マーカーの電気泳動による移動度を説明する。実施例
２に記載した操作を使用し、ただし３〜１０のｐＨ値お
よび一定のイオン濃度に調節した２５ｍＭリン酸ナトリ
ウム緩衝溶液を使用した。ベンジルアルコールの０．０
１％（容量／容量）水溶液の試料を、Ｃ１８、ジメチル
および未処理のヒューズドシリカカラムに注入し、１０
−４ｃｍ２　／Ｖの単位における、カラム中の試料の電
気泳動による移動度を測定した。これらの測定結果を次
の実施例４に続く第２表に示した。
【００４０】実施例４ この実施例は、緩衝溶液のｐＨの関数としての、本発明
のＣ８　カラムにおける、および未処理のシリカカラム
における、ベンジルアルコール中性マーカーの電気泳動
による移動度を例示する。ベンジルアルコール中性マー
カーの試料の電気泳動による移動度を、内径５０μｍお
よび長さ４８ｃｍ（検出器に対する長さ３７ｃｍを有す
る）のＣ８　カラムを用いて、３〜９．５のｐＨ範囲に
亘って測定し、同様の寸法の未処理のヒューズドシリカ
カラムと直接比較した。緩衝水溶液は、１０ｍＭリン酸
ナトリウム／６ｍＭホウ酸ナトリウム溶液として調製し
、かつ指示されたｐＨおよびイオン濃度に調節した。手
動の毛管電気泳動システムとして、２０キロボルトの電
位差発生用ヒポトロニクス８４０Ａ型パワーサプライ（
Ｈｉｐｐｏｔｒｏｎｉｃｓ　　Ｍｏｄｅｌ　　８４０Ａ
　　ｐｏｗｅｒ　　ｓｕｐｐｌｙ）（Ｈｉｐｐｏｔｒｏ
ｎｉｃｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｒｅｗｓｔｅｒ，ＮＹ　　１０
５０９）、および波長２２９ｎｍにおいて操作する改良
したラボラトリー　　データ　　コントロールＵＶＩＩ
Ｉ　型（ｍｏｄｉｆｉｅｄＬａｂｏｒａｔｏｒｙ　　Ｄ
ａｔａ　　ＣｏｎｔｒｏｌＭｏｄｅｌ　　ＵＶＩＩＩ　
）（Ｈｉｐｏｔｒｏｎｉｃｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｒｅｗｓｔ
ｅｒ，ＮＹ１０５０９）吸着度検出器を包含するシステ
ムを使用した。カラムは、実験の間はずっと室温（約２
３℃）にしておいた。０．０１％（容量／容量）のベン
ジルアルコール水溶液の試料を、この試料溶液中にカラ
ムの注入用末端を差し込み、そしてこの注入用末端をカ
ラムの溶出末端の上１０ｃｍに引き揚げることにより、
静水圧的に注入した。各カラムは、注入と注入との間に
、緩衝溶液を用いて５分間フラッシ（ｆｌｕｃｈ）した
。これらの測定の結果を次の第２表に示した。
【表２】 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　第　　２　　表　　処理カラムおよび未処理
カラム中の中性マーカーの電気泳動による移動度　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　カ　　　　ラ　　　　　　ム　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　ｐＨ　　　　　　　　未
処理　　　　　　　　　　Ｃ１８　　　　　　　　Ｃ８
　　　　　　　　　ジメチル　　　　　　３　　　　　
　　　２．６７　　　　　　　　１．９０　　　　２．
３３　　　　データなし　　　　　　４　　　　　　　
　５．９６　　　　　　　　２．５３　　　　２．５１
　　　　データなし　　　　　　５　　　　　　　　７
．２１　　　　　　　　２．９３　　　　２．５１　　
　　２．７９　　　　　　６　　　　　　　　７．８４
　　　　　　　　２．８５　　　　２．３８　　　　３
．１５　　　　　　７　　　　　　　　８．４０　　　
　　　　　３．４７　　　　３．１０　　　　３．９３
　　　　　　８　　　　　　　　８．４０　　　　　　
　　３．８４　　　　３．００　　　　４．３２　　　
　　　９　　　　　　　　８．２８　　　　　　　　３
．８８　　　　３．１６　　　　４．１９　　　　１０
　　　　　　　　８．３４　　　　　　　　３．８５　
　　　３．１８　　　　４．０２
【００４１】第２表の
結果に見られるように、ｐＨの変化に伴う電気泳動によ
る移動度の変化は、未処理のヒューズドシリカカラムと
比較して、本発明のカラムにおいては大いに減少してい
る。
【００４２】実施例５ この実施例は、未処理のヒューズドシリカカラム上のコ
ンアルブミンの移行性と比較して、本発明の方法を使用
するコンアルブミンの移行性を比較する。この実施例の
分離は、参考カラムが内径５０μｍおよび長さ７５ｃｍ
を有する未処理のヒューズドシリカカラムであり、本発
明の処理カラムが内径５０μｍおよび長さ５０ｃｍを有
するＣ１８カラムである以外は、実施例４の装置および
操作を使用して行った。緩衝溶液は、次の第３表に示し
たように調節したｐＨを有する１０ｍＭリン酸ナトリウ
ム／６ｍＭホウ酸ナトリウムの水溶液である。試料は、
１ｍｇ／ｍｌのコンアルブミン溶液であった。これらの
結果を次の第３表に示した。
【表３】 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　第　　３　　表　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　コンアルブミンの移行　　
カラム　　　　　　ｐＨ　　　　　　移行時間　　　　
　　　　コメント　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　（分）　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　未処理　　　　　　８．３　　　　　　１３　　　
　　　重大なテーリング（ｔａｉｌｉｎｇ　）あり未処
理　　　　１０．１　　　　　　１５　　　　　　鋭い
ピーク（ｐｅａｋ）があるが、いくらかの　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　試料の吸収ありＣ１８　　　　　　　　８．０　
　　　　　　　８　　　　　　鋭いピークあり
【００４
３】実施例６ この実施例は、未処理のヒューズドシリカカラムからの
結果と比較して、本発明の方法による蛋白質の分離を例
示する。蛋白質試料としては、４種の蛋白質：ミオグロ
ビン、コンアルブミン、β−ラクトグロブリンＡおよび
β−ラクトグロブリンＢを含有する試料を調製した。こ
の試料を、実施例４の装置およびＣ８カラムを使用して
、それぞれｐＨ６．２、ｐＨ７．２およびｐＨ９．２に
調節した１０ｍＭリン酸ナトリウム／６ｍＭホウ酸ナト
リウムの緩衝水溶液を使用して、分離した。これらの分
離の結果を次の第４表に示した。
【表４】 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　第　　４　　表　　　　　　　　　　異った
ｐＨ値におけるＣ８　カラムを使用した蛋白質の分離　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　蛋白
質の移行時間（分）　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　ｐＨ　　　　　　ミオグロビ
ン　　　　コンアルブミン　　　　β−ラクト　　　　
　　β−ラクト　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　グロブリンＡ　　　　グロブリンＢ９．２　　　　　
　８．５（１）　　　　　　　８．５（１）　　　　　
　　　　１９．０　　　　　　　　２１．８７．２　　
　　　　８．０（２）　　　　　　　８．１（２）　　
　　　　　　　１６．８　　　　　　　　１９．０６．
２　　　　　　７．７（３）　　　　　　　８．１（３
）　　　　　　　　　１６．８（４）　　　　　１８．
８（注）（１）　分離していないピークあり、正確な測
定は不可能。 （２）　部分的に分離したピークあり、正確な測定は困
難。 （３）　ベースライン（ｂａｓｅｌｉｎｅ）に充分に分
離したピークあり。 （４）　より高いｐＨにおいて隠れている第５のピーク
の部分的分離あり。
【００４４】実施例７ この実施例は、実施例１に記載されたジメチルカラムお
よび未処理のヒューズドシリカの比較カラムを使用して
、本発明の方法による種々なｐＨレベルにおける蛋白質
の分離を例示する。実施例２の操作および手動式装置を
使用して、実施例６において使用した４種の蛋白質を含
有する試料を、５０μｍ×１ｍのジメチルカラムおよび
未処理のヒューズドカラム中に流体力学的に注入した。 １０ｍＭリン酸ナトリウム／６ｍＭホウ酸ナトリウム水
溶液を第５表に指示されているｐＨに調節し、そして、
３０℃の温度において、カラムを横切っている２０ｋＶ
の電位差をかけて分離を行った。
【表５】 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　第　　５　　表異ったｐＨ値におけるジメチ
ルカラムおよび未処理カラムを使用した蛋白質の分離　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　蛋白質の
移行時間（分）　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　カラム　　　　ｐＨ　　　　ミオ
グロビン　　コンアルブミン　　β−ラクト　　　　β
−ラクト　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
グロブリンＢ　　グロブリンＡジメチル　　７．０　　
　　　　２０．２４　　　　　　　　　２９．１３　　
　　　　　　　　　３９．３１　　　　　　　　　４３
．６５　　〃　　　　　　７．５　　　　　　２０．９
６　　　　　　　　　２３．６１　　　　　　　　　　
　４１．０８　　　　　　　　　４５．９０　　〃　　
　　　　８．０　　　　　　２１．１８　　　　　　　
　　２２．２２　　　　　　　　　　　３８．６８　　
　　　　　　　４２．５３未処理　　　　６．０　　　
　　分離なし、試料蛋白質が本質的に完全に吸収される
。 　　〃　　　　　　７．０　　　　　１５分において広
い不明確なピークあり。 　　〃　　　　　　８．０　　　　　　　８．５９　　
　　　　　　　１０．９０　　　　　　　　　　　１１
．２２　　　　　　　　　１１．６４　　〃　　　　　
　９．０　　　　　　　８．８３　　　　　　　　　　
９．１３　　　　　　　　　　　１０．８９　　　　　
　　　　１１．５０（１）　（注）（１）　より低いｐ
Ｈにおいて隠れている第５のピークが、また表われる。

Claims (26)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】　　（ａ）　　　約１００μｍより小さい
    孔径を有する小孔のガラスまたはヒューズドシリカの毛
    管カラムであって、水素化シリル重合体、シロキサン重
    合体、環状シロキサン重合体、シラザン重合体、および
    シリコーン重合体から成る群から選ばれた重合体に共有
    結合されたカラム内部表面を有し、かつ緩衝溶液で充た
    されたカラムの前記小孔を有する前記カラム内に、被分
    析物の緩衝溶液を導入し、 （ｂ）　　　前記カラムの一端から他端に高電位差を設
    定し、（ｃ）　　　前記被分析物を前記カラム内にて分
    離させ、そしてそれが電気浸透流によって前記カラムか
    ら流出するように、前記カラムから緩衝溶液内に移行さ
    せ、そして（ｄ）　　　前記カラムの端部または端部近
    くにおいて、緩衝溶液内の被分析物を検出する 工程から成り、かつそれらの工程が出現する順序におい
    て実施する、キャピラリーゾーン電気泳動による分離お
    よびミセル状動電気的毛管クロマトグラフィーによる分
    離の実施方法。
  2. 【請求項２】　　重合体がシロキサン重合体である、請
    求項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】　　シロキサン重合体がポリ（ジアルキル
    シロキサン）である、請求項２に記載の方法。
  4. 【請求項４】　　シロキサン重合体がポリ（アリールシ
    ロキサン）である、請求項２に記載の方法。
  5. 【請求項５】　　シロキサン重合体がポリ（アルキルア
    リールシロキサン）である、請求項２に記載の方法。
  6. 【請求項６】　　シロキサン重合体がポリ（ジアリール
    シロキサン）である、請求項２に記載の方法。
  7. 【請求項７】　　重合体がシラザン重合体である、請求
    項１に記載の方法。
  8. 【請求項８】　　シラザン重合体がポリ（アルキルシラ
    ザン）である、請求項７に記載の方法。
  9. 【請求項９】　　シラザン重合体がポリ（アリールシラ
    ザン）である、請求項７に記載の方法。
  10. 【請求項１０】　　シロキサン重合体が環状シロキサン
    重合体である、請求項２に記載の方法。
  11. 【請求項１１】　　シラザン重合体が環状シラザン重合
    体である、請求項７に記載の方法。
  12. 【請求項１２】　　シロキサン重合体がポリ（ｎ−オク
    チルメチルシロキサン）である、請求項３に記載の方法
    。
  13. 【請求項１３】　　シロキサン重合体がポリ（ｎ−オク
    タデシルメチルシロキサン）である、請求項３に記載の
    方法。
  14. 【請求項１４】　　ヒューズドシリカのカラム内壁によ
    って囲まれた中空の孔を有するヒューズドシリカの管か
    らなり、前記孔は、約２μｍ〜約１００μｍの直径を有
    し、前記管は、約５ｍ〜約５ｃｍの長さを有し、そして
    前記内壁は、それに、水素化シリル重合体、シロキサン
    重合体、環状シロキサン重合体、シラザン重合体、およ
    びシリコーン重合体から成る群から選ばれた重合体が共
    有結合している、キャピラリーゾーン電気泳動による分
    離およびミセル状動電気的毛管クロマトグラフィーによ
    る分離を実施するために適したカラム。
  15. 【請求項１５】　　重合体がシロキサン重合体である、
    請求項１４に記載のカラム。
  16. 【請求項１６】　　シロキサン重合体がポリ（ジアルキ
    ルシロキサン）である、請求項１５に記載のカラム。
  17. 【請求項１７】　　シロキサン重合体がポリ（アリール
    シロキサン）である、請求項１５に記載のカラム。
  18. 【請求項１８】　　シロキサン重合体がポリ（アルキル
    アリールシロキサン）である、請求項１５に記載のカラ
    ム。
  19. 【請求項１９】　　シロキサン重合体がポリ（ジアリー
    ルシロキサン）である、請求項１５に記載のカラム。
  20. 【請求項２０】　　重合体がシラザン重合体である、請
    求項１４に記載のカラム。
  21. 【請求項２１】　　シラザン重合体がポリ（アルキルシ
    ラザン）である、請求項２０に記載のカラム。
  22. 【請求項２２】　　シラザン重合体がポリ（アリールシ
    ラザン）である、請求項２０に記載のカラム。
  23. 【請求項２３】　　シロキサン重合体が環状シロキサン
    重合体である、請求項１４に記載のカラム。
  24. 【請求項２４】　　シラザン重合体が環状シラザンであ
    る、請求項２０に記載のカラム。
  25. 【請求項２５】　　シロキサン重合体がポリ（ｎ−オク
    チルメチルシロキサン）である、請求項１４に記載のカ
    ラム。
  26. 【請求項２６】　　シロキサン重合体がポリ（ｎ−オク
    タデシルメチルシロキサン）である、請求項１４に記載
    のカラム。
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