JPH03163353A - 高性能マイクロ毛管ゲル電気泳動 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、電気泳動に関し、特に、高性能電気泳動用ゲ
ル充填マイクロ毛管カラムに関する。

［従来の技術コ 電気泳動は、生物科学において最も広く用いられている
分離技法の１つである。ペプチド、蛋白質及びオリゴヌ
クレオチドのような分子種は、電界の影響下にある緩衝
液中でそれらを泳動させることにより、分離される。こ
の緩衝液は、対流混合の発生を最小にするためのアガロ
ース又はポリアクリルアミドのような適切なゲル剤であ
って、低濃度から中濃度のものと共に、通常は使用され
る。

２つの主要な分離機構、即ち、検体の有効電荷における
差異に基づく分離と分子の大きさに基づく分離とが、存
在する。これらの分離機構の内の第１のものは、オリゴ
ヌクレオチドの分離の場合、低い分子量から中位の分子
量の材料に限定される。

何故ならば、高分子量範囲においては、これらの材料の
有効電荷が同じようになり、それらを分離することが困
難又は不可能になる。蛋白質の場合、電荷及び大きさが
、分離を達戊すべく、独立に使用され得る。分子の大き
さに基づく分離は、分子篩い操作として一般的に呼ばれ
ており、制御された孔径を有するゲル母材を分離媒質と
して用いて行われる。そのような分離系においては、検
体の有効電荷が同じであると、分離は、異なった大きさ
の分子種の、ゲル母材を貫通する能力における差異から
生ずる。より小さい分子は、より大きい分子よりも、与
えられた孔径のゲルを、相対的により速く貫通する。オ
リゴヌクレオチド並びに中位の分子量から高分子量のポ
リペプチド及び蛋白質は、通常、分子篩い電気泳動によ
って分離される。しかしながら、蛋白質材料の場合、分
離されるべき材料を変性させてそれらが全て同じ有効電
荷を有するようにすることが、一般的に必要である。こ
れは、通常、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ誘導手順を用いて行われ
、このＳＤＳ−ＰＡＧＥ誘導手順は、例えば、オックス
フォード及びワシントンＤ，Ｃ．在のアイ・アール・エ
ル・プレス（ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ）によってｌ９８１年
に発行された、ビー・ディー・ヘイムス（Ｂ．Ｄ．　Ｈ
ａｍｅｓ）及びディー・リックウッド（Ｄ．　Ｒｉｃｋ
ｗｏｏｄ）編、“蛋白質のゲル電気泳動”に記載されて
いる。この本の内容は、参照によって本明細書中に組み
入れられている。

時には、変性のリスクが最小である条件の下で蛋白質材
料を分離することが、望まれる。そのような場合、尿素
及びＳＤＳのような添加剤は避けられ、そして、結果的
にもたらされる分離は、分子の大きさ及び電荷の両方に
おける差異に基づく。

今日、殆どの電気泳動分離は、スラブ又はオープンベッ
ド内で行われる。しかしながら、そのような分離は、自
動化又は定量化が困難である。異なった有効電荷を有す
る材料の高分離能分離は、オーブンチューブ・フリーゾ
ーン電気泳動及び細い毛管における等速回転電気泳動に
よって達成されている。更に、非常に鋭いピークを生成
すべく、大量の流れが、電気浸透によってもたらされ得
る。

しかしながら、そのような高効率オーブンチューブ電気
泳動は、中位の分子量から高分子量のオリゴヌクレオチ
ドの分離に対しては、通常、適用されない。何故ならば
、これらの材料は、上述のように、非常に似通った有効
電荷を有しているからである。更に、オープンチューブ
電気泳動は、大きさに関する選択性を蛋白質材料に対し
て提供しない。このため、ゲル充填マイクロ毛管がオリ
ゴヌクレオチドの高分離能分離を達成すべく使用され得
るか否かという疑問、及び在来のＳＤＳ−ＰＡＧＥの手
順がそのようなマイクロ毛管で達或され得るか否かとい
う疑問が、生ずる。生物科学における分離技法としての
潜在的な重要性を与えられているマイクロ毛管ゲル電気
泳動に列しては、驚くべきことに、注意が殆ど払われて
こなかったが、本発明の開示によって明らかにされるよ
うに、これらの疑問に対する答は、肯定的である。

イエルテン（Ｈｊｅｒｔｅｎ）は、ジャーナル・オブ・
クロマトグラフイ（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｈｒｏｍ
ａｔｏｇｒａｐｙ）、第２７０巻、第１〜６頁（１９８
３年）に、“高性能電気泳動：高性能液体クロマトグラ
フィの電気泳動対応品（Ｈｉｇｈ　Ｐｅｒｆｏｒｍａｎ
ｃｅ　Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅ−ｓｉｓ：　Ｔｈｅ　
Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ　Ｃｏｕｎｔｅｒｐａ
ｒｔ　ｏｆ　ＨｉｇｈＰｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　Ｌｉｑ
ｕｉｄ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）″と題する論
文を発表している。この論文によると、彼は、５０〜３
００ミクロンの内径及び１００〜２００ミクロンの壁厚
を有するチューブ内の架橋ポリアクリルアミドゲルを用
いている。しかしながら、比較的大きい内腔の毛管、比
較的低い印加電界及び大電流の使用、並びに電気浸透の
不十分な抑制が幾分原因して、このやり方は、効率が低
く、性能が余り良くない。また、彼は、米国特許第３，
７２８，１４５号を得ており、この特許において、彼は
、オーブンチューブ内のフリーゾーン電気泳動における
電気浸透を減少させるべく、大きい内腔のチューブの内
壁に、メチルセルロース又はポリアクリルアミドのよう
な中性の親水性物質を塗被する方法を開示している。そ
の後の特許第４，６８０，２０１号において、イエルテ
ンは、小さい内腔の毛管の内壁に、二官能価試薬によっ
てその毛管の壁に結合させられるポリアクリルアミドの
単分子重合性塗被材料を塗被する方法を開示している。

これらの毛管は、フリーゾーン電気泳動に使用されるオ
ープンチューブでもある。

［発明が解決しようとする課題コ 本発明者以外の研究者による、毛管でのゲル電気泳動の
分野における少量の研究は、通常、カラムに帰着し、こ
れらのカラムは、余り安定ではなく、しかも、高効率・
高分離能分離を達成する、十分に高い電界に曝されるこ
とができなかった。

優れた安定性、効率及び分離能を提供する、電気泳動用
の改良されたゲル充填毛管カラムは、生物科学において
大きな価値を有しよう。

従って、本発明の目的は、優れた安定性、効率及び分離
能を提供する、ゲル充填マイクロ毛管カラムを提供する
ことである。

［課題を解決するための手段］ 上記目的を達戊する、本発明に係るゲル充填マイクロ毛
管カラムは、マイクロ毛管と、このマイクロ毛管の内部
大内の重合体ゲルと、このマイクロ毛管の壁の内表面に
共有結合すると共にその重合体ゲルにも好適に結合する
塗被材料の薄層とを備えている。

マイクロ毛管の壁とゲルとの間の塗被材料の層は、一般
的に疎水性材料であり、マイクロ毛管の壁の内表面上に
反応官能性によって反応することのできる反応性官能基
、例えばシラノール基を有する試薬に由来している。試
薬の残りの部分は、ビニル単量体と反応することのでき
る第２の反応基と、重合した際に重合体ゲルを構或する
、任意の架橋剤とを含んでいてもよい。

親水性重合体の層が、塗被材料の層とゲルとの間に任意
に使用さてもよい。親水性重合体の層は、効果的に電気
浸透を減少させ、カラムを安定化し、高電界（より正確
には高電力）でのマイクロ毛看カラムの操作を思いがけ
なく可能にし、結果的に高分離能分離をもたらす。

本発明に係る改良されたゲル充填マイクロ毛管カラムは
、次のようにして調製する。先ず、マイクロ毛管の内表
面を、それを塩基性材料もしくは酸性材料又は逐次的に
両方に接触させることにより、活性化し、次いで、それ
を、マイクロ毛管の壁に共有結合することのできる適切
な塗被試薬の溶液で処理し、マイクロ毛管の壁の内表面
に共有的に付着する塗被材料の層を形成する。次に、塗
被したマイクロ毛管を、親水性重合体の溶液で任意に処
理し、これを乾燥し、塗被材料の層上に吸着された親水
性重合体の層を残す。この任意の工程に続いて、少なく
とも１つの単量体、任意に少なくとも１つの架橋剤、少
なくとも１つのラジカル源及び適切な触媒を含有する溶
液で、マイクロ毛管を満たし、そして、この混合物をマ
イクロ毛管内で重合させ、マイクロ毛管の内腔を満たす
重合体母材を最終的に形成する。最後の工程として、ゲ
ル充填マイクロ毛管の一方の端部を、きれいに且つ真っ
直ぐに切断する。

本発明に係るゲル充填マイクロ毛管カラムは、非常に安
定であり、しかも、３００ボルト／　ｃ　ｍ以上の印加
電界及びほぼ５０マイクロアンペア以上の電流で良好に
働く。これらの条件の下で、極めて高い分離能の分離が
、非常に少量の材料について得られる。更に、本発明に
係るマイクロ毛管カラムは、検体の混合物を、それらの
分子量の対数の一次関数として分析することを示した。

従つて、それらは、ナノグラム以下の量の未知の生体高
分子についての正確な分子量決定を可能にする。

［実　施　例コ 以下、添付図面を参照して本発明の実施例について説明
する。

第１図に示されているように、本発明に係るゲル充填マ
イクロ毛管カラムは、マイクロ毛管１０と、このマイク
ロ毛管の壁の内表面に共有的に結合した塗被材料の層１
２と、このマイクロ毛管の内腔内の重合体ゲル材料１８
とを含んでいる。

本明細書中で使用される用語「重合体ゲル」は、共有結
合架橋ユニット、遠距離引力、水素結合、分子鎖の絡み
合い等の種々の手段の内のいずれかによって結合させら
れている重合体鎖の三次元網目構造であって、液相中に
分散させられているものを意味する。重合体網目構造は
、ある程度の剛性を提供し、そして、系の他の成分が、
重合体鎖の間の空間を占める。

マイクロ毛管は、電気泳動に使用される検出装置が、採
用されたその具体的な材料と適切に作用することができ
るならば、いずれの材料で作製されていてもよい。適切
な材料として、例えば、ガラス、アルミナ、ベリリア、
及びテフロンが挙げられる。好適に、マイクロ毛管は、
石英ガラスで作製される。

マイクロ毛管の寸法は、重要である。何故ならば、与え
られた電界に対し、マイクロ毛管の内径が小さくなるに
つれ、具体的に印加された電界によって生成される、電
流及び結果として生ずる加熱が減少するからである。そ
れ故、最高の分離能での分離のためには、マイクロ毛管
が最小の内径を有するということが、望ましい。しかし
ながら、本発明に係る改良されたマイクロ毛管の場合、
この因子は、従来例におけるときよりも幾分重要ではな
い。従って、１０〜２０００ミクロンの範囲内にある内
径を有するマイクロ毛管が、本発明で機能を果す。

使用される重合体ゲル材料１８は、変化させられ得る細
孔構造を有するいずれの重合体でもよい。

それは、架橋されていても、いなくてもよい。好適に、
重合体ゲルは、その細孔構造が単量体及び架橋剤の量並
びに反応条件を変化させることによって変化させられる
ところの架橋重合体である。

適切な重合体系の例は、ポリアクリルアミド、アガロー
ス、及びアガロースとポリアクリルアミドとの混合物で
ある。好適な重合体ゲル材料は、アクリルアミドとＮ，
Ｎ’　　−メチレンビスアクリルアミドとに基づいてお
り、このＮ，Ｎ’　　−メチレンビスアクリルアミドは
、架橋剤として働く。他の可能な架橋剤は、Ｎ，Ｎ’　
−　（１．２−ジヒドロキシエチレン）一ビスアクリル
アミド、Ｎ，Ｎ’ージアリル酒石酸ジアミド、及びＮ，
Ｎ’　　−シスタミンービスアクリルアミドである。更
に、他の単量体及び架橋剤が、それら自身を当業者に示
唆するであろう。

重合反応は、過硫酸アンモニウム又はＮ，Ｎ，Ｎ’　　
Ｎ’　−テトラメチレンエチレンジアミンによって好適
に開始させられるが、当業者に知られている、他のラジ
カル重合開始剤が用いられてもよい。

第１図に示されているように、重合体ゲル材料工８とマ
イクロ毛管の壁の内表面上４との間の層ｌ２は、通常疎
水性材料であり、マイクロ毛管の壁に化学的に結合し得
る塗被試薬から得られる。

この試薬は、通常、一端に適切な反応性官能基を有する
分子鎖であるが、適切な官能価を有する非鎖型分子も、
役に立つであろう。マイクロ毛管の壁に結合する、塗被
試薬の端部は、マイクロ毛管の内表面のシラノール基又
は他の反応性官能基と化学的に結合し得る反応性官能基
を備えている。

試薬のそのような反応性官能基は、トリアルコキシシラ
ン、トリクロロシラン、モノエノレートシラン、ジエノ
レートシラン、トリエノレートシラン、及びアミノシラ
ンのような、典型的な反応性シランであり、これらのシ
ランにおいては、ケイ素元素は、容易に置換され得る少
なくとも１つの基を備えている。適切な塗被試薬の例は
、アルキルジエトキシシラン、アルキルトリエトキシシ
ラン、アルキルジメトキシシラン、アルキルトリメトキ
シシラン、アルキルエーテルジエトキシシラン、アルキ
ルエーテルトリエトキシシラン、アルキルエーテルジメ
トキシシラン、アルキルエーテルトリメトキシシランの
ような材料である。

好適な実施例においては、塗被試薬は、二官能価材料で
あり、重合体ゲル材料との共有結合を原則として形成し
得る第２の官能基をも含んでいる。

そのような官能基としては、ビニル基、置換ビニル基、
又は開裂した際にラジカルを産出するあらゆる基が挙げ
られるが、実際的な目的に対しては、ビニル基が好適で
ある。何故ならば、ビニル基は、マイクロ毛管内で重合
体ゲルを形威し、同時にそれをマイクロ毛管の壁に化学
的に結合することが可能であるからである。代表的な二
官能価試薬は、下記ａ）及びｂ）として示されている、
３−メタクリルオキシプロピルトリメトキシシラン、及
び３−メタクリルオキシプロピルジメチルエトキシシラ
ンである。

ａ　）　ＣＨ＊”Ｃ（ＣＨｓ）一Ｃｏｔ−（ＣＨｚ）ａ
−Ｓｉ（ＯＣＨａ）ａｂ　）　ＣＨ＊＝Ｃ（ＣＨｓ）−
Ｃｏｗ−（ＣＨｉ）ｓ−Ｓｉ（ＣＨｓ）ｚＯｃ２Ｈｓ他
の可能な二官能価試薬は、ビニルトリアセトキシシラン
、ビニルトリ　（−メトキシエトキシ）シラン、ビニル
トリクロロシラン、及びメチルビニルジクロロシランで
あるが、これらは、単に説明のためのものであり、これ
らが、全てではない。

二官能価試薬がそれに結合しないマイクロ毛管（例えば
テフロン）の場合、マイクロ毛管は、層１２を用いずに
使用されてもよく、あるいは、マイクロ毛管の壁及び重
合体ゲルに吸着する能力を有する重合体の層が、用いら
れてもよい。

親水性重合体の薄層が、塗被材料とゲルとの間に任意に
使用され得る。本発明に有用な親水性重合体として、ポ
リオキシメチレンのようなポリオキシド；ポリエチレン
オキシドのようなポリエーテル；ポリエチレンイミンの
ようなポリアルキルイミン；ポリアクリルアミド、ポリ
メチルアクリルアミド、ポリーＮ，Ｎ−ジメチルアクリ
ルアミド、ポリイソプロピルアミド及びボリアクリリル
グリシンアミドのようなポリアミド；ポリエチレングリ
コール及びポリプロピレングリコールのようなポリアル
キレングリコール；並びにポリビニルアルコール、ポリ
ビニルアセテート及びポリビニルピロリドンのようなビ
ニル材料の重合体が挙げられる。親水性重合体の分子量
は、６００〜５ｏｏ，ｏｏｏダルトン以上であり、好ま
しくは、ほぼ５０００〜２００，０００ダルトンの範囲
内である。親水性重合体は、好適に線状重合体である。

ポリエチレングリコールが、好適な親水性重合体である
。ポリエチレングリコールが親水性重合体として用いら
れている改良されたマイクロ毛管の場合、ポリエチレン
グリコールは、約８０００ダルトン以上の平均分子量を
好適に有しているが、６００〜３５，０００ダルトンの
範囲内の平均分子量を有する材料も、役に立つであろう
。役８０００ダルトン以上の平均分子量を有するポリエ
チレングリコールが好適であり、本発明において採用さ
れる水性系での使用に特に適している。

最高の分離能のためには、ゲル充填マイクロ毛管の少な
くとも前端部が、マイクロ毛管の中心軸に垂直に、きれ
いに且つ真っ直ぐに切断されるということが、必要であ
る。マイクロ毛管の端部に露出する重合体ゲル材料の表
面が平坦でないと、試料を均一な狭いバンドで注入する
ことが不可能となり、その結果、得られるピークが広く
なる。

本発明のゲル充填マイクロ毛管は、通常、下記のように
して調製される。先ず、マイクロ毛管を、１００℃超で
通常は数時間加熱し、そして、その内表面を、塩酸又は
硝酸の希薄溶液のような酸性材料及び／又はアンモニア
ガス又は塩基の溶液のような塩基性材料と接触させるこ
とにより、マイクロ毛管を活性化させる。加熱工程にお
いては、１１０’Ｃ〜２００℃の温度が、好都合に使用
され得る。そのような加熱の時間は、数時間から一晩以
上まで変化させられ得る。一手順においては、活性化工
程は、マイクロ毛管を、ほぼ２０〜３５℃、好ましくは
室温でほぼ２時間に亘って乾燥アンモニアガスでフラッ
シすることにより、完了する。別の好適な手順において
は、マイクロ毛管を上述のようにして加熱し、それをア
ルカリ金属水酸化物のような塩基の溶液、例えば０．１
〜ＩＮのＮａＯＨ溶液で満たし、その溶液をマイクロ毛
管内に通常は２０〜３５℃の範囲内の温度、好ましくは
室温で少なくともほぼ１〜３時間、場合によっては一晩
に亘って置いておき、その後、水でフラッシすることに
より、マイクロ毛管を活性化し得る。

マイクロ毛管を活性化するのに用いられる時間及び温度
は、それらがマイクロ毛管を活性化するのに十分であり
、もってマイクロ毛管と二官能価試薬との間の良好な結
合が達成されるよう、選択される。

次に、活性化させたマイクロ毛管を、その容量の少なく
とも２０倍の、その壁を塗被するのに使用する試薬の溶
液でフラッシし、そして、このマイクロ毛管を、２０〜
３５゜Ｃの温度、好ましくは室温で、少なくとも１時間
、好ましくは２時間以上に亘り、反応させるべく、その
塗被試薬の溶液で満たしたまま放置する。別の手順は、
満たしたマイクロ毛管を、約６０°Ｃで一晩、真空オー
ブン内に置くことである。

塗被試薬の溶液は、アルコール、エーテル、ケトン又は
中位の極性ハロゲン化溶剤のような非水溶剤内で調製さ
れ、通常、４〜６０重量％の塗被試薬を含有している。

代表的な溶剤は、メタノール、ジオキサン、アセトン及
び塩化メチレンである。塗被試薬をマイクロ毛管の内壁
と反応させた後、マイクロ毛管をメタノールのような適
切な溶剤で濯ぎ、更に水で濯ぐことにより、過剰の未反
応試薬を任意に除去する。通常、チューブ容量の少なく
とも１００倍の溶剤及び水が、用いられる。

親水性重合体の任意の層を形成するため、塗披されたマ
イクロ毛管を、緩衝剤であって、後述するゲル充填剤の
調製に使用されるものを含有する親水性重合体のガス抜
きされた溶液で満たす。この溶液中の重合体の濃度は、
通常、約５〜１０％（Ｗ／　Ｖ　）である。次に、マイ
クロ毛管を、約１２５°Ｃの温度に維持されている真空
オーブン内に、数時間又は一晩、マイクロ毛管が乾燥す
るまで保持する。これは、マイクロ毛管を顕微鏡で検査
することにより、容易に決定される。最後に、緩衝剤の
過剰な結晶をマイクロ毛管の壁から除去するため、親水
性重合体の被膜を殆ど乱さないようにして、マイクロ毛
管を、その容量の１又は２倍の緩衝液でフラッシする。

親水性重合体の任意の層がポリエチレングリコールであ
る場合、ポリエチレングリコールを、ガス抜きされた、
３回蒸留された水であって、約工０°Ｃまで冷却された
ものと組み合わせ、次いで、攪拌しつつ、温度を室温ま
で徐々に上昇させる。

沈殿物を含まない、きれいな透明な溶液が、結果的に生
ずる。この溶液は、後述する親水性重合体の緩衝化され
た溶液を調製するのに使用される。

次に、単量体、架橋剤、開始剤及び重合反応用ラジカル
源の別々の溶液を、その濃度は通常は７〜８モルである
が、それよりも高くてもあるいは低くてもよい、水性尿
素内で調製する。非変性であるべく意図されているゲル
を、尿素又は他の変性添加剤を用いることなく調製し、
良好に機能を果させる。これらの試薬の濃度は、溶戒の
アリコートが、採取され、所定の濃度の、単量体、架橋
剤（もし使用されるならば）及び重合触媒を有する重合
混合物を形戊すべく混合され得るよう、選択される。こ
れらの試薬のアリコートを混合する前に、溶液を、少な
くとも１時間、別々にガス抜きする。このガス抜き作業
は、この分野で知られているいくつかの方法で行われ得
るが、基本的には、溶液を機械的に攪拌しつつ、あるい
はそれらを超音波で攪拌しつつ、同時に、ほぼ２０〜３
０ｍｍＨｇの低真空を適用することを包含する。これら
の溶液の調製は、例えばヘイムズ（Ｈａｍｅｓ）及びリ
ックウッド（Ｒｉｃｋｗｏｏｃｌ）によって示されてい
るように、この分野では知られている。

これらの種類の系における単量体の全濃度及び架橋剤の
濃度は、通常、イエルテン（Ｈｊｅｒｔｅｎ）の用語法
を用い、％Ｔ及び％Ｃとしてそれぞれ表現される。これ
に関しては、イエルテン、クロマトグラフィック・レビ
ューズ（Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ　Ｒｅ−ｖｉ
ｅｗｓ）、第９巻、第１２２〜２１９頁（１９６７年）
参照。本発明で好適に使用されるアクリルアミド　Ｎ，
Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド系の場合、％Ｔ及び
％Ｃは、次のように定義される。

％Ｔ＝（アクリルアミドのグラム数＋ビスアクリルアミ
ドのダラム数）÷（１００ミリリットルの溶剤） ％Ｃ＝（ビスアクリルアミドのダラム数×１００）÷（
ビスアクリルアミドのダラム数＋アクリルアミドのダラ
ム数） 単量体及び架橋剤の濃度は、所望の高分子母材の多孔度
に応じて前もって決定される。しかしながら、反応溶液
中の開始剤及び重合触媒の濃度は、実験的に決定されな
ければならない。これは、所望の％Ｔ及び％Ｃを含有す
る試験溶液を調製し、使用される開始剤及び重合触媒の
量を変化させることにより、行われる。ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ電気泳動が考慮されている場合、ナトリウムドデシル
スルフエートも、反応混合物内に、必要量、通常０．１
％（Ｗ／Ｖ）含まれる。これらの試験溶液は、電気泳動
が実施されるべき温度以下で重合することを可能にし、
そして、重合反応の進行は、ビニル二重結合の吸収にお
ける減少を観測することによる紫外分光分析法により、
監視する。あるいは、マイクロ毛管は、視覚的に観察し
得る。開始剤及び重合触媒のレベルは、試験混合物の重
合がほぼ４５〜６０分のような合理的な時間で本質的に
完了するよう、選択する。

正しい試薬濃度が決定すると、重合試薬の新しい混合物
を調製し、泡を生じないよう注意してマイクロ毛管内に
注入する。マイクロ毛管を満たすべく使用する注射器に
マイクロ毛管を接続すべく、内径の小さいテフロンチュ
ーブを使用する。マイクロ毛管を重合混合物で満たすと
、注射器を取り外し、マイクロ毛管の両方の端部を、そ
れらを隔壁（ｓｅｐｔｕｍ）内に挿入することによって
栓をし、隔壁を、重合反応が起こっている間、維持する
。

重合反応は、後続のマイクロ毛管カラムでの電気泳動で
使用される温度以下で行う。重合反応が起こっている間
、その反応を、紫外分光分析法によるビニル基に起因す
る吸収の減少を観測することにより、あるいは視覚的に
、反混合物のアリコートで別々に監視する。カラム内の
重合反応及び別個の監視溶液内の重合反応は同じである
が、毛管内の反応はずっと速い。重合反応が４５〜６０
分の時間で本質的に終了したことを試験溶液が指示する
と、反応を、上述した温度を維持しつつ、少なくとも更
に２時間、好ましくは一晩に亘って進ませる。

別の好適な重合手順は、上述のようにしてマイクロ毛管
を重合試薬の溶液で満たし、そのマイクロ毛管を５〜１
０℃の温度にある冷蔵庫内に直ちに置き、一晩に亘って
重合反応を進ませることである。

マイクロ毛管内の重合反応が本質的に完了した後、キャ
ップをマイクロ毛管の端部から取り外し、マイクロ毛管
の少なくとも一方の端部を、きれいに且つ真っ直ぐに切
断する。これを威し遂げるための一方法は、切断される
べき端部を径の小さいテフロンチューブに緊密に納め、
次いで、テフロンチューブに納められた端部を、マイク
ロ毛管の軸に垂直に、きれいに且つ真っ直ぐにミクロト
ームを用いて切断することであり、このミクロトームは
、テフロンチューブの鞘、マイクロ毛管材料及び重合体
ゲルを、マイクロ毛管の端部に露出したゲル材料の表面
を非常に滑らかにしつつ、切断する。あるいは、好適に
、マイクロ毛管は、サファイア・カッターにより、その
軸に直角に注意深く線を刻まれ、それを曲げることによ
り、きれいに破断され得る。切断作業が、露出した重合
体ゲルの必要な平坦さを実際にもたらしたということを
確認するため、切断したマイクロ毛管の端部を、顕微鏡
で調査する。もし必要ならば、適切に平坦な端部が形成
されるまで、更に切断を行う。マイクロ毛管の両方の端
部は、通常、このようなやり方で処理するが、マイクロ
毛管の前部において真っ直ぐに切断された端部を有する
ことが、本当に必要なだけである。

その調製後、マイクロ毛管を、適切な電気泳動装置内に
配置し、ほぼ１００〜１５０ボルト／Ｃｍの低電界を、
約１時間に亘って印加する。もし・非常にノイズの多い
ベースライン即ちゼロ電流状態が得られるならば、これ
は、マイクロ毛管カラムが不適正に調製されたことを示
す。この場合、新しいマイクロ毛管を調製しなければな
らない。

本発明に係るゲル充填マイクロ毛管カラムを電気泳動に
使用する場合、オープンチューブ・フリーゾーンマイク
ロ毛管電気泳動の分野における当業者には一般的に知ら
れている装置及び技法が、使用される。例えば、ビー・
エル・カーガー（Ｂ．Ｌ．Ｋａｒｇｅｒ）、エイ・エス
・コーエン（Ａ．Ｓ．　Ｃｏｈｅｎ）及びエイ・グット
マン（Ａ．　Ｇｕｔｔｍａｎ）、ジエイ・クロマトグ（
Ｊ．　Ｃｈｒｏｍａｔｇ．）、第４９２巻、第５８５頁
（１９８９年）；エム・ジエイ・ゴードン（Ｍ．Ｊ．Ｇ
ｏｒｄｏｎ）、エクスａ　ハン（Ｘ．　Ｈｕｎｇ）、エ
ス・エル・ペンタニー●ジュニア（Ｓ．Ｌ．　Ｐｅｎｔ
ａｎｅｙ，　Ｊｒ．）及びアール・エヌ・ゼイアー（Ｒ
．Ｎ．　Ｚａｒｅ）、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、
第２４２巻、第２２４頁（１９８８年）；並びにジエイ
・ダブリュ・ジョルジェンスン（Ｊ．Ｗ．　Ｊｏｒｇｅ
ｎｓｏｎ）及びケイ０ディー０ルカクス（Ｋ，Ｄ，　Ｌ
ｕｋａｃｓ）、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、第２２
２巻、第２６６〜２７２頁（１　９　８　３年）参照。

毛管ゲル電気泳動においては、２つの化合物間の分離は
、試料の大きさ、試料中のイオン材料及びゲル濃度を含
む、バンドの鮮鋭度に影響を及ぼす全ての因子によって
影響される。後者の因子が特に重要である。何故ならば
、ゲル濃度が高過ぎると、検体はカラムから完全に締め
出される一方、それが低過ぎると、分子篩い作用が殆ど
又は全く起こらないからである。単一のゲル濃度は、蛋
白質材料又はオリゴヌクレオチドの全ての混合物の分離
に対して最適ではない。具体的な試料に対して適切なゲ
ル濃度を選択することが、必要である。

マイクロ毛管における電気泳動に影響を及ぼす他の重要
な変数は、印加される電界及び使用される電流である。

試料は、所謂”電気泳動注入”技法によって注入される
が、注射器成層注入のような、この分野で知られている
他の技法も、使用され得る。電気泳動注入技法において
は、電気泳動マイクロ毛管の前端部が、適切な極性の電
極を収容する試料溶液中に浸漬され、そして、少量の試
料溶液の、マイクロ毛管の端部内への電気泳動を引き起
こすべく、ほぼ５０〜１００ボルト／　ｃ　ｒＨの電界
が、数秒間印加される。その後、マイクロ毛管は“運転
（ｒｕｎｎｉｎｇ）”緩衝液に移され、所望の電気泳動
電界が印加され、電気泳動が通常の方法で実行される。

マイクロ毛管を冷却するため、冷却ジャケット又は関連
装置が、マイクロ毛管の周囲に、このマイクロ毛管の前
端部及び後端部のみを除く、その犬部分の長さに亘って
使用される。なお、上記前端部及び後端部は、緩衝液中
にそれぞれ浸漬されると共に、電気泳動装置の検出器に
それぞれ接続される。冷却流体は、上記ジャケットを介
して循環させられると共に、所望される温度に維持され
る。あるいは、電気的に制御される機械的な冷却装置が
、マイクロ毛管カラムの周囲に使用され得る。そのよう
な“能動”冷却は、所望のマイクロ毛管温度を維持する
ことにおいて、強制空気又は自然対流よりも効果的であ
る。

分析用高分離能分子篩電気泳動を実施する方法は、分離
されるべき検体を含有する試料のアリコ−トを、本発明
に係るゲル充填マイクロ毛管カラム内に電気泳動的に注
入する工程と、１００〜３００ボルト／　ｃ　ｍ以上の
電界を印加する工程と、Ｒ常約５ｏマイクロアンペア未
満の電流がマイクロ毛管を通過することを許容する工程
と、分離された検体を、それらが検出器を過って泳動ず
る際に、機器を用いて逐次的に検出・測定する工程とを
含んでいる。

本発明に係るゲル充填マイクロ毛管は、検体を、それら
の分子量の対数の関数として、直線状に分離する。従っ
て、標準の電気泳動条件下での未知の検体の移動度を、
標準材料の分子量の対数をそれらの標準材料の移動度に
対してプロットした検量線図と比較することにより、未
知の検体の分子量を決定することが、可能である。

従って、検体の分子量を決定する方法は、本発明に係る
ゲル充填マイクロ毛管カラムを調製し、電気泳動作業パ
ラメータの標準値を選択し（通常、印加電界は１００〜
３００ボルト／　ｃ　ｍ又はそれ以上であり、電流は約
５０マイクロアンペア未満である）、分子量が既知であ
るいくつかの標準検体を含有する標準溶液のアリコート
を上記マイクロ毛管に注入し、電気泳動作業パラメータ
の選択された標準値をマイクロ毛管に適用して標準液を
分離し、その電気泳動条件下での既知標準液の移動度を
測定し、各標準材料についての分子量の対数を標準作業
条件下での移動度に対してプロットし、同一条件且つ同
一カラムで未知の溶液を電気泳動的に分析し、その中に
含有されている検体の移動度を測定し、検量プロットと
の比較からこれらの検体の分子量を最終的に決定するこ
とからなっている。

重合体ゲル充填剤とマイクロ毛管の壁との間の、親水性
重合体の任意の層を含む、壁塗被材料の層を有する改良
されたマイクロ毛管カラムは、そのような毛管壁被膜を
有さないカラムよりも、より長い保存寿命及び使用時に
おけるより良好な安定性を示す。最も重要で且つ思いが
けなかったことに、本発明に係る改良されたマイクロ毛
管カラムは、高分離能分離が短い分析時間で達成される
ことを可能にする、高電界強度で作業させられ得る。

実一」４−Ｉと一理 アクリルアミド、Ｎ，Ｎ’　　−メチレンビスアクリル
アミド、Ｎ，Ｎ，Ｎ’　　　Ｎ’　　−テトラメチレン
エチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）　、過硫酸アンモニウ
ム、ナトリウムドデシルスルフエート、ＴＲＩＳ緩衝剤
及び燐酸水素二ナトリウムは、全て、オハイオ州クリー
ブランド在のシュワルッ／マン・バイオテック（Ｓｗａ
ｒｔｚ／Ｍａｎｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈ）から入手した、超
純級材料即ち電気泳動級材料であった。

他の供給源からの幾分純度の低いアクリルアミドは、そ
れを３回再結晶させ且つイオン交換樹脂での処理によっ
て脱イオンすることにより、適切に精製し得た。，尿素
は、新しく人手し、水／メタノールから３度再結晶させ
た。蛋白質は、ミズーリ州セント・ルイス在のシグマ・
ケミカル・カンパ＝　−　（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃ
ａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ）から入手し、入手した状態で使
用した。ポリ（デオキシアデニル酸）及びφＸ１７４Ｒ
Ｆ／Ｈａｅ　　ｍ　　ＤＮＡ片は、ファルマシア（Ｐｈ
ａｒｍａｃｉａ）から入手した。水は、３度蒸留し且つ
脱イオンした。本発明で好適に採用された石英ガラスマ
イクロ毛管チューブは、最初は、テキサス州オースチン
在のサイエンティフィック・グラス・エンジニアニング
・インコーボレーテッド（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｇｌ
ａｓｓ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｒｊｇ　Ｉｎｃ．）から、
後には、アリゾナ州フェニックス在のポリミクロ・テク
ノロジーズ・インコーポレーテッド（Ｐｏｌｙｍｉｃｒ
ｏ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，　Ｉｎｃ．）から入手
した。

ポリミクロ・テクノロジーズは、種々の他の寸法のチュ
ーブをも供給した。マイクロ毛管の端部に線を刻むのに
使用されるサファイア・カッターは、０１７６０マサチ
ューセッツ州サウス・ナティック、プレザント・ストリ
ート２２在のアーリング・エレクトロニクス・コーポレ
ーション（ＥａｒｌｉｎｇＥｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ　Ｃ
ｏｒｐ．）から入手した。

マイクロ毛管チューブを満たすのに、小径のテフロンチ
ューブ（０．２〜０．２５ミリメートルの内径）を使用
した。０．２ミクロンの孔径を有するナイロン６６・フ
ィルタ膜又はメチルセルロース・フィルタ膜により、全
ての溶液を濾過した。

分析試料は、使用に先立ち、−２０℃で凍結させておき
、実験用のこれらの試料のアリコートは、４℃で貯蔵し
た。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ作業用の蛋白質は、この分野で知
られている方法で調製した。

マサチューセッツ州キングストン在のインストゥルメン
テイション・フォー・リサーチ・アンド・ディヴエ口ッ
プメント・インコーボレーテッド（Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎ
ｔａｔｉｏｎ　ｆｏｒ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　ａｎｄ　Ｄ
ｅｖｅｌｏｐ−ｍｅｎｔ，　Ｉｎｃ．）によるＳｏｍａ
　　Ｓ−３２０７検出器を使用し、エス・テレイブ（Ｓ
．　Ｔｅｒａｂｅ）他、アナル・ケム（Ａｎａｌ．　Ｃ
ｈｅｍ．）、第５６巻、第１１１〜１１３頁（１９８４
年）に記載されているようにして、その検出器をマイク
ロ毛管作業用に改造した。データは、ネルソン・アナリ
ティカル・Ａ／Ｄ−インターフェイス（Ｎｅｌｓｏｎ　
Ａｎａｌｉｔｉｃａｌ　Ａ／Ｉ）Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ）
　・モデル７６２ＳＡを用いてディジタルの形に変換し
、ＩＢＭ　　ＰＣ／ＸＴコンピュータを用いて記憶した
。この分野で知られている他の装置も役に立つであろう
。

７５ミクロンの内径、３０ミクロンの壁厚及びポリイミ
ド被膜を有する石英ガラスマイクロ毛管チューブを用い
た。このチューブの４０〜４５ｃｍの長さを、ゲル充填
マイクロ毛管カラムの調製に取り出した。このチューブ
の一方の端部の１ｃｍの部分から、燃焼によってポリイ
ミド被膜を除去した。この端部を、電気泳動装置の検出
器に最終的に接続した。

マイクロ毛管チューブを、空気中約１２０℃で一晩加熱
し、次いで、ほぼ２時間に亘って約３０℃の乾燥アンモ
ニアガスでフラッシした。本明細書において約３０℃で
実行したと報告されている上記作業及び他の作業は、室
温で行われたものであり、この室温は、概して約３０℃
士約３℃である。次に、３−メタクリルオキシプロピル
トリメトキシシランの５０％メタノール溶液１００μｌ
を約３０℃の温度でマイクロ毛管を通過させてマイクロ
毛管を二官能価試薬溶液で満たしたままにしておき、長
さの短いテフロンチューブ（これも二官能価試薬溶液で
満たされている）を介してマイクロ毛管の端部を接続し
、そして、閉塞し且つ試薬を充填したマイクロ毛管を約
３０’Ｃで一晩放置した。次に、テフロンチューブをマ
イゝクロ毛管の一方の端部から取り外し、そして、各々
２５０μｌのメタノール及び水で連続的にマイクロ毛管
をフラッシして未反応の二官能価試薬を除去した。

次に、塗被されたマイクロ毛管を電気泳動装置の検出器
内に組み込み、そして、処理したマイクロ毛管及び未処
理のマイクロ毛管の１５Ｃｍの部分を分析用に取り出し
た。処理したマイクロ毛管を２０ｃｍよりも幾分長く切
断し、そして、その“前”端部にテフロンの鞘を取り付
けた。

７モルの尿素溶液１００ｍｌ中にＴＲｒＳ緩衝剤１．１
ｇを溶解させ、ＥＤＴＡＯ，Ｏｌｇ及びナトリウムドデ
シルスルフエート０，Ｉｇを添加し、そして燐酸水素二
ナトリウムの添加よってｐＨを８．６に調節することに
より、緩衝液を調製した。

アクリルアミド及びＮ，Ｎ’　　−メチレンビスアクリ
ルアミドの溶液は、アクリルアミド２９ｇとＮ，Ｎ’−
メチレンビスアクリルアミド１ｇとを１００ｍｌの緩衝
液中で組み合わせることによって調製し、３０％の％Ｔ
及び３．３％の％Ｃを有する溶液を得た。

過硫酸アンモニウムの溶液は、過硫酸アンモニウム０．
２ｇを２ｍｌの緩衝液中に溶解させることによって調製
した。

緩衝剤、単量体及び過硫酸アンモニウムの溶液を、０．
２ミクロンのフィルタで別々に濾過し、そして、２０〜
３０ｍｍＨＨの真空を適用しつつ超音波で処理すること
により、２時間に亘ってガス抜きした。

１０ｍｌのアクリルアミドービスアクリルアミド溶液を
、緩衝液で３０ｍｌに希釈し、％Ｔ＝１０％及び％Ｃ＝
３．３％を有する最終的な溶液を得た。この溶液のｌｍ
ｌアリコートを、過硫酸アンモニウム溶液及びＴＥＭＥ
Ｄの量を変化させて実験的に処理し、そして、使用すべ
き過硫酸アンモニウム及びＴＥＭＥＤの正しい量を決定
するため、重合時間を監視した。２．５μ１のＴＥＭＥ
Ｄ及び４μｌの過硫酸アンモニウムの添加が約４５分の
重合時間を与えるということが、確かめられた。

アクリルアミドービスアクリルアミド溶液の１０ｍｌア
リコートを、緩衝液で３０ｍｌに希釈し、２．５μｌの
ＴＥＭＥＤ及び４μｌの過硫酸アンモニウムを添加し、
そして、過剰な５０μｌのこの重合混合物を、マイクロ
毛管を出て行く泡が観察されなくなるまで、マイクロ毛
管に注入した。

マイクロ毛管内への泡の導入を防止するため、注入を続
けつつ、テフロンチューブから注入注射器を注意深く取
り外した。最後に、マイクロ毛管の両方の端部を“運転
”緩衝液中に浸漬し、そして、約３０’Ｃで重合を進行
させた。重合混合物の残りの部分の重合を、外部から監
視した。重合が完了したように見えた後、完全な重合を
確実にするため、更に２時間に亘って系を放置し、次い
で、２０ｃｍのマイクロ毛管泳動距離（前端部から検出
器まで）で、マイクロ毛管の前端部をミクロトームで切
断した。最終的なゲル充填マイクロ毛管カラムを、１０
０ボルト／　ｃ　ｍの印加電界下で１時間に亘って評価
し、満足し得るものであることを見出した。

４つの蛋白質、α−ラクトアルブミン、β−ラクトグロ
プリン、トリブシノゲン及びペプシンの混合物を、この
分野で知られている標準的なやり方で、ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ電気泳動用に調製し、次いで、１００ボルト／　ｃ　
ｍの電界を１５秒間印加することにより、この溶液の試
料を、マイクロ毛管カラムに電気泳動的に注入した。電
気泳動は、４００ボルト／．ｃｍ及び２４μＡの電流で
、２０ｃｍの泳動距離に亘って行った。その結果を第２
図に示す。

％Ｔ＝７．５％　び５％を　　るゲル　　マイクアクリ
ルアミドービスアクリルアミドの原液の適切に希釈され
たアリコートを用いることによってもたらされる％Ｔ＝
７．５％及び５％を、それらがそれぞれ有することを除
いて、正確に上述のようにして別のマイクロ毛管カラム
を調製した。

上記４つの蛋白質の混合物を、上述したものと同一条件
の電気泳動により、これらのマイクロ毛管カラムで分離
した。それらの結果を第３図及び第４図にそれぞれ示す
。

第５図に、試験されたゲルの各々において試験された蛋
白質の分子量の対数がそれらの移動度の直線的な関数で
あるということが、示されており、このことは、分子量
決定ｐ《本発明に係るゲル充填マイクロ毛管カラムで行
われ得るということを示している。

，，い　　の証ロ 第６図に、試験されたマイクロ毛管カラムの各々におい
て試験された蛋白質の移動度の対数が、％Ｔに対して“
ファーガソン（Ｆｅｒｇｕｓｏｎ）”プロットでプロッ
トされている。分子篩い分離に対して期待される通り、
ゲル濃度がゼロにおける、外挿された移動度が、本質的
に同一である。第７図に、“ファーガソン”プロットの
傾きが、分離された材料の分子量と直線的に相関してい
ることが示されており、このことは、分子量決定に対す
るゲル充填マイクロ毛管カラムの有用性を示している。

７５ミクロンの内径、約１５０ミクロンの壁厚及びポリ
イミド被膜を有する石英ガラスマイクロ毛管チューブを
用いた。このチューブの４０〜４５ｃｍの長さを、ゲル
充填マイクロ毛管の調製に取り出した。このチューブの
一方の端部の２ｃｍの部分から、燃焼によってポリイミ
ド被膜を除去した。この端部を、電気泳動装置の検出器
に最終的に接続した。

マイクロ毛管チューブを、ＩＭ　ＫＯＨ溶液で満たし、
室温で一晩放置した。次に、マイクロ毛管を、カラム容
量の約２０倍の量の、室温の、３一メタクリルオキシブ
口ピルトリメトキシシランのＨＰＬＣ級メタノール５０
％溶液で濯いだ。次に、二官能価試薬溶液で満たしたマ
イクロ毛管を、隔壁で栓をし、一晩放置した。

７モルの尿素溶液１００ｍｌ中にＴＲＩＳ緩衝剤１．１
ｇを溶解させ、ＥＤＴＡＯ．Ｏｌｇを添加し、そしてホ
ウ酸の添加よってｐＨを８．３に調節することにより、
緩衝液を調製した。

アクリルアミド及びＮ，Ｎ’　　−メチレンビスアクリ
ルアミドの溶液は、アクリルアミド１９ｇとＮ，Ｎ’　
　−メチレンビスアクリルアミド１ｇとを１００ｍｌの
緩衝液中で組み合わせることによって調製し、２０％の
％Ｔ及び５％の％Ｃを有する溶液を得た。

過硫酸アンモニウムの溶液は、過硫酸アンモニウム０．
２ｇを２ｍｌの緩衝液中に溶解させることによって調製
した。

緩衝剤、単量体及び過硫酸アンモニウムの溶液を、０．
２ミクロンのフィルタで別々に濾過し、そして、２０〜
３０ｍｍＨＨの真空を適用することにより、２時間に亘
ってガス抜きした。

１．５ｍｌのアクリルアミドービスアクリルアミド溶液
を、緩衝液で１０ｍｌに希釈し、％Ｔ＝３％及び％Ｃ＝
５％を有する最終的な溶液を得た。

この溶液を、０．２μｍのフィルタで濾過し、約２０〜
２２ｍｍＨ２０の減圧下で一晩ガス抜きした。

アクリルアミドービスアクリルアミド溶液の０．５ｍｌ
アリコートに、電気泳動級ＴＥＭＥＤの５％ｖ　／　ｖ
溶液７．５μＩ及び過硫酸アンモニウムの５％ｗ／ｖ溶
液７．５μ１を添加し、そして、過剰な５０μｌのこの
重合屈合物を、マイクロ毛管を出て行く泡が観察されな
くなるまで、マイクロ毛管に注入した。マイクロ毛管内
への泡の導入を防止するため、注入を続けつつ、テフロ
ンチューブから注入注射器を注意深く取り外した。次に
、マイクロ毛管の両方の端部を隔壁で栓をし、そして、
マイクロ毛管を、冷蔵庫内に置き、その間に重合が起こ
るところの一晩、５〜１０℃に維持した。最後に、２０
ｃｍのマイクロ毛管泳動距離（前端部から検出器まで）
で、マイクロ毛管の前端部を切断した。最終的なゲル充
填マイクロ毛管カラムを、１００ボルト／　ｃ　ｍの印
加電界下でｌ時間に亘って評価し、満足し得るものであ
ることを見出した。

公称４０〜６０塩基のポリ（デオキシアデニル酸）オリ
ゴマの混合物の溶液を、６０ボルト／Ｃｍの電界を５秒
間印加することにより、マイクロ毛管カラムに電気泳動
的に注入した。電気泳動は、３００ボルト／ｃｍ及び１
２μＡの電流で、２０Ｃｍの泳動距離に亘って実行した
。その結果を第８図に示す。

架橋剤を用いず、アクリルアミド原液を、アクリルアミ
ド３０ｇを１００ｍｌの緩衝液と組み合わせることによ
って調製し、これを５倍に希釈して６％Ｔを有する作業
用アクリルアミド溶液を生成したということを除いて、
上述した３％Ｔ及び５％Ｃマイクロ毛管カラムと同じや
り方で第３のマイクロ毛管カラムを調製した。７２〜１
３００塩基対の範囲内にあるφＸ　１　７　４　Ｒ　Ｆ
　／　Ｈ　ａ　ｅＩＩ［　　ＤＮＡ片の混合物を、６０
ボルト／　ｃ　ｍの電界を１０秒間印加することにより
、マイクロ毛管カラムに電気泳動的に注入した。電気泳
動は、３００ボルト／ｃｍ及び１２μＡの電流で、２０
ｃｍの泳動距離に亘って実行した。その結果を第９図に
示す。

６％Ｔｏ％Ｃ　び０．　　１％ＳＤＳを　　るゲル緩衝
液が、１００ｍｌ当り０．１ｇのナトリウムドデシルス
ルフェートを含有しているということを除いて、上述し
た６％Ｔ及びＯ％Ｃマイクロ毛管カラムと同じやり方で
第４のマイクロ毛管カラムを調製した。

リゾチームは、１１より大きいｐＩを有しており、従っ
て、ｐＨ＝７．６では正に帯電して負電極へと泳動する
ものと思われるが、ＳＤＳ−リゾチーム錯体は負に帯電
し、従って、この錯体は、正電極に向かって泳動ずる。

リゾチームの溶液を、６０ボルト／ｃｍの電界を１５秒
間印加することにより、マイクロ毛管カラムに電気泳動
的に注入した。電気泳動は、３００ボルト／Ｃｍ及び１
７μＡの電流で、２０ｃｍの泳動距離に亘って実行した
。その結果を第１０図に示す。

７５％Ｔ３３％Ｃｏ，１％ＳＤＳび 第１１図に示されているように、本発明に係る別の好適
な実施例のゲル充填マイクロ毛管カラムは、マイクロ毛
管１０と、塗被材料の層１２であって、マイクロ毛管の
壁の内表面１４に共有結合しているものと、層１２上に
吸着された親水性重合体の層１６と、このマイクロ毛管
の内腔内の重合体ゲル材料１８とを備えている。

７５ミクロンの内径、約１５０ミクロンの壁厚及びポリ
イミド被膜を有する石英ガラスマイクロ毛管チューブを
使用した。このチューブの４０〜４５ｃｍの長さを、ゲ
ル充填マイクロ毛管カラムの調製に取り出した。このチ
ューブの一方の端部の２ｃｍの部分から、燃焼によって
ポリイミド被膜を除去した。この端部を、電気泳動装置
の検出器に最終的に接続した。

マイクロ毛管チューブを、空気中約１２０℃で一晩加熱
し、ＩＭ　ＫＯＨ溶液で満たし、そして、室温で一晩放
置した。次に、マイクロ毛管を、カラム容量の約２０倍
の量の、室温の、３−メタクリルオキシプロピルトリメ
トキシシランのＨＰＬＣ級メタノール５０％溶液で濯い
だ。次に、二官能価試薬溶液で満たしたマイクロ毛管を
、１２５℃の温度及びほぼ２ｍｍＨＨの真空に維持され
ている真空オーブン内に置き、一晩放置した。

次に、塗被したマイクロ毛管を、約３５，０００ダルト
ンの公称分子量を有する６％ｗ／ｖポリエチレングリコ
ールと、０．１Ｍトリスボラート緩衝液（ｐＨ＝８）と
、７Ｍ尿素を有するポリエチレングリコールとを含有す
る、前もってガス抜きした溶液で注意深く満たし、そし
て、約１２５℃の温度及び約２ｍｍＨｇの真空に維持さ
れている真空オーブン内に一晩放置し、その後、マイク
ロ毛管が乾燥していることを、顕微鏡による調査で確か
めた。処理したマイクロ毛管を、チューブ容量の約１〜
２倍の量の緩衝液（下記）でフラツシし、次いで、窓か
ら２０ｃｍよりも幾分長い長さに切断した。

緩衝液は、７モルの尿素溶液１００ｍｌ中にＴＲＩＳ緩
衝剤１．１ｇを溶解させ、ＥＤＴＡ０，０１ｇ及びナト
リウムドデシルスルフェート０．１ｇを添加し、そして
ホウ酸の添加によってｐＨを８に調節することにより、
調製した。

アクリルアミド及びＮ，Ｎ’　−メチレンビスアクリル
アミドの溶液は、アクリルアミド２９ｇとＮ，Ｎ’−メ
チレンビスアクリルアミド１ｇとを１００ｍｌの緩衝液
中で組み合わせることによって調製し、３０％の％Ｔ及
び３．３％の％Ｃを有する溶液を得た。

過硫酸アンモニウムの溶液は、過硫酸アンモニウム０．
２ｇを２ｍｌの緩衝液中に溶解させることによって調製
した。

緩衝剤、単量体及び過硫酸アンモニウムの溶液を、０．
２ミクロンのフィルタで別々に濾過し、６そして、２０
〜３０ｍｍＨｇの真空を適用することにより、２時間に
亘ってガス抜きした。

０．７５ｇのアクリルアミドービスアクリルアミド溶液
を１０ｍｌの緩衝液に添加し、％Ｔ＝７．５％及び％Ｃ
＝３、３％を有する最終的な溶液を得た。この溶液を、
０．２μｍのフィルタで濾過し、約２０〜２２ｍｍＨｔ
Ｏの減圧下で一晩ガス抜きした。

アクリルアミドービスアクリルアミド溶液の０．５ｍｌ
アリコートに、電気泳動級ＴＥＭＥＤの５％ｖ　／　ｖ
溶液７．５μＩ及び過・硫酸アンモニウムの５％Ｗ　／
　Ｖ溶液７．５μｌを添加し、そして、過剰な５０μｌ
のこの重合混合物を、マイクロ毛管を出て行く泡が観察
されなくなるまで、マイクロ毛管に注入した。マイクロ
毛管内への泡の導入を防止するため、注入を続けつつ、
テフロンチューブから注入注射器を注意深く取り外した
。次に、マイクロ毛管の両方の端部を隔壁で栓をし、そ
して、マイクロ毛管を冷蔵庫内に置き、その間に重合が
起こるところの一晩、５〜１０℃に維持した。

最後ニ、２０ｃｍのマイクロ毛管泳動距離（前端部から
検出器まで）で、マイクロ毛管の前端部をミクロトーム
で切断した。最終的なゲル充填マイクロ毛管カラムを、
１００ボルト／　ｃ　ｍの印加電界下で１時間に亘って
評価し、満足し得るものであることを見出した。

４つの蛋白質、チトクロームＣ１リゾチーム、ミオグロ
ビン及びトリプシノゲンの混合物を、この分野で知られ
ている標準的なやり方で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動用
に調製し、次いで、１００ボルト／　ｃ　ｍの電界を１
５秒間印加することにより、この溶液の試料を、マイク
ロ毛管カラムに電気泳動的に注入した。電気泳動は、３
００ボルト／　ｃ　ｍ及び１５〜１７μＡの電流で、２
０ｃｍの泳動距離に亘って実行した。その結果を第１２
図に示す。

ＳＤＳを含まないということを除いて、上述のようにし
て第２のマイクロ毛管カラムを調製した。

ポリ（デオキシアデニル酸）の混合物を、３００ボルト
／　ｃ　ｍ及び１２〜１４μＡの電流での電気泳動によ
り、注入し且つ分離した。その結果を第１３図に示す。

マイクロ毛　カラムの０ それらの寿命の間、種々の印加電界で電気泳動電流を測
定することにより、ゲル充填マイクロ毛管カラムを、安
定性及び再現性に関して周期的に試験した。良好な状態
で申し分なく作製したカラムは、印加した電界の範囲に
亘って一定の抵抗を示し、しかも、これは、反復可能で
ある。この試験においては、測定した電流を、印加した
電界（Ｖ／Ｃｍ）に対してプロットした。一定の傾き（
抵抗）を有する直線は、カラムが良好であることを示し
ている。ＳＤＳ−ゲルマイクロ毛管カラムについての典
型的な実験データを、第１表に示す。

垣一」一一表 旦亘』〕二（匪矢 上」コ仁髪と １００ ２００ ３００ ４００ ５００ ６００ ７００ ６ １　２ １８ ２　２ ２８ ３３ ４　０ これらのデータは、申し分なく作製されたカラムを示し
ていると共に、カラムが７　０　０　Ｖ　／　ｃ　ｍの
印加電界下で作業し得るということをも証明している。

［発明の効果］ 以上のように、本発明によれば、優れた安定性、効率及
び分離能を提供する、ゲル充填マイクロ毛管カラムが提
供される。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明に係るゲル充填マイクロ毛管カラムの
端部の拡大斜視図である。 第２図は、１０％の全単量体、３．３％の架橋剤及び０
．１％のＳＤＳを含有する、本発明に係るゲル充填マイ
クロ毛管カラムにおける、４つの標準的な蛋白質、α−
ラクトアルブミン、β−ラクトグロプリン、トリプシノ
ゲン及びペプシンの通電クロマトグラムである。緩衝液
のｐＨは８，６であり、そして、電気泳動は、４００ボ
ルト／ｃｍ及び２４μＡの電流で、２０ｃｍの泳動距離
に亘って行った。 第３図は、７，５％の全単量体を含有するカラムを使用
したということを除いて同一の電気泳動条件下での、第
２図に示されているものと同じ蛋白質の通電クロマトグ
ラムである。 第４図は、５％の全単量体を含有するカラムを使用した
ということを除いて同一の電気泳動条件下での、第２図
及び第３図に示されているものと同じ蛋白質の通電クロ
マトグラムである。 第５図は、本発明に係る３つの異なるゲル充填マイクロ
毛管カラムにおける、試験された蛋白質の分子量の対数
とそれらの移動度との間の関係を示す図である。 第６図は、第２図、第３図及び第４図からのデータのフ
ァーガソン・プロットを示す図である。 第７図は、ファーガソン・プロットの傾きと標準的な蛋
白質の分子量との関係を示す図である。 第８図は、３％全単量体及び５％架橋剤を含有し、ＳＤ
Ｓを含有しない、本発明に係るゲル充填マイクロ毛管カ
ラムにおける、公称４０〜６０塩基の、ポリ（デオキシ
アデニル酸）オリゴマの混合物の通電クロマトグラムで
ある。緩衝液のｐＨは８．３であり、そして、電気泳動
は、３００ボルト／　ｃ　ｍの印加電界及び１２マイク
ロアンペアの電流で、２０ｃｍの泳動距離に亘って行っ
た。 第９図は、制限酵素Ｈａｅ　　ｍでの切断によって作製
されたφＸ１７４ＲＦのＤＮＡ片の混合物の通電クロマ
トグラムである。６％全単量体を含有し、架橋剤及びＳ
ＤＳを含有しない、本発明に係るゲル充填マイクロ毛管
カラムを使用した。緩衝液のｐＨは８．３であり、そし
て、電気泳動は、３００ボルト／　ｃ　ｍの印加電界及
び１２マイクロアンペアの電流で、２０ｃｍの泳動距離
に亘って行った。 第１０図は、６％全単量体及び０．１％ＳＤＳを含有し
、架橋剤を含有しない、本発明に係るゲル充填マイクロ
毛管カラムにおける、リゾチームの通電クロマトグラム
である。緩衝液のｐＨは７．６であり、そして、電気泳
動は、３００ボルト／Ｃｍの印加電界及び１７マイクロ
アンペアの電流で、２０ｃｍの泳動距離に亘って行った
。 第１１図は、本発明に係るゲル充填マイクロ毛管カラム
であって、塗被材料の層上に吸着された親水性重合体の
薄層が任意に用いられているものの拡大端面図である。 第１２図は、７．５％全単量体、３．３％架橋剤及び０
．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳを含有する、第１１図に示され
ている、本発明に係るゲル充填マイクロ毛管カラムにお
ける、４つの標準的な蛋白質、チトクロームＣ１リゾチ
ーム、ミオグロビン及びトリプシノゲンのＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥ分離を示す図である。緩衝液のｐＨは８．６であり
、そして、電気泳動は、３００ボルト／　ｃ　ｍの印加
電界及び１２〜１５マイクロアンペアの電流で、２０ｃ
ｍの泳動距離に亘って行った。 第１３図は、ＳＤＳを含有していないということを除い
て、第１２図に関して記載されているのと同様なマイク
ロ毛管カラムにおける、第１２図に示されている分離で
採用されたのと同じ電気泳動条件下での、ポリ（デオキ
シアデニル酸）オリゴマの電気泳動分離を示す図である
。 １０・・・マイクロ毛管 １２・・・層 １４・・・内表面 １６・・・層 １８・・・重合体ゲル材料

Claims (16)

【特許請求の範囲】
1. （１）高精度・高性能電気泳動用ゲル充填マイクロ毛管
   カラムであって、 内部穴と内表面を備えた壁とを有するマイクロ毛管、 上記壁の上記内表面に共有結合した塗被材料の層、及び 上記内部穴を満たす重合体ゲル、 を具備するゲル充填マイクロ毛管カラム。
2. （２）前記マイクロ毛管が石英ガラスで作製されている
   請求項１記載のゲル充填マイクロ毛管カラム。
3. （３）前記重合体ゲルが重合非架橋単量体からなる請求
   項１記載のゲル充填マイクロ毛管カラム。
4. （４）前記重合体ゲルが、アクリルアミドと少なくとも
   １つの架橋剤との共重合体からなる請求項１記載のゲル
   充填マイクロ毛管カラム。
5. （５）前記塗被材料が、３−メタクリルオキシプロピル
   トリメトキシシラン、３−メタクリルオキシプロピルジ
   メチルエトキシシラン、ビニルトリアセトキシシラン、
   ビニルトリ（−メトキシエトキシ）シラン、ビニルトリ
   クロロシラン及びメチルビニルジクロロシランからなる
   群から選択される二官能価試薬に由来する請求項１記載
   のゲル充填マイクロ毛管カラム。
6. （６）高精度・高性能電気泳動用ゲル充填マイクロ毛管
   カラムであって、 内部穴と、内表面を備えた壁と、１０〜２００ミクロン
   の間の内径とを有する石英マイクロ毛管、上記壁の上記
   内表面に共有結合した塗被材料の層であって、該塗被材
   料は、３−メタクリルオキシプロピルトリメトキシシラ
   ン又は３−メタクリルオキシプロピルジメチルエトキシ
   シランに由来するもの、及び 上記内部穴を満たすポリアクリルアミドからなるゲル、 を具備するゲル充填マイクロ毛管カラム。
7. （７）前記ゲルが、アクリルアミド単量体とＮ，Ｎ′−
   メチレンビスアクリルアミド架橋剤との共重合体である
   請求項６記載のゲル充填マイクロ毛管カラム。
8. （８）高分離能分子篩い電気泳動を実施する方法であっ
   て、 分離されるべき検体を含有する試料のアリコートを、ゲ
   ル充填マイクロ毛管カラムであって、内部穴と内表面を
   備えた壁とを有するマイクロ毛管、該壁の上記内表面に
   共有結合した塗被材料の層及び該内部穴を満たす重合体
   ゲルを具備するものに注入し、 少なくとも１００ボルト／ｃｍの電界を印加し、そして 分離された検体を機器を用いて逐次的に検出・測定する
   、 方法。
9. （９）高精度・高性能電気泳動用ゲル充填マイクロ毛管
   カラムであって、 内部穴と内表面を備えた壁とを有するマイクロ毛管、 上記壁の上記内表面に共有結合した塗被材料の層、 上記塗被材料の層に吸着された親水性重合体の層、及び 上記内部穴を満たす重合体ゲル、 を具備するゲル充填マイクロ毛管カラム。
10. （１０）前記マイクロ毛管が石英ガラスで作製されてい
    る請求項９記載のゲル充填マイクロ毛管カラム。
11. （１１）前記親水性重合体がポリエチレングリコールで
    ある請求項９記載のゲル充填マイクロ毛管カラム。
12. （１２）前記重合体ゲルが、アクリルアミドと少なくと
    も１つの架橋剤との共重合体からなる請求項９記載のゲ
    ル充填マイクロ毛管カラム。
13. （１３）前記塗被材料が、３−メタクリルオキシプロピ
    ルトリメトキシシラン、３−メタクリルオキシプロピル
    ジメチルエトキシシラン、ビニルトリアセトキシシラン
    、ビニルトリ（−メトキシエトキシ）シラン、ビニルト
    リクロロシラン及びメチルビニルジクロロシランからな
    る群から選択される二官能価試薬に由来する請求項９記
    載のゲル充填マイクロ毛管カラム。
14. （１４）高精度・高性能電気泳動用ゲル充填マイクロ毛
    管カラムであって、 内部穴と、内表面を備えた壁と、１０〜２００ミクロン
    の間の内径とを有する石英マイクロ毛管、上記壁の上記
    内表面に共有結合した塗被材料の層であって、該塗被材
    料は、３−メタクリルオキシプロピルトリメトキシシラ
    ン又は３−メタクリルオキシプロピルジメチルエトキシ
    シランに由来するもの、 上記塗被材料の層上に吸着されるポリエチレングリコー
    ルの層、及び 上記内部穴を満たすポリアクリルアミドからなるゲル、 を具備するゲル充填マイクロ毛管カラム。
15. （１５）前記ゲルが、アクリルアミド単量体とＮ，Ｎ′
    −メチレンビスアクリルアミド架橋剤との共重合体であ
    る請求項１４記載のゲル充填マイクロ毛管カラム。
16. （１６）高分離能分子篩い電気泳動を実施する方法であ
    って、 分離されるべき検体を含有する試料のアリコートを、ゲ
    ル充填マイクロ毛管であって、内部穴と内表面を備えた
    壁とを有するマイクロ毛管、該壁の上記内表面に共有結
    合した塗被材料の層、該塗被材料の層上に吸着された親
    水性重合体の層及び該内部穴を満たす重合体ゲルを具備
    するものに注入し、 少なくとも１００ボルト／ｃｍの電界を印加し、そして 分離された検体を機器を用いて逐次的に検出・測定する
    、 方法。