JPH04300894A - アンジオテンシンｉ変換酵素阻害ヘキサぺプチドとそれを製造する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、アンジオテンシンＩ変
換酵素阻害ペプチドとその製造法に関する。より詳しく
は、本発明は、血圧を上昇させる働きのあるアンジオテ
ンシンＩＩをアンジオテンシンＩから変換する酵素であ
るアンジオテンシンＩ変換酵素阻害ペプチドとその製造
法に関する。

【０００２】

【従来の技術】高血圧症は、最大血圧が１６０ｍｍＨｇ
以上か、最小血圧が９５ｍｍＨｇ以上または両者がそれ
以上の状態である。わが国では患者数が約２０００万人
であるといわれ、罹患率の高い疾病である。

【０００３】高血圧症は、脳出血、脳梗塞、クモ膜下出
血、狭心症、心筋梗塞、腎硬化症、腎不全、網膜静脈閉
塞症など広範囲の臓器にわたって、さまざまな合併症を
生じることが知られており、有効な治療薬が望まれてい
る。

【０００４】生体内において血圧を調節するメカニズム
の一つとして、昇圧系であるレニン・アンジオテンシン
系と、降圧系であるカリクレイン・キニン系がある。レ
ニン・アンジオテンシン系では、酵素レニンが腎臓の旁
糸球体細胞（Ｊ．Ｇ細胞）で生成され、血管でレニン基
質であるところのアンジオテシノーゲンに作用してアン
ジオテンシンＩを生成する。このアンジオテンシンＩを
アンジオテンシンＩＩに変換する酵素がアンジオテンシ
ンＩ変換酵素であり、生じたアンジオテンシンＩＩは細
動脈に作用して収縮を起こさせる。

【０００５】また、アンジオテンシンＩＩは副腎皮質に
も作用してアルドステロンの合成と分泌を促し、腎臓で
のナトリウムの再吸収を促進し、体液量を保持する働き
もある。このようにして、アンジオテンシンＩＩによっ
て血圧が上昇する。

【０００６】一方、カリクレイン・キニン系では、蛋白
分解酵素であるカリクレインが、基質であるところのキ
ニノーゲンに作用してキニンを生じる。キニンは血管を
拡張させ、血圧を下げる働きを有するが、キニナーゼＩ
Ｉによって分解を受ける。キニナーゼＩＩはアンジオテ
ンシンＩ変換酵素と同一物質であることが知られている
。

【０００７】以上のことから、アンジオテンシンＩ変換
酵素を阻害することによる高血圧の治療が考えられ、現
在までにカプトプリル、エナラプリル、アラセプリル、
デラプリル等が開発されている。また、カゼインやツエ
イン、ゼラチン、魚肉などに由来するペプチドも、アン
ジオテンシンＩ変換酵素を阻害する働きがあることが知
られている（特開昭５９−４４３２４号、特開昭６４−
５４９７号、特開平１−３１３４９８号）。

【０００８】しかし、カプトプリルは強力な血圧降下作
用を有するが、合成法で作られるので高価であり、安易
に入手することは難しい。その上、用量が不適当である
と腎機能障害や低血圧をもたらす。また、分子内に存在
するＳＨ基のため、発疹や味覚異常を引き起こすともい
われている。カゼインやツエイン、魚肉などに由来する
ペプチドは、天然物を原料とするものであり、製造工程
で多くの未利用物を生成し、その処理に莫大な費用がか
かるだけでなく、廃棄による環境汚染の心配がある。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、安価に入手
でき、副作用が少なく、製造にともない新たに未利用物
を生成しないようなアンジオテンシンＩ変換酵素阻害物
、さらには、その適切な製造法を提供することを目的と
する。

【００１０】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決するために種々検討した結果、本発明を完成する
に至った。すなわち、本発明は、Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｐｒ
ｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｒｇの構造を持つアンジオテン
シンＩ変換酵素阻害ペプチドである。

【００１１】また、本発明は、上記アンジオテンシンＩ
変換酵素阻害ペプチドを、魚介類の内臓、筋肉より抽出
するか、さらには、Ｆｍｏｃ−ロイシン、Ｆｍｏｃ−グ
リシン、Ｆｍｏｃ−プロリン、Ｆｍｏｃ−アラニン、Ｆ
ｍｏｃ−アルギニンを用い固相合成して製造する方法で
ある。本ペプチドは、魚介類の内臓、筋肉から水抽出、
加熱した後、抽出したペプチド含有物を各種クロマトグ
ラフィーの手法を用いて分離することにより得られる。

【００１２】本ペプチドは、水抽出液中のペプチドを逆
相クロマト用充填剤Ｃ１８（シリカ担体にオクタデシル
基を結合させたもの）に吸着させ、水洗浄後、アセトニ
トリル１５％液で溶出した画分を弱陽イオン交換体ＣＭ
（担体にカルボキシメチル基を結合させたもの）に吸着
させ、段階的溶出法で得た画分のうちアンジオテンシン
Ｉ変換酵素阻害画分をさらに、逆相ＨＰＬＣで分離し、
活性画分をさらに、ゲル濾過ＨＰＬＣで分離することに
より得られる。

【００１３】本発明で使用できる魚種は、カツオ、マグ
ロ、アジ、サバ、イワシ、サンマ、ブリ、タイ、ヒラメ
、カレイ、スズキ、サケ、ニシン、イカ、タコ等の如何
なる魚種でも使用できる。内臓としては、胃、幽門垂、
腸、肝臓、精巣、卵巣、心臓等のいずれを使用してもよ
い。また、魚介類の筋肉も使用することができる。

【００１４】また、本ペプチドは、Ｆｍｏｃ−ロイシン
、Ｆｍｏｃ−グリシン、Ｆｍｏｃ−プロリン、Ｆｍｏｃ
−アラニン、Ｆｍｏｃ−アルギニンを用いた固相合成法
のような化学合成法で製造することもできる。

【００１５】

【実施例】以下、実施例により本発明を具体的に説明す
る。 実施例１ カツオの腸１０６．３ｇに４倍量の水を加え、ホモジナ
イザー（ニッセイＡＭ−１型）を用いて、氷冷下１０，
０００ｒｐｍ　で５分間ホモジナイズした。

【００１６】１２０℃で５分間オートクレーブした後、
４０，０００Ｇで４０分間４℃で遠心分離し、その上清
を濃縮後、Ｃ１８充填剤（　Ｗａｔｅｒｓ　社　　Ｂｕ
ｌｋ　Ｃ１８　　５５〜１０５μｍ）１００ｇを詰めた
簡易カラムに吸着させた。このカラムを蒸留水１４３５
ｍｌで洗浄後、アセトニトリル１５％溶液でペプチドを
溶出した。この操作で４．２ｇのペプチド画分を得た。

【００１７】本ペプチド画分は、１０ｍＭリン酸バッフ
ァー（ｐＨ６．０）で平衡化したアクセルＣＭ（　Ｗａ
ｔｅｒｓ　社）７５ｇを詰めた簡易カラムに添加し、１
０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ６．０）１５００ｍｌ、
（ｐＨ７．０）１５００ｍｌ、（ｐＨ８．０）１５００
ｍｌ、（ｐＨ９．０）１５００ｍｌで溶出した。このう
ちアンジオテンシンＩ変換酵素阻害能の強いｐＨ９．０
溶出画分をさらに精製するため、逆相ＨＰＬＣで分離を
行った。このＨＰＬＣ条件は下記ＨＰＬＣ条件１に示し
た。

【００１８】ＨＰＬＣ条件１ カラム　　　　ＲＰ−１８（ｅ）　　１×２５ｃｍ　　
メルク社検　　出　　　　ＵＶ　　２１０ｎｍ 流　　速　　　　４ｍｌ／ｍｉｎ 溶離液　　　　Ａ：　　０．０５％　　ＴＦＡＢ：　　
０．０５％　　ＴＦＡ　　５０％アセトニトリルＡ１０
０％から８００ｍｉｎ　後、Ａ５０％、Ｂ５０％になる
ような直線グラジエント

【００１９】条件１では、アンジオテンシンＩ変換酵素
阻害能を持つペプチドは、リテンションタイム１１０分
に溶出された。このペプチドをさらに精製するため、さ
らにＨＰＬＣで精製した。このときの条件を下記ＨＰＬ
Ｃ条件２に示した。

【００２０】ＨＰＬＣ条件２ カラム　　　　ＲＰ−１８（ｅ）　　４ｍｍ×２５ｃｍ
　　メルク社検　　出　　　　ＵＶ　　２１０ｎｍ 流　　速　　　　１．０ｍｌ／ｍｉｎ 溶離液　　　　Ａ：　　０．０５％　　ＴＦＡＢ：　　
０．０５％　　ＴＦＡ　　２５％アセトニトリルＡ１０
０％から８００ｍｉｎ　後、Ａ５０％、Ｂ５０％になる
ような直線グラジエント

【００２１】条件２では、リテンションタイム１４５分
（図１に示すチャートのピーク１）に強いアンジオテン
シンＩ変換酵素阻害能が認められた。このピークをさら
に精製するため、下記ＨＰＬＣ条件３に示すＨＰＬＣ条
件でＨＰＬＣを行った。

【００２２】ＨＰＬＣ条件３ カラム　　　　アサヒパック　　ＧＳ−２２０　　７．
５ｍｍ×５０ｃｍ　　旭化成工業株式会社 検　　出　　　　ＵＶ　　２１０ｎｍ 流　　速　　　　１．０ｍｌ／ｍｉｎ 溶離液　　　　５０ｍＭ酢酸アンモニウム溶液

【００２
３】この条件では、アンジオテンシンＩ変換酵素阻害能
を持つペプチドは、リテンションタイム１４．５分に溶
出された（図２に示すチャートのピーク２）。 本ピークを　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社の
気相プロテイン・シーケンサー（　Ｍｏｄｅｌ−４７０
Ａ　）　とオンラインの高速液体クロマトグラフィーを
用いてＥｄｍａｎ分解反応を行い、各サイクルで得られ
るＰＴＨアミノ酸を同定した。その結果、配列番号１の
Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｒｇの構
造をもつことがわかった。

【００２４】アンジオテンシンＩ変換酵素阻害の測定は
、カッシュマンらの方法〔バイオケミカル・ファーマコ
ロジー２０巻、１６３７〜１６４８頁（１９７１）〕を
改良した丸山らの方法〔アグリカリチュアル・バイオロ
ジカル・ケミストリー４６巻、５号、１３９３〜１３９
４頁（１９８２）〕に従った。

【００２５】すなわち、試験管に本発明のペプチド水溶
液３０μｌと、酵素基質としてＬ−ヒプリルヒスチジル
ロイシン（シグマ製）とＮａＣｌを含有したｐＨ８．３
のホウ酸バッファー２５０ｍｌを加え、３７℃で１０分
間プレインキュベーションした。その後、アンジオテン
シンＩ変換酵素含有液１００μｌを加え、酵素反応を開
始した。この時、ホウ酸バッファーの濃度は０．１Ｍ、
Ｌ−ヒプリルヒスチジルロイシン濃度は５ｍＭ、ＮａＣ
ｌ　　３００ｍＭであり、阻害がかからない場合の酵素
活性は８ｍＵである。３７℃、ｐＨ８．３で３０分間振
動しつつ反応せしめた後、１Ｎ　　ＨＣｌ　　２５０ｍ
ｌを加え、反応を停止させた。酢酸エチル１．５ｍｌを
加え、１５秒間振盪させて酵素反応で生じた馬尿酸を抽
出し、２０００ｒｐｍ　、１０分間遠心分離して、酢酸
エチル層１．０ｍｌを試験管に採取した。酢酸エチルを
ホットドライバスの中で１２０℃、３０分間加温して完
全に除去した後、室温で５分間放置した。そして、Ｈ２
　Ｏ　　１．０ｍｌを加え、生成した馬尿酸の量を２２
８ｎｍの吸光度を測定して求めた。酵素反応に使用した
アンジオテンシンＩ変換酵素含有液は、ラビットアセト
ンパウダー（シグマ製）１ｇを０．１Ｍホウ酸バッファ
ー（ｐＨ８．３）１０ｍｌに溶かし、よく攪拌した後、
４℃、４００００Ｇで４０分間遠心分離した上清を０．
１Ｍホウ酸バッファーで希釈して作成した。

【００２６】阻害率は下記の式を使用して求めた。 Ａ：蒸留水添加時の吸光度　　　　（２２８ｎｍ）Ｂ：
阻害剤添加時の吸光度　　　　（２２８ｎｍ）この方法
で上記ペプチドのＩＣ５０（酵素活性を５０％阻害する
濃度）を測定した結果、１２００μＭであった。

【００２７】実施例２ 本発明のペプチドは、Ｆｍｏｃ−（９−フルオレニルメ
チルオキシカルボニル）アミノ酸（Ｆｍｏｃ−ロイシン
、Ｆｍｏｃ−グリシン、Ｆｍｏｃ−プロリン、Ｆｍｏｃ
−アラニン、Ｆｍｏｃ−アルギニン）を用いる固相合成
法で合成した。このペプチドは、ＹＭＣ−ＯＤＳ−Ｒ５
カラム（株式会社ワイエムシイ製）で、０．１％ＴＦＡ
（トリフルオロ酢酸）水溶液のイニシャル液から０．１
％ＴＦＡの７０％アセトニトリル溶液をファイナル液と
する２５分の直線グラジエントで分析（流速１．０ｍｌ
／ｍｉｎ　、検出ＵＶ２１０ｎｍ）した結果、９８％の
純度を示した。この物質を用いてＩＣ５０を測定した結
果、カツオの腸から抽出したものと同じ値になった。

【００２８】

【発明の効果】本発明によれば、従来廃棄されていた魚
介類内臓から、血圧上昇を抑える作用を有するアンジオ
テンシンＩ変換酵素阻害ペプチドが得られる。

【配列表】

【００２９】配列番号：１ 配列の長さ：６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状（　ｌｉｎｅａｒ　）配列の種類：
ペプチド（　ｐｅｐｔｉｄｅ　）起　　源 生物名：カツオナス　　ペラミス　　（　Ｋａｔｓｕｗ
ｏｎｕｓ　ｐｅｌａｍｉｓ　） 配　　列 Ｌｅｕ　　Ｇｌｙ　　Ｐｒｏ　　Ａｌａ　　Ｇｌｙ　　
Ａｒｇ１　　　　　　　　　　　　　　　　　　　５

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例１において、アンジオテンシンＩ変換酵
素阻害能の強い画分をＨＰＬＣ条件２で分離したチャー
トを示す。

【図２】図１のピーク１をさらにＨＰＬＣ条件３で分離
したチャートを示す。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇ
   ｌｙ−Ａｒｇの構造を持つアンジオテンシンＩ変換酵素
   阻害ペプチド。ただし、Ｌｅｕはロイシン、Ｇｌｙはグ
   リシン、Ｐｒｏはプロリン、Ａｌａはアラニン、Ａｒｇ
   はアルギニン残基を示す。
2. 【請求項２】　　魚介類の内臓、筋肉より、溶媒を用い
   て抽出して得られる抽出液を分離、精製することを特徴
   とするＬｅｕ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｒ
   ｇの構造を持つアンジオテンシンＩ変換酵素阻害ペプチ
   ドを製造する方法。
3. 【請求項３】　　Ｆｍｏｃ−ロイシン、Ｆｍｏｃ−グリ
   シン、Ｆｍｏｃ−プロリン、Ｆｍｏｃ−アラニン、Ｆｍ
   ｏｃ−アルギニンを用いて固相合成することを特徴とす
   るＬｅｕ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｒｇの
   構造を持つアンジオテンシンＩ変換酵素阻害ペプチドの
   製造法。