JPH0429342B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 (イ) 産業上の利用分野 この発明は、光検出式化学センサーに関する。
さらに詳しくは、種々の化学試料、ことに生体試
料の分析に有用な光検出式化学センサーに関す
る。

(ロ) 従来技術 多種多様な物質の動的平衡状態により生命は保
たれているが、その量的及び質的変動が各種疾病
と密接に結びついている。従つて、生体成分を分
析しその正確な変動を知ることにより病的状態を
把握することができる。従来、これらの分析は化
学分析によつてなされてきたが、最近、特異性、
感度等の点でより有利な酵素を用いる方法が開発
され実用化されつつある。しかしその多くが溶液
状態の酵素を用いる方法であり酵素の反復使用の
可能性を見捨てている。そのため、ガラスビーズ
等の支持体の表面に酵素をカツプリングさせたい
わゆる固定化酵素を利用する方析法が提案され、
これを用いた生体試料分析装置が種々研究されて
いる。

この点に関し、過酸化水素を産生する固定化酸
化酵素と発光試薬による過酸化水素の化学発光と
を利用した高感度の生体試料分析装置が提案され
ている（特開昭58−47484号公報参照）。この生体
試料分析装置は、生体試料をバツフアーと共に、
ガラスビーズ等に酵素を固定化した固定化酵素カ
ラムへ導入して過酸化水素を産生させ、次いでこ
れをルミノールー赤血塩混合液からなる発光試薬
と混合して化学発光させてその発光量や発光強度
を光電子増倍管等の光検知素子で検出するもので
ある。すなわち、酵素反応と化学発光反応は別々
に行なわれ、それに対応して固定化酵素カラム、
光検知素子及びこれらを接続する流路を必要とす
るものであつた。

(ハ) 発明の目的 この発明は、上記酵素反応、化学発光反応及び
光検出を実質的に同時に行ないうる化学センサー
であつて、しかも取り扱いや装置構成上、簡略化
され小型で検出効率の良好な化学センサーを提供
することを一つの目的とするものである。

この発明の発明者らは、先に、金属アルコキシ
ドの加水分解で生成する水酸化金属化合物及び／
又はその低縮合物からなるガラス様ゲル体が酵素
固定化用の担体として優れており、しかも所望の
基材の表面に簡便に膜状に形成できることを見出
した。

この発明は上記知見に基づき鋭意研究した結果
なされたものである。

(ニ) 発明の構成 かくしてこの発明によれば、光検知素子の受光
面を構成する光透過性膜表面に酵素を固定化して
なる光検出式化学センサーが提供される。

この発明に用いる光検知素子としては、光分析
に用いられる種々の受光器（例えば、光電子増倍
管、光電池、フオトダイオード等）が挙げられ、
これらのうちフオトダイオードを用いるのが小型
化の点で好ましい。ただし、分光感度特性の点で
光電子増倍管や光電池を用いるのが好ましい場合
もある。

上記フオトダイオードとは、ｎ型（又はｐ型）
半導体層表面にｐ型（又はｎ型）半導体領域を拡
散形成し、その外面に光透過性の絶縁膜（受光
面）を形成したものであり、通常のプレートチツ
プ状のものが一般的に適している。ただし、半導
体層の基体としてアモルフアスシリコンを用いて
もよい。この場合、アモルフアスシリコンは任意
の膜状に形成させることができるためガラス管内
面にもフオトダイオード層を形成させることがで
きる。従つて第４図に示すごとくガラス管内面全
体にフオトダイオード層を形成させた管形状のフ
オトダイオードからなる光検出式化学センサーと
することもできる。この光検出式化学センサーは
360゜の受光を可能とする点望ましいものである。
また、ｎ型（又はｐ型）半導体層表面にｐ型（又
はｎ型）半導体領域を多数分画状に拡散形成して
なるアレー型のフオトダイオードを用いてもよ
い。このアレー型フオトダイオードはことに後述
する複数の酵素をブロツク状に分画固定して試料
中の多成分を実質的に同時に分析することを意図
する場合に必要な光検知素子である。

上記光検知素子の受光面を構成する光透過性膜
表面に酵素を固定化することによりこの発明の光
検出式化学センサーが得られる。この固定化は、
光検知素子自体が有する光透過性膜（例えば、ガ
ラス製窓からなる受光面）に直接公知の方法で行
なつてもよいが、通常、この受光面上に又は素子
表面に直接金属アルコキシドの加水分解で生成す
る水酸化金属化合物及び／又はその低縮合物から
なるガラス様ゲル体の光透過性膜を形成させた
後、このゲル膜を固定化用担体として酵素を固定
化するのが好ましい。というのは、かようなガラ
ス様ゲル体からなる光透過性膜を担体とした場合
には、それ自身多数の水酸基を有するためガラス
窓の表面をアルカリ処理してOH基を導入した後
固定化した場合に比して、面積当りの酵素固定化
量を増大でき、比較的小さな受光面を有するフオ
トダイオードを対象とした場合においても実用上
充分な程度の受光面近傍における意図する反応を
得ることができるからである。かようなガラス様
ゲル体からなる光透過性膜は、通常、金属アルコ
キシドことにテトラメトキシシランやテトラエト
キシシランの如き低級アルコキシシランの水性溶
媒溶液を上記受光面に塗布しそこで金属アルコキ
シドを加水分解させることにより得られる。加水
分解は、通常、水性溶媒溶液に塩酸等の鉱散を加
えてPH約１〜３とし、塗布後、常温〜100℃の温
度条件下に保持することにより行なうことができ
る。この際、系中にさらに少量（通常、金属アル
コキシド１モルに対し0.05〜１モル）のフツ化水
素を含有させることが、より活性が高く酵素固定
化能に優れた担体（部分フツ素化物）膜が得られ
る点で好ましい。より詳しい条件については、こ
の発明の発明者らが先に提案し出願した特願昭57
−133055号、57−134309号及び57−230159号に準
じて選択することができる。なお、その膜厚は保
持強度及び光透過性の点でできるだけ薄くするの
が好ましく通常、0.1〜0.5mm程度で充分である。

固定化する酵素は、通常、生体試料中の被検成
分と反応して化学発光系のトリガとなる成分を産
生しうる酵素が選択される。これらの酵素は単一
種類の酵素であつてもよく、トリガ成分を産生し
うる二種以上の酵素からなる複合酵素であつても
よい。さらに、複数の被検成分に対応してトリガ
成分をそれぞれ産生する複数の酵素又は複合酵素
であつてもよい。ただし、上記トリガ成分発生酵
素以外に、化学発光系の発光剤に対応する物質が
酵素の場合、これが上記酵素と共に固定化されて
いてもよい。

一つの具体的な化学発光系の発光剤としてはル
ミノール系発光剤が挙げられ、この場合のトリガ
成分としては過酸化水素が挙げられる。ルミノー
ル系発光剤としてはルミノール−赤血塩、ルミノ
ールーバーオキシダーゼ及びルミノール−ヘミン
などが挙げられる。

他の一つの具体的な発光剤としてはルシフエリ
ン−ルシフエラーゼが挙げられ、この場合のトリ
ガ成分としてはアデノシン三リン酸（ATP）が
挙げられる。

従つて、通常過酸化水素、又はATPを産生し
うる酵素又は酵素系が被検成分に対応して固定化
されておればよい。代表的な固定化様式を第１図
〜第３図に示す。

第１図は、ｎ型半導体層１１、ｐ型半導体領域
１２及びガラス製の受光面１３を備えたフオトダ
イオード１に、前述した金属アルコキシドからの
ガラス様ゲル状薄膜２からなる光透過性の新たな
受光面を形成し、その薄膜を担体とし、カツプリ
ング剤やプロモシアン処理によつてグルコースオ
キシダーゼ３を固定化してなる、この発明の光検
出式グルコースセンサーを示す。かかるグルコー
スセンサーは、グルコースオキシダーゼの作用に
より試料中の被検成分すなわちグルコースとの接
触時に過酸化水素をその受光面近傍に産生する。
従つてそこに例えばルミノール−赤血塩混合液を
存在させた場合に、過酸化水素に基ずく発光（約
420nm）が受光面近傍に同時に行なわれることと
なり、その発光量や発光強度をフオトダイオード
で測定することにより、試料中のグルコース濃度
を検出することができる。

第２図は、同様にしてコレステロールエステラ
ーゼ４とコレステロールオキシダーゼ５を複合固
定化（co−immobilization）してなる光検出式
コレステロールセンサーを示す。このセンサー
は、接触する試料中のコレステロールエステルに
対応しコレステロールエステラーゼ及びコレステ
ロールオキシダーゼの作用により受光面近傍に過
酸化水素を産生する。従つて前記と同様に例えば
ルミノール−赤血塩の共存下において受光面近傍
で化学発光が行なわれ結局試料中のコレステロー
ル濃度を検出することができる。

第３図は、ｎ型半導体層１１中に３つの分画さ
れたｐ型半導体領域１２Ａ，１２Ｂ，１２Ｃを拡
散形成してなりガラス製の受光面１３を備えた３
チヤンネルアレー型フオトダイオード１′に、ガ
ラス様ゲル状薄膜２を形成し、これを担体とし
て、グルコースオキシダーゼ３固定化エリア、コ
レステロールエステラーゼ４とコレステロールオ
キシダーゼ５固定化エリア及びウリカーゼ６固定
化エリアを固定形成してなる、３チヤンネル光検
出式化学センサーを示す。このセンサーは、グル
コース、コレステロールエステル及び尿酸を含む
試料ことに生化学試料と接触時に、各エリアごと
に、それぞれグルコース、コレステロール、尿酸
に対応して受光面近傍で過酸化水素を産生する。
従つて、前記と同様に例えばルミノール−赤血塩
の共存下において各エリアごとに受光面近傍で化
学発光が行なわれ、アレー型フオトダイオードの
検出特性と合まつて、実質的に同時に上記三成分
の濃度を検知することができる。

なお、同様にしてクレアチンホスホキナーゼを
固定化しルシフエリン、ルシフエラーゼを発光剤
とし、アデノシン二リン酸を基質として添加すれ
ば、ATPをトリガ成分としてクレアチンホスフ
エートが検知できる。

かような酵素の固定化は、シランカツプリング
剤を用いたり、プロムシアンを用いる当該分野で
公知の方法により行なうことができ、シランカツ
プリング剤としては例えば、γ−アミノプロピル
トリエトキシシラン、γ−クロロプロピルトリメ
トキシシラン、ビニルトリエトキシシラン、γ−
グリシドキシプロピルトリメトキシシラン、Ｎ−
β−（アミノエチル）−γ−アミノプロピルトリメ
トキシシラン等が使用される。

なお、この発明のセンサーを用いるに当り、前
記した発光剤による化学発光反応と酵素反応が共
に行なわれるべく接触液の条件を選択すべきであ
る。この点に関し、リン酸塩バツフアー中に、ル
ミノール系発光剤ことにルミノール−赤血塩をそ
れぞれ10^-4〜10^-2M及び10^-4〜10^-2M程度溶解さ
せ、この溶液にさらに少量（例えば2M程度）の
炭酸ナトリウムを添加してPHを約9.0に調整した
媒体を用いるのが好ましいことが判明した。かか
る媒体は、同様なPHの他の緩衝性媒体例えばトリ
ス−HCl系バツフアーに比して、化学発光反応を
より効率良く行なわせ、固定化酵素に対する失格
等の影響も与えない優れた反応媒体である。さら
にルミノールーパーオキシダーゼ又はルミノール
−ヘミンなどの発光剤を用いた際には、リン酸水
素カリウム−水酸化ナトリウム系緩衝液を採用す
ることによりPH約８の条件において同様な化学発
光を検出することができる。ただしこれ以外にも
種々の媒体が考えられ、発光系によつて適宜選択
することが可能である。

(ホ) 実施例 実施例 １ 面積91.6mm²の石英ガラス窓を備え5.9×5.9mmの
受光面（有効受光面積33mm²）を有する平板状のフ
オトダイオードを光検知素子としてこの発明の化
学センサーを製造した。

フオートダイオードの受光面を構成するガラス
窓の表面に、テトラエトキシシラン、エタノー
ル、水、塩酸及び粘結剤（セルロース系）からな
るPH約１の溶液を塗布し自然乾燥することにより
厚み1000μmのガラス様ゲル体からなる薄膜を形
成させた。この表面部分を、水酸化ナトリウムで
PH10〜11に調整されたプロモシアン水溶液（１
ｇ／10ml）に約12分間、約20℃下で攪拌下、浸漬
して処理（固定化の前処理）し、次いで冷蒸留水
で洗浄した。これを、グルコースオキシダーゼ緩
衝液（1000u／10ml；PH７，0.1M.リン酸塩緩衝
液中）に約120分間、約30℃下で浸漬することに
より、グルコースオキシダーゼのガラス様ゲル体
薄膜への固定化が行なわれ、PH7.0のリン酸塩緩
衝液で洗浄して、この発明の化学センサーである
第１図に示すような光検出式グルコースセンサー
を得た。

このようにして得られたグルコースセンサーを
所定の発光測定用セルに取り付け、電流計を接続
してグルコース測定に用いた。

まず、10^-3〜10^-1M間の所定濃度のβ−Ｄ−グ
ルコース溶液20ml（溶媒：0.1M PH７、リン酸
塩緩衝液）をそれぞれビーカーに加え、この中に
上記グルコースセンサーが浸漬するよう固定し
た。グルコース液を２分間攪拌した後、ルミノー
ル溶液（ルミノール0.177ｇを0.1N水酸化ナトリ
ウムで溶解し、100mlとした溶液）１mlを加えて
さらに1.5分間攪拌した後、赤血塩溶液（フエリ
シアン化カリウム0.322ｇを水で溶解し100mlとし
た溶液）２ml及び2Mの炭酸ナトリウム水溶液１
mlを加えた。これらの添加と同時にグルコースセ
ンサーの受光面近傍に産生過酸化水素に基づく発
光が認められた。なお、この際の、反応系中のル
ミノール、赤血塩及び炭酸ナトリウムの濃度はそ
れぞれ4.2×10^-4M、8.3×10^-4M及び4.2×10^-2M
であつた。

30秒間の化学発光に基ずく光電流とグルコース
濃度との関係を第５図に、光電流と時間との関係
を第６図に示した。このようにグルコース濃度と
光電流との間に良好な直線関係が認められた。ま
た化学発光量も約30秒以内では充分に高いもので
あることが判つた。

実施例 ２ グルコースオキシダーゼ緩衝液の代わりに、ウ
リカーゼ緩衝液（100uを0.1Mリン酸塩緩衝液
（PH7.0）に溶解）５mlを用い、固定化を30℃下で
５時間、緩やかな攪拌下で行なう以外、実施例１
と同様にして、光検出式尿酸センサーを得、尿酸
水溶液とルミノール−赤血塩溶液により受光面近
傍に化学発光が認められた。

実施例 ３ グルコースオキシダーゼ緩衝液の代わりに、コ
レステロールエステラーゼ（CE）及びコレステ
ロールオキシダーゼ（CO）の混合溶液（CE200u
及びCO100uを0.1M、PH７のリン酸塩緩衝液に溶
解）５mlを用い、固定化を30℃下で３時間、緩や
かな攪拌下で行なう以外、実施例１と同様にし
て、第２図に示すごとき、CEとOCOを複合固定
化してなる化学発光式コレステロールセンサーを
得た。そしてコレステロール標準液とルミノール
−赤血塩溶液により、受光面近傍に化学発光が認
められた。

(ヘ) 発明の効果 以上述べたように、この発明の光検出式化学セ
ンサーは、ことに生体試料の定量、定性に有用で
ある。そして該センサーは基本的に光検出素子と
その受光面に固定化された酵素からなるものであ
るため、小型化、軽量化されており、有利であ
り、酵素による反応と化学発光反応とが実質的に
同時に行なわれるためフローシステムの分析装置
を意図する場合においても専用の固定化酵素カラ
ムや受光器を必要とせず、流路構成上簡略化でき
好都合である。さらに分析原理からも、化学発光
が実質的に光検知素子の受光面近傍で選択的に行
なわれるため、化学発光の検知も効率良く行なわ
れ、従来の同様な発光系に比してより高感度な検
出を行なうことができる。

【図面の簡単な説明】

第１〜３図は、この発明の光検出化学センサー
の具体例をそれぞれ示す模式的構成説明図、第４
図は、さらに他の具体例を示す断面を含む構成説
明図、第５図は、この発明の光検出式化学センサ
ーで得られる光電流と濃度との関係を例示するグ
ラフ、第６図は同じく光電流と時間との関係を例
示するグラフである。 １……フオトダイオード、１′……アレー型フ
オトダイオード、１１……ｎ型半導体層、１２，
１２Ａ，１２Ｂ，１２Ｃ……ｐ型半導体領域、１
３……受光面、２……ガラス様ゲル状薄膜、３…
…グルコースオキシダーゼ、４……コレステロー
ルエステラーゼ、５……コレステロールオキシダ
ーゼ、６……ウリカーゼ、７……ガラス管、２１
……酵素固定化担体層。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 光検知素子の受光面を構成する光透過性膜素
   面に酵素を固定化してなる光検出式化学センサ
   ー。 ２ 酵素が、被検成分と反応して過酸化水素又は
   アデノシン三リン酸を産生しうる酵素である特許
   請求の範囲第１項記載のセンサー。 ３ 酵素が、グルコースオキシダーゼ、ウリカー
   ゼもしくはコレステロールエステラーゼ・コレス
   テロールオキシダーゼ複合酵素又はクレアチンホ
   スホキナーゼである特許請求の範囲第２項記載の
   センサー。 ４ 光透過性膜が、金属アルコキシドの加水分解
   で生成する化合物又はその部分フツ素化物からな
   るガラス様ゲル体からなる特許請求の範囲第１項
   記載のセンサー。 ５ 金属アルコキシドが、低級アルコキシシラン
   である特許請求の範囲第４項記載のセンサー。 ６ 光検知素子が、フオトダイオードである特許
   請求の範囲第１項記載のセンサー。