JPS6049789A - 光検出式化学センサ− - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （イ）産業上の利用分野 この発明は、光検出式化学センサーに関する。

さらに詳しくは、種々の化学試料、ことに生体試料の分
析に有用な光検出式化学センサーに関する。

←）従来技術 多種多様な物質の動的平衡状態によシ生命は保たれてい
るが、その量的及び質的変動が各種疾病と密接に結びつ
いている。　従って、生体成分を分析しその正確な変動
を知ることによル病的状態を把握することができる。　
従来、これらの分析は化学分析によってなされてきたが
、最近、特異性、感度等の点でよ少有利な酵素を用いる
方法が開発され実用化されつつある。　しかしその多く
が溶液状態の酵素を用いる方法でちゃ酵素の反！使用の
可能性を見捨てている。　そのため、ガラスピーズ等の
支持体の表面に酵素をカップリングさせたいわゆる固定
化酵素を利用する分析法が提案され、これを用いた生体
試料分析装置が種々研究されている。

この点に関し、過酸化水素を産生ずる固定化酸化酵素と
発光試薬によｉ酸化水素の化学発光とを利用した高感度
の生体試料分析装置が提案されている（特開昭５８−４
７４８４号公報参照）。

この生体試料分析装置は、生体試料をバッファーと共に
、ガラスピーズ等に酵素を固定化した固定化酵素カラム
へ導入して過酸化水素を産生させ、次いでこれをルミノ
ール−赤血塩混合液からなる発光試薬と混合して化学発
光させてその発光量や発光強度を光電子増倍管等の光検
知素子で検出するものである。　すなわち、酵素反応と
化学発光反応は別々に行なわれ、それに対応して固定化
酵素カラム、光検知素子及びこれらを接続する流路を必
要とするものであった。

（ハ）発明の目的 この発明は、上記酵素反応、化学発光反応及び光検出を
実質的に同時に行ないうる化学センサーであって、しか
も取シ扱いや装置構成上、簡略化され小型で検出効率の
良好な化学センサーを提供することを一つの目的とする
ものである。

この発明の発明者らは、先に、金属アルコキシドの加水
分解で生成する水酸化金属化合物及び／又はその低縮合
物からなるガラス様ゲル体が酵素固定化用の担体として
優れておシ、しかも所望の基材の表面に簡便に膜状に形
成できることを見出した。

この発明は上記知見に基づき鋭意研究した結果なされた
ものである。

に）発明の構成 かくしてこの発明によれば、光検知素子の受光面を構成
する光透過性膜表面に酵素を固定化してなる光検出式化
学センサーが提供される。

この発明に用いる光検知素子としては、光分析に用いら
れる種々の受光器（例えば、光電子増倍管、光電池、フ
ォトダイオード等）が挙げられ、これらのうちフォトダ
イオードを用いるのが小型化の点で好ましい。　ただし
、分光感度特性の点で光電子増倍管や光電池を用いるの
が好ましい場合もある。

上記フォトダイオードとは、ｎ型（又はｐ型）半導体層
表面にｐ型（又はｎ型）半導体領域を拡散形成し、その
外面に光透過性の絶縁膜（受光面）を形成したものであ
ル、通常のプレートチップ状のものが一般的に適してい
る。　ただし、半導体層の基体としてアモルファスシリ
コンヲ用いて１ｉい。　この場合、アモルファスシリコ
ンハ任意の膜状に形成させることができるためガラス管
内面にもフォトダイオード層を形成させることができる
。　従って第４図に示すごとくガラス管内面全体にフォ
トダイオード層を形成させた管形状のフォトダイオード
からなる光検出式化学センサーとすることもできる。　
この光検出式化学センサーは８６０′″の受光を可能と
する点望ましいものである。、　また、ｎ型（又はｐ型
）半導体層表面にｐ型（又はｎ型）半導体領域を多数分
画状に拡散形成してなるアレー型のフォトダイオードを
用いてもよい。　このアレー型フォトダイオードはこと
に後述する複数の酵素をブロック状に分画固定して試料
中の多成分を実質的に同時に分析することを意図する場
合に必要な光検知素子である。

上記光検知素子の受光面葡構成する光透過性膜表面に酵
素を固定化することにょシこの発明の光検出式化学セン
サーが得られる。　この固定化は、光検知素子自体が有
する光透過性膜（例えば、ガラス製窓からなる受光面）
Ｋ直接公知の方法で行なってもよいが、通常、この受光
面上に又は素子表面に直接金属アルコキシドの加水分解
で生成する水酸化金属化合物及び／又はその低縮合物か
らなるガラス様ゲル体の光透過性膜を形成させた後、こ
のゲル膜を固定化用担体として酵素を固定化するのが好
ましい。　というのは、かようなガラス様ゲル体からな
る光透過性膜を担体とした場合には、それ自身多数の水
酸基を有するためガラス窓の表面をアルカリ処理してＯ
Ｈ基を導入した後固定化した場合に比して、面積当りの
酵素固定化量を増大でき、比較的小さな受光面を有する
フォトダイオードを対象とした場合においても実用上充
分な程度の受光面近傍における意図する反応を得ること
ができるからである。　かようなガラス様ゲル体からな
る光透過性膜は、通常、金属アルコキシドことにテトラ
メトキシシランやテトラエトキシシランの如き低級アル
コキシシランの水性溶媒溶液を上記受光面に塗布しそこ
で金属アルコキシドを加水分解させることにより得られ
る。　加水分解は、通常、水性溶媒溶液に塩酸等の鉱酸
を加えてｐＨ約１〜８とし、塗布後、常温〜１００℃の
温度条件下に保持することによシ行なうことができる。

　この際、系中にさらに少量（通常、金属アルコキシド
１モルに対し０．０５〜１モル）のフッ化水素を含有さ
せることが、よ）活性が高く酵素固定化能に優れた担体
（部分フツ素化物）膜が得られる点で好ましい。　よシ
詳しい条件については、この発明の発明者らが先に提案
し出願した特願昭５７−１８８０５５号、５７−１８４
８０９号及び５７−２８０１５９号に準じて選択するこ
とができる。　なお、その膜厚は保持強度及び光透過性
の点でできるだけ薄くするのが好ましく通常、０．１〜
０．５鱈程度で充分である。

固定化する酵素は、通常、生体試料中の被検成分と反応
して化学発光系のトリガとなる成分を産生しうる酵素が
選択される。　これらの酵素は単一種類の酵素であって
もよく、トリガ成分を産生しうる二種以上の酵素からな
る複合酵素であってもよい。　さらに、複数の被検成分
に対応してトリガ成分をそれぞれ産生ずる複数の酵素又
は複合酵素であってもよい。　ただし、上記トリガ成分
発生酵素以外に、化学発光系の発光剤に対応する物質が
酵素の場合、これが上記酵素と共に固定化されてい”Ｃ
もよい。

一つの具体的な化学発光系の発光剤としてはルミノール
系発光剤が挙げられ、この場合のトリガ成分としては過
酸化水素が挙げられる。　ルミノール系発光剤としては
ルミノール−赤血塩、ルミノール−パーオキシダーゼ及
びルミノール−ヘミンなどが挙げられる。

他の一つの具体的な発光剤としてはルシフェリン−ルシ
フェラーゼが挙げられ、この場合のトリガ成分としては
アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）が挙げられる。

従って、通常過酸化水素　又はＡＴＰ　を産生しうる酵
素又は酵素系が被検成分に対応して固定化されておれば
よい。　代表的な固定化様式を第１図〜第８図に示す。

第１図は、ｎｆｉ半導体層（２）、ｐ型半導体領域■及
びガラス製の受光面Ｏｊを備えたフォトダイオード（１
）に、前述した金属アルコキシドからのガラス様ゲル状
薄膜（２）からなる光透過性の新たな受光面を形成し、
その薄膜を担体とし、カップリング剤やブロモシアン処
理によってグルコースオキシダーゼ（３）を固定化して
なる、この発明の光検出式グルコースセンサーヲ示す。

　かかるグルコースセンサーは、グルコースオキシダー
ゼの作用により試料中の被検成分すなわちグルコースと
の接触時に過酸化水素をその受光面近傍に産生ずる。　
従ってそこに例えばルミノール−赤血塩混合液を存在さ
せた場合に、過酸化水素に基ずく発光（約４２０　ｎｍ
　）が受光面近傍に同時に行なわれることとな少、その
発光量や発光強度をフォトダイオードで測定することに
よシ、試料中のグルコース濃度を検出することができる
。

第２図は、同様にしてコレステロールエステラーゼ（４
）とコレステロールオキシダーゼ（５）を複合固定化（
ｃｏ−１ｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ　）　［、てなる
光検出式コレステロールセンサーを示す。　このセンサ
ーは、接触する試料中のコレステロールエステルに対応
シコレステ目−ルエステラーゼ及ヒコＬ／スフ−ロール
オキシダーゼの作用によ）受光面近傍に過酸化水素を産
生ずる。　従って前記と同様に例えばルミノール−赤血
塩の共存下において受光面近傍で化学発光が行なわれ結
局試料中のコレステロール濃度を検出することができる
。

第８図は、ｎ型半導体層Ｑｌ）中に８つに分画されたｐ
Ｗ半導体領域（Ｌ２Ａ）、（１２Ｂ）、（ｉ２ｃ）を拡
散形成してなりガラス製の受光面α３を備えた８チヤン
ネルアレー型フオトダイオード（１うに、ガラス様ゲル
状薄膜（２）を形成し、これを担体として、グルコース
オキシダーゼ（３）固定化エリア、コレステロールエス
テラーゼ（４）　トコレステロールオキシダーセ（５）
固定化エリア及びウリカーゼ（６）固定化エリアを固定
形成してなる、８チャンネル光検出式化学センｔ−を示
ｆ。　このセンサーは、グルコース、コレステロールエ
ステル及び尿酸を含む試料ことに生化学試料と接触時に
、各エリアごとに、それぞれグルコース、コレステロー
ル、尿酸に対応して受光面近傍で過酸化水素を産生ずる
。　従って、前記と同様に例えばルミノール−赤血塩の
共存下において各エリアごとに受光面近傍で化学発光が
行なわれ、アレー型フォトダイオードの検出特性と含ま
って、実質的に同時に上記三成分の濃度を検知すること
ができる。

なお、同様にしてクレアチンホスホキナーゼを固定化し
ルシフェリン、ルシフェラーゼを発光剤とし、アデノシ
ンニリン酸を基質として添加すれば、ＡＴ１？をトリガ
取分としてクレアチンホスフェートが検知できる。

かような酵素の固定化は、シランカップリング剤を用い
たル、ブロムシアンを用いる当該分野で公知の方法によ
シ行なうことができ、シランカッ７”ｌＪング剤として
は例えば、γ−アミノプロピルトリエトキシシラン、γ
−クロロプロピルトリメトキシシラン、ビニルトリエト
キシシラン、Ｔ−グリシドキシプロビルトリメトキシシ
ラン、Ｎ−β−（アミノエチル）−γ−アミノプロピル
トリメトキシシラン等が使用される。

なお、この発明のセンサーを用いるに当り、前記した発
光剤による化学発光反応と酵素反応が共に行なわれるべ
く接触液の条件を選択すべきである。　この点に関し、
リン酸塩バッファー中に、ルミノール系発光剤ことにル
ミノール−赤血塩をそれぞれ１０−４〜１０−”Ｍ及び
１０−４〜１０−１Ｍ程度溶解させ、この溶液にさらに
少量（例えば２Ｍ程度）の炭酸ナトリウムを添加してｐ
Ｈを約９．０に調整した媒体を用いるのが好ましいこと
が判明した。　かかる媒体は、同様なｐＨの他の緩衝性
媒体例えばトリス−Ｈ０ｊ系バッファーに比して、化学
発光反応をより効率良く行なわせ、固定化酵素に対する
失活等の影響も与えない優れた反応媒体である。　さら
にルミノール−パーオキシダーゼ又はルミノール−ヘミ
ンなどの発光剤を用いた際には、リン酸水素カリウム−
水酸化ナトリウム系緩衝液を採用することにより　ｐＨ
約８の条件において同様な化学発光を検出することがで
きる。　ただしこれ以外にも種々の媒体が考えられ、発
光系によって適宜選択することが可能である。

に）実施例 実施例１ 面積９１．６−の石英ガラス窓を備え５．９Ｘ５−９寵
の受光面（有効受光面積８８−）を有する平板状のフォ
トダイオードを光検知素子としてこの発明の化学センサ
ーを製造した。

フォートダイオードの受光面を構成するガラス窓の表面
に、テトラエトキシシラン、エタノール。

水、塩酸及び粘結剤（セルロース系）からなるｐＥＩ約
１の溶液を箪布し自然乾燥することＫよシ厚み１０００
μｍのガラス様ゲル体からなる薄膜を形成させた。　乙
の表面部分を、水酸化ナトリウムｆＰＨ１０−１１に調
整されたブロモシアン水溶液（Ｉｆ／！Ｏｇ／）に約１
２分間、約２０℃下で攪拌下、浸漬して処理（固定化の
前処理）し、次いで冷蒸留水で洗浄した。　これを、グ
ルコースオキシダーゼ緩衝液（１０００ｕ／１０ｓｔｌ
ｉｐＨ７，０，１Ｍ、リン酸塩緩衝液中）に約１２０分
間。

約８０℃下で浸漬することによシ、グルコースオキシダ
ーゼのガラス様ゲル体薄膜への固定化が行なわれ、ｐＨ
７，０のリン酸塩緩衝液で洗浄して、この発明の化学セ
ンサーである第１図に示すような光検出式グルコースセ
ンサーヲ得り。

このようにして得られたグルコースセンサーを所定の発
光測定用セルに取ｐ付け、電流計を接続してグルコース
測定に用いた。

まず、ｌ　Ｇ　”−１ｏ”　ｗ間の所定ｍ度ｏｐ−−Ｄ
−グルコース溶液２０＋／（溶媒：０．１ＭｐＨ７、リ
ン酸塩緩衝液）をそれぞれビーカーに加え、この中に上
記グルコースセンサーが浸漬するよう固定した。　グル
コース液を２分間攪拌した後、ルミノール溶液（ルミノ
ールｏ、ｘ７７ｒを０．１１１１水酸化ナトリウムで溶
解し、ｘｏｏｗ７とした溶液）１Ｍｌを加えてさらに１
．５分間攪拌した後、赤血塩溶液（フェリシアン化カリ
ウム０．８２２　Ｆを水で溶解し１００ｇ／とした溶液
）２ゴ及び２ＭＩＺ＞炭酸ナトリウム水溶液１ｍｌを加
えた。　これらの添加と同時にグルコースセンサーの受
光面近傍に産生過酸化水素比基づく発光が認められた。

　なお、この際の、反応系中のルミノール、赤血塩及び
炭酸す）ＩＪウムの濃度はそれぞれ４．２ＸＩＯ−４Ｍ
。

８．８Ｘ１０−４Ｍ及び４．２Ｘ１０−”Ｍであった。

８０秒間の化学発光に基ずく光電流とグルコース濃度と
の関係を第５図に、光電流と時間との関係を第６図に示
した。　このようにグルコース濃度と光電流との間に良
好な直線関係が認められた。

また化学発光量も約８０秒以内では充分に高いものであ
ることが判った。

実施例２ グルコースオキシダーゼ緩衝液の代わシに、ウリカーゼ
緩衝液（１００ｕを０．１　Ｍ　’Ｊリン酸塩緩衝液ｐ
Ｈ７，０）に溶解）５ｇ７を用い、固定化を８０℃下で
６時間、緩やかな攪拌下で行なう以外、実施例１と同様
にして、光検出式尿酸センサーを得、尿酸水溶液とルミ
ノール−赤血塩溶液によシ受光面近傍に化学発光が認め
られた。

実施例８ グルコースオキシダーゼ緩衝液の代わりに、コレステロ
ールエステラーゼ（ＣＩ）及びコレステロールオキシダ
ーゼ（ＣＯ）の混合溶液（Ｏ１ｌｉ２００ｕ及び０Ｏ１
００ｕを０．ｉＭ、ｐＨ７のリン酸塩緩衝液に溶解）６
ゴを用い、固定化を８０℃下で８時間、緩やかな攪拌下
で行なう以外、実施例１と同様にして、第２図に示すご
とき、ＣＢとＣＯを複合固定化してなる化学発光式コレ
ステロールセンサーを得た。　そしてコレステロール標
準液とルミノール−赤血塩溶液によル、受光面近傍に化
学発光が認められた。

（へ）発明の効果 以上述べたように、この発明の光検出式化学センサーは
、ことに生体試料の定量、定性に有用である。　そして
該センサーは基本的に光検出素子とその受光面に固定化
された酵素からなるものであるため、小型化、軽量化さ
れておシ、有利であシ、酵素による反応と化学発光反応
とが実質的に同時に行なわれるためフローシステムの分
析装置を意図する場合においても専用の固定化酵素カラ
ムや受光器を必要とせず、流路構成上簡略化でき好都合
である。　さらに分析原理からも、化学発光が実質的に
光検知素子の受光面近傍で撰択的に行なわれるため、化
学発光、の検知も効率良く行なわれ、従来の同様な発光
系に比してよｐ高感度な検出を行なうことができる。

【図面の簡単な説明】

第１〜８図は、この発明の光検出式化学センサーの具体
例をそれぞれ示す模式的構成説明図、第４図は、さらに
他の具体例を示す断面を含む構成説明図、第６図は、こ
の発明の光検出式化学センサーで得られる光電流と濃度
との関係を例示するグラフ、第６図は同じく光電流と時
間との関係を例示するグラフである。 （１）・・・フォトダイオード、（Ｉｔ”）・・・アレ
ー型フォトダイオード、（ロ）・・・ｎ型半導体層、■
、（１２Ａ）、（１２Ｂ）、（１２０）・・・ｐ型半導
体領域、（至）・・・受光面、（２）・・・ガラス様ゲ
ル状薄膜、（粉・・・グルコースオキシター−ｈ’、（
４）・・・コレステロールニステラー（！’、（５）・
・・コレステロールオキシダーゼ、　（６）・・・ウリ
カーゼ、（７）・・・ガラス管、１２１１・・・酵素固
定化担体層。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、光検知素子の受光面を構成する光透過性膜表面に酵
   素を固定化してなる光検出式化学センサー・ ２、酵素が、被検成分と反応して過酸化水素又はアデノ
   シン三リン酸を産生じつる酵素である特許請求の範囲第
   １項記載のセンサー。 ８、酵素が、グルコースオキシダーゼ、ウリカーゼもし
   くはコレステロールエステラーゼ・コレステロールオキ
   シダーゼ複合酵素又はクレアチンホスホキナーゼである
   特許請求の範囲第２項記載のセンサー。 ｔ　光透過性膜が、金属アルコキシドの加水分解で生成
   する化合物又はその部分フツ素化物からなるガラス様ゲ
   ル体からなる特許請求の範囲第１項記載のセンサー。 ５、金属アルコキシドが、低級アルコキシシランである
   特許請求の範囲第４項記載のセンサー。 ６、光検知素子が、フォトダイオードである特許請求の
   範囲第１項記載のセンサー。