JPH04262797A - ヒアルロン酸の定量用キット及び定量方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ヒアルロン酸の定量用
キット及び定量方法に関する。更に詳しくは、検体ヒア
ルロン酸を、軟骨のプロテオグリカンコンドロイチナー
ゼＡＢＣ処理物と標識されたヒアルロン酸結合性蛋白と
で挟み、サンドイッチ状結合体を形成させ、サンドイッ
チ状結合体の標識物質により検体ヒアルロン酸を定量す
るキット及び定量方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】ヒアルロン酸は、Ｎ−アセチルグルコサ
ミンとグルクロン酸が交互にβ−１，４結合により重合
した酸性ムコ多糖類であり、臍帯、関節液及び眼の硝子
体等に含まれている。一方、血清ヒアルロン酸の変化が
、ある種の病気と相関関係にあることが知られている。 例えば、血清ヒアルロン酸の増加が、肝硬変などの肝機
能不全患者に見られる。更には、血清ヒアルロン酸の増
加は、ガン及び慢性関節リウマチと相関関係がある。し
たがって、血清及び他の生物体液中のヒアルロン酸を定
量することは、炎症の進行や手術後の回復の診断或いは
癌の診断において有用である。

【０００３】軟骨型プロテオグリカンは、主鎖となる蛋
白（分子量２０万〜３０万）のアミノ末端領域（分子量
６万〜７万、ヒアルロン酸結合性部位と呼ばれる部分）
がヒアルロン酸に会合する状態で、かつ、該ヒアルロン
酸からカルボキシル末端を上方にして立ち上がる状態で
存在する。そして該蛋白のカルボキシル末端領域には主
としてコンドロイチン硫酸鎖群が結合し、次いでコンド
ロイチン硫酸鎖群の次に（アミノ末端側に）主としてケ
ラタン硫酸鎖群が結合している。また、ケラタン硫酸鎖
群からアミノ末端までの相当の距離は、結合する基が存
在しない裸の状態で存在する。

【０００４】従来、ヒアルロン酸の定量法として、軟骨
型プロテオグリカンのトリプシン処理によって得られた
ヒアルロン酸結合性蛋白を、固相に固着させ、該ヒアル
ロン酸結合性蛋白と標識されたヒアルロン酸結合性蛋白
とでヒアルロン酸を挟み、サンドイッチ状結合体を形成
させ、該結合体の標識物を測定することにより、ヒアル
ロン酸を定量する方法が知られている（Ｃｌｉｎｉｃａ
．　Ｃｈｉｍｉｃａ．　Ａｃｔａ．，　１８１，１９８
９年，Ｋｅｎｊｉ　Ｃｈｉｃｈｉｂｕ　ｅｔ　ａｌ．，
　ｐ．　３１７−３２４、及び特開昭６４−４６９号公
報、以下あわせて秩父法と記す）。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】しかし、上記秩父法で
は、感度が低いという欠点があった。それは、プロテオ
グリカンのトリプシン処理物、すなわち親水性のヒアル
ロン酸結合性蛋白を使用するため、該結合性蛋白を疎水
性の固相に、効率よく固着させることができなかったも
のと考えられる。

【０００６】本発明は、感度の高いヒアルロン酸の定量
を行うためのキット及び定量方法を提供することを目的
とする。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明は、軟骨のプロテ
オグリカンコンドロイチナーゼＡＢＣ処理物と標識され
たヒアルロン酸結合性蛋白とからなるヒアルロン酸定量
キット及び固相に固着された軟骨のプロテオグリカンコ
ンドロイチナーゼＡＢＣ処理物に、検体ヒアルロン酸を
含む試料を添加して、該処理物と検体ヒアルロン酸とを
結合させ、さらに予め標識物質で標識されたヒアルロン
酸結合性蛋白を添加して、検体ヒアルロン酸を、該処理
物と標識されたヒアルロン酸結合性蛋白とで挟み、サン
ドイッチ状結合体を形成させ、サンドイッチ状結合体の
標識物質により検体ヒアルロン酸を定量する方法を要旨
とする。

【０００８】本発明の、軟骨のプロテオグリカンコンド
ロイチナーゼＡＢＣ処理物としては牛、豚、鹿または人
等の軟骨から得られる軟骨型プロテオグリカンを、コン
ドロイチナーゼＡＢＣ（ＥＣ４．２．２．４）で処理し
たものを挙げることができる。

【０００９】本発明の原料としての軟骨型プロテオグリ
カンの製法としては、例えば軟骨から、４〜６Ｍ　塩酸
グアニジンで軟骨成分を可溶化して抽出し、次いでプロ
テオグリカンが会合する条件下（例えば０．５Ｍ　塩酸
グアニジン溶液中）で沈降平衡遠心を行って高密度（約
１．６ｇ／ｍｌ以上）の画分を得、この画分についてプ
ロテオグリカンが会合しない条件下（例えば４〜６Ｍ　
塩酸グアニジン溶液中）で沈降平衡遠心を行って高密度
（約１．５ｇ／ｍｌ以上）画分を得、これを透析して軟
骨型プロテオグリカンを得る方法等を挙げることができ
る。

【００１０】コンドロイチナーゼＡＢＣの製造法として
は、例えばプロテウス・ブルガリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ　
ｖｕｌｇａｒｉｓ，　ＡＴＣＣ　６８９６）培養菌体を
破砕処理し、硫安分画、吸着クロマトグラフィー、アフ
ィニティー・クロマトグラフィー等の一般的酵素採取法
により製造することができる（Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈ
ｅｍ．，　　２４３（１９６８），ＹａｍａｇａｔａＴ
．　ｅｔ　ａｌ．，　ｐ．１５２３−１５３５）。

【００１１】また、市販品を使用することもできる。市
販品としては、コンドロイチナーゼＡＢＣプロテアーゼ
フリー（生化学工業株式会社製造および販売、商品名）
、コンドロイチナーゼＡＢＣ（生化学工業（株）製造お
よび販売、シグマ社販売、商品名）等を挙げることがで
きる。ただし、市販品を使用する場合に、有意量のプロ
テアーゼが混入している場合には、該プロテアーゼの活
性を押えるために、プロテアーゼ阻害剤例えばエチレン
ジアミン四酢酸等を添加することが望ましい。これはも
しコンドロイチナーゼＡＢＣにプロテアーゼが混入して
いると、コア蛋白が切断されるためである。

【００１２】コンドロイチナーゼＡＢＣ処理は、プロテ
オグリカンに結合する親水性物質であるコンドロイチン
硫酸をコンドロイチナーゼＡＢＣで分解して取り除くこ
とで、上記処理物を疎水性の固相表面に結合しやすくす
ることを目的とする。このため該処理は、コンドロイチ
ナーゼＡＢＣの至適条件下で、１〜２時間、コンドロイ
チン硫酸が完全に分解する程度まで酵素反応させること
が好ましい。

【００１３】本発明に使用するヒアルロン酸結合性蛋白
は、上記秩父法等により製造することができる。例えば
、軟骨のプロテオグリカンに蛋白分解酵素（トリプシン
等）を加え、コア蛋白を分解し、ヒアルロン酸結合担体
（例えば、ヒアルロン酸を結合させた球状セルロース）
を用いるアフィニティー・クロマトグラフィーにより該
結合性蛋白を得ることができる。次いで該結合性蛋白を
、既知法に従い標識物質（例えばビオチン、アビジン、
酵素、アイソトープ、蛍光色素、化学発光物質等）で標
識して、本発明の標識されたヒアルロン酸結合性蛋白を
得ることができる。

【００１４】本発明に使用する固相としては、プレート
、チューブ、ビーズまたはメンブレン等が挙げられ、こ
れらの材質としては、ポリスチレン又はポリ塩化ビニル
等が好ましい。市販品としては、例えばヌンクプレート
（ポリスチレン製）を挙げることができる。

【００１５】本発明の定量方法としては、先ず、固相に
軟骨のプロテオグリカンコンドロイチナーゼＡＢＣ処理
物を固着する。固着方法としては、例えば該処理物をｐ
Ｈ７〜９のリン酸緩衝液又は炭酸緩衝液に溶解して固相
に加え、３７℃で２〜３時間保存して固着させる方法等
を挙げることができる。上記固着後、ブロック体を添加
して、該処理物が固着していない部分を被覆しておく必
要がある。ブロック体としては、例えば牛等から採取で
きる、血清アルブミン、血清又はミルク蛋白等が挙げら
れ、特に固相にヌンクプレートを使用した場合はミルク
蛋白の使用が推奨される。

【００１６】次いで、上記処理物が固着した固相に、検
体ヒアルロン酸を含む試料を添加し、上記処理物にヒア
ルロン酸を結合させる。ヒアルロン酸を含む試料として
は、人、牛、ラット等の血液や体液をそのまま試料とし
て使用することができる。ヒアルロン酸を結合させた後
、一般的には固相をトウィーン系界面活性剤を添加した
リン酸緩衝液等で洗浄することが推奨される。

【００１７】さらに、上記のヒアルロン酸が結合した固
相に、標識されたヒアルロン酸結合性蛋白を添加して、
ヒアルロン酸に該結合性蛋白を結合させる。この操作に
よって、ヒアルロン酸を上記処理物と該結合性蛋白とで
挟みサンドイッチ状結合体を形成させる。

【００１８】次に、該サンドイッチ状結合体の標識物質
を測定してヒアルロン酸を定量する。標識物質の測定方
法としては、標識物質により異なるが、例えば標識物質
にビオチンを使用する場合は、例えばアビジンを結合さ
せた酵素を、上記サンドイッチ状結合体を形成させた固
相に添加し、酵素をアジビンを介して結合体に結合させ
、酵素の酵素反応を測定する方法を挙げることができる
。

【００１９】次いで、ヒアルロン酸濃度と標識物質の測
定結果との関係について検量線を作成し、未知検体につ
いての測定結果と該検量線とを用いて、未知検体中のヒ
アルロン酸を定量する。

【００２０】本発明のキットは、軟骨のプロテオグリカ
ンコンドロイチナーゼＡＢＣ処理物と、標識されたヒア
ルロン酸結合性蛋白とで構成される。本発明のキットを
使用するに当り、該処理物を固相に固着させる工程が必
要となるが、あらかじめ該処理物を固相に固着させてお
くことにより、該工程を省略することができる。上記処
理物と結合性蛋白とは、それぞれ別の容器に収め、どち
らも凍結或いは凍結乾燥した状態で保存することにより
、２年程度の期間、活性を維持することが期待できる。

【００２１】

【作用】本発明の軟骨のプロテオグリカンコンドロイチ
ナーゼＡＢＣ処理物は、軟骨型プロテオグリカンのコン
ドロイチン硫酸のみを除去した物であって、ヒアルロン
酸結合部位を変化させることなく得られた物であるので
、ヒアルロン酸との会合能を損なっていない。また該処
理物は、親水性であるコンドロイチン硫酸鎖群が除かれ
、該鎖群の結合していたコア蛋白領域が疎水性にされて
いるため、該領域を疎水性の固相に固着することができ
、親水性であるヒアルロン酸結合部位を上方にして立ち
上がる状態で存在する。このため該結合部位にヒアルロ
ン酸が効率よく結合し、感度の高い定量結果を得ること
ができるものと考える。

【００２２】

【実施例】以下に本発明を実施例により詳細に説明する
が、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。

【００２３】以下において、使用する単位としては、Ｍ
　は（ｍｏｌ／ｌ）、％は（ｇ／１００ｍｌ）　、及び
ＵはｐＨ８．０、３７℃で１分間にコンドロイチン６−
硫酸から１μｍｏｌ　の不飽和二糖を生成する酵素量を
示すものである。

【００２４】製造例 軟骨のプロテオグリカンコンドイチナーゼＡＢＣ処理物
の製造 （軟骨型プロテオグリカンの製造）牛の鼻中隔軟骨３５
０ｇを細断し、予め４℃に保持した４Ｍ　塩酸グアニジ
ン３５００ｍｌに投入し、４℃で約７０時間撹拌し、プ
ロテオグリカンを抽出した。次いで、１０，０００ｒｐ
ｍ　で２０分間遠心分離した後、上清液を得た。該上清
液を４Ｍ　塩酸グアニジン、０．０１Ｍ　ＥＤＴＡ、０
．０５Ｍ　ベンゾアミジン塩酸及び０．１Ｍ　６−アミ
ノヘキサン酸を含む、０．０５Ｍ　酢酸ナトリウム溶液
（以下溶媒Ａと記す）を外液とし、セルロースチューブ
を使用して４℃で２４時間透析した。

【００２５】次いで、透析内液を１０，０００ｒｐｍ　
で３０分間遠心分離し上清液を得た。得られた上清液を
、塩酸グアニジン濃度を０．４Ｍ　に変えた溶媒Ａを、
外液とし、セルロースチューブを使用して４℃で２４時
間透析した。次いで、透析内液１ｇに対して１．１ｇの
塩化セシウムを加えよく撹拌後、１０℃、２３，０００
ｒｐｍ　で約７０時間遠心分離した。遠心分画された溶
液の管底から２／５位までを採取し、プロテオグリカン
Ａ１画分とした。

【００２６】次に、プロテオグリカンＡ１画分溶液に、
塩酸グアニジン濃度を８Ｍ　に変えた溶媒Ａを同容量加
えた。

【００２７】次いで、溶液１ｇに対して０．５５ｇの塩
化セシウムを加えよく撹拌し、１０℃、２３，０００ｒ
ｐｍ　で約５０時間遠心分離を行った。遠心分画された
溶液の管底から１／４部分を採取し、軟骨型プロテオグ
リカン溶液とした。得られた軟骨型プロテオグリカン溶
液を、０．０１Ｍ　ＥＤＴＡを含む０．２Ｍ　酢酸ナト
リウム（ｐＨ６．５）を外液とし、セルロースチューブ
を使用して透析し、さらに脱イオン水に対しても透析し
た後、凍結乾燥して、軟骨型プロテオグリカン粉末１０
０ｍｇを得た。

【００２８】（軟骨のプロテオグリカンコンドイチナー
ゼＡＢＣ処理物の製造）軟骨型プロテオグリカン粉末１
５ｍｇを、０．０３Ｍ　酢酸ナトリウムを含む０．１Ｍ
　トリス塩酸（ｐＨ８．０）緩衝液２ｍｌに溶解し、１
ＵのコンドイチナーゼＡＢＣプロテアーゼフリー（商品
名、生化学工業（株）製造及び販売）を加え、３７℃で
１時間保存した。次いで蒸留水を外液とし、セルロース
チューブを使用して１０℃で約２０時間透析し、得られ
た透析内液を、軟骨のプロテオグリカンコドイチナーゼ
ＡＢＣ処理物の溶液として用いた。上記処理物の溶液は
、使用前まで−７０℃で凍結保存した。

【００２９】ヒアルロン酸結合性蛋白の製造牛の鼻中隔
軟骨４００ｇを細断し、予め４℃に保持した４Ｍ　塩酸
グアニジン溶液を２倍量加えて、ミンチ状とした。８倍
重量の４Ｍ　塩酸グアニジン溶液を加えて、撹拌しなが
ら４℃で４８時間抽出した。

【００３０】次いで、１０，０００ｒｐｍ　で３０分間
遠心分離して４，０００ｍｌの上清液を採取した。該上
清液を、セルロースチューブを使用して脱イオン水で透
析した後、凍結乾燥して粗抽出粉末を得た。

【００３１】次に、粗抽出粉末について以下のようにト
リプシン処理を行った。粗抽出粉末２，５００ｍｇとト
リプシン（シグマ社製造）１．２ｍｇとを、０．１Ｍ　
酢酸ナトリウムを含む０．１Ｍ　トリス塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．３）５０ｍｌに溶解し、３７℃で３時間保存した
。次いで、トリプシン阻害剤１．６ｍｇ（　大豆由来、
シグマ社製造）及び７．５Ｍ　塩酸グアニジン（ｐＨ５
．８）４３ｍｌ（終濃度が４Ｍ　）を加えた。そして、
１０，０００ｒｐｍ　で２０分間遠心分離して上清液９
０ｍｌを得た。

【００３２】さらに以下のようにアフィニティークロマ
トグラフィーを行って、ヒアルロン酸結合性蛋白を得た
。

【００３３】上記の上清液９０ｍｌに、予め作成したヒ
アルロン酸結合球状セルロース（作成方法は後述）１０
０ｍｌを加えて混合し、該混合物を、４℃に保持した０
．５Ｍ　酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ５．８）を外液とし
、セルロースチューブを使用して、約２０時間透析し、
ゲルを得た。

【００３４】ゲルを内径３ｃｍ、高さ２０ｃｍのカラム
に充填した後、０．４Ｍ　塩酸グアニジンを含む０．０
５Ｍ　酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ５．８）で洗浄し、３
Ｍ　ＮａＣｌを含む０．５Ｍ　酢酸ナトリウム溶液（ｐ
Ｈ５．８）で、不要な蛋白を溶出した後、４Ｍ　塩酸グ
アニジン溶液でヒアルロン酸結合性蛋白を溶出した。該
ヒアルロン酸結合性蛋白を脱イオン水を外液とし、セル
ロースチューブを用いて４℃で２４時間透析した後、凍
結乾燥してヒアルロン酸結合性蛋白を得た。

【００３５】ビチオン化ヒアルロン酸結合性蛋白の製造
次いで、ヒアルロン酸結合性蛋白に、以下の操作によっ
てビオチンを結合させ、ビオチン化ヒアルロン酸結合性
蛋白を製造した。

【００３６】ヒアルロン酸１１２ｍｇとヒアルロン酸結
合性蛋白１１２ｍｇとを、１２ｍｌの０．０５Ｍ　酸緩
衝液（ｐＨ７．０）に溶解し、４℃で１５時間保存した
。次いで０．１Ｍ　炭酸水素ナトリウム溶液で１０倍に
希釈して１２０ｍｌの溶液とした。この溶液に２０ｍｇ
／ｍｌ　ビオチン−Ｎ−ヒドロキシサクシンイミド溶液
（溶媒はジメチルスルホキシドを用いた）５ｍｌを加え
て、室温で４時間保存した。この溶液を、０．０２Ｍ　
リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を外液とし、セルロースチ
ューブを使用して４℃で２４時間透析を行った。

【００３７】次いで、塩酸グアニジン１０５ｍｌを加え
、終濃度４Ｍ　塩酸グアニジン溶液とした。ヒアルロン
酸結合球状セルロースを該溶液に加えて混合し、混合液
を、０．５Ｍ　酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ５．８）を外
液とし、セルロースチューブを用いて透析した。該チュ
ーブ内ゲルをカラムに詰め、０．４Ｍ　塩酸グアニジン
含有０．５Ｍ　酢酸ナトリウム（ｐＨ５．８）緩衝液と
、３Ｍ　ＮａＣｌ含有０．５Ｍ　酢酸ナトリウム（ｐＨ
５．８）緩衝液とで順次洗浄した後、４Ｍ　塩酸グアニ
ジン溶液で溶出した。溶出液を減圧下に、蛋白濃度が１
ｍｇ／ｍｌ　になるまで濃縮し、次いで１ｍｌに小分け
して凍結保存し、ビオチン化ヒアルロン酸結合性蛋白を
得た。

【００３８】ヒアルロン酸結合球状セルロースの製造ヒ
アルロン酸ナトリウム（分子量：５０，０００）１０ｇ
を蒸留水に溶かし、１Ｎ　ＨＣｌでｐＨ４．５に調整し
、全量を２００ｍｌとした。この溶液に蒸留水で洗浄し
たアミノ−セルロファイン（商品名、生化学工業（株）
販売）１００ｇ（ｗｅｔ）　を加えて混合し、この懸濁
液にＷＳＣ（ウォーター　　ソルブル　　カルボジイミ
ド（Ｗａｔｅｒ　Ｓｏｌｂｌｅ　Ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉ
ｄｏ），　（株）同仁化学研究所製造）８ｇを加えて溶
かし、減圧脱気した。この懸濁液をゆっくり撹拌しなが
ら、４℃で２０時間保存した。このとき希塩酸でｐＨ４
．５に調整した。懸濁液はろ過し、ゲルを蒸留水で洗浄
した後、１Ｍ　酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）２００ｍｌに
加えて、再度懸濁し、ＷＳＣ８ｇを加え溶解し、脱気後
、４℃に２０時間保存した。このとき０．５Ｍ　酢酸で
ｐＨ４．５に調整した。懸濁液をろ過し、ゲルを蒸留水
、３Ｍ　ＮａＣｌ溶液、４Ｍ　塩酸グアニジン溶液で順
次洗浄し、最後に蒸留水で洗浄した後、使用するまで４
℃で保存した。このようにして製造したヒアルロン酸結
合セルロファインゲルは、湿重量１ｇ当たり４．２５ｍ
ｇのヒアルロン酸が結合していた。

【００３９】実施例１　　ヒアルロン酸の定量ＮａＣｌ
　　３６ｇ、リン酸−ナトリウム１１．６ｇ及びリン酸
二ナトリウム０．５９ｇを蒸留水４０００ｍｌに溶解し
た後、ｐＨを７．４に調整してリン酸緩衝液（以下、Ｐ
ＢＳと略）を調製した。

【００４０】軟骨のプロテオグリカンコンドロイチナー
ゼＡＢＣ処理物の溶液を、ＰＢＳで４０倍に希釈し、コ
ンドロイチナーゼＡＢＣ処理前の軟骨型プロテオグリカ
ン重量に換算して５μｇ／ｍｌ溶液を調製した。この溶
液を９６ウエルのイムノプレート（ヌンク社製）に１０
０μｌ　ずつ添加し、３７℃で３時間保存した。次いで
、この溶液を除き、ブロック体として２５％ブロックエ
ース（商品名、大日本製薬（株）製造）を含むＰＢＳを
１５０μｌ　ずつ添加し、３７℃で１時間保存した後、
洗浄液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ　２０を含むＰＢＳ）で
３回洗浄した。

【００４１】ヒアルロン酸の濃度を２５０、１２５、３
１．２、７．８、１．９、０．４９ｎｇ／ｍｌ　とした
検量線作成のためのヒアルロン酸標準液と、検体として
、３倍希釈した正常人血清５サンプル（Ａ〜Ｅ）及び１
７０倍希釈した慢性リウマチ患者の血清２サンプル（Ｒ
Ａ−１、ＲＡ−５）を用意した。希釈は１０％ブロック
・エースを含むＰＢＳ（以下、希釈液と記す）で行った
。対照は希釈液を用いた。以上の標準液、検体及び対照
をそれぞれウエルに１００μｌ　添加し、３７℃で１．
５時間保存した。

【００４２】その後上記洗浄液で５回洗浄後、希釈液で
２００倍に希釈したビオチン化ヒアルロン酸結合性蛋白
溶液（蛋白濃度５μｇ／ｍｌ）をウエルに１００μｌ　
ずつ加え、３７℃で１．５時間保存した。上記洗浄液で
５回洗浄後、ＰＢＳで８，０００倍に希釈したストレプ
トアビジン結合アルカリホスファターゼ（ＩＣＮ社製造
）溶液を１００μｌ　ずつウエルに加え、３７℃で６０
分間保存した。上記洗浄液で５回洗浄後、１ｍｇ／ｍｌ
　ｐ−ニトロフェニルホスフェート（シグマ社製造）溶
液（溶媒は０．００１％ＭｇＣｌ２を含む１Ｍ　ジエタ
ノールアミン（ｐＨ９．８）を用いた）をウエルに１０
０μｌ　ずつ加え、３７℃で３０分間保存して発色させ
た。停止液（５Ｍ　ＮａＯＨ）を５０μｌ　ずつ加え、
紫外・可視吸光度計にてＯＤ４０５−６６０ｎｍ　の差
吸光度を測定した。ヒアルロン標準液及び対照の測定結
果を表１に、検量線を図１に示す。また、検体の測定結
果と該検量線を使用して得られたヒアルロン酸の定量値
とを表２に示す。

【００４３】

【表１】

【００４４】

【表２】

【００４５】比較例 本発明のヒアルロン酸定量方法と前述の秩父法とにより
以下に説明する方法により検量線を作成し、定量感度の
比較を行った。

【００４６】軟骨のプロテオグリカンコンドロイチナー
ゼＡＢＣ処理物の溶液を、ＰＢＳで希釈し、コンドロイ
チナーゼＡＢＣ処理前の軟骨型プロテオグリカン重量に
換算して１０μｇ／ｍｌ溶液（以下、ＢＮＳＣ　　ＡＢ
Ｃ処理液と記す）を調製した。また秩父法のヒアルロン
酸結合性蛋白１０μｇ／ｍｌ溶液（以下、ＨＡＢＰ液と
記す）を調製した。それぞれの溶液を９６ウエルのイム
ノプレート（ヌンク社製造）に１００μｌ　ずつ添加し
、３７℃で３時間保存した。

【００４７】次いで、この溶液を除き、ブロック体とし
て２５％ブロックエースを含むＰＢＳを２００μｌ　ず
つ添加し、３７℃で１時間保存した後、洗浄液で３回洗
浄した。

【００４８】ヒアルロン酸濃度を、希釈液を使用して、
５００、１００、１０、１、０．１、０μｇ／ｍｌとし
たヒアルロン酸標準液を用意し、それぞれウエルに１０
０μｌ　添加して、３７℃１．５時間保存した。

【００４９】その後、洗浄液で５回洗浄後、希釈液で１
００倍に希釈したビオチン化ヒアルロン酸結合性蛋白溶
液（蛋白濃度１０μｇ／ｍｌ）をウエル１００μｌ　ず
つ加え、３７℃で１．５時間保存した。洗浄液で５回洗
浄後、４，０００倍に希釈したストレプトアビジン結合
アルカリホスファターゼ溶液を１００μｌ　ずつウエル
に加え、３７℃で１時間保存した。洗浄液で５回洗浄後
、１ｍｇ／ｍｌ　ｐ−ニトロフェニルホスフェート溶液
をウエルに１００μｌ　ずつ加え、３７℃で１時間保存
して発色させた。停止液（５Ｍ　ＮａＯＨ）を５０μｌ
　ずつ加え、紫外・可視吸光度計にてＯＤ４０５−６６
０ｎｍ　の差吸光度を測定した。本発明の定量方法すな
わちＢＮＳＣＡＢＣ処理液を添加したウエルについての
測定結果と、秩父法すなわちＨＡＢＰ液を添加したウエ
ルについての測定結果とから作成した検量線を図２に示
す。

【００５０】図２から、ヒアルロン酸濃度が、０．１〜
１０μｇ／ｍｌの範囲において、秩父法ではヒアルロン
酸定量は不可能であるのに対し、本発明の方法は０．５
ｎｇ／ｍｌ　オーダーの定量が可能であり、測定感度の
点で優れていることが理解されよう。

【００５１】

【発明の効果】本発明のヒアルロン酸の定量キット及び
定量方法は、軟骨のプロテオグリカンコンドロイチナー
ゼＡＢＣ処理物を使用するため、検体ヒアルロン酸を効
率よく結合させることができ、５００ｐｇ／ｍｌ　のヒ
アルロン酸定量が可能となった。

【図面の簡単な説明】

【図１】ヒアルロン酸の検量線の例である。

【図２】ヒアルロン酸の検量線である。

【符号の説明】

黒丸…本発明の方法 白丸…秩父法

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　軟骨のプロテオグリカンコンドロイチ
   ナーゼＡＢＣ処理物と、標識されたヒアルロン酸結合性
   蛋白とからなるヒアルロン酸定量用キット。
2. 【請求項２】　　固相に固着された軟骨のプロテオグリ
   カンコンドロイチナーゼＡＢＣ処理物に、検体ヒアルロ
   ン酸を含む試料を添加して、該処理物と検体ヒアルロン
   酸とを結合させ、さらに予め標識物質で標識されたヒア
   ルロン酸結合性蛋白を添加して、検体ヒアルロン酸を、
   該処理物と標識されたヒアルロン酸結合性蛋白とで挟み
   、サンドイッチ状結合体を形成させ、サンドイッチ状結
   合体の標識物質により検体ヒアルロン酸を定量する方法
   。