JPH04228098A - コバラミンの検出方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、試料中のビタミンＢ１
２などのコバラミンレベルを検出するための方法および
試薬、とりわけコバラミンを検出するための酵素アッセ
イに関する。

【０００２】

【従来の技術および発明が解決しようとする課題】コバ
ラミンは、下記式で示される一般構造を有する。

【化１】

【０００３】コバラミンは、文献中では幾つかの場合に
ビタミンＢ１２と総称されているが、上記構造でＲ置換
基が互いに異なる幾つかの異なる種類のコバラミンが実
際に存在する。すなわち、シアノコバラミン（Ｒ＝シア
ノ）、ヒドロキシコバラミン（Ｒ＝ヒドロキシ）、アク
アコバラミン（Ｒ＝Ｈ２Ｏ）、ニトロコバラミン（Ｒ＝
ＮＯ２）、５’−デオキシアデノシルコバラミン（Ｒ＝
５’−デオキシアデノシル）、およびメチルコバラミン
（Ｒ＝メチル）などである。これら各コバラミンは、一
般にビタミンＢ１２であると考えられる：シアノコバラ
ミン（ＣＮ−Ｃｂ１；ビタミンＢ１２）、ヒドロキシコ
バラミン（ＯＨ−Ｃｂ１；ビタミンＢ１２ａ）、アクア
コバラミン（Ａｑ−Ｃｂ１；ビタミンＢ１２ｂ）、ニト
ロコバラミン（ＮＯ−Ｃｂ１；ビタミンＢ１２ｃ）、５
’−デオキシアデノシルコバラミン（ＡｄｏＣｂ１；補
酵素Ｂ１２）、メチルコバラミン（ＭｅＣｂ１；メチル
Ｂ１２）。これら種々のコバラミンは、同様の代謝活性
を有する。しかしながら、シアノコバラミンが他に比べ
て一層安定である。

【０００４】コバラミンは多くの代謝機能に関与してお
り、正常な成育および栄養、造血、すべての上皮細胞の
産生、およびすべての神経系のミエリンの維持に必須で
ある。ビタミンＢ１２が欠乏すると、不充分な造血、不
充分なミエリン合成、消化管上皮細胞の不充分な維持、
および全身性貧血が示される。しかしながら、これら兆
候のうち不充分なミエリン合成以外は、その発症原因に
関係なく多くの巨大赤芽球性貧血に共通して認められる
ものである。

【０００５】そのような貧血の原因を正確に指摘するた
めには、ビタミンＢ１２の欠乏を試験する必要がある。 ビタミンＢ１２のための種々の異なるアッセイがある。 すなわち、比色法、分光分析法、蛍光測光法、および放
射性同位元素法などである。最も一般的な方法では、ビ
タミンＢ１２分子のコリン核中のコバルトの代わりにコ
バルト５７放射性同位元素が用いられる。この放射性標
識した分子およびＢ１２内因子をＢ１２含有試料に加え
、放射性標識したＢ１２と試料中のＢ１２とをＢ１２内
因子上の結合部位に対して競合させる。Ｂ１２内因子は
固相に結合させてあるので、固相上または試料中の放射
能の量は最初の試料に含まれるＢ１２の量に比例する。 現在用いられているラジオアッセイは、放射性物質の取
り扱い、貯蔵、および廃棄を含んでいるという点で明ら
かな欠点を有する。さらに、これら方法は装置の組合せ
および約２時間のアッセイ時間を必要とする。

【０００６】酵素競合結合アッセイがビタミンＢ１２の
ために提唱されている［ベーチャス（Ｂａｃｈａｓ）、
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｃｓ、ｖｏｌ．４、Ｎｏ．１、４２
頁以下（１９８６）］。しかしながら、ヒト血清中のビ
タミンＢ１２の正常範囲は約２００〜９００ｐｇ／ｍｌ
であるのに、このアッセイの感度は１３５５ｐｇ／ｍｌ
と報告されている。そのようなアッセイではヒト血清中
の正常範囲にあるビタミンＢ１２でさえ検出できないの
で、ビタミンＢ１２の欠乏を試験するのに用いることが
できないことは明らかである。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明は、試料中のコバ
ラミンを検出するための方法、キットおよび試薬に関す
る。本発明の方法は、少なくとも３Åの長さを有する第
一連結基によりアフィニティー精製内因子に結合させた
固相（該固相は、表面第一級アミンまたは表面カルボキ
シル基を有するラテックスまたはラテックス様物質であ
る）からなる第一複合体を試料中に導入することを含む
。ついで、該第一複合体および試料からの結合コバラミ
ンを、検出可能な酵素に結合させたコバラミンからなる
第二複合体に暴露して、第一複合体に結合した第二複合
体および未結合の第二複合体を生成させる。ついで、固
相第一複合体かまたは未結合の第二複合体のいずれかに
付随する酵素活性を検出する。少なくとも３Åの長さの
第一連結基によりアフィニティー精製内因子を固相に連
結することにより、正常範囲内または正常範囲以下の患
者試料中のコバラミンレベルを検出し得る酵素アッセイ
を行うことができる。

【０００８】本発明の他の側面において、まず固相／内
因子複合体を試料とともにインキュベートし、ついで酵
素／コバラミン複合体を加える前に血清タンパク質を該
固相から分離する。このようにインキュベーション、分
離および第二複合体の添加を順番に行うことにより、ア
ッセイ時間を１時間未満に保持しながらアッセイ感度を
大きく向上させることができる。

【０００９】本発明はまた、上記第一複合体および第二
複合体を有するキットをも包含する。本発明はまた、内
因子を検出可能な酵素に結合し、コバラミンを固相に結
合したアッセイ法およびキットをも包含する。

【００１０】以下、本発明をさらに詳しく説明する。上
記のように、本発明は、試料中のビタミンＢ１２などの
コバラミンを測定するための方法、キットおよび試薬を
包含し、これら方法、キットおよび試薬は、少なくとも
３Åの長さの連結基を介して内因子とラテックスまたは
ラテックス様固相を結合させた複合体を包含する。この
連結基の使用は、本発明を首尾よく行う上で重要である
。内因子を固相表面から少なくとも３Åのスペースをあ
けて空間配置することにより、内因子と固相との間で示
される相互の誘引力が充分に抑えられる。ラテックスま
たはラテックス様固相（本発明で使用する物質）を使用
する場合は、内因子がコバラミンを捕捉するための充分
な空間を有していることが重要である。内因子が固相の
アミン基に直接結合しておれば、タンパク質鎖は固相表
面と絡み合うかまたは少なくとも固相表面によって抑制
され、そのため試料中に存在するコバラミンを捕捉する
ための空間が不充分となる。固相表面から少なくとも３
Åの空間をあけて内因子を配置することにより、Ｂ１２
の酵素アッセイの感度は放射性同位元素アッセイに比べ
て著しく向上する。ここで「感度の向上」または「高感
度」とは、一層低い濃度のコバラミンを検出することが
できることを意味する。本発明のアッセイによれば、１
５０ｐｇ／ｍｌ未満、多くの場合には１００ｐｇ／ｍｌ
未満の濃度のコバラミンを検出することができる。事実
、本発明のアッセイの検出限界は、約４０ｐｇ／ｍｌで
あることがわかっている。

【００１１】連結基の厳密な性質は、それが少なくとも
３Åの長さ、好ましくは５Åの長さを有すること以外は
重要であるとは思われない。クリストファー（Ｃｈｒｉ
ｓｔｏｐｈｅｒ）ビエニアルツ（Ｂｉｅｎｉａｒｚ）ら
の米国特許出願第１１４，９３０号（１９８７年１０月
３０日出願）などに記載されたヘテロ２官能性連結基を
用いることができる。他の連結基も有利に用いることが
できる。

【００１２】下記実施例で使用する内因子は、アフィニ
ティークロマトグラフィーによりブタの腸から単離した
ものである。このことは重要である。というのは、コバ
ラミンに結合しないタンパク質（アッセイの性能を下げ
る）が排除されるからである。加えて、精製内因子は低
含量のＲタンパク質を有することが重要である。Ｒタン
パク質はコバラミンを含む多くのポルフィリン環含有化
合物と結合するので、コバラミンのアッセイに使用する
精製内因子中のＲタンパク質の存在は減少させることが
望ましい。内因子の他の採取源としては、マウス、ウシ
、または他の哺乳動物が挙げられる。

【００１３】本発明に使用するのに適当なラテックスま
たはラテックス様固相としては、シート、プレート、ビ
ーズ、繊維、フィルター、織物などが挙げられる。好ま
しい固相は、第一級アミン（たとえば、ポリメチルメタ
クリレートなど）が結合したラテックスまたはラテック
ス様微細粒子である。

【００１４】好ましくは、固相は、たとえばセラジン（
Ｓｅｒａｄｙｎ）（インディアナポリス、ＩＮ）から得
られるように、表面第一級アミンかまたは表面カルボキ
シル基のいずれかを有する小さな（０．１〜１．０μｍ
）微細粒子の形態である。アミン微細粒子はカップリン
グ手順に直接用いられるが、カルボキシル微細粒子は内
因子にカップリングさせる前にアミンに変換させる。

【００１５】実験の示唆するところによれば、固相表面
上の内因子は３０〜４００Å２／内因子分子、より好ま
しくは２００〜４００Å２／内因子分子の「パーキング
領域」を有している。「パーキング領域」とは、固相に
結合した内因子１分子当たりの固相の表面積である。パ
ーキング領域を制御することにより、連結基（固相上の
反応性基と反応する）を介して固相に結合させた場合に
、内因子分子は互いに立体妨害し合わないと思われる。 内因子の立体妨害は、その立体配座に影響を与え、コバ
ラミンと結合する能力を損なうと思われる。

【００１６】コバラミン／酵素複合体も該酵素と該コバ
ラミンとの間に少なくとも３Å、好ましくは約２０Åの
長さの連結基を有していることが好ましい。好ましくは
、実施例１に記載のホモ２官能性連結基を用いる。しか
しながら、実施例１、７および８に記載のヘテロ２官能
性基を含む他の連結基を用いることもできる。

【００１７】コバラミン／酵素複合体に用いる検出可能
な酵素としては、酵素アッセイに通常用いられる種々の
酵素（たとえばアルカリホスファターゼ、西洋ワサビペ
ルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼなど）のいずれ
であってもよい。アルカリホスファターゼはよく特徴付
けがされており、多くのアルカリホスファターゼ基質は
長期間貯蔵した場合に安定であるので好ましい。

【００１８】酵素／コバラミン複合体に用いるのに好ま
しいコバラミンは、シアノコバラミン（ＣＮ−Ｃｂ１）
そのものである。しかしながら、ＣＮ−Ｃｂ１を酵素に
結合させるには、酸加水分解して環Ｃ上の１３位にてカ
ルボキシレート（化合物１、実施例１）とし、ついで、
これを１３位においてアミンに変換する（実施例１、工
程ｃ）。ついで、このアミンを用いて該酵素をＢ１２分
子に結合させる。この複合体には、内因子に結合する限
り他のコバラミン、たとえばビタミンＢ１２ａ、ビタミ
ンＢ１２ｂ、ビタミンＢ１２ｃ、補酵素Ｂ１２およびメ
チルＢ１２なども用いることができる。他のコバラミン
誘導体（特に環Ｃ上の１３位における誘導体）も、内因
子に結合することができる限り用いることができ、本発
明の範囲に含まれる。

【００１９】本発明のアッセイを行うに際しては、内因
子／固相複合体を試料中に導入して試料中のコバラミン
を結合させる。残留する試料を固相から洗浄により除い
た後、既知量のコバラミン／酵素複合体溶液を固相上を
通過させて固相上の過剰の内因子と結合させる。固相に
付随した酵素活性かまたは過剰のコバラミン／酵素複合
体中に残留する酵素活性のいずれかをアッセイし、試料
中に最初に含まれていたコバラミンの量を決定すること
ができる。酵素活性のアッセイは、酵素の基質、たとえ
ば酵素がアルカリホスファターゼである場合は４−メチ
ルウンベリフェロンホスフェートなどを用いて行う。

【００２０】別法として、試料、ラテックスまたはラテ
ックス様固相内因子および酵素複合体を一緒にインキュ
ベートすることができる。ついで、過剰の試料および酵
素複合体を洗浄して固相支持体から除き、指示薬基質を
加える。

【００２１】本発明のアッセイは、上記適当な試薬を備
えたキットを用いて行うことができる。そのようなキッ
トには、少なくとも３Åの長さの連結基によりラテック
スまたはラテックス様固相にアフィニティー精製内因子
を結合させた第一複合体が含まれる。好ましくは少なく
とも３Åの長さの連結基により連結させたコバラミンと
検出可能な酵素からなる第二複合体も上記キットに含ま
れる。このキットにはまた、上記複合体をアッセイ法に
使用する場合に、該第二複合体に結合した該第一複合体
から未結合第一複合体を洗浄するための洗浄溶液も含ま
れる。このキットにはまた、酵素活性を検出するための
酵素基質も含まれる。

【００２２】本発明のアッセイ態様は、コバラミンを固
相に結合させ、アフィニティー精製内因子を酵素に結合
させることにより「逆にする」ことができる。この態様
においては、内因子／酵素複合体が、該酵素と該内因子
との間に少なくとも３Åの長さの連結基を有する。コバ
ラミンのラテックスまたはラテックス様固相への連結は
、コバラミンのＣ環上の基により、コバラミンと固相と
が少なくとも３Åの長さで離れて配置されるように行う
。 このように空間をあけることは、リンカー（使用するＢ
１２誘導体により変わってよい）の使用により行うこと
ができる。この逆アッセイにおいては、酵素／内因子複
合体を試料とともにインキュベートした後、固相／Ｂ１
２複合体を試料に加えることによりアッセイを行う。つ
いで、固相を溶液から除き、酵素活性についてアッセイ
する。

【００２３】

【実施例】つぎに、実施例に基づいて本発明をさらに詳
しく説明するが、本発明はこれらに限られるものではな
い。実施例１〜８ではＢ１２アッセイを記載する。実施
例９では実施例１〜６で行ったアッセイの結果を記載す
る。実施例１０では感度とパーキング領域との関係を示
す。

【００２４】実施例１（２３原子リンカーを有する酵素
／Ｂ１２複合体、および１８原子リンカーを有する固相
／内因子複合体を用いたＢ１２アッセイ）Ａ．Ｂ１２誘
導体の調製： （ｉ）一般的手順 本手順では、シアノコバラミンを０．８Ｍリン酸で酸加
水分解してカルボン酸の混合物とし、そのうちモノカル
ボン酸を単離した。ついで、この酸を１，６−ジアミノ
ヘキサンにカップリングしてＢ１２アミンを得た。

【００２５】（ｉｉ）酸加水分解 ビタミンＢ１２（２．２ｇ）を０．８Ｍリン酸（３００
ｍｌ）中に入れ、窒素雰囲気下、暗所にて７０°Ｃで６
時間加熱した。このＢ１２反応混合物をアンバーライト
ＸＡＤ−２で脱塩した。この洗浄樹脂を４×６０ｃｍカ
ラム中に充填した。このカラムに反応混合物を適用し、
未結合誘導体を溶出した。結合Ｂ１２酸をメタノールで
溶離し、回転蒸発により濃縮した。

【００２６】（ｉｉｉ）精製 個々のＢ１２酸をＤＥ−５２セルロースカラム上で分離
した（ＮａＯＨ、ＨＣｌ、ＮａＯＡｃで洗浄し、ついで
水でｐＨ５．０に平衡化した）。４×７５ｃｍのカラム
を調製し、試料を加え、ゆっくりと溶出した。２日後、
未反応コリノイド（ｃｏｒｉｎｏｉｄ）を含む単一の赤
色バンドを蒸留水で除いた。Ｂ１２モノ酸は、０．０５
％酢酸で溶離した。１．５日で３つのピークが溶離した
。各バンドを回収し、回転蒸発により濃縮した。赤色の
物質を含むフラクションのみをプールした（オレンジ−
黄色のフラクションは捨てた）。これら赤色のフラクシ
ョンをＢ１２反応性についてラジオアッセイにより試験
した。Ｂ１２モノ酸の特徴付けを質量分析、Ｃ１３ＮＭ
Ｒ、およびＨＰＬＣにより行った。１３位（すなわち、
環Ｃ上の１３位）がカルボキシル化されたＢ１２（化合
物１）が得られた。

【化２】

【００２７】（ｉｖ）カルボキシルのアミンへの変換化
合物１（６３ｍｇ；４５μＭ）および１，６−ヘキシル
ジアミン（０．２５５４ｇ；２．２ｍＭ）を蒸留水（１
３ｍｌ）に溶解した。この溶液のｐＨを１Ｎ　ＨＣｌで
６．０に調節した。１−エチル−３−（３−ジメチルア
ミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＡＣ）（８８．８
ｍｇ；４６３μＭ）を加え、この溶液を窒素雰囲気下で
一夜撹拌した［テツオトラヤ（Ｔｅｔｓｕｏ　Ｔｏｒａ
ｙａ）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５５：３５２０
〜３５２５（１９８０）］。反応液を回転蒸発により濃
縮し、ＨＰＬＣにより精製した［テツオトラヤ、Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ．，１８：４１７〜４２６（１９７９）］。流
速４ｍｌ／分（８０分後、流速を６ｍｌ／分に上げた）
の２０／８０（メタノール／１％酢酸）溶媒系を用い、
Ｂ１２をＣ−１８（マグナム９）カラム上で精製した。 このアミンを質量分析およびＨＰＬＣにより特徴付けた
。上記化学的手順によりＢ１２アミン（化合物２）が得
られ、これを実施例１工程Ｆの酵素複合体を製造するの
に用いた。

【化３】

【００２８】Ｂ．ブタの腸からの内因子の調製：１．５
〜２．５ｋｇのブタ十二指腸を洗浄し、小片にカッティ
ングした。これら小片を混練し、過塩素酸でｐＨ１．０
の酸性にし、１時間混合した。遠心分離により粗い固体
を除去し、上澄み液をＫＯＨ（５Ｎ）およびＫ２ＨＰＯ
４で中和した。４°Ｃで一夜貯蔵すると沈澱が生成した
。上澄み液の上部の９０％をデカントして除き、ＳｉＯ
２を加え、溶液を遠心分離にかけた。清澄化した上澄み
液をセライトで濾過して脂質を除いた。透明な濾液中の
内因子を、アガロースにライゲートしたＢ１２誘導体を
有するカラム上のコビナミド（ｃｏｂｉｎａｍｉｄｅ）
の存在下、アフィニティークロマトグラフィーにより精
製した。

【００２９】カラムを４Ｍ　ＮａＣｌ、グルシン（ｇｌ
ｕｃｉｎｅ）／ナトリウムショ糖および５０ｍＭリン酸
カリウムで順番に洗浄することにより、非特異的結合タ
ンパク質を除去した。３．８Ｍグアニジン／ＨＣｌで内
因子を溶出した。Ｒタンパク質（コバラミンを含む多く
のポルフィリン環含有化合物、すなわちコビナミドと結
合する）の存在について、所望のフラクション中の内因
子を試験した。内因子を試験して（Ｂ１２コバルト５７
を用いたラジオアッセイにより）コビナミドとの交差反
応性が０．００４％未満であることがわかったら、脱イ
オン水を数回変えながら内因子を充分に透析した。この
ようにしてアフィニティー精製した第一フラクションは
、少なくとも９５％がコバラミンと結合するタンパク質
を含有していることがわかり、ＮＬＴ２０００ｎｇＢ１
２結合／ｍｌ（２０００単位）が得られた。官能性純度
が約９５％未満のものは、感度が損なわれていることが
わかった。

【００３０】Ｃ．２３原子リンカーの調製：（ｉ）化合
物３の合成 米国特許出願第１１４，９３０号明細書（参照のため本
明細書に引用する）に記載された方法に従って、延長さ
れた長さのヘテロ２官能性リンカーを合成した。ヨシタ
ケ（Ｙｏｓｈｉｔａｋｅ）の方法［Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ
．，１０１：３９５〜３９９（１９７９）］により、ト
ランス−４−（アミノメチル）シクロヘキサンカルボン
酸（アルドリッチ・ケミカル）をＮ−（４−カルボキシ
シクロヘキシルメチル）マレイミドに変換した。ついで
、この物質（１００ｍｇ）を乾燥ジメチルホルムアミド
（ＤＭＦ）（１．０ｍｌ）に溶解し、６−アミノカプロ
ン酸（３９．２ｍｇ、１．０当量）を加え、得られた反
応混合物を窒素雰囲気下、室温にて一夜撹拌した。翌朝
、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣＩ）（６７
．８ｍｇ；１．１当量）を加え、この反応混合物をさら
に６時間撹拌した。沈澱したジシクロヘキシル尿素（Ｄ
ＣＵ）を濾去し、得られたＤＭＦ溶液を減圧蒸発させて
粘着性の固体を得、これをシリカゲル上のフラッシュク
ロマトグラフィー（メタノール／クロロホルム）により
精製して化合物３（７１ｍｇ）を白色固体として得た（
全収率５３％）。

【化４】

【００３１】（ｉｉ）２３原子のヘテロ２官能性リンカ
ーの調製 化合物３（１００ｍｇ；上記のようにして合成）を乾燥
ＤＭＦ（１．０ｍｌ）に溶解し、６−アミノカプロン酸
（２９．３ｍｇ；１．０当量）を加え、得られた混合物
を窒素雰囲気下、室温にて一夜撹拌した。翌朝、ＤＣＣ
Ｉ（５０．７ｍｇ；１．１当量）を加え、この反応混合
物をさらに６時間撹拌した。固体の沈澱（ＤＣＵ）を濾
去し、得られたＤＭＦ溶液を減圧蒸発させて粘着固体を
得、これをシリカゲル上のフラッシュクロマトグラフィ
ー（１０％メタノール／クロロホルム）により精製して
、化合物４（６０ｍｇ）、すなわち長さが約２９．１Å
のヘテロ２官能性リンカーを白色固体として得た（全収
率４８％）。

【化５】

【００３２】Ｄ．２３原子リンカーを用いた内因子のア
ミン微細粒子へのカップリング （ｉ）微細粒子の洗浄 バイオラドバイオ−レックスＭＳＸ５０１（Ｄ）樹脂（
１８９）を脱イオン水（２Ｌ）で洗浄した。この樹脂に
アミノ微細粒子（セラジン、平均直径０．４８５μｍ）
を加え、脱イオン水と混合し、混合物を室温にて１時間
回転させた。樹脂を沈澱させ、微細粒子をデカントした
。脱イオン水（１．０ｍｌ／０．５ｇ樹脂）を樹脂に加
え、樹脂を混合し、沈澱させた。微細粒子をもう一度樹
脂からデカントした。水濯ぎ／混合／デカントの手順を
２回繰り返した。得られた微細粒子調製物に脱イオン水
を加えて１２〜１７％固体に調節した。

【００３３】（ｉｉ）微細粒子／内因子複合体の調製洗
浄した微細粒子と０．１％ＤＴＡＢを等容量で室温にて
１５分間混合した。微細粒子を回収し、Ｈ２Ｏ中に再懸
濁して７．５％固体を得た。微細粒子（０．６％）、内
因子（７００μ）および化合物４（８０μＭ）を１７．
５ｍＭ　ＴＥＡ緩衝液（ｐＨ８．０）中で全容量１．０
ｍｌで混合した。この溶液を暗所、室温にて２時間混合
した。インキュベーション後、微細粒子をペレット化し
、穏やかな界面活性剤／５０ｍＭトリス緩衝液中で数回
洗浄し、ホモジナイズして均一な粒径分布を確実にし、
ついで所望の濃度に希釈した。

【００３４】Ｅ．１８原子ホモ２官能性リンカーの調製
： （ｉ）４原子ホモ２官能性リンカーの合成Ｎ−ヒドロキ
シスクシンイミド（８．１６ｇ）をトリエチルアミン（
７．１７ｇ）とともに乾燥ジメチルホルムアミド（ＤＭ
Ｆ、２００ｍｌ）中に溶解した。この撹拌反応混合物に
窒素雰囲気下、添加漏斗でスクシニルクロリド（５．０
ｇ）をゆっくりと加えた。この混合物を室温で８時間撹
拌した。沈殿を濾去し、高真空乾燥して粗製の生成物を
得、ついで、これをクロロホルム（５０ｍｌ）でトリチ
ュレートし、高真空下でアルゴン乾燥させて純粋な白色
粉末（化合物５、長さが約２０．３Åのホモ２官能性リ
ンカー；８．５２ｇ、８５％）を得た。

【化６】

【００３５】（ｉｉ）１８原子ホモ２官能性リンカーの
合成化合物５（５．０ｇ）を乾燥ＤＭＦ（１５０ｍｌ）
に溶解し、６−アミノカプロン酸（４．２０ｇ）を加え
、この反応混合物を窒素雰囲気下、室温にて３時間撹拌
した。ついで、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣ
ＣＩ、６．９３ｇ）を加え、一夜混合した。翌朝、ジシ
クロヘキシル尿素（ＤＣＵ）沈殿を濾去し、得られたＤ
ＭＦ溶液を減圧下で蒸発させて粘性の固体を得た。エー
テルでトリチュレートした後、高真空下で乾燥させて純
粋な生成物（化合物６、長さが約３８Åのホモ２官能性
リンカー；７．９４ｇ、９２％）を得た。

【化７】

【００３６】Ｆ．１８原子ホモ２官能性リンカーを用い
たＢ１２アミン誘導体のアルカリホスファターゼへの結
合： アルカリホスファターゼ（ベーリンガー・マンハイム；
１０ｍｇ／ｍｌ）を０．１ｍＭ塩化亜鉛を含有するリン
酸カリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．４）中に透析し
た。

【００３７】Ｂ１２アミン（化合物２；０．１７３ｍｌ
、ＤＭＦ／ＤＭＳＯ（５０：５０、ｖ／ｖ）中に０．８
２ｍＭ）、１８原子ホモ２官能性試薬（化合物６；０．
１４２ｍｌ、ＤＭＦ／ＤＭＳＯ（５０：５０、ｖ／ｖ）
中に１．８８ｍＭ）およびＤＭＦ／ＤＭＳＯ（５０：５
０）（０．０７４９ｍｌ）をガラスバイアルに入れ、室
温で３０分間反応させた。このＢ１２溶液（１．０ｍｌ
）を上記透析アルカリホスファターゼ（１．０ｍｌ）に
加え、穏やかに混合し、４℃で１６〜２４時間放置した
。この混合物を、１．０ｍＭ塩化マグネシウムおよび１
．０ｍＭ塩化亜鉛を含有する５０ｍＭトリス（ｐＨ７．
４）（トリス／Ｍｇ／Ｚｎ）を用い、セファデックスＧ
５０−１００（１．２×４４ｃｍ）上で分離した。適当
なフラクションをプールし、トリス／Ｍｇ／Ｚｎ（１０
００ｍｌ）に対して透析して１８原子リンカーにより結
合したＢ１２／アルカリホスファターゼ複合体を得た。

【００３８】Ｇ．アッセイ： 工程Ｆの酵素／Ｂ１２複合体および工程Ｄの固相／内因
子複合体を用い、完全に自動化した機械（アボットＩＭ
ｘアナライザー）上で酵素結合アッセイを行った。（ｉ
）標準 図１の標準曲線を作成するのに使用した溶液は、２％Ｈ
ＳＡ、０．１５ＮＮａＣｌ、および０．１％ＮａＮ３を
含有するホウ酸ナトリウム（１０ｍＭ、ｐＨ７．５）中
にＵＳＰシアノコバラミン標準を希釈することにより行
った。下記希釈液を調製した：０、１００、２００、４
００、１０００、および２０００ｐｇ／ｍｌ標準。

【００３９】（ｉｉ）酵素／Ｂ１２複合体溶液工程Ｆの
酵素／Ｂ１２複合体を、複合体希釈液である１％ＢＳＡ
、１００ｍＭＮａＣｌ、１．０ｍＭ　ＭｇＣｌ２、０．
１ｍＭ　ＺｎＣｌ、および０．１％ＮａＮ３を含有する
トリス（５０ｍＭ、ｐＨ７．４）中に１：２００に希釈
した。（ｉｉｉ）内因子／微細粒子複合体溶液工程Ｄの
固相／内因子複合体を粒子希釈液である１％ＢＳＡ、０
．４Ｍショ糖、０．１％ＮａＮ３、０．０１％ツイーン
２０を含有するホウ酸塩（０．０５Ｍ、ｐＨ７．２５）
中に１：１０００に希釈した。

【００４０】（ｉｖ）アルカリホスファターゼ基質指示
薬蛍光指示試薬として、１ｍＭ塩化マグネシウム、４ｍ
Ｍテトラミソール、１．２ｍＭ　４−メチルウンベリフ
ェロンホスフェート（ＭＵＰ）および０．１％アジ化ナ
トリウムを含有する１００ｍＭ　２−アミノ−２−メチ
ル−１−プロパノール（ＡＭＰ）（ｐＨ１０．３）を調
製した。ＭＵＰをアルカリホスファターゼで加水分解し
、無機リン酸および４−メチルウンベリフェロン（ＭＵ
）（蛍光を発する、励起および放出はそれぞれ３６２ｎ
ｍおよび４４８ｎｍ）を生成させた。ＭＵの経時的な生
成は、ＭＵＰを反応混合物に添加後直ちにＭＵの生成を
経時的に測定し、Ｂ／ＢＯ比で読み取って図１に示した
。

【００４１】（ｖ）アッセイプロトコールおよび分離法
所定量の標準または試料を、ＮａＯＨ（０．４Ｎ）、コ
ビナミド（２５０ｎｇ／ｍｌ）、ＫＣＮ（０．００１％
）およびチオール試薬（たとえば、ｘ−モノチオグリセ
ロール、β−メルカプトエタノール、ジチオスレイトー
ルなど）と３４℃にて８分間混合する。この処理により
、内因性結合タンパク質から血清Ｂ１２が解離され、す
べての形態のビタミンＢ１２がシアノコバラミンに変換
される。他の試料処理法としては、（１）チオール試薬
、ＨＳＡ（０．１〜０．５％）およびＫＣＮ（０．００
１％）を含有する緩衝液中に希釈した試料を沸騰させる
こと、または（２）試料に過塩素酸（６５％）を加えて
血清タンパク質を沈殿させることが挙げられる。ついで
、試料を遠心分離にかけ、透明な上澄み液をＢ１２含量
についてさらにアッセイする。

【００４２】上記変性溶液を微細粒子／内因子複合体溶
液で中和し、１３分間インキュベートした。ついで、試
料／微細粒子調製をフィルター表面（アボット・ラボラ
トリーズ（ノースシカゴ、イリノイ）により販売されて
いるＩＭｘ使い捨て反応セル）上に沈積させて、遊離Ｂ
１２から微細粒子結合体を分離した。５０ｍＭトリス（
ｐＨ７．４）（洗浄溶液）で洗浄した後、フィルター表
面にＢ１２／アルカリホスファターゼ複合体溶液（５０
μｌ）を加えて遊離の内因子部位に結合させた。フィル
ターを洗浄し、アルカリホスファターゼ基質試薬を加え
た。ＩＭｘアナライザーで基質の蛍光生成物への変換速
度を読み取り、標準曲線値に基づいて試料のＢ１２濃度
を計算した。

【００４３】その結果得られたアッセイは、０標準の複
数試行の標準偏差（ＳＤ）を２倍し、この２ＳＤを標準
曲線から試料として読み取ることにより計算したところ
、６０ｐｇ／ｍｌ未満の感度を示した。（ｖｉ）アボッ
トＢ１２　ＩＭｘアッセイとベクトンディキンソンＢ１
２　ＲＩＡとの患者相関患者血清試料（ｎ＝７６）を、
本発明の酵素アッセイを用いたアボットＩＭｘアナライ
ザーおよび市販のＢＩＯＲＡＤ、クオンタフェース（Ｑ
ｕａｎｔａｐｈａｓｅ）ＴＭラジオアッセイで試験した
。図２の相関プロットを計算した。傾きは１．１０であ
り、相関係数（Ｒ）は０．９９であった。

【００４４】実施例２（１８原子リンカーを有する酵素
／Ｂ１２複合体、およびリンカーを有しない固相／内因
子複合体を用いたＢ１２アッセイ） Ａ．アッセイ： 実施例１工程Ｄ（ｉｉ）に記載した複合体の代わりにリ
ンカー基を有しない内因子／微細粒子複合体を用いた他
は、実施例１に記載の方法および試薬を用いてアッセイ
を行った。リンカー基を有しない内因子／微細粒子複合
体の合成は、下記工程Ｂに記載してある。

【００４５】Ｂ．リンカー基を用いない内因子の微細粒
子への結合： ＥＤＡＣ溶液（０．３４ｍｌ、０．１Ｍ　２−（Ｎ−モ
ルホリン）エタンスルホン酸中の０．２Ｍ　ＥＤＡＣ）
を、実施例７工程Ａ（ｉ）からの２％カルボキシ微細粒
子溶液（０．３４ｍｌ）と混合した。この溶液を超音波
処理して分散させ、２５℃で１時間、エンドオーバーエ
ンド（ｅｎｄ−ｏｖｅｒ−ｅｎｄ）で回転させた。この
混合物を遠心分離にかけ、得られたペレットを０．１Ｍ
　２−（Ｎ−モルホリン）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）
（ｐＨ７．０）で洗浄した。この混合物（ＥＤＡＣ活性
化微細粒子を含有）を遠心分離にかけ、得られたペレッ
トを脱イオン水（０．２８ｍｌ）中に懸濁した。

【００４６】上記ＥＤＡＣ活性化微細粒子（２８０μｌ
）および実施例１０からの内因子（２８０μｌ；３８０
μｇ／ｍｌ）を小さなプラスチックバイアルに入れた。 この混合物を２５℃で一夜回転し、脱イオン水中の０．
０５％ツイーン２０で２回洗浄し、０．０５Ｍトリス緩
衝液（ｐＨ７．４）で２回洗浄した。内因子が微細粒子
に直接結合した内因子／微細粒子複合体を得た。

【００４７】実施例３（１８原子リンカーを有する酵素
／Ｂ１２複合体、および４原子リンカーを有する固相／
内因子複合体を用いたＢ１２アッセイ）Ａ，アッセイ： 実施例１工程Ｄ（ｉｉ）に記載の複合体の代わりに４原
子リンカー基を有する内因子／微細粒子複合体を用いた
他は、実施例１に記載の方法および試薬を用いてアッセ
イを行った。４原子リンカー基を有する内因子／微細粒
子複合体の合成は、下記工程Ｂに記載した。

【００４８】Ｂ．４原子リンカーを用いた内因子のアミ
ン微細粒子へのカップリング： 実施例１工程Ｄにおいて化合物４の代わりに化合物５を
用い、手順を下記のように修正する他は実施例１工程Ｄ
の手順を繰り返した。ホモ２官能性リンカー化合物５を
アミン微細粒子とともに１時間半インキュベートし、つ
いで内因子を緩衝液とともに加えた。この混合物を２５
℃で一夜回転させ、その後は実施例１工程Ｄ（ｉｉ）に
記載と同様にして処理して標記複合体を得た。

【００４９】実施例４（１８原子リンカーを有する酵素
／Ｂ１２複合体、および９原子リンカーを有する固相／
内因子複合体を用いたＢ１２アッセイ）Ａ．アッセイ： 実施例１工程Ｄに記載の複合体の代わりに９原子リンカ
ー基を有する内因子／微細粒子複合体を用いる他は、実
施例１に記載の方法および試薬を用いてアッセイを行っ
た。９原子リンカー基を有する内因子／微細粒子複合体
の合成は、下記工程Ｂに記載した。

【００５０】Ｂ．９原子リンカーを用いた内因子のアミ
ン微細粒子へのカップリング： 実施例１工程Ｄの化合物４の代わりにスクシンイミジル
−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−
カルボキシレート（ＳＭＣＣ）を用いる他は実施例１工
程Ｄの手順に従い、標記生成物を得た。

【００５１】実施例５（１８原子リンカーを有する酵素
／Ｂ１２複合体、および１６原子リンカーを有する固相
／内因子複合体を用いたＢ１２アッセイ）Ａ．アッセイ
： 実施例１工程Ｄに記載の複合体の代わりに１６原子リン
カー基を有する内因子／微細粒子複合体を用いる他は、
実施例１に記載の方法および試薬を用いてアッセイを行
った。１６原子リンカー基を有する内因子／微細粒子複
合体の合成は、下記工程Ｂに記載した。

【００５２】Ｂ．１６原子リンカーを用いた内因子のア
ミン微細粒子へのカップリング： 実施例１工程Ｄの化合物４の代わりに化合物３を用いる
他は実施例１工程Ｄの手順に従い、標記生成物を得た。

【００５３】実施例６（１８原子リンカーを有する酵素
／Ｂ１２複合体、および３０原子リンカーを有する固相
／内因子複合体を用いたＢ１２アッセイ）Ａ．アッセイ
： 実施例１工程Ｄ（ｉｉ）に記載の複合体の代わりに３０
原子リンカー基を有する内因子／微細粒子複合体を用い
る他は、実施例１に記載の方法および試薬を用いてアッ
セイを行った。３０原子リンカー基を有する内因子／微
細粒子複合体の合成は、下記工程Ｂに記載した。

【００５４】Ｂ．３０原子ヘテロ２官能性リンカーの合
成： 化合物４（１００ｍｇ；上記合成）を乾燥ＤＭＦ（２．
０ｍｌ）中に溶解し、６−アミノカプロン酸（２３．４
ｍｇ；１．０当量）を加え、得られた混合物を窒素雰囲
気下、室温で一夜撹拌した。翌朝、ＤＣＣＩ（４０，５
ｍｇ；１．１当量）を加え、この反応混合物をさらに６
時間撹拌した。固体沈殿（ＤＣＵ）を濾去し、得られた
ＤＭＦ溶液を減圧蒸発させて粘性固体を得、これをシリ
カゲル上のフラッシュクロマトグラフィー（１０％メタ
ノール／クロロホルム）により精製して化合物７（長さ
が約３８Åのヘテロ２官能性リンカー）（６０．０ｍｇ
）を白色固体として５０％の全収率で得た。

【化８】

【００５５】Ｃ．３０原子リンカーを用いた内因子のア
ミン微細粒子へのカップリング： 実施例１工程Ｄ（ｉｉ）の化合物４の代わりに化合物７
を用いる他は実施例１工程Ｄの手順に従い、標記生成物
を得た。

【００５６】実施例７（他のコバラミンアッセイ）下記
工程Ａ〜Ｇに記載の固相／内因子複合体を用い、他のコ
バラミンアッセイを行うことができる。 Ａ．３６原子リンカーを用いた内因子／固相複合体の合
成： （ｉ）３６原子ヘテロ２官能性リンカーの合成化合物７
（１００ｍｇ；上記合成）を乾燥ＤＭＦ（１０．０ｍｌ
）中に溶解し、６−アミノカプロン酸（１９．５ｍｇ；
１．０当量）を加え、得られた混合物を窒素雰囲気下、
室温で一夜撹拌した。翌朝、ＤＣＣＩ（３３，７ｍｇ；
１．１当量）を加え、この反応混合物をさらに６時間撹
拌した。固体沈殿（ＤＣＵ）を濾去し、得られたＤＭＦ
溶液を減圧蒸発させて粘性固体を得、これをシリカゲル
上のフラッシュクロマトグラフィー（１０％メタノール
／クロロホルム）により精製して化合物８（長さが約４
８Åのヘテロ２官能性リンカー）（５３ｍｇ）を白色固
体として４５％の全収率で得た。

【化９】

【００５７】（ｉｉ）３６原子リンカーを用いた内因子
のアミン微細粒子へのカップリング 実施例１工程Ｄ（ｉｉ）の化合物４の代わりに化合物８
を用いる他は実施例１工程Ｄの手順に従い、標記複合体
を得た。

【００５８】Ｂ．２３原子リンカーを用いた内因子のカ
ルボキシル微細粒子へのカップリング ： （ｉ）微細粒子の洗浄 バイオラドＢｉｏ−Ｒｅｘ　ＭＳＺ　５０１（Ｄ）樹脂
を脱イオン水で数回洗浄した。カルボキシル化修飾微細
粒子（セラジン、５〜１５％固体）を２．５％固体に希
釈し、樹脂を加えた（０．５ｇ樹脂／ｍｌ微細粒子）。 この混合物を室温で１時間回転させた。樹脂を沈殿させ
、微細粒子をデカントした。樹脂を数回洗浄し、各場合
に微細粒子をデカントした。別法として、残留微細粒子
を焼結ガラス漏斗で樹脂から濾過し、脱イオン水で洗浄
することができる。微細粒子を遠心分離にかけ、得られ
たペレットを０．１Ｍ　２−（Ｎ−モルホリン）エタン
スルホン酸（ＭＥＳ）（ｐＨ５．０）中に２％固体（ｗ
／ｖ）に再懸濁した。

【００５９】（ｉｉ）カルボキシ微細粒子のアミン微細
粒子への変換 ＥＤＡＣ溶液（５ｍｌ、０．１Ｍ　ＭＥＳ中の０．２Ｍ
　ＥＤＡＣ（ｐＨ５．０））を実施例７工程Ｂ（ｉ）か
らの２％微細粒子溶液（５ｍｌ）と混合した。この溶液
を超音波処理して分散させ、２５℃で１時間、エンドオ
ーバーエンドで回転させた。この混合物を遠心分離にか
け、得られたペレットを０．１Ｍ　ＭＥＳ（ｐＨ５．０
）で洗浄した。この混合物を遠心分離にかけ、得られた
ペレットを０．０５Ｍ　トリス−ＨＣｌ（７．６）（５
．０ｍｌ）中に再懸濁した。このＥＤＡＣ活性化微細粒
子（５．０ｍｌ）に０．０５Ｍ　トリスＨＣｌ（ｐＨ７
．６）中の０．４Ｍエチレンジアミン（５ｍｌ）を加え
、混合物を２５℃で一夜、エンドオーバーエンドで回転
させた。この混合物を遠心分離にかけ、得られたペレッ
トを０．０５Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）で洗浄し
た。ついで、このアミン粒子を遠心分離にかけ、得られ
たペレットを脱イオン水中に再懸濁して１３％（ｖ／ｖ
）アミン粒子を得た。

【００６０】（ｉｉｉ）微細粒子／内因子複合体の調製
上記工程（ｉｉ）からの微細粒子（３００μｌ）、実施
例１工程Ｂからの内因子（６００μｌ；３８μｇ／ｍｌ
）、および化合物４（３３μｌ；ＤＭＦ中に１．０ｍｇ
／ｍｌ）を小さなプラスチックバイアルに入れた。この
混合物を２５℃で一夜回転し、脱イオン水中の０．０５
％ツイーン２０で２回洗浄し、０．０５Ｍトリス緩衝液
（ｐＨ７．４）で２回洗浄した。２３原子リンカーを有
する内因子／微細粒子複合体を得た。

【００６１】Ｃ．３６原子リンカーを用いた内因子の微
細粒子へのカップリング： 実施例７工程Ｂ（ｉｉｉ）の化合物４の代わりに化合物
８を用いる他は、実施例７工程Ｂの手順を繰り返して標
記複合体を得た。

【００６２】Ｄ．４原子ホモ２官能性リンカーを用いた
内因子のカルボキシル微細粒子へのカップリング：実施
例７工程Ｂ（ｉ）および（ｉｉ）の手順を繰り返した。 化合物４の代わりにホモ２官能性リンカー（化合物５）
を用い、下記修正を施した他は実施例７工程Ｂ（ｉｉｉ
）の手順を繰り返した。微細粒子および化合物５を１時
間半回転し、ついで内因子を緩衝液とともに加えた。こ
の混合物を２５℃で一夜回転し、実施例７工程Ｂ（ｉｉ
ｉ）の記載と同様にして洗浄して標記複合体を得た。

【００６３】Ｅ．１８原子ホモ２官能性リンカーを用い
た内因子のカルボキシル微細粒子へのカップリング：実
施例７工程Ｂ（ｉ）および（ｉｉ）の手順を繰り返した
。化合物４の代わりにホモ２官能性リンカー（化合物６
）を用い、下記修正を施した他は実施例７工程Ｂ（ｉｉ
ｉ）の手順を繰り返した。微細粒子および化合物６を１
時間半回転し、ついで内因子を緩衝液とともに加えた。 この混合物を２５℃で一夜回転し、実施例７工程Ｂ（ｉ
ｉｉ）に記載と同様にして洗浄して標記複合体を得た。

【００６４】Ｆ．アビジン−ビオチンによる内因子の固
相へのカップリング： （ｉ）固相の調製 カルボキシル化微細粒子を実施例７工程Ｂ（ｉ）と同様
にして洗浄し、下記（ｉｉ）の手順に従ってアミン微細
粒子に変換した。

【００６５】（ｉｉ）ポリ−ｌ−リジンのカルボキシル
微細粒子への結合 上記微細粒子（２００μｌ）、ポリ−ｌ−リジン（分子
量４０００〜６０００；５０μｌ、リン酸カリウム緩衝
液中に２．５ｍｇ／ｍｌ）、リン酸カリウム緩衝液（４
００μｌ；５０ｍＭ）およびＥＤＡＣをミクロ分離管に
入れ、２５℃で２時間インキュベートし、遠心分離した
。 得られたペレット（ポリ−ｌ−リジンに結合した微細粒
子を含有）をリン酸カリウム緩衝液で２回洗浄し、脱イ
オン水（５００μｌ）中に再懸濁した。

【００６６】（ｉｉｉ）アビジンのポリ−ｌ−リジン微
細粒子へのカップリング ガラス容器中で、ウシガンマグロブリン（４．２５ｍｇ
、シグマ）、アビジン（６．２２５ｍｇ）、リン酸緩衝
液（ｐＨ７．２、９ｍｌ）を入れ、すべての成分が溶解
するまで混合した。別のガラス容器に新たに調製したグ
ルタールアルデヒド（３６μｌ）およびリン酸緩衝液（
９ｍｌ）を加え、よく混合した。ついで、上記アビジン
溶液およびグルタールアルデヒド溶液を混合し、シェー
カー上に２５℃にて６０分間入れた。ついで、この混合
物をローテーター上に２〜８℃にて２時間置いた。

【００６７】ポリ−ｌ−リジン微細粒子をリン酸緩衝液
で洗浄し、この微細粒子（２８０μｌ）を上記アビジン
−グルタールアルデヒド調製物（１８ｍｌ）と混合した
。ついで、この混合物を２〜８℃にて２時間回転させた
。反応混合物を遠心分離にかけ、３回洗浄した。得られ
たペレットをスポイトで再懸濁した。得られた粒子は、
微細粒子／アビジン複合体であった。

【００６８】（ｉｖ）ビオチン／内因子複合体ビオチン
−ＬＣ−ＮＨＳ（ピアス）をＤＭＦ（１５０μｌ）中に
溶解し、ついで、このビオチン溶液に実施例１からの内
因子溶液（３ｍｌ）およびホウ酸緩衝液（ｐＨ８．５）
（３００μｌ）を内因子に対するビオチンのモル比１０
０：１にて加えた。この混合物を充分に、しかしゆっく
りと混合し、２〜８℃で一夜反応させた。この溶液を１
２〜１４，０００ｍｗ管で脱イオン水中に充分に透析し
た。得られた生成物は、ビオチン／内因子複合体であっ
た。

【００６９】（ｖ）内因子／微細粒子複合体上記工程（
ｉｉｉ）からのアビジン／微細粒子複合体（１ｍｌ）、
上記工程（ｉｖ）からのビオチン／内因子複合体（１０
０μｌ）およびリン酸緩衝液（２５０μｌ）をバイアル
中で混合し、２〜８℃で一夜回転させた。ついで、この
反応混合物を遠心分離にかけ、０．０５Ｍトリス（ｐＨ
７．４）で２回洗浄した。得られた複合体は、ビオチン
−アビジンにより微細粒子に連結した内因子であった。

【００７０】Ｇ．１８原子リンカーを用いた内因子のア
ミン微細粒子へのカップリング：実施例１工程Ｄ（ｉｉ
）の化合物４の代わりに化合物６を用い、下記修正を施
した他は実施例１工程Ｄの手順を繰り返した。ホモ２官
能性リンカー（化合物６）をアミン微細粒子とともに１
時間半インキュベートし、ついで内因子を緩衝液ととも
に加えた。この混合物を２５℃で一夜回転し、その後、
実施例１工程Ｄ（ｉｉ）と同様にして処理して標記複合
体を得た。

【００７１】実施例８（ＥＤＡＣ連結試薬を用いたＢ１
２／アルカルホスファターゼ複合体を用いたアッセイ）
Ａ．アッセイ： 実施例１工程Ｆとは異なり酵素／Ｂ１２複合体を用いて
アッセイを行った。とりわけ、実施例工程Ｆの複合体の
代わりにＥＤＡＣ連結試薬を用いたＢ１２／アルカルホ
スファターゼ複合体（下記合成）を用いた他は実施例１
に記載の方法に従ってアッセイを行った。

【００７２】Ｂ．ＥＤＡＣ連結試薬を用いたＢ１２／ア
ルカルホスファターゼ複合体の合成：ＥＤＡＣ（１ｍｇ
）、化合物１（０．１ｍｌ、ＤＭＦ／ＤＭＳＯ（５０：
５０、ｖ／ｖ）中に２．３ｍＭ）およびＮ−ヒドロキシ
スクシンイミド（０．００９ｍｌ、ＤＭＦ中に２０ｍＭ
）をバイアルに入れ、室温で２時間反応させた。ＤＭＦ
／ＤＭＳＯ（５０：５０、ｖ／ｖ）を用いて反応混合物
の容量を１．０ｍｌに増加させた。このＥＤＡＣ活性化
Ｂ１２をアルカルホスファターゼ（１．０ｍｌ、５０ｍ
Ｍリン酸カリウム、０．１ｍＭ　ＺｎＣｌ溶液中に１０
ｍｇ／ｍｌ）に加え、この混合物を４℃で１６〜２４時
間放置した。 得られたＢ１２／アルカルホスファターゼ複合体を実施
例１工程の記載と同様にして精製した。

【００７３】実施例９（内因子／リンカー／微細粒子）
システムｖｓ感度 種々の長さのリンカーを用いて製造した内因子／リンカ
ー／微細粒子複合体を用いたアッセイの感度を調べた。 各場合に、実施例１に記載のアッセイプロトコールおよ
び実施例１のＢ１２／酵素複合体を用いて感度を試験し
た。

【００７４】 　　　　　　表Ｉ 固相複合体　　　　距離（Å）　　　　感度（ｐｇ／ｍ
ｌ）　　　　リンカーの長さ（原子）実施例２　　　　
　　　　２．６　　　　　　　　２２７　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　０実施例３　　　　　　　
　６．４　　　　　　　　　　３６　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　４実施例４　　　　　　１１．
４　　　　　　　　　　５１　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　９実施例５　　　　　　２０．３　　
　　　　　　　　５０　　　　　　　　　　　　　　　
　　　１６実施例１　　　　　　２９．１　　　　　　
　　　　４８　　　　　　　　　　　　　　　　　　２
３実施例６　　　　　　３７．９　　　　　　　　　　
４０　　　　　　　　　　　　　　　　　　３０

【００
７５】実施例１０（パーキング領域と感度との関係）種
々の値の反応性基パーキング領域を有する固相を用いて
内因子／固相複合体を合成し、できるだけ多数の反応性
基が内因子分子に結合するように複合体生成反応を行う
ことにより、パーキング領域と感度との関係を示した。 それゆえ、反応性基パーキング領域と内因子パーキング
領域とは、極めて類似していると想定することができる
。特に、製造業者（セラジン、インディアナポリス、イ
ンディアナ）により提供された種々の反応性基パーキン
グ領域を有するカルボキシル微細粒子を上記のようにし
てアミン微細粒子に誘導体化し、ヘテロ２官能性連結基
を介して内因子に結合させた。反応性基パーキング領域
（および、おそらく内因子パーキング領域）とアッセイ
感度（実施例１の標準偏差を用いて決定）との関係を下
記表ＩＩに示す。

【００７６】 （注）ＲＧ＝反応性基

【図面の簡単な説明】

【図１】　　本発明のアッセイをアボット・ラボラトリ
ーズのＩＭｘＲアナライザーで行った場合の検量曲線。

【図２】　　本発明のアッセイと市販の放射性同位元素
アッセイとの相関を示すグラフ。

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　試料中のコバラミンの検出方法であっ
   て、 （ａ）試料に、少なくとも３Åの長さの第一連結基によ
   りアフィニティー精製内因子に結合させたラテックス固
   相またはラテックス様固相からなる第一複合体を混合し
   、（ｂ）検出可能な酵素に結合させたコバラミンからな
   る第二複合体に該第一複合体およびコバラミンを暴露し
   て、第一複合体に結合した第二複合体および未結合の第
   二複合体を生成し、ついで （ｃ）該固相かまたは該未結合第二複合体に付随する酵
   素活性を検出することを特徴とする方法。
2. 【請求項２】　　第一連結基が少なくとも５Åの長さを
   有する、請求項１に記載の方法。
3. 【請求項３】　　第二複合体が、少なくとも３Åの長さ
   の第二連結基により検出可能な酵素に結合させたコバラ
   ミンからなる、請求項１に記載の方法。
4. 【請求項４】　　コバラミンがビタミンＢ１２である、
   請求項１に記載の方法。
5. 【請求項５】　　ビタミンＢ１２が、ビタミンＢ１２の
   Ｃ環上の基により該検出可能な酵素に結合している、請
   求項４に記載の方法。
6. 【請求項６】　　ビタミンＢ１２が該酵素に結合させる
   前にＣ環上の１３位にてカルボキシル化しアミンに変換
   させたものである、請求項５に記載の方法。
7. 【請求項７】　　試料中のコバラミンを結合させるため
   に第一複合体を試料とともにインキュベートした後、該
   第一複合体およびコバラミンを該第二複合体に暴露させ
   る前に該試料を該第一複合体から洗浄する工程をさらに
   含む、請求項１に記載の方法。
8. 【請求項８】　　少なくとも３Åの長さの連結基により
   アフィニティー精製内因子に結合させたラテックス固相
   またはラテックス様固相からなる複合体。
9. 【請求項９】　　ラテックス固相またはラテックス様固
   相が微細粒子からなる、請求項８に記載の複合体。
10. 【請求項１０】　　アフィニティー精製内因子が、少な
    くとも９５％がコバラミンと結合するタンパク質からな
    る、請求項８に記載の複合体。