JPH04225906A - グラム陰性バクテリアを殺す方法 - Google Patents

グラム陰性バクテリアを殺す方法

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JPH04225906A
JPH04225906A JP3113806A JP11380691A JPH04225906A JP H04225906 A JPH04225906 A JP H04225906A JP 3113806 A JP3113806 A JP 3113806A JP 11380691 A JP11380691 A JP 11380691A JP H04225906 A JPH04225906 A JP H04225906A
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gram
nisin
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food
organisms
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JP3113806A
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John Michael Baum
ジヨン・マイケル・ボーム
Nancy L Bycroft
ナンシイ・エル・バイクロフト
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Original Assignee
Haarmann and Reimer Corp
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】本発明は、グラム陰性バクテリアをランチ
オニン架橋を含有する抗微生物剤で殺す方法に関する。 とくに、本発明は、グラム陰性の食物が有する病原体、
例えば、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）および
赤痢菌属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）およびグラム陰性の腐敗
有機体、例えば、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏ
ｎａｓ）に対してナイシンを使用することに関する。
【０００２】ランチビチック（ｌａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ
）は、ナイシン、エピダーミン、ガリダーミン、スブチ
リン、Ｐｅｐ−５、シンナマイシン、ジュラマイシンお
よびアンコベニンを包含する、乳酸バクテリアから得ら
れるバクテリオシンの１つのクラスである。一般に、ナ
イシンはグラム陽性有機体に対して有効であり、そして
今日までのランチビチックを使用する研究の多くはクロ
ストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）に対するナ
イシンの効能に集中されてきている。ライマン（Ｒｙｍ
ａｎ）ら、アプライド・アンド・エンバイロメンタル・
マイクロバイオロジー（Ａｐｐｌｉｅｄ　　ａｎｄ　　
Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ　　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏ
ｇｙ）、１９８１年２月、ｐ．３７５−３８０、は、ク
ロストリジウム・スポロゲネス（Ｃ．ｓｐｏｒｏｇｅｎ
ｅｓ）の明らかな増殖はｐＨ６．５までのナイシン処理
したスラリー中で起こらなかったことを開示した。しか
しながら、ｐＨ６．６に調節したスラリー中で、ナイシ
ンの保存作用は損失された。Ｆ．レジャス・ガルシア（
Ｒｅｊａｓ　　Ｇａｒｃｉａ）、アナレス・デ・ラ・フ
ァクルタド・デ・ベテリナリア・デ・レオン（Ａｎａｌ
ｅｓ　　ｄｅ　　ｌａＦａｃｕｌａｔａｄ　　ｄｅ　　
Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｉａ　　ｄｅ　　Ｌｅｏｎ）、Ｖｏ
ｌ．５、１９５９、１７１−１７８、は、溶液中のナイ
シンおよび１〜３％のリン酸二ナトリウムが酪酸菌（Ｃ
．ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ）に対する相乗作用を有すること
を開示した。
【０００３】しかしながら、ナイシンはグラム陽性バク
テリア、例えば、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉ
ｄｉｕｍ）、リステリア菌（Ｌｉｓｔｅｒｉａ　　ｍｏ
ｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐ
ｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　　ａｕｒｅｕｓ）および乳連鎖
球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｓｓｕｓ　　ｌａｃｔｉｓ）
［現在ラクトコッカス・ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃ
ｕｓ　　ｌａｃｔｉｓ）として知られている］に対して
既知の阻害作用を有するが、一般にそれはグラム陰性バ
クテリアに対して無効であると報告された。
【０００４】グラム陽性有機体に対する効能の１つの明
らかな報告は、ライマン（Ｒａｙｍａｎ）およびフルス
ト（Ｈｕｒｓｔ）［工業的抗生物質のバイオテクノロジ
ー（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　　ｏｆ　　Ｉｎｄｕ
ｓｔｒｉａｌ　　Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ）、第２１章
、ｐ．６１８、Ｅ．バンダンメ（Ｖａｎｄａｍｍｅ）編
、１９８４、マーセル・デッカー・インコーポレーテッ
ド（ＭａｒｃｅｌＤｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．）、ニューヨ
ークおよびバーゼル］に見いだされる。ライマン（Ｒａ
ｙｍａｎ）およびフルスト（Ｈｕｒｓｔ）は、マチック
（Ｍａｔｔｉｃｋ）およびヒルシュ（Ｈｉｒｓｃｈ）を
、グラム陰性バクテリアのナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅ
ｒｉａ）の３つの菌株に対するナイシンにより阻害の発
見として引用した。しかしながら、参考文献［マチック
（Ｍａｔｔｉｃｋ）およびヒルシュ（Ｈｉｒｓｃｈ）、
ランセット（Ｌａｎｃｅｔ）、１９４７日７月５日、５
−８］は「ナイセリア属（ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）」を生
体外のナイシンに対して感受性である病原性有機体とし
て列挙したが、同一節（第６ページの上部）内に、また
、「試験した限りにおいてグラム陽性有機体のいずれも
感受性でない」と述べられている。
【０００５】ＡＵ４９４１３／８５号は、エピダーミン
およびナイシンの平板拡散試験を開示しており、これら
の試験は両者の化合物がグラム陽性有機体、プロテウス
・ミラビリス（Ｐｏｒｔｅｕｓ　　ｍｉｒａｂｉｌｉｓ
）およびプロテウス・ブルガリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ　　
ｖｕｌｇａｒｉｓ）の増殖を阻害したことを示す。
【０００６】ＷＯ８９１２３９９号は、食物防腐剤とし
てのナイシンの使用が、ナイシンがグラム陰性バクテリ
アおよび多数のグラム陽性バクテリアに対して無効であ
ったという信念により、妨害されてきていることを開示
している。この明細書が述べているように、ナイシン単
独で得ることができるより、グラム陰性バクテリアに対
する増強された、広い範囲の殺バクテリア活性、ならび
により広い範囲のグラム陽性バクテリアに対する増強さ
れた活性は、非殺バクテリア剤、例えば、キレート剤ま
たは界面活性剤と組み合わせてナイシンを含有する組成
物を使用して見いだされる。この開示は、ナイシン単独
をｐＨ５およびｐＨ８において添加したときの、生存能
力をもつバクテリアの減少を示す。
【０００７】ここに記載する本発明は、ランチオニン架
橋を含有する抗微生物剤、とくにナイシンまたは断片が
、ｐＨ約５．５〜約６．５を有する環境において使用す
るとき、事実グラム陽性有機体に対して有効な抗微生物
剤であることを示す。このｐＨの範囲内で、ナイシン単
独はグラム陰性の食物が有する病原体およびグラム陰性
の食物腐敗有機体に対して有効な殺バクテリア剤である
。ナイシンの商業的調製物は、普通に存在する不純物、
塩化ナトリウムおよび水不溶性成分が除去される場合、
使用することができる。次いで、ナイシン調製物は溶液
または乾燥組成物として表面処理剤として使用すること
ができるか、あるいは汚染され易い液体中の溶解のため
の錠剤として配合することができる。好ましい組成物は
、水性環境の中に溶解したとき、適当なｐＨを提供する
ことができる緩衝成分を含む。
【０００８】この方法は食物の処理装置、食用飼鳥類の
処理、水、飲料および食物製品とともに使用することが
できる。食物が有するグラム陰性バクテリア、例えば、
サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）または赤痢菌属
（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）に対するナイシンの使用は、とく
に重要である。
【０００９】グラム陽性有機体に対する抗微生物系を使
用して研究するとき、対照実験の１つは、シグマ・ケミ
カル・コーポレーション（Ｓｉｇｍａ　　Ｃｈｅｍｉｃ
ａｌＣｏｒｐ．）（郵便私書箱１４５０８、ミゾリー州
６３１７８−９９１６、セントルイス）から入手した商
業的調製物の中に存在する希釈剤を除去することによっ
て得られたナイシンであった。ナイシンの抗微生物スペ
クトルについての一般の文献と反対に、対照はサルモネ
ラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）に対する活性を示したこ
とが認められた。この発見は食物の領域においてとくに
重要である。なぜなら、ナイシンは食物の承認された抗
微生物剤であり、そしてグラム陰性の食物の病原体、例
えば、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）は食物系
および食物処理プラントにおいて問題であるからである
。
【００１０】今回、定義されたｐＨ範囲内で、ナイシン
はキレート剤または界面活性剤のような物質を添加しな
いで、グラム陽性有機体に対して有効な抗微生物剤であ
ることが発見された。同様な結果は、ランチビチックの
クラスにおける他の抗微生物剤から、およびランチオニ
ン架橋を含有するこのようなランチビチックの断片から
得られるであろうことが期待される。ランチビチックは
、ここにおいて、３〜５０、好ましくは８〜３４のアミ
ノ酸を含有し、そして１または２以上のランチオニン架
橋を含むポリペプチドであると定義される。ナイシンは
このクラスの最もよく知られている代表である。また、
エピダーミン、ガリダーミン、スブチリンおよびＰＥＰ
−５が包含される。ランチオニン架橋を含有するランチ
ビチック、例えば、ナイシンの断片、および正確なアミ
ノ酸が異なることがある機能的に同等の類似体は、本発
明の方法において使用するランチビチックと同等である
と考えられる。とくに、ランチオニン架橋を含有するナ
イシンの断片または類似体は、このような断片または類
似体がグラム陰性の食物が有する病原体に対して有効な
抗微生物活性を示すことを条件として、同等であると考
えられる。
【００１１】アブリン・アンド・バレット（Ａｐｌｉｎ
　　ａｎｄ　　Ｂａｒｒｅｔｔ）からのニサプリン（Ｎ
ＩＳＡＰＬＩＮ）およびシグマ・ケミカル・カンパニー
（Ｓｉｇｍａ　　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　　Ｃｏ．）からの
ナイシン調製物は、希釈剤としてミルクのタンパク質お
よび塩化ナトリウムを含有すると表示されている。この
ような調製物はサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）
に対して無効である。今回、不純物をこのような調製物
から除去するとき、ナイシンはグラム陰性の食物が有す
る病原体およびグラム陰性の食物腐敗有機体に対して殺
バクテリア性である。これらのクラスには、ネズミチフ
ス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕ
ｍ）、腸炎菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　　ｅｎｔｅｒｉ
ｔｉｄｉｓ）、志賀赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ　　ｄｙ
ｓｅｎｔｅｒｉａｅ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａ
ｓ　　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉ
ｏ　　ｃｈｏｌｅｒａ）、肺炎杆菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌ
ｌａ　　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）および大腸菌（Ｅｓｃ
ｈｅｒｉｃｈｉａ　　ｃｏｌｉ）が包含される。いくつ
かの手順は、商業的調製物から抗微生物的に有効なナイ
シン調製物を生成するであろう。最も簡単な手順は塩を
除去する透析、引き続く水不溶性成分を除去する遠心で
ある。この手順および限外濾過手順は実施例に記載され
ている。さらに、高圧液体クロマトグラフィーを使用す
ることができる。
【００１２】異なる活性の調製物をこれらの異なる手順
により得ることができる（そして事実、異なる活性の調
製物は異なる場合に同一手順を使用して得られることが
ある）が、各調製物を使用して、処理溶液の１ｍｌ当た
り有効活性の精製されたナイシン（ＩＵ／ｍｌ）を含有
する乾燥組成物または溶液を調製することができ、これ
らを使用してグラム陰性の食物が有する病原体またはグ
ラム陰性の食物腐敗有機体を殺すことができる。例えば
、このような調製物を使用するとき：２５０ＩＵ／ｍｌ
は肺炎杆菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ　　ｐｎｅｕｍｏｎ
ｉａｅ）に対して３．９対数の減少を提供した；腸炎菌
（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　　ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ）
に対して１００ＩＵ／ｍｌは４．５対数の減少を提供し
そして５０ＩＵ／ｍｌは３．９対数の減少を提供した；
５００ＩＵ／ｍｌはシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍ
ｏｎａｓ）に対して３．２対数の減少を提供した；そし
て１００ＩＵ／ｍｌは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に対して
３．２対数の減少を提供した。
【００１３】精製の手順は提供されるが、ナイシンの商
業的調製物から塩化ナトリウムおよび水不溶性不純物を
排除する手順は有用な調製物を提供するであろう。事実
、商業的調製物中に見いだされる希釈剤が添加されてい
ない、アッセイ標準として販売されている、３７，００
０，０００ＩＵ／ｇの活性をもつ調製物を使用する実験
は、ここに記載する手順により精製された調製物と同様
な活性をグラム陰性バクテリアに対してを示した。 （活性はバイオアッセイにより決定した。ある場合にお
いて、ＨＰＬＣのプロフィルを使用した。）処理 塩化ナトリウムおよび水不溶性成分を本質的に含まない
調製物から得られたランチビチックから本質的に成る組
成物は、環境が固有にｐＨ約５．５〜約６．５内にある
場合、直接使用することができる。好ましくは、緩衝成
分を添加し、この緩衝成分は、疑われる汚染物質が多数
倍になり易い水性の微小環境中に溶解するとき、所望の
ｐＨ範囲を提供することができる。組成物は、また、ｐ
Ｈ約５．５〜約６．５を有する水溶液から本質的に成る
処理溶液として調製することができ、この溶液はグラム
陽性有機体の個体数を少なくとも約３対数だけ減少する
か、あるいは検出可能な限界以下に減少するために有効
量のランチビチックを含有する。ここで使用する効能の
基準は、１時間の暴露後に対照が示すもよりグラム陽性
有機体の３対数の減少である。
【００１４】適当なｐＨは、処理溶液のｐＨを調節し、
固有に所望のｐＨを有する環境に水性処理溶液を適用ま
たは添加するか、あるいはｐＨを所望の範囲に維持する
ことができる緩衝成分を添加することによって得ること
ができる。好ましいｐＨは約６．０である。緩衝剤はホ
スフェート緩衝剤またはｐＨを所望の範囲に維持するこ
とができる他のものであることができる。好ましい処理
溶液は、ｐＨ約５．５〜約６．５を維持することができ
るホスフェート緩衝剤を含有する水溶液の中に、少なく
とも約５００ＩＵ／ｍｌのナイシンを含有する。この活
性は、広い範囲のグラム陰性の食物が有する病原体に対
して有効であるべきである。
【００１５】約０．１％の塩化ナトリウムおよび／また
は抗体０．０５％の非脂肪ドライミルクの固体を精製さ
れた調製物から調製された処理溶液に添加し戻す場合、
５００ＩＵ／ｍｌの精製されたナイシンはネズミチフス
菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ
）に対する不活性とされることが発見された。処理溶液
は、約０．１％より少ない塩化ナトリウム（すなわち、
処理溶液の１００ｍｌ当たり約０．１ｇより少ない塩化
ナトリウム）、好ましくは約０．０５％より少ない塩化
ナトリウムを含有すべきである。また、処理溶液中の混
入の前に、ナイシン調製物から不安定性物質を除去する
ことが好ましい。
【００１６】使用方法 処理の組成物または溶液は、汚染が疑われる表面に適用
することができる。処理溶液は噴霧または浸漬または任
意の他の便利な方法により適用することができる。処理
を使用して氷を配合し、次いでこれを、例えば、魚の輸
送、貯蔵および／または展示のために使用することがで
きるであろう。乾燥組成物は疑われる飲料の中に溶解す
るための錠剤として配合し、食物の表面上にダスチング
するか、あるいは乾燥食物成分と混合することができる
。
【００１７】ナイシンは食物の許容された抗微生物剤で
あるので、残留するナイシンがヒトと接触する任意の応
用においてとくに有用であろう。食用飼鳥類の処理にお
けるサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）および水の
汚染物質である緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　　ａ
ｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、およびなおより重要には普通の
病院の汚染物質の根絶はとくに重要である。この新規な
使用は、このようなグラム陽性有機体を生物学的危険を
つくるという恐怖なしに根絶することができることを意
味する。それは、食物の処理プラントにおける表面およ
び料理の道具のクリーニングおよび食物が調製または提
供される区域、例えば、病院、養護ホーム、レストラン
、ことに急速食物レストラン、調理済み食品などにおい
て消毒剤として使用することができる。それは、また、
食物製品上の抗微生物剤として使用することができ、そ
してチーズ、新鮮な産生物、例えば、フルーツおよび野
菜およびサラダバー上の食物および調理済み食品におけ
る表面の抗微生物剤としてとくに有用であろう。
【００１８】次の実施例は本発明の好ましい実施態様を
開示するが、特許請求の範囲によってのみ規定される本
発明の応用性を限定しない。
【００１９】
【実施例】ナイシンについての他の発表された研究と比
較する目的で、１ｇの純粋なナイシンは４０，０００，
０００ＩＵの活性を有し、そして１ｇのニサプリン（Ｎ
ＩＳＡＰＬＩＮ）は１，０００，０００ｉｕＯＲ２．５
％のナイシンを含有することに注意されたい。シグマ・
ケミカル・カンパニー（Ｓｉｇｍａ　　Ｃｈｅｍｉｃａ
ｌＣｏ．）からのナイシンおよびアブリン・アンド・バ
レット（Ａｐｌｉｎ　　ａｎｄ　　Ｂａｒｒｅｔｔ）か
らのニサプリン（ＮＩＳＡＰＬＩＮ）の両者は、２．５
％（調製物の１ｇ当たり０．０２５ｇのナイシン）を含
有する調製物として販売されており、したがって０．０
２５ｇのナイシンは調製物の１ｇ当たり１，０００，０
００国際単位（ＩＵ／ｇ）を有する。
【００２０】確証の研究は、特記しない限り、対数期の
有機体について実施した。
【００２１】実施例１−商業的に入手可能なナイシンの
精製 シグマ（Ｓｉｇｍａ）から入手したナイシンを精製して
、塩化ナトリウムおよび変性ミルク固体から主として成
る不純物を除去した。
【００２２】ナイシンを水中に溶解し、そしてｐＨを塩
酸で２．５に調節した。この溶液を透析濾過して塩化ナ
トリウムを除去した。濾液を８０℃に加熱して固体を沈
澱させた；濾過助剤、例えば、ケイ藻土を添加した；そ
して濾液を真空濾過して沈澱したミルクの固体を除去し
た。必要に応じて、濾液のｐＨを６に調節した後、真空
濾過してなおより高い純度を得た。いずれかの方法にお
いて得られた調製物はいずれもグラム陰性バクテリアに
対する殺バクテリア性であった。得られた溶液は精製さ
れたナイシンを含有した。この溶液を標準の方法により
アッセイし、そして活性をその方法でアッセイした。
【００２３】ナイシンは、また、標準の透析および遠心
により精製した。５０ｍｌの水中の１０ｇのニサプリン
（ＮＩＳＡＰＬＩＮ）のｐＨを塩酸で２．５に調節し、
これを室温において２リットルの酸性化蒸留水（ｐＨ２
．５、２回交換した）に対する２４時間透析して塩を除
去した。次いで、この溶液を遠心して固体（ミルクの固
体であると信じられる）を除去し、そして上澄み液を凍
結乾燥した。生ずる調製物はほぼ５×１０６単位／ｍｌ
の活性を有した。それを後に使用して、グラム陽性有機
体に対して使用するための抗微生物的に有効な処理溶液
を調製した。
【００２４】実施例２−試験有機体の調製増殖条件： ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　　ｔｙｐｈｉ
ｍｕｒｉｕｍ）（ＡＴＣＣ１４０２８）を、トリプシン
大豆寒天（Ｄｉｆｃｏ　　Ｌａｂｓ）を含有する寒天培
地上で維持した。ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌ
ａ　　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）の一夜の培養物を、１
０ｍｌの栄養ブロス（Ｄｉｆｃｏ）を含有する２５０ｍ
ｌのフラスコを原料スラントからの１ループの培養物で
接種し、そして３７℃において２５ｒｐｍの遅い震盪で
ニュー・ブルスウィック（Ｎｅｗ　　Ｂｒｕｎｓｗｉｃ
ｋ）Ｇ２４震盪器上でインキュベーションすることによ
って調製した。次いで、一夜の増殖培養物を使用して、
２５０ｍｌのサイドアームの濾過中の新鮮な栄養ブロス
を接種した（１：２０の接種レベル）。次いで、このフ
ラスコを３７℃においてインキュベーションし、そして
２５ｒｐｍで撹拌して、培養物をクレット−サンマーソ
ン（Ｋｌｅｔｔ−Ｓｕｍｍｅｒｓｏｎ）のカロリーメー
ターで測定して１００単位の密度に到達させた。この密
度はほぼ３×１０８細胞／ｍｌの生存能力の細胞計数に
相当した。すべての試験は、特記しない限り、対数期増
殖における細胞について実施した。試験培養物は同様な
方法で腸炎菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　　ｅｎｔｅｒｉ
ｔｉｄｉｓ）（ＡＴＣＣ　　１３０７６）、志賀赤痢菌
（Ｓｈｉｇｅｌｌａ　　ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）（Ａ
ＴＣＣ１１４５６Ａ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａ
ｓ　　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）（ＡＴＣＣ　　９０２７
）および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＡＴＣＣ　　８７３
９）を使用して調製した。
【００２５】前述したように限外濾過により精製した、
所望の濃度（ＩＵ／ｍｌ）を達成するために適当な量の
精製したナイシンを、塩酸でｐＨ３．６に調節した９．
０ｍｌの１４．７ミリモルのリン酸カリウムに添加した
。 ほぼ１０８細胞／ｍｌを含有する１ｍｌの培養物をナイ
シン溶液に添加して、最終体積を１０ｍｌとした。３７
℃においてインキュベーションし、そして試料を１０、
２０、４０および６０分の間隔で抜き出した。系統的希
釈を栄養ブロス中で実施し、そして生存能力をもつ計数
を３７℃において４８時間のインキュベーションで栄養
寒天ブロス平板上の試料の増殖を追跡して得た。
【００２６】実施例３−サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅ
ｌｌａ）に対して無効の商業的ナイシン２０，０００国
際単位（ＩＵ）の活性／ｍｌを含有するナイシンの未精
製の商業的調製物（Ｓｉｇｍａ）を使用して実験は、６
０分の暴露後、１０７のネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎ
ｅｌｌａ　　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）に対する殺バク
テリア性を示さなかったが、精製したナイシンを使用す
る実験は２，０００ＩＵ／ｍｌの活性において同一濃度
の細胞に対して１０００倍の減少を示した。商業的ナイ
シン処理（２０，０００ＩＵ／ｍｌ）からの１０６細胞
（１：１０希釈）および緩衝液の対照（０ＩＵ／ｍｌ）
を適用したとき、再分離平板上（ｒｅｃｏｖｅｒｙ　　
ｐｌａｔｅ）の全面増殖は得られたが、２，０００ＩＵ
／ｍｌの精製したナイシンで同様な処理後、再分離平板
上でわずかに３００コロニーのみが増殖した。１０４細
胞（１：１０００の希釈）を処理後再分離平板に適用し
たとき、商業的調製物および対照を使用して計数には多
すぎる細胞（明確な結腸であるが、計数には多すぎる）
が観察されるが、精製した調製物を使用する処理でわず
かに４つのコロニーが生存した。１８，０００ＩＵの商
業的ナイシンを２，０００ＩＵの精製した調製物に添加
して２０，０００ＩＵ／ｍｌの活性を得たとき、１０６
微生物を再分離平板に適用したとき、６０分の実験的暴
露後、全面増殖が再び観察された。
【００２７】より少ない量（５００ＩＵ／ｍｌおよび１
０００ＩＵ／ｍｌ）の精製したナイシン対商業的ナイシ
ン調製物を使用する追加の実験は、同様な結果を示した
。商業的調製物はネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌ
ａ　　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）に対して無効であるが
、精製したナイシンは、１０４または１０６細胞を再分
離平板に適用したとき、４０〜６０分後、殺バクテリア
活性を示した。
【００２８】精製したナイシンは２０，０００ＩＵ／ｍ
ｌおよび２，０００ＩＵ／ｍｌにおいて、また、腸炎菌
（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　　ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ）
の生存能力をもつ細胞の計数を１０７細胞／ｍｌに対し
て、２０〜３０分後、減少するために有効であった。
【００２９】実施例４−志賀赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ
　　ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）に対する精製したナイシ
ン志賀赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ　　ｄｙｓｅｎｔｅｒ
ｉａｅ）の定常期の細胞を、２０，０００ＩＵ／ｍｌの
精製したナイシンで処理し、そしてナイシンを含まない
緩衝液から回収した細胞からの増殖と比較した。殺バク
テリア作用は、１０４（処理溶液および細胞の１：１０
００希釈）細胞を再分離平板に適用して、１０分の暴露
後に見られた。４０分の暴露後、増殖は再分離平板上に
観測されなかった。６０分後、再分離平板への１０６細
胞の適用（処理溶液および細胞の１：１０希釈）は、リ
ン酸塩緩衝液の対照からの全面増殖を産生し、わずかに
１３の生存能力をもつ細胞の計数を示し、ほぼ１００，
０００倍の減少を示した。
【００３０】対数期では、２０，０００ＩＵ／ｍｌの精
製したナイシンは、１０７細胞／ｍｌに対して１０分後
ほとんど完全に殺し、そして２０分後完全に殺した（１
０ＣＦＵ／ｍｌより少ない）。
【００３１】実施例５−緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａ
ｓ　　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）に対する精製したナイシ
ン精製したナイシンは２０，０００ＩＵ／ｍｌにおいて
前に開示したように試験し、そして６０分後、緑膿菌（
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）を
根絶することが発見された。
【００３２】実施例６−大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に対す
る精製したナイシン 精製したナイシンは２０，０００ＩＵ／ｍｌにおいて前
に開示したように試験し、そして６０分後、定常期の大
腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を根絶することが発見された。
【００３３】実施例７−サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅ
ｌｌａ）に対する効能を決定する最良の方法実施例７、
８および９において使用したナイシンｈａ、アブリン・
アンド・バレット（Ａｐｌｉｎ　　ａｎｄ　　Ｂａｒｒ
ｅｔｔ）から入手し、３７，０００，０００ＩＵ／ｍｌ
の活性を有するナイシンの標準である、そしてニサプリ
ン（ＮＩＳＡＰＬＩＮ）に通常添加される添加剤を含有
すると表示されていなかった。１００，０００ＩＵ／ｍ
ｌのストックを酸性化した水、ｐＨ２．７、中で調製し
、凍結し、そして−７０℃において貯蔵した。このナイ
シンのストックを処理緩衝液で１：１０または１：１０
０に希釈した後、処理系に添加した。
【００３４】ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　
　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）ＡＴＣＣ１４０２８の細胞
を、トリプシン大豆ブロス（Ｄｉｆｃｏ）中で３７℃に
おいて一夜増殖させた。一夜の培養物からの２％の接種
物を使用して、対数期の培養を開始した。培養物の濁り
がクレット−サンマーソンのカロリーメーター上で１０
単位に到達したとき、対数期の培養物を実験の研究にお
ける使用のために選択した。これは通常２〜３時間イン
キュベーションに等しかった。評価は１０％の接種物を
使用して１４．７ミリモルのリン酸カリウム中で実施し
た。５．０またはそれ以上のｐＨ値について、１塩基性
塩および２塩基性塩の混合物を使用した。４．５または
それ以下のｐＨ値について、１塩基性塩を塩酸で調節し
た。細胞は接種前にナイシンを含まない類似の処理緩衝
液で１回洗浄した。
【００３５】処理物を接種してほぼ１０７細胞／ｍｌと
し、そして３７℃において１または３時間インキュベー
ションした後、試料を細胞の計数のために取った。系統
的１０倍希釈をリン酸塩緩衝液（ＰＢＳ）中で、３５μ
ｌの培養物を３１５μｌのＰＢＳとマイクロタイタート
レー中で混合することによって実施した。ＰＢＳは０．
１２％の２塩基性リン酸ナトリウム、０．０２２％の１
塩基性リン酸ナトリウム、および０．８５％の塩化ナト
リウム、塩酸でｐＨ７．０に調節した、から成っていた
。０．１ｍｌの選択した希釈物中の細胞の数は、標準の
注ぎプレイティング技術を使用して決定した。トリプシ
ン大豆寒天を再分離培地として使用した。平板は３７℃
において１８〜２４時間インキュベーションした後、コ
ロニー形成単位を計数した。
【００３６】インキュベーションのときに洗浄した細胞
の緩衝懸濁液から取った平板の計数を使用して、時間０
の処理における細胞濃度を決定した。
【００３７】ナイシンを含有する処理についての対数減
少を、インキュベーション後、緩衝液の対照（０ＩＵ／
ｍｌのナイシン）と比較した。緩衝液の対照についての
対数減少を時間０の細胞濃度と比較した。
【００３８】実施例８−ｐＨの作用２，０００ＩＵ／ｍ
ｌから１．０ＩＵ／ｍｌまでの範囲のナイシン濃度を、
３．５から７．５までの１ｐＨ単位の増分の範囲で、１
４．７ミリモルのリン酸カリウム中で試験した。接種に
使用した細胞を、接種前に、それらの同様な処理緩衝液
で洗浄した。結果はｐＨ５．５〜６．５が最適であるこ
とを示す。
【００３９】ｐＨについての追加の研究を実施した。５
００ＩＵ／ｍｌのナイシン濃度をこれらの研究のために
選択した。４．５〜７．５の範囲の１／２ｐＨ単位の増
分を、類似の処理緩衝液中で洗浄した細胞に対して試験
した。結果を表Ｉに示す。５対数減少（１００，０００
倍）が１時間でｐＨ６．０において観測された。４対数
（１０，０００倍）の減少はｐＨ５．５〜６．５におい
て見いだされた。
【００４０】
【表１】 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　表　　　　Ｉ　　　　　ネズミチフス菌（Ｓ
ａｌｍｏｎｅｌｌａ　　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）　　
　　　　　　ＡＴＣＣ１４０２８に対するナイシンの有
効なへのｐＨの効果　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　１時間　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　３時間　　　　　　　　　　　　
　　　　ナイシン　　　　　　　　　　　　　　　　　
　ｌｏｇ　１０　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　ｌｏｇ　１０ｐＨ　　　　ＩＵ／ｍｌ　　　　ＣＦＵ
／ｍｌ　　　　減　　少　　　　　　ＣＦＵ／ｍｌ　　
　　減　　少　　４．５　　　　５００　　　　３．８
Ｅ＋０６　　０．９４　　　　９．１Ｅ＋０５　　１．
４９　　　　　　　　　　　０　　　　　　３．３Ｅ＋
０７　（０．０６）　　　２．８Ｅ＋０７　　０．０２
　　　　　　　　時間　　０　　　２．９Ｅ＋０７　　
　　−−　　　　　２．９Ｅ＋０７　　　　−−５．０
　　　　５００　　　　３．０Ｅ＋０４　　２．８７　
　　　３．５Ｅ＋０３　　３．６５　　　　　　　　　
　　０　　　　　　２．２Ｅ＋０７　　０．２９　　　
　１．５Ｅ＋０７　　０．４４　　　　　　　　時間　
　０　　　４．３Ｅ＋０７　　　　−−　　　　　４．
３Ｅ＋０７　　　　−−５．５　　　　５００　　　　
１．３Ｅ＋０３　　４．２０　　　　７．０Ｅ＋０１　
　５．２８　　　　　　　　　　　０　　　　　　２．
０Ｅ＋０７　　０．３１　　　　１．３Ｅ＋０７　　０
．４８　　　　　　　　時間　　０　　　４．１Ｅ＋０
７　　　　−−　　　　　４．１Ｅ＋０７　　　　−−
６．０　　　　５００　　　　３．５Ｅ＋０１　　５．
７６　　　　１．０Ｅ＋０１　　６．３０　　　　　　
　　　　　０　　　　　　２．０Ｅ＋０７　　０．３３
　　　　２．０Ｅ＋０７　　０．３３　　　　　　　　
時間　　０　　　４．３Ｅ＋０７　　　　−−　　　　
　４．３Ｅ＋０７　　　　−−６．５　　　　５００　
　　　５．９Ｅ＋０２　　４．４１　　　　１．０Ｅ＋
０１　　６．３６　　　　　　　　　　　０　　　　　
　１．５Ｅ＋０７　　０．５６　　　　２．３Ｅ＋０７
　　０．３８　　　　　　　　時間　　０　　　５．５
Ｅ＋０７　　　　−−　　　　　５．５Ｅ＋０７　　　
　−−７．０　　　　５００　　　　６．４Ｅ＋０４　
　２．７１　　　　５．５Ｅ＋０３　　３．７０　　　
　　　　　　　　０　　　　　　３．２Ｅ＋０７　　０
．２１　　　　２．８Ｅ＋０７　　０．２８　　　　　
　　　時間　　０　　　５．３Ｅ＋０７　　　　−−　
　　　　５．３Ｅ＋０６　　　　−−７．５　　　　５
００　　　　７．０Ｅ＋０６　　０．５０　　　　１．
０Ｅ＋０５　　１．３５　　　　　　　　　　　０　　
　　　　２．２Ｅ＋０７　　０．２９　　　　２．３Ｅ
＋０７　　０．２７　　　　　　　　時間　　０　　　
４．３Ｅ＋０７　　　　−−　　　　　４．３Ｅ＋０７
　　　　−−５００ＩＵ／ｍｌのナイシン濃度は１３．
５１μｇ／ｍｌに等しい。
【００４１】５００ＩＵ／ｍｌのナイシンについての対
数減少を、インキュベーション後の０ＩＵ／ｍｌの対照
と比較した。
【００４２】０ＩＵ／ｍｌについての対数減少を、時間
０における細胞濃度と比較した。
【００４３】処理は１４．７ミリモルのリン酸カリウム
緩衝液中で実施した。
【００４４】（）＝増加。
【００４５】ナイシンの活性は３．７Ｅ＋０７ＩＵ／ｇ
であった。
【００４６】２，０００ＩＵ／ｍｌ〜１．０ＩＵ／ｍｌ
の範囲のナイシン濃度を１４．７ミリモルのリン酸カリ
ウム緩衝液、ｐＨ６．０、中で試験した。結果を表ＩＩ
に記載し、そして結果が示すように、４対数（１０，０
００倍）より大きい減少は２５０ＩＵ／ｍｌまたはそれ
以上のナイシン濃度において達成された。
【００４７】
【表２】 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
表　　　　ＩＩ　　　　　リン酸カリウム緩衝液、ｐＨ
６．０、中のネズミチフス菌　　　　　（Ｓａｌｍｏｎ
ｅｌｌａ　　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）　　　　　ＡＴ
ＣＣ１４０２８に対する活性へのナイシン濃度の効果　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１時間の
インキュ　　　　　　　　３時間のインキュ　　ナイシ
ン濃度　　　　　　　　ベーション　　　　　　　　　
　　　　　ベーション　　　　　　 （ＩＵ／ｍｌ）　（μｇ／ｍｌ）　　　ＣＦＵ／ｍｌ　
　ｌｏｇ　１０減少　　　　ＣＦＵ／ｍｌ　　ｌｏｇ　
１０減少　　２０００　　　　　５４．０５　　　　　
１．０Ｅ＋０１　　　　６．５３　　　　　　　　１．
０Ｅ＋０１　　　　　６．６７　　１０００　　　　　
２７．０３　　　　　１．０Ｅ＋０１　　　　６．５３
　　　　　　　　１．０Ｅ＋０１　　　　　６．６７　
　　５００　　　　　１３．５１　　　　　１．０Ｅ＋
０１　　　　６．５３　　　　　　　　１．０Ｅ＋０１
　　　　　６．６７　　　２５０　　　　　　６．７６
　　　　　９．２Ｅ＋０２　　　　４．５６　　　　　
　　　１．２Ｅ＋０２　　　　　５．６１　　　１００
　　　　　　２．７０　　　　　４．０Ｅ＋０５　　　
　１．９３　　　　　　　　４．８Ｅ＋０５　　　　　
１．９９　　　　５０　　　　　　１．３５　　　　　
８．８Ｅ＋０５　　　　１．５８　　　　　　　　２．
５Ｅ＋０６　　　　　１．２７　　　　２５　　　　　
　０．６８　　　　　１．６Ｅ＋０６　　　　１．３２
　　　　　　　　５．０Ｅ＋０６　　　　　０．９７　
　　　１０　　　　　　０．２７　　　　　３．５Ｅ＋
０６　　　　０．９９　　　　　　　　８．８Ｅ＋０６
　　　　　０．７３　　　　　５　　　　　　０．１４
　　　　　９．４Ｅ＋０６　　　　０．５５　　　　　
　　　１．３Ｅ＋０７　　　　　０．５６　　　　　２
．５　　　　０．０７　　　　　１．６Ｅ＋０７　　　
　０．３２　　　　　　　　３．２Ｅ＋０７　　　　　
０．１７　　　　　１　　　　　　０．０３　　　　　
３．２Ｅ＋０７　　　　０．０３　　　　　　　　２．
８Ｅ＋０７　　　　　０．２２　　　　　０　　　　　
　０．００　　　　　３．４Ｅ＋０７　　　　０．０１
　　　　　　　　４．７Ｅ＋０７　　　　（０．１３）
時間　０　　　　　　　　　　　　　　　３．５Ｅ＋０
７　　　　０．００　　　　　　　　３．５Ｅ＋０７　
　　　　０．００　　　　ナイシン濃度についての対数
減少を、インキュベーション後の０ＩＵ／ｍｌの対照と
比較した。
【００４８】０ＩＵ／ｍｌの対照についての対数減少を
、時間０における細胞濃度と比較した。
【００４９】緩衝液は１４．７ミリモルのＫＨＰＯ４、
ｐＨ６．０、中で実施した。
【００５０】（）＝増加。
【００５１】ナイシンの活性は３．７Ｅ＋０７ＩＵ／ｇ
であった。
【００５２】多数の変更および変化は、特許請求の範囲
によってのみ規定される、本発明の範囲を逸脱しないで
、ここで使用した比率および成分において行うことがで
きる。
【００５３】本発明の主な特徴および態様は、次の通り
である。
【００５４】１、有効活性のランチビチックおよび水中
に溶解したときｐＨ約５．５〜約６．５を提供すること
ができる緩衝成分から本質的に成る組成物を、グラム陰
性の食物が有する病原体またはグラム陰性の腐敗有機体
の増殖に適する表面に適用し、これによりグラム陰性の
個体数を検出可能な限界以下にまたは少なくとも約３対
数だけ減少することからなる、グラム陰性バクテリアを
殺す方法。
【００５５】２、ランチビチックは、塩化ナトリウムお
よび水不溶性成分を本質的に含まないナイシン調製物か
ら得られたナイシンである、上記第１項記載の方法。
【００５６】３、ｐＨ約５．５〜約６．５を有しそして
有効活性のナイシンを含有する水溶液から本質的に成る
処理溶液を、グラム陰性の食物が有する病原体またはグ
ラム陰性の腐敗有機体による汚染が疑われる表面に適用
し、これによりネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ
　　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、腸炎菌（Ｓａｌｍｏｎ
ｅｌｌａ　　ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ）、志賀赤痢菌（
Ｓｈｉｇｅｌｌａ　　ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）、緑膿
菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ
）、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ　　ｃｈｏｌｅｒａ）、肺
炎杆菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ　　ｐｎｅｕｍｏｎｉａ
ｅ）および大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　　ｃｏｌ
ｉ）から成る群より選択されるグラム陰性有機体の個体
数を検出可能な限界以下にまたは少なくとも約３対数だ
け減少することからなる、グラム陰性有機体を殺す方法
。
【００５７】４、有効量のナイシンから本質的に成る、
ｐＨ約５．５〜約６．５を有する、水性処理溶液を食物
処理装置の表面に適用することからなる、グラム陰性有
機体による汚染が疑われる食物処理装置を消毒をする方
法。
【００５８】５、有効量のナイシンから本質的に成る水
性処理溶液を、ｐＨ約５．５〜約６．５において、新し
く屠殺した食用飼鳥類に適用することからなり、ここで
ナイシンは塩化ナトリウムおよび水不溶性成分を本質的
に含まない調製物から得られる、を有する、水性処理溶
液を食物処理装置に適用することからなる、食用飼鳥類
の処理の間にサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）を
殺す方法。
【００５９】６、有効量のナイシンから本質的に成る水
性処理溶液を、ｐＨ約５．５〜約６．５において、野菜
の表面に適用することからなる、グラム陰性有機体を殺
す方法。
【００６０】７、水性環境中に溶解したときｐＨ約５．
５〜約６．５を提供することができる緩衝剤および有効
活性のナイシンから本質的に成る組成物を、グラム陰性
の食物が有する病原体またはグラム陰性の腐敗有機体の
増殖に感受性の食物製品の表面に適用し、これによりグ
ラム陰性有機体の個体数を検出可能な限界以下にまたは
少なくとも約３対数だけ減少する工程からなる、グラム
陰性の食物が有する病原体またはグラム陰性の腐敗有機
体を殺す方法。

Claims (6)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】　　有効活性のランチビチックおよび水中
    に溶解したときｐＨ約５．５〜約６．５を提供すること
    ができる緩衝成分から本質的に成る組成物を、グラム陰
    性の食物が有する病原体またはグラム陰性の腐敗有機体
    の増殖に適する表面に適用し、これによりグラム陰性の
    個体数を検出可能な限界以下にまたは少なくとも約３対
    数だけ減少することからなる、グラム陰性バクテリアを
    殺す方法。
  2. 【請求項２】　　ｐＨ約５．５〜約６．５を有しそして
    有効活性のナイシンを含有する水溶液から本質的に成る
    処理溶液を、グラム陰性の食物が有する病原体またはグ
    ラム陰性の腐敗有機体による汚染が疑われる表面に適用
    し、これによりネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ
    　　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、腸炎菌（Ｓａｌｍｏｎ
    ｅｌｌａ　　ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ）、志賀赤痢菌（
    Ｓｈｉｇｅｌｌａ　　ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）、緑膿
    菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ
    ）、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ　　ｃｈｏｌｅｒａ）、肺
    炎杆菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ　　ｐｎｅｕｍｏｎｉａ
    ｅ）および大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　　ｃｏｌ
    ｉ）から成る群より選択されるグラム陰性有機体の個体
    数を検出可能な限界以下にまたは少なくとも約３対数だ
    け減少することからなる、グラム陰性有機体を殺す方法
    。
  3. 【請求項３】　　有効量のナイシンから本質的に成る、
    ｐＨ約５．５〜約６．５を有する、水性処理溶液を食物
    処理装置の表面に適用することからなる、グラム陰性有
    機体による汚染が疑われる食物処理装置を消毒をする方
    法。
  4. 【請求項４】　　有効量のナイシンから本質的に成る水
    性処理溶液を、ｐＨ約５．５〜約６．５において、新し
    く屠殺した食用飼鳥類に適用することからなり、ここで
    ナイシンは塩化ナトリウムおよび水不溶性成分を本質的
    に含まない調製物から得られる、を有する、水性処理溶
    液を食物処理装置に適用することからなる、食用飼鳥類
    の処理の間にサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）を
    殺す方法。
  5. 【請求項５】　　有効量のナイシンから本質的に成る水
    性処理溶液を、ｐＨ約５．５〜約６．５において、野菜
    の表面に適用することからなる、グラム陰性有機体を殺
    す方法。
  6. 【請求項６】　　水性環境中に溶解したときｐＨ約５．
    ５〜約６．５を提供することができる緩衝剤および有効
    活性のナイシンから本質的に成る組成物を、グラム陰性
    の食物が有する病原体またはグラム陰性の腐敗有機体の
    増殖に感受性の食物製品の表面に適用し、これによりグ
    ラム陰性有機体の個体数を検出可能な限界以下にまたは
    少なくとも約３対数だけ減少する工程からなる、グラム
    陰性の食物が有する病原体またはグラム陰性の腐敗有機
    体を殺す方法。
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